Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

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Biochemistry

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Summary

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

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Vasavda, C., Zaccor, N. W., Scherer, P. C., Sumner, C. J., Snyder, S. H. Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding. J. Vis. Exp. (124), e55561, doi:10.3791/55561 (2017).

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Abstract

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Transmembran-Rezeptoren, die in der normalen zellulären Physiologie kritische Rollen spielen und ein großes pharmakologisches Ziel für multiple Indikationen darstellen, einschließlich Analgesie, Blutdruckregulation und Behandlung psychiatrischer Erkrankungen. Nach der Ligandenbindung katalysieren GPCRs die Aktivierung von intrazellulären G-Proteinen durch Stimulierung des Einbaues von Guanosintriphosphat (GTP). Aktivierte G-Proteine ​​stimulieren dann Signalwege, die zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die GPCR-Signalisierung kann durch Messung des Einbringens einer radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren Form von GTP, [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([ 35 S] GTPγS) in G-Proteine ​​überwacht werden. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die mehr nachgeschaltete Signalisierungsprozesse beurteilen, misst [ 35 S] GTPγS-Bindung ein proximales Ereignis in der GPCR-Signalisierung und kann vor allem Agonis unterscheidenTs, antagonisten und inverse agonisten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine empfindliche und spezifische Methode zum Studieren der GPCR-Signalisierung unter Verwendung von Rohmembranpräparationen eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1). Obwohl alternative Ansätze zur Fraktionierung von Zellen und Geweben existieren, sind viele kostenaufwendig, langwierig und / oder erfordern nicht standardisierte Laborgeräte. Die vorliegende Methode liefert ein einfaches Verfahren, das funktionelle Rohmembranen angereichert. Nach der Isolierung von MOR1 wurden verschiedene pharmakologische Eigenschaften seines Agonisten, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) und Antagonist, Naloxon, bestimmt.

Introduction

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die für eine bemerkenswerte Reihe von physiologischen Prozessen verantwortlich sind, einschließlich Analgesie, Olfusion und Verhalten 1 . GPCRs wirken, indem sie spezifische externe Signale erfassen und anschließend die intrazelluläre Signalisierung stimulieren. Sie markieren daher eine Schlüsselverbindung zwischen den äußeren und inneren Umgebungen einer Zelle. Aufgrund der kritischen Rolle, die GPCRs in der Biologie spielen, sind sie zu Hauptzielen für die Grundlagenforschung und die Wirkstoffforschung geworden 2 , 3 .

Im Gegensatz zu anderen Rezeptorfamilien, die diskrete Liganden binden, können GPCRs sehr unterschiedliche Molekülarten binden. Während ein GPCR mit Peptiden interagieren kann, kann ein anderer Photonen, kleine Moleküle oder Ionen 1 , 4 feststellen. Während ihre Liganden vielfältig sind, sind GPCRs in ihrem Gesamtarchitekten vereintUnd Funktion. Individuelle GPCRs bestehen aus sieben α-helicalen Transmembranproteinen mit extrazellulären Aminoterminals und intrazellulären Carboxylterminals 5 , 6 . GPCRs sind an intrazelluläre G-Proteine-heterotrimere Proteinkomplexe aus α-, β- und γ-Untereinheiten gekoppelt, die verschiedene Signalwege vermitteln 7 . Die G & agr ; -Untereinheit ist ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein, das inaktiv ist, wenn es an Guanosindiphosphat (GDP) gebunden ist und aktiv ist, wenn es an Guanosintriphosphat (GTP) 8 , 9 gebunden ist. Wenn GPCRs ihre Liganden binden, unterliegen sie einer Konformationsänderung, die es ermöglicht, dass G & agr; von G & bgr; & ggr ; abtrennt , wodurch G & agr; das GDP für GTP 7 austauschen kann. Der Rezeptor selbst wird an seinem Carboxylterminal durch verschiedene Serin / Threon phosphoryliertIne-Kinasen 10 , 11 und verinnerlicht, um die Rezeptorsignalisierung 12 , 13 , 14 zu dämpfen. Mittlerweile verlaufen das aktivierte G & agr; -Monomer und das G & bgr; & ggr ; -Dimer , um unterschiedliche Signalwege 7 zu aktivieren. Es gibt mehrere Isoformen jeder G-Protein-Untereinheit, und jede Isoform zielt auf bestimmte nachgeschaltete Wege und sekundäre Messenger-Systeme ab. Die Haupt-G & agr; -Isoformen umfassen G s , G q , G i / o und G 12-13 . Typischerweise assoziieren einzelne GPCRs mit einer bestimmten G & agr; -Isoform, wodurch ein externer Stimulus mit einer spezifischen zellulären Antwort 1 verbunden wird.

