次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

Published 4/13/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CD4 + T細胞は、適応免疫応答の重要なオーケストレーターです。ナイーブCD4 + T細胞は、いくつかの異なるエフェクターT細胞( 例えば TH1、TH2、Th17細胞、 )に現像することが可能である、局所微小環境1に依存特性サイトカインおよび転写因子の独自のセットをそれぞれ。 T細胞が作る系譜の決定は、自己に対する防御免疫と寛容の両方のために重要です。 Th17細胞は、細胞外細菌および真菌に対抗することが知られているT細胞のサブセットであるが、その不適切な応答はまた、多発性硬化症および乾癬2、3のように複数の自己免疫疾患および炎症性疾患の病因に関与しています。ヒトTh17細胞は、適切な偏光環境4とそれらを提供することにより、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から生成することができます。バリオ私たちのサイトカインIL-1βの組み合わせ、IL-23、TGFβ、及びIL-6は、人間のTh17細胞の発達のために使用されています。ヒトTh17細胞はCCR6、一般的にこの細胞集団を同定するために使用され、それらの主要な転写因子、(RORCによってコードされる)のRORγt5、6の式で定義されるケモカイン受容体を発現します。 Th17細胞は、複数のサイトカインを発現する能力を有するが、IL-17Aは、これらの細胞によって産生さ系統規定エフェクターサイトカインです。私たちは、ヒトTh17細胞のin vitro分化アッセイの頑健性を評価するために、3つのすべてのTh17関連マーカー(CCR6、のRORγt、IL-17A)の発現を調べました。また、我々は、これらのTh17マーカーの発現が非常に低いかまたは存在しないなければならないので、何のサイトカインまたはブロッキング抗体を陰性対照として使用するために培地に添加しなかった非分極条件下でヒトCD4 + T細胞を培養しました。

ve_content ">正常ヒトT細胞の発達及び生物学を研究する1つの方法は、開発中の遺伝子発現を操作することである。短干渉RNA(siRNA)は、タンパク質をコードするmRNAを標的とする合成小RNA分子であり、特定の遺伝子の発現を減少させるために利用することができます。マイクロRNA(miRNA)は転写後遺伝子発現を調節することが知られている内因性の非コード小型RNAである。miRNAは、Th17細胞7、8、9に含め、マウスおよびヒトT細胞生物学の両方で重要な役割を果たしていることが示されている。これは、遺伝子発現に及ぼす影響を研究するために、ヒトT細胞の小さなRNAの活動を操作し、最終的にはヒトT細胞生物学上の信頼性の高い方法を持つことが重要です。ここでは、我々は我々が導入するために開発さ簡単に使用できる、一貫性と信頼性プロトコルを記述小さな合成RNAおよびロックされた核酸(LNA、増大した安定性を有する化学的に修飾された核酸)免疫細胞への、そして、ヒトTh17細胞へ。

一般に、化学、生物学的、または物理的なカテゴリ10に分類された哺乳動物細胞、内低分子RNAを導入するいくつかの代替方法があります。脂質ベースのトランスフェクション、およびリン酸カルシウムのトランスフェクションを含む一般的に使用される化学的方法は、より効率的に細胞に取り込まれている化学-DNA複合体を作成することに依存しています。一般的に、化学的方法は、一次T細胞のトランスフェクション用として効率的ではありません。最も一般的な生物学的方法は、直接的にその天然の複製サイクルの一部として宿主に外来RNAを挿入するウイルスベクター( 例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス)を使用することです。ウイルス形質導入は、一般的にプロウイルスプラスミドの分子クローニングのための時間にする場合は特に1つの要因、完了するまでに時間がかかります。また、ウイルス形質導入ベクターとしては、人間の研究者に対して潜在的に有害であり得ます。エレクトロポレーションは、物理mで核酸は一過性に、彼らは彼らのターゲットに作用することができセルに入力することができ、高電圧パルスに細胞を付すことにより、膜透過性を誘導するethod。従来のエレクトロポレーション機器は、初代リンパ球をトランスフェクトするための効果的ではなかったです。しかし、最適化された次世代のエレクトロポレーションは、トランスフェクトされる材料は、小さいRNAである場合は特に、非常に高い効率でT細胞をトランスフェクトすることができることが証明されています。用語次の世代は緩く、伝統的なエレクトロポレーションマシンから2つの新しいプラットフォーム( 例えば 、ネオン、AMAXA)を区別するために使用されます。また、この方法は、多くの場合、検証合成試薬を用いて単一の実験で最大約120小RNAと中程度のスループットスクリーニングのために容易に拡張可能です。重要なことに、成功したトランスフェクションは、T細胞活性化後にわずか16のような時間で達成することができます。この方法の欠点は、しかし、それは安定したゲノムincorporatiが生じないということです上、したがって、一過性です。したがって、ウイルスベクターにパッケージングされ、正常に小さなRNAの長期発現が必要とされる場合にはT細胞で発現させることができる安定した発現構築物を作成するために余分な労力の価値があります。