Die Charakterisierung einer GPCR-Ligand-Interaktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie des Rezeptors. Da der BIP / GTP-Austausch einer der frühesten Vorabend istNts, die der Ligandenbindung folgen, die Überwachung der GTP-Bindung kann die GPCR-Aktivierung oder Hemmung messen. Das Testen von mehr nachgeschalteten Ereignissen in der GPCR-Signalisierung ist oft nicht so quantitativ oder stöchiometrisch, kann nicht vollständige Agonisten von partiellen unterscheiden und kann teure Reagenzien erfordern. Darüber hinaus ist eine erhöhte GTP-Bindung an G & agr; -Proteine ​​ein fast universelles Ereignis nach der GPCR-Aktivierung, was bedeutet, dass die Messung der GTP-Bindung ein weitgehend anwendbarer Assay zur Überwachung der Aktivität der meisten GPCRs ist. Die Messung der GTP-Bindung ist ein einfacher und schneller Ansatz zur Überwachung der GPCR-Signalisierung in Zellen, die den Rezeptor von Interesse oder in nativem Gewebe überexprimieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt einen funktionellen GTP-Bindungsassay unter Verwendung eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1), um die Aktivität eines Agonisten und Antagonisten auf GPCR-Signalisierung quantitativ zu bestimmen.

Dieses Protokoll beschreibt zunächst, wie man Rohmembranen aus Zellen, die MOR1 überexprimieren, isoliert. Anmerkung thaDieses Protokoll ist nicht auf Überexpressionssysteme beschränkt und kann auf viele Membranquellen angewendet werden, einschließlich natives Gewebe oder Präparate, die mehrere Rezeptoren und G-Proteine ​​ausdrücken. Das Protokoll beschreibt dann, wie man die Bindung eines radioaktiven GTP-Analogons an diese Membranen in Abhängigkeit von variierenden Konzentrationen von [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -Enkephalin (DAMGO) oder Naloxon, einem MOR1-Agonisten und -Antagonisten, beziehungsweise. Das GTP-Analog-, [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([ 35 S] GTPγS) ist nicht hydrolysierbar. Diese Eigenschaft ist kritisch, da G & agr; -Untereinheiten eine intrinsische GTPase-Aktivität 7 aufweisen und das markierte Gamma-Phosphat auf einer hydrolysierbaren GTP-Radiochemie eliminieren würden. Membranen werden dann auf Glasfaserfilter gefangen und gewaschen, wonach das radioaktiv markierte GTP durch Flüssigszintillationszählung quantifiziert wird. Mehrere pharmakologische Parameter können zu charakterisiert werdenE die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung, einschließlich der halbmaximalen Antwort (EC 50 ) und des Hill-Koeffizienten (n H ) für Agonisten und der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC 50 ) und der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K b ) für die Antagonisten 16 , 17 , 18

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Protocol

1. Expression von rekombinantem HA-MOR1 in kultivierten Zellen

HINWEIS: Befolgen Sie alle Zellkulturprotokolle in einer sterilen laminaren Strömungshaube.

  1. Sterilisieren Sie die Zellkultur-Laminar-Flow-Kapuze mit 70% Ethanol und halten Sie sterile Technik in der gesamten Zellkultur.
  2. Bereiten menschliche embryonale Nierenzellen vor 293 (HEK293) Zellkulturmedium, vollständiges Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM): DMEM, pH 7,4, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (FBS ).
  3. Platte 2,5 x 10 6 HEK293 Zellen auf eine 10 cm Gewebekulturplatte in 10 ml vollständigem DMEM auftragen und bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren, bis 70-80% Konfluenz erreicht sind (O / N).
    ANMERKUNG: Um genug Protein für ein komplettes GTP-Bindungsexperiment zu sammeln, muss mindestens 3 x 10 cm Platten von Zellen platzen.
  4. Transformieren Sie die Zellen mit HA-MOR1 mit einem Transfektionsreagenz der Wahl und indem Sie dem Hersteller "Richtlinien. Inkubieren für 36-48 h.
    HINWEIS: Die menschliche MOR-1-cDNA (NCBI-Referenzsequenz: NM_000914.4) war ein großzügiges Geschenk von Gavril Pasternak und wurde in pCMV-HA kloniert.