我々は、異なる目的の11、12、13のために多様な合成一本鎖または二本鎖RNA又はLNAオリゴヌクレオチドのツールを提供する次世代のトランスフェクション( 例えば 、ネオン)を使用しています。効率的なRNA干渉は、二本鎖短干渉RNA(siRNA)を使用して、一次マウスおよびヒトT細胞において誘導することができます。このプロトコルは、ヒトTh17細胞は、この技術を使用するための最適化された条件を記載しています。 siRNAに加えて、市販の合成miRNA模倣剤および阻害剤は、機能のmiRNAの利得及び損失を研究するために使用することができます。 miRNA模倣は、siRNAと非常に類似した二本鎖RNA分子であるが、デザイン性は、内因性の成熟miRNAの配列とD。 miRNA阻害剤は、化学的に修飾されたRNAおよび/または天然のmiRNAに結合し、その機能を拮抗するLNAベースの一本鎖オリゴヌクレオチドです。私たちは、これらのツールのすべてを含めて、初代培養Tリンパ球に効果的に使用されるが、人間のTh17細胞に限定されないことができることを見出しました。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

このプロトコルは、人間研究倫理のためのUCSFのガイドラインに準拠しています。

T細胞培養、CD4 + T細胞の単離、及びのTh17分極の調製

  1. 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3(2μg/ ml)および抗ヒトCD28(4μgの/ mL)をウェル当たり1.5mLの0日目に、コート6ウェル組織培養プレート37°C。
    1. 代替的に、4℃で一晩コートプレート。パラフィルムでプレートを包みます。
  2. 製造者の指示に従って、密度勾配遠心分離によって臍帯血単核細胞(CBMCs)を準備。
    注意:慎重に作業し、血液媒介病原体への曝露のリスクを回避するために、ヒトの血液を取り扱う際に着用され、適切な個人用保護具(PPE)を確保。
  3. 単核細胞を単離し、洗浄した後、負SELEによるヒトCD4 + T細胞単離を行います市販のヒトCD4 + T細胞のキットを使用してction。
    注:単核細胞の単離後に赤血球の混入がある場合、オプションの赤血球の溶解がCD4 + T細胞単離工程の前に行ってもよいです。分離緩衝液(PBS中2%FBS)1mLの単核細胞を再懸濁します。 1X溶解溶液5mLを加えます。室温で15分間インキュベートします。次いで、細胞をペレット化し、4℃で5分間、300×gで分離緩衝液及び遠心分離機の5ミリリットルを加えます。
    1. 新しい5mLのチューブに分離バッファー500μLあたり50×10 6の密度で単核細胞を再懸濁します。
    2. FBSの100μL、次いでよく混合するオービタルシェーカー上で20分間、4℃で各チューブをインキュベートチューブ当たり抗体混合物の100μLを加えます。
    3. インキュベーション後、細胞を洗浄し、分離緩衝液の3-4 mLを加え。細胞をペレット化し、4℃で8分間、300×gで細胞を遠心分離。慎重にsupeを吸引rnatant。
    4. このスピンの間に、磁気ビーズを事前に洗います。ビーズを洗浄し、分離緩衝液の等量を追加します(細胞と1:1で使用)を新しいチューブに磁気ビーズの所望の量を転送します。 1mLのマイクロピペットを用いてよく混合した後、少なくとも1分間磁石中に管を置き。注意深く上清を吸引除去します。最初の前洗浄に移し、同じボリューム内の磁気ビーズを再懸濁。
    5. 分離緩衝液500μlで各チューブに細胞を再懸濁し、予め洗浄した磁気ビーズの500μLを加えます。
    6. よく混合するために室温(25°C〜18°C)でオービタルシェーカー上で15分間、磁気ビーズで細胞をインキュベートします。
    7. インキュベーション後、十分少なくとも10倍1mLのマイクロピペットを用いて細胞をピペット。次いで、分離バッファー3-4 mLを加え、2分間磁石中に各管を配置します。
    8. 慎重にある負の選択CD4 + T細胞を転送します新しいチューブに上清。
  4. CD4 + T細胞の分離が完了すると、血球計数器で細胞をカウントし、氷上で細胞を維持します。
  5. PBSで抗体コーティングプレートを2回洗浄します。抗ヒトIFNγ(20μgの/ mL)を、抗ヒトIL-4(20μgの/ mL)を、ヒトTGFβ(10ng / mLの)、ヒト:次いで、各ウェルへのTh17分極媒体の2X混合物1.5 mLを加えIL-1β(40 ngの/ mL)を、ヒトIL-23(40 ngの/ mL)を、ヒトIL-6(50ng / mlの)すべて2mMのL-グルタミンを補充した無血清基本培地(100で希釈しましたU / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび100μMの2-メルカプトエタノール)。
    注:トランスフェクションおよびRNA干渉は、血清含有培地中で作業を行います。このプロトコルを無血清培地を使用する目的は、より優れたIL-17Aの生産を達成することです。
  6. 遠心分離機4℃で5分間、500×gでのヒトCD4 + T細胞は、細胞をペレット化します。慎重supernatを吸引蟻。その後、無血清基本培地中で細胞を再懸濁し、最終容量をウェル当たり3ミリリットルであり、偏光サイトカインが1×最終濃度で今であるように、ウェル当たり1.5mLの中に3×10 6の密度で細胞をプレート。
    1. 5%CO 2、2日間37℃のインキュベーターにプレートを置きます。

2.エレクトロポレーションインビトロの極性ヒトTh17細胞

  1. 少なくとも2時間、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中の抗ヒトCD3(2μg/ ml)および抗ヒトCD28(4μgの/ mL)をウェル当たり250μLと2日目に、被覆48ウェル組織培養プレート37°C。
    1. 代替的に、4℃で一晩コートプレート。パラフィルムでプレートを包みます。
  2. トランスフェクションのために小さなRNAを準備します。各トランスフェクションのために、1.5mLの微量遠心管へのsiRNAの5μMストック溶液のアリコートを1μL。適切な化学マッチした小さなRNAのCONTRを含めますオール。氷の上のすべてのチューブを保管してください。
  3. PBSで抗体コーティングプレートを2回洗浄します。 、抗ヒトIFNγ(を10μg/ mL)を、抗ヒトIL-4(10μgの/ mL)を、ヒトTGFβ(5 NG / mL)を、ヒトIL-:次いで、各ウェルに1×のTh17分極媒体の500μLを加えます1β(20ng / mlの)、ヒトIL-23(20ng / mlの)、ヒトIL-6(25 ngの/ mL)を全て2mMのL-グルタミンを補充した無血清基本培地(100 Uで希釈します/ mLのペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、10mMのHEPES、1mMのピルビン酸ナトリウムおよび100μMの2-メルカプトエタノール)。
  4. 培養プレートおよびトランスフェクション試薬を調製した後、穏やかにピペッティングが、すべての細胞がウェルの底から剥離されることを保証する、1 mLのマイクロピペットで細胞を再懸濁します。 4℃で5分間、500×gでコニカルチューブと遠心分離機に細胞をプールします。
    注:本明細書で提示する4日間のプロトコルよりも長い培養期間のために、細胞は、この同じプロトコルを使用して、3日毎に約トランスフェクトされなければなりません。ステップ2異なる低分子RNAで処理した細胞をプールすべきではないので、0.4しかし修飾されなければなりません。テストされた条件のすべてが、収集し、計数し、個別にトランスフェクトされなければなりません。
  5. 注意深く上清を吸引し、その後洗浄するPBSの少なくとも1 mL中に細胞を再懸濁。その後、マイクロ遠心チューブに細胞を移す(生存率を評価するためにトリパンブルー排除を使用して、血球計など )のライブTh17細胞を数えます。
  6. 細胞をペレット化し、室温で5分間、500×gで遠心します。
  7. 注意深く上清を吸引し、その後、mL当たり2.5〜4×10 7細胞の密度でトランスフェクションシステム10μLキットから提供再懸濁緩衝液を用いて細胞を再懸濁します。室温で細胞を保管してください。
    注:ガイドラインとして、30分以内にトランスフェクトすることができるようにのみなど、多くの細胞を調製してみてください。複数のバッチを比較することができます。