2. Zellfraktionierung und Membransammlung

  1. Vorbereitung der folgenden Lysepuffer:
    1. Puffer 1: 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,4; 1 mM Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA); 10% Saccharose; Protease-Inhibitor-Cocktail; Und 1 mM Dithiothreitol (DTT). Füge das DTT frisch am Tag der Membranisolation hinzu.
    2. Puffer 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl & sub2 ;; Und 1 mM DTT. Füge das DTT frisch am Tag der Membranisolation hinzu.
  2. Entfernen Sie die transfizierten Zellen aus dem Inkubator (Schritt 1.4), saugt das Medium an und spülen Sie die Zellen mit 5 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab. Aspirieren Sie die PBS und überschüssige Flüssigkeit ausder Teller.
  3. Füge 600 μl Puffer 1 zu den Zellen hinzu. Mit einem Zellschaber werden die Zellen von der Plattenoberfläche entfernt und die Zellsuspension in ein 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert.
  4. Sofort das Mikrozentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren. Sobald die Proben eingefroren sind, tauen Sie die Lysate auf Eis auf oder legen Sie sie bei -80 ° C für die Langzeitlagerung auf.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 mit allen Platten der Zellen.
  6. Sobald die Lysate aufgetaut haben, verwenden Sie einen Single-Puls-Mikroröhren-Homogenisator, um die Zellen aufzubrechen. Den Homogenisator 3-5 mal für 10 s anziehen und das Röhrchen für 30 s zwischen den Impulsen auf Eis legen.
    1. Sammle 20 μl als ganze Zellfraktion.
  7. Die restliche Probe für 10 min bei 1000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand sammeln und in ein neues 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis geben.
  8. Das Pellet in 100 μl Puffer 1 resuspendieren und mit einer Pistille rehomogenisieren. Puls den HomoGenizer 3-5 mal für 5 s, Platzierung der Röhre wieder auf Eis für 30 s zwischen Impulsen.
    1. Zentrifugieren Sie die Probe ein zweites Mal für 10 min bei 1000 xg und 4 ° C. Kombinieren Sie den Überstand mit dem Überstand aus Schritt 2.7.
      HINWEIS: Das verbleibende Pellet enthält Kern- und Membranproteine.
  9. Zentrifugieren der vereinigten Überstände für 20 min bei 11.000 xg und 4 ° C. Trennen Sie den Überstand (die zytosolische Fraktion) in ein neues 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
  10. Das Pellet wird in 200 & mgr; l Puffer 2 resuspendiert. Das Pellet wird durch Triturieren 3-5 mal homogenisiert. Die Probe 20 Minuten lang bei 21.100 xg und 4 ° C zentrifugieren. Sauge den Überstand. Das Pellet, das die Rohmembranfraktion enthält, in 50 & mgr; l Puffer 2 resuspendieren.
  11. Verlassen Sie sofort die GTPγS-Bindungsexperimente (Abschnitt 3) oder Snap-Freeze in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 ° C.

3. [ 35 S] GTPγS Bindung HINWEIS: Bei der Handhabung von [ 35 S] GTPγS und bei der Durchführung von [ 35 S] GTPγS-Bindungsexperimenten ein standardmäßiges radiochemisches Sicherheitsprotokoll verwenden. Tragen Sie Schutzhandschuhe und einen Laborkittel zu jeder Zeit. Überprüfen Sie das Verpackungsmaterial auf Lecks oder Risse. Entsorgung von Abfällen und überschüssigen Reagenzien nach institutionellen Protokollen.

  1. Vorbereiten des unvollständigen Bindungspuffers (IBB) durch Mischen von 50 mM HEPES, pH 7,4; 5 mM MgCl & sub2 ;; 100 mM NaCl; Und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in destilliertem Wasser.
  2. Verdünnungsmittel [ 35 S] GTPγS bis 50 nM in 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 10 mM DTT. Mischen Sie 500 μl Aliquots und lagern Sie sie bei -80 ° C. Verwenden Sie vor dem Einleiten des Experiments nur ein frisch aufgetautes Aliquot. Tausche die Aliquots auf Eis.
  3. Vorbereiten von nicht radioaktiv markiertem GTP & ggr; S durch Auflösen von 1 mg GTP & ggr; S-Pulver in 177,62 & mgr; l reinem Wasser für eine Stammkonzentration von 10 mM. Machen Sie 10-μl Aliquots und speichern Sie sie bei-20 ° C
  4. Vorbereiten des vollständigen Bindungspuffers (CBB) durch Ergänzung des IBB um eine Endkonzentration von 1 mM DTT, 0,1% (wt / vol) Rinderserumalbumin (BSA), 10 μM GDP und 0,1 nM [ 35 S] GTPγS.
    HINWEIS: Die CBB enthält jetzt radioaktiv markiertes GTP. Bei der Arbeit mit radioaktiven Lösungen geeignete Sicherheitsvorkehrungen treffen.
  5. Die Membranfraktion aus Schritt 2.11 auf Eis auftauen.
  6. Quantifizierung der Proteinkonzentration der Membranfraktion über einen Bradford-Protein-Assay unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 595 nm.
    1. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von BSA-Proteinstandards mit Puffer 2 bei Endkonzentrationen von 0, 250, 500, 750, 1.500, 2.500 und 5.000 μg / ml vor.
    2. 2 & mgr; l von jedem Standard oder Membran zu 1 ml Bradford-Reagenz in einer Küvette geben. Mischen Sie gründlich durch Vortexen.
    3. Stellen Sie das Spektrophotometer auf eine Wellenlänge von 595 nm und leeren Sie es mit der Küvette mit 0 μg / ml Protein.
    4. Warte 5 min und rEad jeder der Standards und jede der Proben bei einer Wellenlänge von 595 nm.
    5. Zeichnen Sie die Absorption der Standards gegenüber der Konzentration. Mit dem Beer-Lambert-Gesetz (A = εcl, wobei ε = Extinktionskoeffizient, l = Länge der Küvette und c = Konzentration) die Konzentration der Membranproben berechnen.
  7. Die Membranfraktionen auf eine Konzentration von 100 μg Protein / ml in IBB verdünnen.
    HINWEIS: Eine 10-cm-Schale mit HEK293-Zellen ergibt typischerweise zwischen 1 & 3 mg Protein / ml.
  8. Bereiten Sie die folgenden experimentellen Bedingungen in einzelnen 1,6-mL-Mikrozentrifugenröhrchen vor: eine Ligand-Verdünnungsreihe, eine basale Aktivitätsbedingung zur Messung der basalen GTP-Bindung und eine unspezifische Bindungsbedingung zur Messung der unspezifischen GTP-Bindung.
    1. Für die Liganden-Verdünnungsreihe wird eine Verdünnungsreihe des interessierenden Liganden in einem Endvolumen von 100 & mgr; l CBB hergestellt. Bereiten Sie die Ligandenreihe bei 2x die gewünschte Endkonzentration vorOns Platzieren Sie die Ligandenkonzentrationen, um eine Reihe von Antworten adäquat abzudecken.
      1. Um die Wirkung von DAMGO auf die GTP-Bindung über MOR1 zu untersuchen, werden DAMGO-Verdünnungen von 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM und 2 pM in CBB (endgültig) Volumen: 100 & mgr; l).
        HINWEIS: Wenn zum Beispiel der interessierende Ligand einen erwarteten EC 50 -Wert von 10 μM aufweist, so erhält man Ligandenverdünnungen von 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM und 2 mM. Diese fünf Bedingungen decken einen breiten Bereich von Konzentrationen ab und sind 2x die für den Assay gewünschte Konzentration.
    2. Für die basale Bindung wird ein Röhrchen nur mit 100 μl CBB hergestellt.
    3. Zur unspezifischen Bindung wird ein Röhrchen mit 99 μl CBB, ergänzt mit 1 μl 2 mM nicht radioaktiv markiertem GTPγS, hergestellt.
  9. Füge 100 μl der verdünnten Membranlösung (Schritt 3.7) zu jeder experimentellen Bedingung hinzu.
  10. Inkubieren Sie die Membranen mit den verschiedenen ExperimentenBedingungen in 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen für 30 min bei 25 ° C in einem Thermomixer oder auf einem Orbitalschüttler.

4. Membranfiltration

  1. Vorbereiten von Waschpuffer durch Kombinieren von 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl & sub2 ;; Und 50 mM NaCl in destilliertem Wasser.
  2. Die Glasfaserfilter in Wasser für 10 min abschleifen.
    HINWEIS: Die Filter haben eine Porengröße von 1 μm, einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Dicke von 675 μm.
  3. Entfernen Sie die Proben aus dem Thermomixer oder dem Orbitalschüttler (Schritt 3.10). Die Proben für 5 s kurz spülen, um jede Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
  4. Entfernen Sie den Deckel des Vakuumfiltrationsgeräts. Legen Sie die vorgespannten Filter auf die Vakuumanschlüsse des Gerätes. Sichern Sie den Apparat Deckel, um eine Vakuumdichtung zu bilden. Schalte das Vakuum ein.
  5. Pipette von 195 μl jeder 200 μl experimentellen Bedingung auf Filter, um den Fehler der Adsorption an den Wänden des Röhrchens und / oder der Pipette zu minimierenTing
  6. Waschen Sie die Filter dreimal mit 1 ml eiskaltem Waschpuffer.

5. Flüssigkeitszintillationszählung

  1. Legen Sie 5 ml Szintillationszählröhrchen in ein Zählgestell ein. Füge 5 ml Szintillationsflüssigkeit zu jeder Durchstechflasche hinzu.
  2. Schalte das Vakuum aus (Schritt 4.4). Entfernen Sie den Deckel des Vakuumfiltrationsgeräts. Mit Pinzetten die Filter aus den Vakuumanschlüssen des Filtrationsapparates aufnehmen und jeden Filter in eine einzelne 5 ml Szintillationsfläschchen geben.
  3. Bereiten Sie eine Durchstechflasche mit 195 μl CBB vor, um das maximale Signal zu bestimmen.
  4. Kappe jede Durchstechflasche sicher. Inkubieren Sie die Fläschchen auf einem Orbitalschüttler bei 25 ° C für 10 min.
  5. Schalte den Szintillationszähler ein. Programmieren Sie den Szintillationszähler, um die 5 S-Isotopenemission für 5 min pro Probe mit dem standardbezogenen Szintillationsprogramm zu messen.
  6. Drücken Sie "Start", um eine Zählung zu nehmen.
  7. Wenn die Zählung erfolgt ist, entsorgen Sie die gezählte DurchstechflascheS als gefährlicher Abfall.