  8. それぞれのMicroCに小さなRNAの1μLに細胞の9μLを追加entrifugeチューブ。ピペットは、一度に設けられピペット電極チップにロードし、次いでトランスフェクションのための細胞および小RNAを混合します。
    注:典型的には、トランスフェクション前にピペット電極先端に泡を作成防ぐために混合物の十分があることを確認するために、細胞懸濁液の9.5μLを加えます。
  9. 室温電解バッファE.プレイス3mLのピペットステーション内部キュベットを備えたキュベットを充填した後、キュベット内の位置にピペットを配置します。
  10. 以下のパラメータを使用して、細胞および小RNAの直ちにエレクトロポレーション各10μLミックス:パルス電圧1,500-1,550 Vを、パルス幅10ミリ秒、及び3つのパルストランスフェクションデバイスに合計します。
  11. エレクトロポレーションが完了した後、直接培養プレートの調製ウェルに1XのTh17分極媒体の500μLに細胞混合物を加えます。 5%CO 2、さらに2日間37℃のインキュベーターに入れプレート。
    注:ピペットでピペット電極チップを洗います上下PBS中で各トランスフェクションの間です。

3.収穫ヒトTh17細胞

  1. 穏やかにピペッティングが、すべての細胞がウェルの底から剥離されることを保証する、マイクロピペットで培養培地中で細胞を再懸濁。機能的および/または遺伝子発現アッセイのための細胞を調製します。
    注:定期、十分な細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析および転写因子染色のために、または遺伝子発現分析のためのRNAの調製のために使用されるトランスフェクトされたTh17細胞の単一のウェルから得られています。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

正常ヒトTh17細胞をエレクトロポレーションの信頼性の高いシステムを開発するための最初のステップは、 インビトロ分化ヒトのTh17細胞培養におけるロバスト生成することでした。 Th17分極条件下で培養T細胞は、ケモカイン受容体CCR6および転写因子のRORγt( 図1A、左)を発現しました。 T細胞は(右図1A)非偏光(THN)条件下で培養したときに、これらのマーカーは発現されませんでした。 Th17分極条件下で培養T細胞は、再刺激時にIL-17Aを産生しなくTHN条件下( 図1B、右)(左図1B)。 TH17分化は依然として低分子RNAによるトランスフェクション後に起こるが、いくつかの実験では、IL-17A産生の頻度( 図1C)で観察された減少があります。サイトカイン産生に対する小さなRNAトランスフェクションの効果はimporを実証します各実験内の比較のための化学整合小RNA制御を有するのタンス。重要なことに、生存率は低分子RNAでトランスフェクションした後に維持され、典型的には70%以上( 図1D)です。

このプロトコルの効率を決定するために、我々は、RNA干渉を使用しました。 CD45抗原は、PTPRC(タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプC)遺伝子によってコードされています。 CD45は、全ての造血細胞上に発現され、したがって、ヒトTh17細胞は、ロバストこの表面マーカーを発現しなければなりません。 PTPRCを標的とするsiRNAプールが2日目に、ヒトTh17細胞のトランスフェクションは、強く化学と比較して、CD45の発現を減少させた対照siRNA( 図2A)と一致しました。 CD45発現のこの単峰人口シフトは低分子RNAのためのこのプロトコルの典型的な、100%のトランスフェクション効率の近傍を示しています。したがって、これは、トランスフェクションを評価するために使用することができる重要なツールであるEFFプロトコルの最適化中にiciency。 RORCはのRORγt、直接IL-17A産生を調節するヒトTh17細胞の優勢な転写因子をコードします。 ( 図2B)予想通りRORCに対するsiRNAプールに現像ヒトTh17細胞をトランスフェクトするが強くのRORγtの発現を減少させました。示したこれらの細胞は、対照siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、IL-17A産生( 図2C)の低下としてRNAiによる還元のRORγtの発現は、機能的な効果を有していました。非偏CD4 + T細胞は、任意のRORγt又はIL-17Aを発現しないはずであり、この図では、陰性対照として示されています。

図1
図1: インビトロで分化したヒトTh17細胞エクスプレスCCR6、のRORγt、及びIL-17A 臍帯血から単離されたヒトCD4 + T細胞を培養したアンクルRのTh17条件(IL-1β、IL-23、IL-6、およびTGFβ)又は非偏光(THN)条件下で(媒体のみ、いかなる偏サイトカインまたはブロッキング抗体を添加しない)、インビトロおよびTh17細胞マーカーについて4日目に分析しましたフローサイトメトリーによる式:(A)代表的な等高線プロット表示面CCR6およびCD4 + T細胞の細胞内のRORγt共染色。象限の数字はパーセントCCR6及び/又はのRORγt陽性生シングレットCD4 +細胞を示します。 (B)PMA /イオノマイシンによる再刺激後のIL-17AおよびIFNγ生産。象限の数字はパーセントIL-17Aおよび/またはIFNγ陽性生シングレットCD4 +細胞を示します。 (C)代表的な等高線図が表示されCCR6と小さなRNA制御を有するCD4 + T細胞をトランスフェクション後の細胞内のRORγt共染色表面。象限の数字はパーセントCCR6及び/又はのRORγt陽性生シングレットCD4 +細胞(左)を示します。 RepresentaTIVE輪郭プロットは、PMA /小RNAコントロールとイオノマイシントランスフェクションによる再刺激後のIL-17AおよびIFNγ産生を表示します。象限の数字はパーセントIL-17Aおよび/またはIFNγ陽性生シングレットCD4 +細胞(右)を示します。 (D)代表輪郭プロットは、CD4 +細胞の生存率は、小さなRNAコントロールでトランスフェクション後表示します。数パーセントCD4 +生一重の細胞を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:初代ヒトTh17細胞におけるRNA干渉。 Th17条件下で培養臍帯血由来のヒトCD4 + T細胞は、siRNA非ターゲティングコントロール(siNeg CTL)またはターゲティングプールに対してで2日目にトランスフェクトしました 4つの個々のsiRNAを含むPTPRC(SI PTPRC)またはRORC(SI RORC)。 SI PTPRC(グレーの色合い)またはsiNegのCtlによるトランスフェクション後の代表的なヒストグラムに示す(A)表面CD45発現(黒線):次いで、細胞を4日目にフローサイトメトリーにより分析しました。 (B)細胞内のRORγt式がSi RORC(グレーの色合い)またはsiNegのCtl(黒線)を用いたトランスフェクション後の代表的なヒストグラムに示されています。 (C)代表的な等高線プロットは、PMA /イオノマイシン(下のパネル)での再刺激後の表面CD4およびCD4 + T細胞の細胞内のRORγt共染色(上のパネル)またはIL-17AおよびIFNγ産生を示します。象限の数字はsiNegのCtlまたはSi RORCでトランスフェクトTHN又はTh17の条件下パーセントCD4 +RORγt+またはIL-17Aおよび/またはIFNγ陽性生シングレット細胞を示します。fig2large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