6. Datenanalyse

  1. Geben Sie die Daten in die Statistik- und Analysesoftware ein.
    1. Subtrahieren Sie die unspezifische Bindung von jeder der anderen Messungen, um die spezifische Bindung zu bestimmen.
      HINWEIS: Der Grad der unspezifischen Bindung wird durch die mit nicht-radioaktiv markiertem GTPγS inkubierte Probe bestimmt (Schritt 3.8.3).
    2. Öffnen Sie die Statistik- und Analysesoftware und wählen Sie einen XY-Datensatzeintrag aus.
    3. Geben Sie die spezifischen Bindungsdaten aus den [ 35 S] GTPγS-Bindungsexperimenten in eine Datentabelle in der Statistik- und Analysesoftware ein. Geben Sie die Agonistenkonzentrationen als molare Konzentrationen in die "X" -Säule ein. Geben Sie die zugehörigen 35 S-Werte als "Y" -Werte ein.
  2. Verwandeln Sie die Daten.
    1. Konvertieren Sie die X-Werte in ihren jeweiligen Logarithmus, indem Sie auf "Analysieren" klicken. Wählen Sie "Transformieren" aus dem eingebauten iN analysiert.
    2. Wählen Sie im Dialogfeld "Transformieren" die Option "X-Werte umwandeln" und wählen Sie die Funktion "X = log (X)". Wählen Sie, um einen neuen Graphen der Ergebnisse zu erstellen.
    3. OK klicken."
  3. Normalisieren Sie die Y-Werte.
    1. Wenn die umgewandelten Ergebnisse angezeigt werden, klicken Sie auf "Analysieren". Wählen Sie "Normalisieren" aus den eingebauten Analysen.
    2. Wählen Sie im Dialogfeld "Normalisieren" das Optionsfeld aus, um 0% als "kleinsten Wert in jedem Datensatz" und 100% als den "größten Wert in jedem Datensatz" zu definieren. Wählen Sie das Feld aus, um die Ergebnisse als Prozentsätze darzustellen. Markieren Sie das Feld, um ein neues Diagramm der Ergebnisse zu erstellen.
    3. OK klicken."
  4. Setzen Sie eine nichtlineare Regressionskurven auf die gezeichneten Daten. Führen Sie eine nichtlineare Regressionsanalyse durch.
    1. Wenn die normalisierten Ergebnisse angezeigt werden, klicken Sie auf "Analysieren". Aus den eingebauten AnalysenWählen Sie "Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung)".
    2. Bei der Untersuchung eines Agonisten wählen Sie aus dem Dialogfenster "log (agonist) vs. normalisierte Antwort - Variable Slope" aus.
    3. Bei der Untersuchung eines Antagonisten, "Select Log (Antagonist) vs. normalisierte Antwort - Variable Slope" aus dem Dialogfeld.
    4. OK klicken."
  5. Überprüfen Sie die Grafik und die Ergebnisse, um sicherzustellen, dass die Passform und die Daten in angemessener Übereinstimmung sind. Stellen Sie sicher, dass die Regression mit dem allgemeinen Muster der aufgezeichneten Daten übereinstimmt und dass die Residuen nicht so groß sind, dass sie die Dosis-Wirkungs-Kurve flach machen.
    HINWEIS: Die Software fasst die Ergebnisse der nichtlinearen Regression zusammen und beschreibt die Konzentration, die die halbmaximale Antwort (EC 50 ), den Hill-Koeffizienten (n H ) und die halbmaximale Hemmkonzentration (IC 50 ) hervorruft.
  6. Ableitung der Agonisten / Antagonisten-Parameter-Potenz.
    1. Leitet den Agonisten gleichIlibrium-Dissoziationskonstanten (K b ) aus einem der folgenden Experimente 16 , 17 , 18
      1. Beurteilen Sie die Verschiebung in der Dosis-Antwort eines Agonisten im Wettbewerb mit einer festen Konzentration von Antagonisten. Hier ist EC 50 '= EC 50 (1 + [Antagonist] / Antagonist Kb ), wobei EC 50 ' die rechtsverschobene EC 50 ist.
      2. Assess [ 35 S] GTPγS-Bindung mit variierenden Konzentrationen des Antagonisten im Wettbewerb mit einer festen Konzentration von Agonisten. Hier ist K b = IC 50 / (2 + ([Agonist] / Agonist EC 50 ) n ) 1 / n - 1, wobei n der Hangkoeffizient des Agonisten ist.
  7. Abhängig von der Variabilität der Daten, wiederholen Sie den Versuch (Schritte 3.8-5.6) für jeden Liganden etwa 3-5 mal und durchschnittlich die Ergebnisse mit einer Statistik und Analyse Softwsind.

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Representative Results

Zellfraktionierung kann verwendet werden, um Membran-assoziierte Proteine ​​aus zytosolischen und nuklearen Proteinen zu isolieren und zu bereichern. Abbildung 1 ist ein Western-Blot, der den Inhalt der drei primären Fraktionen demonstriert, die während des subzellulären Fraktionierungsprozesses gesammelt werden können. Speziell zeigt Fig. 1 , daß die Fraktionierung Membranproteine ​​( dh Na + / K + ATPase, Proteindisulfidisomerase (PDI) und HA-MOR1) von Histon H2B und Glyceraldehyd 3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH), Kernproteinen und zytosolischen Proteinen, beziehungsweise. Zusätzlich zeigt 1 die Anreicherung von Proteinen (Spur 1 im Vergleich zu Spur 4) in ihren jeweiligen subzellulären Fraktionen als Ergebnis der Fraktionierung. Ein repräsentativer Ponceau-Fleck zeigt eine gleichmäßige Proteinbeladung in jeder Fraktion. Es ist wichtig zu beachten, dass diese FraktiDas Onationsprotokoll unterscheidet nicht zwischen verschiedenen Zellmembranen. PDI ist in der Regel auf das endoplasmatische Retikulum (ER) lokalisiert, während Na + / K + ATPase überwiegend an der Plasmamembran liegt. Jedoch sind beide Proteine ​​in der endgültigen Rohmembranfraktion vorhanden ( Fig. 1 , Spur 4). Zusätzlich, während dieses Protokoll die Kernproteine ​​von der zytosolischen und endgültigen Membranfraktion ( Fig. 1 , Spuren 2-4) robust trennt, enthält die für Nuklearproteine ​​angereicherte Fraktion einige Membranproteine ​​( Fig. 1 , Spur 2), möglicherweise aus dem ER.

Es können mehrere pharmakologische Parameter abgeleitet werden, um eine GPCR-Ligand-Interaktion über GTP-Bindungsversuche zu charakterisieren ( Tabelle 1 ). Zum Beispiel können die halbmaximale Antwort (EC 50 ) und der Hill-Koeffizient (n H ) eines Agonisten durch die Überwachung der GTP-Bindung in abgeleitet werdenAntwort auf unterschiedliche Dosen des Agonisten. Fig. 3A zeigt eine dosisempfindliche GTP-Bindung an MOR1 nach der DAMGO-Behandlung. Wenn die Daten zu einer nichtlinearen Regression mit vier Parametern passen, beschreibt die Anpassung eine Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung mit einer EC 50 von 185 ± 23 nM und einem Hill-Koeffizienten von 0,46 ± 0,06. Die nach der DAMGO-Behandlung beobachtete flache GTP-Bindungskurve deutet auf eine negative Kooperativität zwischen DAMGO und MOR1 hin. Diese Methode kann auch die Pharmakologie eines Antagonisten identifizieren und beschreiben. Wie Abbildung 3A und B zeigt, ist Naloxon ein MOR1-Antagonist. Die Agonistenpotenz (K b ) von Naloxon, 97 ± 20 nM, wurde durch Variation der Konzentration von Naloxon im Wettbewerb mit einer festen Konzentration von DAMGO bestimmt ( 3A ). Naloxon zeigte einen Hill-Koeffizienten von 0,88 ± 0,06, was auf eine unabhängige Bindung zwischen Naloxon und MOR1 hindeutet. Wenn die acEines Liganden unbekannt ist, kann dieser Assay zwischen einem Agonisten, einem Antagonisten und einem inversen Agonisten unterscheiden. Wenn der Ligand ein Agonist ist, würde es eine Erhöhung der GTP-Bindung geben, wie in Fig. 3A nach der DAMGO-Anwendung. Wenn der Ligand ein inverser Agonist ist, würde eine verminderte Bindung von GTP gegenüber der basalen Bindung vermindert sein. Wenn der Ligand ein Antagonist ist, würde es keine Wirkung auf die Behandlung mit Liganden allein geben. Wenn es gleichzeitig mit einem Agonisten angewendet wird, würde ein Antagonist die Fähigkeit des Agonisten hemmen, die GTP-Bindung zu stimulieren. Fig. 3A zeigt die antagonistische Aktivität von Naloxon gegen den Agonisten DAMGO.

Abbildung 1
Abbildung 1: Zelluläre Fraktionierung trennt Membran-assoziierte, nukleare und zytosolische Proteine. ( Top ) Spur 1 repräsentiert dieProtein in der ganzen Zelle vorhanden Spur 2 enthält nukleare und membranassoziierte Proteine, die während der ersten Zentrifugationsschritte getrennt wurden. Spur 3 ist die nach 20 min Zentrifugation abgetrennte Cytosolfraktion bei 11.000 x g. Spur 4 enthält eine Rohmembranfraktion, die für [ 35 S] GTPγS-Bindungsexperimente geeignet ist. ( Unten ) Ponceau Fleck einer westlichen Membran zeigt Proteinbeladung für jede zelluläre Fraktion. Die folgenden Antikörper wurden für das Immunoblotting verwendet: Maus-anti-Na + / K + -ATPase (1: 1.000), Maus-Anti-GAPDH (1: 5.000), Maus-anti-H2B (1: 2.500), Kaninchen-Anti-PDI (1 : 1.000) und Ratten-Anti-HA (1: 2.000). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2: Strömungsdiagramm Umrisse der Fraktionierung und [ 35 S] GTPγS-Bindungsverfahren. Zuerst die Zellen zu transfizieren, um den GPCR von Interesse auszudrücken. Nach 48 h Ernte und Fraktionierung der Zellen zur Isolierung des Rezeptors (rot) und assoziierten G-Proteinen (grün = G α , lila = G β und orange = G γ ). Um GTP-bindende Experimente durchzuführen, fügen Sie [ 35 S] GTPγS hinzu und inkubieren die Membranen mit dem interessierenden Liganden. Um die G-Protein-Aktivität zu messen, binden Sie die Membranen an einen Filter, um jede ungebundene Radiochemie zu waschen und dann die gebundenen [ 35 S] GTPγS durch Flüssigszintillationszählung zu quantifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Agonismus aAntagonismus bei μ-Opioid-Rezeptoren, definiert durch [ 35 S] GTPγS-Bindung. ( A ) [ 35 S] GTPγS-Dosis-Wirkungskurve zu DAMGO allein (blau) oder Naloxon im Wettbewerb mit 2,5 μM DAMGO (grün). [ 35 S] Die GTPγS-Bindung wurde auf die maximale Stimulation in jedem Experiment normalisiert und wurde als Prozentsatz ausgedrückt. Die angegebenen Punkte sind der Mittelwert der Dreifachbestimmungen und werden als Mittelwert ± SEM ( B ) Antagonismus von DAMGO-stimulierten [ 35 S] GTPγS ausgedrückt Bindung durch Naloxon. [ 35 S] GTPγS Die Bindung wurde nach der Zugabe von Naloxon allein (100 μM), DAMGO allein (10 μM) oder DAMGO (10 μM) im Wettbewerb mit Naloxon (100 μM) quantifiziert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Bitte klicken Sie auf ihnUm eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ligand EC 50 oder IC 50 (nM) N H K b (nM)
DAMGO 185 ± 23 0,46 ± 0,06
Naloxon 420 ± 87 0,88 ± 0,06 97 ± 20

Tabelle 1: Pharmakologische Parameter der DAMGO- und Naloxon-Aktivität bei μ-Opioid-Rezeptoren. Die halbmaximale Antwort (EC 50 ) und der Hill-Koeffizient (n H ) für DAMGO wurden aus [ 35 S] GTPγS-Bindung als Reaktion auf unterschiedliche Dosen von DAMGO abgeleitet. Die halbmaximale Hemmkonzentration(IC 50 ) und Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K b ) für Naloxon wurden aus der Wirkung der Konkurrenz zwischen Naloxon und 2,5 μM DAMGO auf [ 35 S] GTPγS-Bindung bestimmt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt.

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Discussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei getrennte, aber komplementäre Methoden: einen einfachen Ansatz zur Fraktionierung von Zellen und Geweben in breite, aber unterschiedliche Kompartimente und ein Mittel zur Untersuchung der GPCR-Signalisierung durch Messung der [ 35 S] GTPγS-Bindung.

Die effiziente zelluläre Fraktionierung hat eine breite Palette von Anwendungen, angefangen von der Extraktion und Anreicherung von Proteinen bis hin zur Bewertung der subzellulären Lokalisation von Proteinen, zur Untersuchung der Rezeptor-Pharmakologie. Obwohl alternative Ansätze zur Fraktionierung von Zellen und Geweben vorhanden sind, ist das hier vorgestellte Protokoll vergleichsweise billiger, schneller und einfacher. Im Gegensatz zu etablierteren Verfahren ist dieses Verfahren jedoch nicht in der Lage, Plasmamembran-assoziierte Proteine ​​von anderen membranösen Kompartimenten, wie Endosomen oder dem ER, sauber zu trennen. Es muss auch angemerkt werden, dass, während das obige Protokoll ein transientes Überexpressionssystem verwendet, um Zellmembranen zu erzeugen, die den GPCR enthaltenInteresse ist dieses Protokoll mit stabilen Überexpressionssystemen sowie mit tierischem oder menschlichem Gewebe kompatibel 19 .

Die Probenvorbereitung ist entscheidend für die Maximierung der Fraktionsausbeute und der Reinheit. Es ist besonders wichtig, eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten und die Übergangszeiten zwischen den Zentrifugationsschritten zu minimieren. Die Verwendung eines Pellet-Homogenisator / Stößels, um die Zellmembran vollständig zu stören, erhöht die Rohmembranausbeute in der endgültigen Zellfraktion erheblich. Wenn die Membranausbeute zu gering ist, wären die beiden einfachsten Lösungen, um die anfängliche Zellkultur zu vergrößern und / oder das Zellpellet noch einige Male zu homogenisieren. Wenn einzelne Fraktionen einen hohen Grad an Verunreinigung aufweisen, reduzieren Sie die Übergangszeiten zwischen Zentrifugation und Trennung. Lassen Sie die Proben nicht nach der Zentrifugation sitzen, da Proteine ​​in die Probe diffundieren und die Fraktionsreinheit reduzieren können.

Filtrationsbasierte [ 35 S] GTPγS-Bindung ist eine schnelle und quantitative Methode zur Messung der Aktivierung von G-Proteinen unter Verwendung des assoziierten Rezeptors. Die Messung der GTP-Bindung ermöglicht eine quantitativere Messung der GPCR-Aktivität, als dies bei der Überwachung von nachgelagerten Prozessen generell möglich ist. Es gibt jedoch zwei kritische Einschränkungen für die hier beschriebene Methode. Am wichtigsten ist, dass die Filtrations-basierte [ 35 S] GTPγS-Quantifizierung bei allen G α- Isoformen 20 , 21 nicht gleichermaßen möglich ist. Im Allgemeinen ist dieses Verfahren auf G i / o- gekoppelte GPCRs wie MOR1 22 beschränkt. Gs - und G q - gekoppelte Rezeptoren neigen dazu, weniger empfindlich zu sein. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der Kombination der geringeren Häufigkeit von G s / G q und ihrer relativ langsamen Nukleotid-Wechselrate, was es schwierig macht, echte [ 35 S] GTPγS-Bindung über dem Hintergrund zu unterscheiden. Diese Beschränkung wurde angestellt Egal mit G-Protein-Antikörper-Capture-Techniken 20 . Einige Gruppen haben festgestellt, dass die Beseitigung des BIP aus der Reaktion das Signal-Rausch-Verhältnis für Gs- oder G- q- gekoppelte Rezeptoren 23 verbessert. Die zweite Einschränkung ist die Membranempfindlichkeit gegenüber lipophilen Agonisten oder Tensiden. [ 35 S] GTPγS-Assays erfordern funktionelle Rezeptor-G-Proteinkomplexe und die Zugabe von lipophilen Molekülen zum Reaktionssystem kann die Struktur der Membranen oder dieser Komplexe stören. Wenn dies ein potentielles Problem ist, kann es vorteilhaft sein, zu testen, ob das interessierende Reagenz [ 35 S] GTPγS-Bindung in einem bereits gut charakterisierten System, wie bei der DAMGO-vermittelten MOR1-Stimulation, stört. Andere Bedingungen, die die Optimierung berücksichtigen, umfassen den Bindungspuffer-pH-Wert, die Konzentrationen von Mg 2+ und NaCl, die Proteinkonzentration und die Inkubationszeit 23 ,Ef "> 24.

Dieses Protokoll konzentrierte sich auf eine gut charakterisierte GPCR, die MOR1 und gut charakterisierte Medikamente, DAMGO (Agonist) und Naloxon (Antagonist), die auf MOR1 wirken. Einer der Vorteile dieser Technik ist jedoch, dass es verwendet werden kann, um unbekannte Liganden als Agonisten, Antagonisten oder inverse Agonisten zu charakterisieren, je nachdem, wie der Ligand die GTP-Bindung moduliert. Bei der Entwicklung von Experimenten ist es entscheidend, eine Reihe von Konzentrationen des interessierenden Liganden zu verwenden und den Bereich der Ergebnisse zu berücksichtigen: Agonisten werden eine Erhöhung der GTP-Bindung über die Baseline verursachen, inverse Agonisten führen zu einer Abnahme der GTP-Bindung im Vergleich zu Baseline und Antagonisten haben wenig bis gar keine Wirkung, wenn sie in Isolation auf Baseline-GTP-Bindung hinzugefügt werden.

Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine Technik zur Durchführung der subzellulären Fraktionierung, das Sammeln von Rohmembranpräparaten und die Untersuchung der GPCR-Aktivierung durch Messung von [ 35 S] GTPγS bindend Diese Techniken können leicht an eine Vielzahl von Zellkultur- und Gewebemodellen angepasst werden, um die Pharmakologie einer der wichtigsten Rezeptorfamilien zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health Grant DA-000266 und der Medical Scientist Training Program T32 Grant (CV, NWZ und PCS) unterstützt. Die Autoren würden auch gerne sagen, somersault18: 24 (somersault1824.com) für die Library of Science & Medical Illustrationen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Thermo Fisher Scientific 10313021 Warm in a 37°C water bath before use
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081 Warm in a 37°C water bath before use
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Warm in a 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070 Warm in a 37°C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16000044 Warm in a 37°C water bath before use
Cell culture 10 cm plate Sigma-Aldrich CLS430167
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) Thermo Fisher Scientific BP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 2900
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DO632
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific BP358-1
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028-1
Pellet pestles motor Sigma-Aldrich Z359971
Pestles Bel Art F19923-0001
Bovine serum albumin (BSA) Affymetrix 10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS)  Perkin Elmer NEG030H
nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS)  Sigma-Aldrich 89378
guanosine diphosphate (GDP) Sigma-Aldrich 51060
Bradford reagent Bio-Rad 5000006
UV/VIS spectrophotometer Beckman Coulter DU640
spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460
orbital shaker Thermo Fisher Scientific 2314
thermomixer Eppendorf 535027903
glass fiber filters  GE Healthcare Life Sciences 1821-021
vacuum filtration apparatus Millipore Corporation XX2702550
desktop microcentrifuge Eppendorf 65717
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
scintillation fluid  Ecoscint A LS-273
scintillation counter vials Beckman Coulter 592690
scintillation vial lids Beckman Coulter 592928
Prism 6 GraphPad Software PRISM 6
ATP1A1 antibody Developmental Studies Hybridoma a6F 1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibody EMD Millipore CB1001 1:5000 in 3% BSA
H2B antibody Cell Signaling 2934S 1:2500 in 3% BSA
PDI antibody Cell Signaling 3501S 1:1000 in 3% BSA
HA antibody Roche 11867423001 1:2000 in 3% BSA

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References

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