このプロトコルは、ヒトTh17細胞への小RNAの送達のための改良された方法を提供します。ヒトTh17細胞は、ここで使用されたが、低分子RNAとエレクトロポレーションのこの方法は、TH1、TH2及びTregのような他の初代ヒトTヘルパーサブセットと共に使用することができます。細胞はトランスフェクションの前に培養して活性化されなければならないので、ナイーブCD4 + T細胞についてうまくいっていません。このプロトコルのために、我々は最初のよりよいIL-17Aの生産のためのin vitro培養系を最適化。最大の要因は、ベースのメディアでした。私たちは、無血清培地は、IL-17Aが、ヒトTh17細胞を産生するより良い誘導のために、従来の血清含有培地より​​も優れていたことがわかりました。 Th17細胞は、サイトカインTGFβ、IL-1β、IL-23、およびIL-6のサブセットを用いて生成することができるので、我々は、異なるサイトカインの混合物を試験しました。すべての4つの偏光のサイトカインが含まれていたときに、この研究では、より強固なIL-17Aの生産を達成しました。さらに、当社は、の長さを短く最適化唯一のトランスフェクションを確実にする文化は、培養期間中に必要でした。この4日間のプロトコルは、結果をより速く生成することを可能にする、唯一のトランスフェクションを必要としながら、培養長はさらに、IL-17A産生を増加させるために長くすることができます。より長い培養期間があっても、他の一次T細胞サブセットの最適な分化を達成するために必要であり得ます。これらのトランスフェクションは一過性であるため、複数のトランスフェクションは、長い培養期間のために時間をかけて必要な場合があります。我々は、複数の細胞分裂を超える希釈を防ぐための試薬で細胞を再エレクトロポレーションにより約3日後に、小さなRNAの試薬を補充することをお勧めします。私たちは日常マウスCD4 + T細胞のためにこれを行っています。各条件で細胞を回収し、別々にカウントしなければならないので、それは、より技術的に困難ではあるが、トランスフェクションが成功し、細胞生存率に対する最小の効果があります。

これらの実験において、ヒトTh17細胞たちヒト臍帯血のインビトロ培養によって再生成。重要なことに、この分化アッセイのための代替オプションは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を使用することであろう。 CBMCsとのPBMCの両方のために、前培養の開始にCD4 + T細胞を単離することが必要です。ここでは堅牢なトランスフェクション効率をもたらした負の選択によって、CD4 + T細胞を精製するための手法を提示し、私たちは、初代ヒトCD4 + T細胞を調製する他の方法は、同様にうまく機能するであろう期待しています。我々は、同様のトランスフェクション効率をもたらしたマウスCD4 + T細胞および両方の方法の単離のために、正または負のいずれかの選択を使用するいくつかのキットを試みました。追加の考慮事項は、最適Th17細胞に分化するために、ナイーブT細胞を使用することの重要性です。ヒト臍帯血を使用することは既にナイーブT細胞pの高い割合を有しているので、この理由のために有利です再送としたがって、ソートまたは培養の開始前に、ナイーブT細胞をプレ濃縮する必要はありません。しかし、このアプローチの明確な欠点は、臍帯血の利用が限られています。このリソースがより容易に利用可能であるので、大量に取得しなければならないであろうがあるいは、PBMCを14からナイーブT細胞の選別は、培養の前に行うことができます。

哺乳動物細胞をトランスフェクトするための複数の方法があるが、一次T細胞をトランスフェクトすることがより困難細胞型になる傾向があります。次世代エレクトロポレーションは、実行するのは技術的に容易であり、再現性のある一過性トランスフェクトT細胞の成功した物理的な方法です。最適化されたら、それは100%に近づく小さなRNAのトランスフェクションのための非常に高い効率を有します。これは、 図2に見ることができる場所CD45 +細胞( 図2A)およびPOの全体単峰人口低い発現レベルのRORγt( 図2B)シフトを発現する全ての細胞のpulation。重要なのは、小さなRNAとの最適化されたトランスフェクションは、細胞の生存率を損ないません。我々は日常的に低分子RNA( 図1D)と70%以上の生存率のトランスフェクション後に観察します。生存率は、このプロトコル、例えばサイトカイン産生などの他のT細胞特性の生物学の問題ではないが、低分子RNAによるトランスフェクション後に影響を受けることができます。このため、すべての実験で化学をマッチさせた小さなRNAコントロールを使用することが非常に重要です。

我々は、細胞死を最小限にし、トランスフェクション効率を最大にするため、2つのエレクトロポレーションパラメータ、パルス電圧を最適化します。高い電圧は、トランスフェクション時に細胞死を高めます。細胞死を防止し、成功したトランスフェクションを確保するために他のいくつかの技術的な考慮事項は、使用される合成試薬の量を最小限に抑え、betwee時間を限定的 n個の細胞の調製およびエレクトロポレーション。合成トランスフェクション試薬のために必要な最小濃度は、常に潜在的なT細胞毒性およびオフターゲット効果を防止するために使用されるべきです。室温でのトランスフェクション緩衝液中の細胞の時間を最小限にするためにトランスフェクション前に細胞調製時間を短縮することは重要であり、必要に応じて、バッチで細胞を調製することによって達成することができます。

現在、2台の市販されている次世代のエレクトロポレーション機器があります。これらのシステムの両方を効率的に一次T細胞をトランスフェクトすることができます。このプロトコルは、ネオントランスフェクション系を使用して最適化しました。このトランスフェクション系は、よりコスト効果的であるが、AMAXAシステム一意高いスループットアプリケーションのためのエレクトロポレーションのために96ウェルアダプタを提供します。私たちは、最低でもコストを維持しながら、追加の商業的進歩は、これらのトランスフェクションシステムのスループットと効率を向上し続けることを願っています。

「ヒトT細胞の>次世代エレクトロポレーションを効率的にこのプロトコルに例示されるように、目的の標的遺伝子に対するsiRNAと同様のmiRNA模倣剤または阻害剤を含む小RNAを導入することができる。ほぼすべての細胞であるため、高効率トランスフェクションのマーカーを使用する必要がなくなります小さなRNAでトランスフェクトされた。これは典型的なプラスミドのトランスフェクションは、プラスミドの量の増加に伴って増加50%以上の毒性マーカー遺伝子のわずか20〜30%の発現をもたらすDNAプラスミド一次T細胞のトランスフェクションとは対照的である。概要この方法を用いて合成模倣体は、遺伝子の多数は、分子クローニング12、13を必要とせずに並列にT細胞生物学における機能についてスクリーニングするために許可されている。また、11並列にT細胞によって発現されるすべてのmiRNAの機能のテストを可能にしました、13。このプロトコルで、適度スループットスクリーニングのこれらのタイプは、ヒトT細胞に適用されます。特に、この技術は、最近ゲノム編集15のプライマリヒトT細胞への小RNA(gRNA)-Cas9リボ核タンパク質複合体を導入するために使用しました。これらの多様なアプリケーションには、T細胞生物学を勉強しようとしている免疫学者のための重要なツールとして、ここで紹介するプロトコルの有用性、柔軟性とパワーを強調表示します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28, (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27, (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14, (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47, (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8, (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10, (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40, (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15, (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35, (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15, (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44, (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), 10437-10442 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats