مستوحاة تشريحيا ثلاثي الأبعاد الأنسجة الدقيقة المهندسة الشبكات العصبية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي، والتحوير، والنمذجة

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذه المخطوطة تفاصيل تلفيق الشبكات العصبية الأنسجة الدقيقة المهندسة: بناء ثلاثي الأبعاد ميكرون الحجم تتألف من المسالك المحورية محاذاة طويلة تمتد سكان الخلايا العصبية المجمعة المغطاة في هيدروجيل أنبوبي. هذه السقالات الحية يمكن أن تكون بمثابة التبديلات وظيفية لإعادة بناء أو تعديل الدوائر العصبية أو كما بيوفيديك اختبار الأسرة تحاكي الرمادي الأبيض المادة العصبية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نادرا ما يحدث الانتعاش وظيفية بعد الإصابة أو انحطاط الناجم عن المرض داخل الجهاز العصبي المركزي (نس) بسبب البيئة المثبطة والقدرة المحدودة على تكوين الخلايا العصبية. نحن نعمل على تطوير استراتيجية لمعالجة في وقت واحد الخلايا العصبية والمحور فقدان المسار داخل الجهاز العصبي المركزي التالفة. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول تصنيع الشبكات العصبية المهندسة الأنسجة الدقيقة (تينس-ميكرو)، والبنى زرع تتكون من الخلايا العصبية ومسارات محور عصبي الانحياز التي تمتد تجويف المصفوفة خارج الخلية (إسم) من هيدروجيل اسطوانة بريفورميد المئات من ميكرون في القطر التي قد تمتد سنتيمتر في الطول. يتم تحديد المجاميع العصبية إلى أقصى حد من التضمين ثلاثي الأبعاد وتمتد من إسقاطات محور عصبي. يتم وضع تينس الصغرى كاستراتيجية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي المركزي، محاكاة جوانب الهندسة المعمارية الدماغ كونيكوم ويحتمل توفير وسائل لاستبدال الشبكة. نيوقد تتشابك مجاميع رونال مع أنسجة المضيف لتشكيل مرحلات وظيفية جديدة لاستعادة و / أو تعديل الدوائر المفقودة أو التالفة. ويمكن أن تكون هذه البنى أيضا بمثابة الموالية للتجدد "السقالات الحية" قادرة على استغلال الآليات التنموية للهجرة الخلية والمحاور المساري، وتوفير التآزر الهيكلي والذوبان الإشارات استنادا إلى حالة التجديد. يتم تصنيعها تينس الصغرى عن طريق صب هيدروجيل السائل في قالب أسطواني يحتوي على إبرة تركز طوليا. مرة واحدة وقد تلمح هيدروجيل، تتم إزالة الإبرة، وترك عمود الصغير جوفاء. يتم إضافة حل إسم إلى التجويف لتوفير بيئة مناسبة لالتصاق العصبية ونمو محور عصبي. يتم تجميع الخلايا العصبية متفرقة ميكانيكيا للبذر الدقيق داخل واحد أو طرفي العمود الصغير. هذه المنهجية تنتج موثوقة بنيات مصغرة مكتفية ذاتيا مع المسارات محور عصبي طويلة الإسقاط التي قد تلخص ملامح الدماغ العصبي. سينابتيك إمونولابيلينغ ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا تشير إلى أن تينس الصغرى تمتلك توزيع متشابك واسعة النطاق والنشاط الكهربائي الجوهري. وبالتالي، تينس الصغرى تمثل استراتيجية واعدة لإعادة بناء الأعصاب المستهدفة من مسارات الدماغ، ويمكن أيضا أن تطبق كنماذج بيوفيديك لدراسة الظواهر العصبية الحيوية في المختبر .

Introduction

وهناك سمة مشتركة من اضطرابات وأمراض الجهاز العصبي المركزي، مثل إصابات الدماغ الصدمة (تبي)، إصابة الحبل الشوكي (سسي) والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر، ومرض باركنسون، هو انقطاع مسارات محور عصبي والخلايا العصبية الخسارة 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . على سبيل المثال، عندما يذهب السكتة الدماغية دون علاج، ويقدر أن محاور يتم فقدان بمعدل 7 أميال من المحاور في الدقيقة 5 . في حالة تبي، والتي ما يقرب من 1.7 مليون شخص تجربة كل عام في الولايات المتحدة وحدها، قد تستمر انحطاط محور عصبي تحدث بعد سنوات من الصدمة، كما يعجل الإصابة الأولية على المدى الطويل الدولة الاعصاب 4 . ومما يزيد من حدة هذه الآثار الضارة أن الجهاز العصبي المركزي لديه كابا محدود للغايةمدينة للتجديد 1 ، 7 ، 8 ، 9 . بعد الإصابة، وتطور البيئة المثبطة التي تتميز بعدم توجيه توجيهات إلى أهداف بعيدة، وجود مثبطات المايلين المرتبطة التي تعيق نمو العصبية، وتشكيل ندبة الدبقية من قبل الخلايا النجمية رد الفعل 8 ، 10 ، 11 ، 12 . الندبة الدبقية بمثابة الحاجز البيوكيميائية والفيزيائية لتجديد، مع جزيئات مثل بروتيوغليكان كبريتات شوندروتن عرقلة نمو محور عصبي 8 ، 11 . وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن الخلايا الجذعية العصبية تم العثور عليها في الجهاز العصبي المركزي الكبار، وإنتاج الخلايا العصبية الجديدة محدودة، ودليل ثابت على تكوين الخلايا العصبية لم يتم العثور عليها إلا في لمبة الشم، والحصينالمنطقة تحت الحبيبية، ومنطقة المحيطة بالبطين، والقناة المركزية للحبل الشوكي 13 ، 14 . هذه العقبات تمنع الانتعاش وظيفية من الخلايا العصبية المفقودة والهندسة المعمارية المادة البيضاء بعد الإصابة أو المرض، مما أدى إلى تغير الحياة في كثير من الأحيان وطويلة الأمد لهذه الظروف.

على الرغم من عدم وجود القدرة التجدد في الجهاز العصبي المركزي الكبار، وقد ثبت أن تجديد محور عصبي ممكن إذا تم تقديم الإشارات البيئية الكافية لاستضافة الخلايا العصبية 15 ، 16 ، 17 ، 18 . وقد حاول الباحثون تقديم ومعالجة عوامل النمو (على سبيل المثال، عامل نمو الأعصاب ، عامل نمو البشرة، عامل النمو المعتمد على الدبقية، والعامل العصبي -3) وغيرها من جزيئات التوجيه لتحفيز اللدونة وتجديد المحوار 14 ،/ سوب> 18 ، 19 . على الرغم من أن هذه الدراسات أكدت أن محاور الكبار قادرة على الاستجابة لعوامل النمو، وهذه الاستراتيجيات محدودة بسبب نفاذية منخفضة من حاجز الدم في الدماغ والتدرجات المكانية والزمانية المحددة المطلوبة لتعزيز التجدد 14 ، 18 ، 19 . وقد اعتمدت نهج أخرى على فرط تنشيط عوامل النسخ ذات الصلة التجدد في الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي. على سبيل المثال، أوفيركسريسيون من عامل النسخ ST3 حفز تجديد محور عصبي في العصب البصري 20 . ومع ذلك، كلا تسليم جزيء حيوي و أوفيركسريسيون من عوامل النسخ تفشل في استبدال السكان العصبية المفقودة. وقد تركزت الاستراتيجيات القائمة على الخلية أساسا على زرع الخلايا الجذعية العصبية (نسس) في الجهاز العصبي المركزي، والاستفادة من قدرتها على استبدال الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي، والإفراج عن العوامل الغذائية،ودعم محاولات العصبية التي تحدث بعد الإصابة 17 . على الرغم من هذا، لا تزال هناك تحديات ملحة تعوق هذا النهج، بما في ذلك القدرة المعوقة للخلايا العصبية المزروعة من أجل البقاء، والاندماج مع المضيف، وتظل مقيدة مكانيا إلى المنطقة المصابة 6 ، 14 ، 17 ، 21 . وبالإضافة إلى ذلك، تسليم الخلية وحدها غير قادرة على إعادة الهندسة المعمارية الخلوية من مسارات محور عصبي التالفة أو المفقودة. وهناك نهج بديل يعالج المشاكل التي تواجه استراتيجيات تسليم الخلايا والمخدرات / الكيميائية هو الجمع بين هذه النهج مع استخدام المواد الحيوية 14 ، 22 ، 23 . المواد الحيوية مثل الهلاميات المائية هي قادرة على محاكاة الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية للمصفوفة خارج الخلية (إسم)، والمساعدة في تسليم الخليةد داخل المنطقة المصابة، وتسليم عوامل النمو وغيرها من الجزيئات النشطة بيولوجيا مع الافراج عن السيطرة 22 . وقد أدت الخصائص الجذابة لهذه الاستراتيجيات القائمة على المواد الحيوية في أدلة على الجسم الحي تجديد محور عصبي بعد زرع السقالات إلى منطقة ليسيونيد 24 ، 25 ، 26 ، 27 ، 28 ، 29 ، 30 . ومع ذلك، واستراتيجيات المواد الحيوية الخلوية لا تحل محل السكان العصبية المفقودة. عندما تستخدم كوسيلة تسليم الخلايا العصبية، الدبقية، أو الخلايا العصبية السلائف، والمواد الحيوية غير قادرة على إعادة تشكيل شبكات محور عصبي لمسافات طويلة. التحدي المتمثل في تطوير النهج الذي يعالج كل من محور عصبي انحطاط المسار وفقدان الخلايا العصبية المرتبطة إصابة الجهاز العصبي المركزي والمرض لا يزال <سوب كلاس = "كريف"> 31.

وقد ذكرت مجموعة أبحاثنا في وقت سابق تطوير الشبكات العصبية زرع الأنسجة العصبية زرع (تينس الصغرى)، والتي هي نوع من "سقالة المعيشة" تتكون من الهيئات خلية الخلايا العصبية تقتصر على واحد أو طرفي أغاروس هيدروجيل-إسم الصغرى العمود ، مع محاذاة محاور عصبية تمتد في جميع أنحاء المناطق الداخلية من هذا ثلاثي الأبعاد (3D) التشفير 1 ، 10 ، 31 ، 32 . واحدة من الاختلافات الرئيسية بين هذه التقنية والنهج السابقة هو أن الهندسة المعمارية الخلوية من تينس الصغرى يتم إنشاؤها تماما في المختبر وزرع بعد ذلك 33 ، 34 ، 35 ، 36 ، 37 ، 38 ، <سوب كلاس = "كريف"> 39 ، 40 ، 41 . في التصنيع المختبر يوفر السيطرة المكانية والزمانية واسعة من النمط الظاهري الخلوي والتوجه، والخصائص الميكانيكية / الفيزيائية، والإشارات البيوكيميائية، والعوامل الخارجية، والذي يفيد دمج هذه السقالات مع المضيف بعد زرع 41 ، 42 . الصغرى تينس مستوحاة تشريحيا لأنها تحاكي الدماغ العصبي، وعرض المسالك محور عصبي مماثلة لتلك التي تجسر مناطق وظيفية متميزة من الدماغ ( الشكل 1A ) 1 . لذلك، قد تكون هذه الاستراتيجية قادرة على استبدال جسديا مساحات المادة البيضاء المفقودة والخلايا العصبية بعد زرع في منطقة ليسيونيد. هذا الأسلوب هو أيضا مستوحاة من الآليات التنموية التي "السقالات الحية الطبيعية" التي شكلتها الخلايا الدبقية شعاعي والمحاور عصبية رائدة بمثابة أدلة دالة للخليةوالهجرة من المنطقة تحت البطينية ونمو محور عصبي، على التوالي 43 . يتم تلخيص هذه الآليات في محاور محور عصبي الانحياز من تينس الصغرى، والتي يمكن أن تقدم مسارات حية للهجرة الخلايا العصبية وتجديد محور عصبي من قبل محور عصبي بوساطة محور عصبي ( الشكل 1C ) 43 . وعلاوة على ذلك، هذه الاستراتيجية تستفيد من التكامل متشابك بين الخلايا العصبية تين الصغرى والدوائر الأصلية، وتشكيل التبديلات الجديدة التي قد تسهم في الانتعاش وظيفية ( الشكل 1B ) 43 . القدرة على تشكيل المشبك قد تمنح أيضا هذا النهج القدرة على تعديل الجهاز العصبي المركزي والرد على الأنسجة المضيف وفقا لتغذية مرتدة الشبكة. على سبيل المثال، يمكن تحفيز الخلايا العصبية النشطة أوبتوجينيتيكالي في السقالات الحية لتعديل الخلايا العصبية المضيف من خلال التفاعلات متشابك ( الشكل 1D ).

وبالإضافة إلى ذلك، فإن كونستر أنبوبي القائم على المواد البيولوجيةأوكتيون من تينس الصغرى يوفر بيئة كافية لالتصاق الخلايا، والنمو، وتمديد نيوريت، والإشارات، في حين أن أبعاد مصغرة من يبني يمكن أن تسمح غرس زرع الحد الأدنى، وتوفير المكروية جزئيا عزلها للاندماج التدريجي في الدماغ. في الواقع، وقد أظهرت المنشورات الأخيرة إمكانات تينس الصغرى لمحاكاة المسارات العصبية بعد زرع في الدماغ الفئران. وبعد حقن مكروي التجسيمي، ذكرنا سابقا أدلة على البقاء على قيد الحياة الصغرى تين الخلايا العصبية، وصيانة الهندسة المعمارية محور عصبي، وتوسيع العصبية في القشرة المضيف إلى 1 شهر على الأقل في الجسم الحي 10 ، 31 . وعلاوة على ذلك، وضع العلامات مع سينابسين قدمت أدلة نسيجية من التكامل متشابك مع الأنسجة الأصلية 10 ، 31 . وعموما، يمكن أن تكون شبكات تينس الصغرى مناسبة بشكل فريد لإعادة بناء وتعديل التالفنس عن طريق استبدال الخلايا العصبية المفقودة، ودمج متشابك مع الدوائر المضيف، واستعادة المفقودة الهندسة المعمارية المحاور المفقودة، وفي بعض الحالات، وتوفير محاور عصبية تجديد مع العظة المسارات المناسبة.

شكل 1
الشكل 1: المبادئ والإلهام وراء تطوير شبكات العصبية الأنسجة الدقيقة المهندسة (تينس الصغرى). ( A ) الصغرى تينس تقليد الهندسة المعمارية الخلوية من الدماغ كونكتوم (الأرجواني)، التي ترتبط مناطق متميزة وظيفيا من قبل طويلة محاذاة محاور عصبية في اتجاه أحادي الاتجاه (الأحمر والأخضر) أو ثنائية الاتجاه (الأزرق). على سبيل المثال، يمكن لشبكات تين الصغرى إعادة تكوين الوصلات المفقودة في المسالك القشرية والنيغروستريتية أو في المسار الثاقب من القشرة المخية إلى الحصين (مقتبس من ستروزينا وآخرون ، 2015) 1 . ( B ) رسم تخطيطي ل أونيديركتيونال و ثنائية الاتجاه الصغرى تين (الأحمر والأزرق، على التوالي) دمج متشابك مع الدوائر المضيف (الأرجواني) لتكون بمثابة تتابع وظيفي بين طرفي الآفة. ( C ) تخطيطي من المسالك المحورية من أحادي الاتجاه تين الصغرى (الأخضر) بمثابة دليل لتجديد يسرع محوار عصبي محاور (الأرجواني) نحو الهدف الذي تتفاعل الصغرى تين. ( D ) الرسم التخطيطي المفاهيمي لاستخدام تينس-أوبتوجينيتيكالي الصغرى تينس كما نيورومودولاتورس، والاستفادة من التكامل متشابك مع الخلايا العصبية استثارة أو مثبطة (القاع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المخطوطة الحالية تفاصيل المنهجية المستخدمة في تلفيق الصغرى تينس باستخدام الخلايا العصبية القشرية الدماغية المستمدة من الجنين. ومن الجدير بالذكر أن تينس الصغرى يمكن أن تكون ملفقة مع أنواع أخرى من الخلايا العصبية. على سبيل المثالوافرة، وتقارير أولية ناجحة التنمية الدقيقة الصغرى ظهرت الظهري العقدة الجذرية العقدة (درغ) الخلايا العصبية 32 . يمكن توليد الأعمدة الصغيرة هيدروجيل ( الشكل 2A ) عن طريق إضافة الاغاروز السائل إلى صفيف قناة أسطواني مصنوع حسب الطلب، أو أنابيب الشعرية، على حد سواء تحتوي على محاذاة إبر الوخز بالإبر. الإبرة تشكل التجويف ويحدد القطر الداخلي (إد) من العمود الصغير، في حين أن معرف أنبوب الشعرية وقطر الاسطوانات في جهاز قطع الليزر تملي القطر الخارجي (أود) من يبني. يمكن اختيار أود و إد وفقا للتطبيق المطلوب عن طريق اختيار أقطار مختلفة للجهاز / أنابيب الشعرية وإبر الوخز بالإبر، على التوالي. ويمكن أيضا أن يتغير طول الأعمدة الصغيرة. حتى الآن، أبلغنا عن بناء الصغرى تينس تصل إلى 20 ملم في الطول 10 وتسعى بنشاط حتى أطوال أطول. بعد المواد الهلامية الاغاروز والوخز بالإبر نتتم إزالة إيدلز، يتم إضافة حل إسم تتألف عموما من نوع I الكولاجين و لامينين إلى التجويف من يبني ( الشكل 2C ). يوفر جوهر إسم سقالة لدعم التصاق الخلايا العصبية ونمو محور عصبي. في البداية، كانت الخلايا العصبية القشرية الفئران الأولية مطلي في الأعمدة الصغيرة باستخدام تعليق خلية فصل 10 ، 31 ، 32 . ومع ذلك، فإن هذا النهج لم تنتج الهندسة المعمارية المستهدفة في جميع الحالات، والتي تم تعريفها على أنها الهيئات الخلية العصبية يقتصر على نهايات الأعمدة الصغيرة، مع التجويف المركزي تتألف من محض محاذاة محاور العصبية. ومنذ ذلك الحين، وقد مكن استخدام طريقة التجميع العصبي القسري (على أساس البروتوكولات تكييفها من أونغرين وآخرون ) تصنيع أكثر موثوقية ومتسقة من تينس الصغرى مع هيكل مثالي ( الشكل 2B ) 44 . بالإضافة إلى وصف التيارالمنهجية، هذه المادة سوف تظهر ممثل على النقيض من المرحلة والصور متحد البؤر من تينس الصغرى التي تثبت تشكيل المسالك محور عصبي مع مرور الوقت، فضلا عن الهدف النهائي الهندسة المعمارية. وهذه المخطوطة توسيع أيضا على الجوانب الجديرة بالملاحظة من البروتوكول والتحديات المتبقية والاتجاهات المستقبلية للتكنولوجيا تين الصغرى.

الشكل 2
الشكل 2: الرسم التخطيطي لعملية التصنيع الصغرى تين ثلاث مراحل. ( أ ) تطوير هيدروجيل الاغاروز: (1) في البداية، يتم إدخال إبرة الوخز بالإبر الصغيرة (على سبيل المثال ، 180-350 ميكرون في القطر) في القنوات اسطوانية من صنع خصيصا، وقص الليزر قطع أو أنبوب شعري (على سبيل المثال ، 380-700 ميكرون في القطر). في الخطوة التالية، يتم عرض الاغاروز السائل في دبس في القنوات اسطوانية أو أنابيب الشعرية. (إي) بعد المواد الهلامية الاغاروز، تتم إزالة الإبرة ويتم تفكيك القالب لانتاج أجاروس الأعمدة الصغيرة جوفاء. (3) يتم بعد ذلك تعقيم هذه البنايات وتخزينها في دبس. ( ب ) ثقافة الخلايا العصبية الأولية وطريقة التجميع: (1) يتم تنفيذ تجميع الخلايا العصبية في صفيف هرمي الصغرى جيدا، يلقي من قوالب 3D المطبوعة، التي تناسب في آبار لوحة الثقافة 12 جيدا. (2) تشمل الشبكات الصغرى تينس الخلايا العصبية الفئران الأولية فصلها عن أدمغة الجنين من الجنينية-يوم 18 الجرذان. بعد تفكك الأنسجة مع التربسين إدتا ودناز الأول، يتم إعداد محلول خلية مع كثافة 1.0-2.0 × 10 6 خلية / مل. (إي) يتم نقل 12 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل بئر في مجموعة هرم الصغيرة أيضا. يتم طرد لوحة تحتوي على هذه الآبار الصغيرة لإنتاج المجاميع الخلية. (4) ثم يتم احتضان هذه بين عشية وضحاها قبل الطلاء في الأعمدة الصغيرة. ( C ) إسم تلفيق الأساسية والبذر الخلية: (ط) قبل زرع الخلايا، والحل إسم تحتوي على 1 ملغ / مل نوع الأول الكولاجين و 1 ملغ / مليتم نقل لامينين إلى المناطق الداخلية من تينس الصغرى ويسمح للبلمرة. (2) اعتمادا على ما إذا كان يتم تصنيع تينس أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه تينس، يتم وضع مجمع في واحد أو كليهما من العمود الصغير، على التوالي. (3) بعد فترة من الحضانة لتعزيز الالتصاق، يتم زراعة تينس الصغرى في أطباق بتري غمرت مع المستمدة الجنينية المتوسطة القاعدية العصبية. (4) بعد 3-5 أيام في الثقافة، وينبغي أن الهيكل النهائي تين الدقيقة تظهر مجاميع الخلايا في أقصى النقيض من العمود الصغير، مع مساحات محور عصبي تمتد طوله. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات من قبل اللجان المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام في جامعة بنسلفانيا والمركز الطبي مايكل مايكل كريزينز شؤون المحاربين القدماء والتزمت المبادئ التوجيهية المنصوص عليها في المعاهد الوطنية للصحة سياسة خدمة الصحة العامة على الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر الحيوانات (2015).

1. تطوير أغاروس هيدروجيل (مكون أسيلولار من الصغرى تينس)

  1. أغاروس حل إعداد
    1. داخل الخزانة السلامة الأحيائية، وإعداد الخزانات للأعمدة الصغيرة عن طريق نقل 20 مل من المالحة الفوسفات مخزنة المالحة (دبس) إلى كل من اثنين من 10 سم أطباق بتري. تعقيم ملقط غرامة و ميكروسكالبلز مع حبة الساخن معقم.
    2. تزن 3 غرام من الاغاروز ونقله إلى كوب معقمة داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. إضافة 100 مل من دبس للتركيز النهائي من 3٪ الوزن / حجم (ث / ت). وتشمل شريط مغناطيسي نظيفة وتغطي الكأس مع ألوميالأسطوانات.
    3. مع لوحة ساخنة / النمام، ودافئ الكأس في 100 درجة مئوية ويقلب في 120-200 دورة في الدقيقة لتذوب تماما الاغاروز (الحل سوف تتحول من غائم لمسح). الحفاظ على التدفئة واثارة بعد ذلك لمنع الجليلة وتغيير درجة حرارة التدفئة حسب الضرورة لتجنب حرق الاغاروز.
      ملاحظة: تلفيق مع كل من جهاز قطع الليزر والأنابيب الشعرية ويرد أدناه في الأقسام الفرعية 1.2 و 1.3، على التوالي. انتقل إلى القسم الفرعي 1.4 بعد الانتهاء من الخطوات الموصوفة في أي من القسم الفرعي. لكل من أساليب تصنيع العمود الصغير، إضافة الاغاروز السائل بسرعة، كما الاغاروز يتصاعد بسرعة كما يبرد. عند التعقيم مع الأوتوكلاف في أي من الخطوات التالية، استخدام الشروط القياسية المطبقة على الأواني الزجاجية.
  2. إعداد العمود الصغير باستخدام جهاز قطع الليزر
    ملاحظة: يتم قطع جهاز قطع الليزر من الاكريليك الشفاف باستخدام قطع ليزر ثاني أكسيد الكربون التجاري. الفبريكاتيون من الهياكل والأجهزة من خلال القطع بالليزر هو موثقة جيدا لمجموعة من التطبيقات الهندسية والبحثية 45 ، 46 ، 47 . يتكون هذا القالب ( الشكل 3 ) من مجموعة من خمس قنوات أسطوانية، كل منها يبلغ قطرها 398 ميكرون وطول 6.35 ملم. تتشكل هذه الصفائح الاسطوانية على طولها بقطعتين: نصف قاع (طول: 25.4 مم، عرض: 6.35 مم، ارتفاع: 6.0 مم) ونصف علوي (طول: 31.5 مم، عرض: 6.35 مم، ارتفاع: 12.7 مم )، كما هو مبين في الشكلين 3A و 3 B، على التوالي. يمكن تثبيت نصفين معا من قبعات الأمامية والخلفية التي لوحظت في الشكل 3C (طول: 31.5 ملم، العرض: 6.35 مم، ارتفاع: 12.7 ملم)، والتي تتميز أربعة ثقوب المحاذاة التي تتزامن مع اثنين من الثقوب كل على أعلى وأسفل القطع التي تساعد على تأمين جميع الأجزاء معا عندما ثمل. هذه القبعات أيضا إنكودفع خمسة ثقوب، متحدة المركز إلى القنوات أسطواني، والتي يمكن إدراجها إبر الوخز بالإبر لتشكيل التجويف من الأعمدة الصغيرة.
    1. تعقيم الجهاز هو مبين في الشكل (3) من خلال تغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم والتعقيم. تجميع الجهاز كما هو مبين في الشكل 3D من خلال محاذاة الأمامي والأقواس الخلفية مع فقط الجزء السفلي من قطعة وتأمين الأجزاء الثلاثة مع اثنين # 4-40 مسامير والمكسرات (قطر الخيط: 3.05 مم) في الثقوب محاذاة أسفل.
    2. إدخال بالكامل إبرة الوخز بالإبر (القطر: 180 ميكرون، طول: 30 ملم) في ثقوب إبرة على إما الأمامي أو الخلفي غطاء للجهاز ( الشكل 3D ). مع ميكروبيبيت، صب ما يكفي الاغاروز السائل (~ 1 مل للقنوات الخمس) على قطعة نصف القاع لملء كامل كل من نصفين أسطواني القناة.
    3. وضع على الفور الجزء العلوي من نصف الجهاز على النصف السفلي وتطبيق الضغط حتى يتم بقوة فيمكان لإكمال القنوات اسطوانية (الاحتكاك بين القبعات والجزء العلوي سوف تبقى الأخيرة في مكان). انتظر ~ 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد الاغاروز بالإضافة إلى السماح لها الهلام داخل قنوات الجهاز.
    4. يدويا استخراج الإبرة من كل من الثقوب على قبعات من الجهاز. إزالة مسامير وفصل يدويا اثنين من قبعات والنصف العلوي من قطعة نصف القاع، حيث أن هذا الأخير سيتم عقد هيدروجيل الأعمدة الصغيرة.
    5. استخدام ملقط غرامة لإزالة بلطف الأعمدة الصغيرة من القنوات على قطعة نصف القاع ووضعها في طبق بتري أعدت مسبقا تحتوي على دبس (الخطوة 1.1.1). ريوتيليز الجهاز لجولة أخرى من تصنيع الصغرى العمود. انتقل إلى القسم الفرعي 1.4.
  3. تصنيع العمود الصغير باستخدام أنابيب الشعرية
    1. نقل أنابيب زجاجية الشعرية (القطر: 398.78 ميكرون، طول: 32 مم) إلى داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. كسر يدوياأنابيب طويلة في شظايا 2.0-2.5 سم وإدراج كامل إبرة الوخز بالإبر واحدة (القطر: 180 ميكرون، طول: 30 مم) في كل جزء ( الشكل 2A ).
    2. نقل 1 مل من الاغاروز السائل من الكأس إلى سطح طبق بتري فارغة. عقد أنبوب الشعرية وإبرة قدم، وضع نهاية واحدة من الأنبوب في اتصال مع تجمع الاغاروز السائل لملء ذلك عن طريق العمل الشعري. يهيج أنبوب لتعزيز ارتفاع الشعرية.
      ملاحظة: ملء أنابيب الشعرية مع الاغاروز السائل مرتفعا كما تصاريح العمل الشعري. بعد ذلك، يمكن أن تقطع هذه الأعمدة الصغيرة في بنايات أصغر اعتمادا على طول المطلوب. وعادة ما تستخدم بركة الاغاروز 1 مل ل أنبوب واحد فقط، منذ يبرد الاغاروز والمواد الهلامية بسرعة، ومنع مزيد من العمل الشعري.
    3. عندما يتوقف السائل في الارتفاع، وإزالة أنبوب شعري من حمام السباحة ووضعه أفقيا على سطح طبق بتري. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح هلام الاغاروز داخل الأنابيب. </ لى>
    4. وضع الإبهام والسبابة على جانبي الأنبوب واضغط عليه. استخدام اليد الأخرى لسحب الإبرة بسرعة أثناء استخدام الإبهام والسبابة لمنع العمود الصغير نفسه من انزلاق من الأنبوب. إدراج إبرة 30 قياس في أنبوب شعري لدفع ببطء العمود الصغير إلى طبق يحتوي دبس (الخطوة 1.1.1).
  4. مايكرو العمود التشذيب والتعقيم
    1. نقل دقيق واحد العمود الصغير من دبس إلى طبق فارغ باستخدام الملقط غرامة. إضافة 10 ميكرولتر من دبس إلى الجزء العلوي من العمود الصغير مع ميكروبيبيت لمنع التجفيف. وضع الطبق الأخير تحت مجسام للإرشاد البصري.
      ملاحظة: في جميع أنحاء بروتوكول، الجزئي العمود التجفيف أو الجفاف يشير إلى اقتناء بنية تكوم التي يتم تمييزها بصريا من نموذجي، مظهر رطب من هذه البنيات. الأعمدة الصغيرة المجففة نعلق بقوة على سطح أطباق بتري و جيمكن نقلها بسهولة، في حين أن البنيات المائية تميل إلى الانزلاق عبر السطح بعد التلاعب بها مع ملقط. يظهر صورة على النقيض من المرحلة المجففة تماما العمود الصغير في الشكل 8A .
    2. تقليم العمود الصغير مع ميكروسكالب لتقصيره إلى الطول المطلوب (هنا، 2-5 ملم). نقل قلص الصغرى العمود مع الملقط غرامة إلى طبق دبس بتري أخرى أعدت في الخطوة 1.1.1.
    3. كرر الخطوات 1.4.1 و 1.4.2 لكل ملف صغير العمود.
    4. تعقيم الأعمدة الصغيرة في أطباق بتري التي تحتوي على دبس تحت الأشعة فوق البنفسجية (أوف) ضوء لمدة 1 ساعة. تخزين أطباق بتري في 4 درجات مئوية قبل إسم إضافة والطلاء الخلية.

2. ثقافة الخلايا العصبية الأولية وطريقة التجميع القسري للخلية

  1. إعداد مجموعة هرمية الصغرى جيدا
    ملاحظة: يستخدم هذا القسم قالب ثلاثي الأبعاد مطبوع يتكون من قاعدة أسطوانية (القطر: 2.2 سم، الارتفاع: 7.0 مم) aالثانية تسعة الأهرامات مربع على رأس (طول الجانب: 4.0 مم، زاوية مائلة: 60 درجة)، نظمت في 3 × 3 مجموعة، كما هو مبين في الشكل 3E . عملية التصنيع المضافة باستخدام طابعات 3D المتاحة تجاريا موثقة جيدا. يمكن استخدام برامج التصميم بمساعدة الحاسوب لتصميم القالب. ويمكن بعد ذلك تحويل ملف التصميم الناتج رقميا إلى مسار أداة لطابعة ثلاثية الأبعاد. تحتوي كل طابعة على مواصفات مختلفة، وتختلف إرشادات إعداد الطابعة ثلاثية الأبعاد وتشغيلها وفقا لذلك.
    1. استخدام مثقاب 3/32 "لثقب 16 ثقوب في صفيف 4 × 4 (طول الجانب: 4 سم، وفصل حفرة: 1 سم)، تتمحور في غطاء طبق بتري 10 سم.داخل غطاء الدخان الكيميائية، واستخدام والجزء السفلي من طبق بتري لزن 27 غرام من بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) و 3 غرام من وكيل علاج (لنسبة 01:10 ).إثارة مع ملعقة صغيرة لتوزيع وكيل بالتساوي.
    2. تغطية بدمس / وكيل علاج مع غطاء ثقب. ربط طرف واحد من خرطوم إلى فاكوم من غطاء الدخان وإدخال الطرف الآخر في ساق القمع (قطر الفم: 10 سم، طول الساق: 3 سم، قطر الساق: 1.5 سم).
    3. جعل فتحة مع 3/32 "مثقاب في الجزء العلوي من لمبة ماصة 1 مل وإدراج وتأمين طرف ميكروبيبيت 1000 ميكرولتر في الافتتاح (مع نهاية مدببة صعودا) وضع لمبة وغيض في خرطوم وسحب خرطوم صعودا حتى لمبة الأختام خرطوم في جذع القمع.
    4. وضع القمع على غطاء طبق ثقب وتأمين خرطوم مع دعم قوي متاح. فتح صمام فراغ لمدة 5 دقائق إلى شفط وجلب فقاعات الهواء إلى السطح.
    5. إغلاق صمام، وإزالة قمع، وضرب طبق بيتري ضد سطح غطاء الدخان ~ 3 مرات لانفجار أي فقاعات الهواء المتبقية.
    6. وضع قالب 3D هرمي جيدا جيدا المطبوعة في كل من الآبار في لوحة ثقافة 12 جيدا، مع الأهرامات لافتا. صب بدمس / وكيل علاج على رأس القوالب حتى كل بئر من رهو شغل لوحة. تغطية لوحة 12 جيدا مع غطاء ونقله إلى فرن لمدة 1 ساعة عند 60 درجة مئوية لتجف.
    7. إزالة بعناية كل بدمس مجموعة الصغرى جيدا ( الشكل 3F ) من لوحة مع ملعقة صغيرة. تغطية صفائف بدمس مع رقائق الألومنيوم وتعقيم بواسطة الأوتوكلاف. داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، إدراج واحد مصفوفة جيدا جيدا في كل بئر من لوحة 12 جيدا ( الشكل 2B ).
  2. عزل الخلايا العصبية القشرية من الأجنة الفئران
    1. إضافة ~ 20 مل من حل الملح المتوازن هانك (هبس) إلى كل من أربعة إلى ستة أطباق بتري 10 سم (واحد لكل الأنسجة تشريح) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. نقل هذه الأطباق إلى غطاء تشريح ووضعها على الجليد. تعقيم أدوات تشريح، مثل ميكروسكالبيلز، مقص، وملقط، مع حبة الساخن معقم.
    2. قبل الدافئة الخلايا العصبية الجنينية القاعدية المتوسطة + 2٪ الملحق خالية من مصل + 0.4 ملي L- الجلوتامين (المشار إليها باسم "ثقافة المتوسطة" هناr) و 0.25٪ التربسين + 1 ملي إيثيلينديامينتيتراسيتيك حمض (إدتا) عند 37 درجة مئوية. ذوبان الجليد ديوكسيريبونوكلياز (الدناز) أنا عن طريق وضعها في درجة حرارة الغرفة. إعداد 1.5 مل من 0.15 ملغ / مل حل دناز I في هبس والحفاظ على الحل على الجليد.
    3. الموت ببطء في الوقت المناسب الحوامل الجنينية اليوم 18 الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون وتأكيد الموت عن طريق قطع الرأس. نقل الذبيحة إلى غطاء تشريح العقيمة ووضعه بطني الجانب حتى. شطف البطن جيدا مع الايثانول 70٪.
    4. فتح الرحم وإزالة الأجنة (عادة ~ 11) من الكيس الذي يحيط بالجنين مع مقص ونقلها مع ملقط إلى طبق بتري تحتوي على هبس الباردة، كما هو موضح 48 . وضع كتلة المبردة (-20 درجة مئوية) الجرانيت تحت المجسام. وضع طبق بتري على سطح هذه الكتلة الباردة للحفاظ على درجة حرارة منخفضة من هبس في جميع أنحاء إجراء تشريح.
    5. شطف الجراء عن طريق سحق هبس حول ومن ثم نقلها إلى طبق نظيفة المقبلالتي تحتوي على هبس. مع المعونة من المجسام وأدوات تشريح، بالتسلسل إزالة رؤساء، نصفي الكرة المخية، والقشور من الأجنة ونقل كل الأنسجة مع ملقط إلى طبق جديد هبس مليئة بعد كل تشريح 48 .
    6. نضح فقط القشور مع ماصة باستور ووضع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل العقيمة. تجاهل الأنسجة الأخرى تشريح. شطف القشور ثلاث مرات عن طريق إضافة بالتسلسل وإزالة ~ 5 مل من هبس مع ماصة المصلية. وضع أنبوب على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
    7. نقل القشور مع ماصة باستور إلى أنبوب 15 مل تحتوي على ما قبل تحسنت التربسين إدتا (4-6 القشور لكل 5 مل من التربسين-إدتا). يهيج يدويا أنبوب مرة واحدة ووضعه في 37 درجة مئوية. عكس أنبوب كل 3 دقائق لمنع الأنسجة من التكتل.
    8. وقف التعرض إلى التربسين بعد ~ 10 دقيقة عن طريق إزالة الأنسجة مع ماصة باستور ونقله إلى نظيفة 15 مل الطرد المركزيالة النفخ. إضافة 0.15 ملغ / مل حل الدناز I (1.5 مل) إلى أنبوب مع ماصة.
    9. استخدام ماصة باستور لتفكيك يدويا كتل الأنسجة ثم دوامة (~ 30 ثانية) حتى يظهر الحل متجانسة وليس هناك أي شظايا الأنسجة المتبقية في السائل. إذا لم يكن من الممكن تجانس الحل تماما، استخراج شظايا غير قابلة للذوبان عن طريق سحبها في غيض من ماصة باستور.
    10. أجهزة الطرد المركزي حل الخلية متجانسة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.9 في 200 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف مع ماصة باستور، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا مكعبات. إضافة 2 مل من وسط الثقافة مع ماصة المصلية ودوامة ريسوسبيند الخلايا.
    11. عد عدد الخلايا في الحل أعدت في الخطوة 2.2.10 باستخدام عدادة الكريات. والعائد المتوقع هو 3.0-5.0 × 10 6 خلايا / نصف الكرة القشرية. إعداد 1 مل أو أكثر من تعليق الخلية في وسط الثقافة، مع كثافة 1.0-2.0 × 10 6 خلايا / مل.
  3. تشكيل الخلايا العصبية المجاميع
    1. مع ميكروبيبيت، إضافة 12 ميكرولتر من 1.0-2.0 × 10 6 / مل تعليق خلية في كل الصغرى جيدا من مجموعة بدمس (التي وضعت في لوحة في الخطوة 2.1.7).
      ملاحظة: يمكن تعديل تركيز الخلية اعتمادا على معرف العمود الصغير والحجم التجميعي الخلية المطلوبة، كما تركيزات أعلى تسفر المجاميع الكبيرة.
    2. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 5 دقائق لإجبار تجميع الخلايا في الجزء السفلي من الآبار الصغيرة ( الشكل 2B ). إضافة بعناية ~ 2 مل من وسط الثقافة إلى الجزء العلوي من كل مجموعة بدمس لتغطية جميع المصنفة الآبار الصغيرة، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المجمعة.
    3. إذا لم يتم ترانسدوسد الخلايا مع ناقلات الفيروسية، احتضان لوحة لمدة 12-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 ثم انتقل إلى القسم 3. إذا كان سيتم ترانزدوسد المجاميع، تخطي الحضانة والانتقال إلى القسم 2.4 .
  4. ترانمع ناقلات فيروسية لمراقبة إشارات الكالسيوم
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوات لانتشار الخلايا العصبية مع ناقلات الفيروسية التي تحتوي على مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا (جيسي). تم الحصول على النتائج المبينة في هذه المقالة باستخدام فيروس الغدة المرتبطة تجاريا (آف) (المصلي 1) مع GCaMP6f، جيسي مع حركية سريعة تتكون من البروتين الفلوري الأخضر (غفب)، كالمودولين (كام)، والببتيد M13، مدفوعا الإنسان سينابسين أنا المروج. قد يتطلب حل ناقلات الفيروسية التخفيف في دبس العقيمة قبل تنبيغ، اعتمادا على تركيز محلول المخزون. يجب ملاحظة صحة الخلية / التشكل وقوة إشارة GCaMP6f مع مرور الوقت لمجموعة من تركيزات النواقل. يجب إجراء هذا الإجراء الأمثل من قبل كل محقق لتحديد العيار المناسب لثقافات الخلايا الخاصة بهم. الوقت التعبير GCaMP6f نموذجي هو 7-8 أيام التالية التنبيب الذي يحدث أثناء الحضانة القيام به في سانتإب 2.4.2.
    1. مع ميكروبيبيت، إضافة الحجم المطلوب من حل ناقلات الفيروسية (للتركيز النهائي من ~ 3.0 × 10 9 نسخ الجينومية لكل المجاميع) إلى الوسط الثقافي، وتغطي المجاميع. ببطء ماصة صعودا وهبوطا لضمان أن يتم توزيع حل متجه بشكل متجانس في جميع أنحاء وسط الثقافة.
    2. احتضان لوحة مع المصنفة هرمي الآبار الصغيرة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 للسماح للتنبيغ الفيروسي من GCaMP6f.

3. تطوير المكون الخلوي من تينس الصغرى

  1. إسم تلفيق الأساسية
    1. بعد الحضانة الإجمالية، إضافة نوع الأول الكولاجين و لامينين إلى وسط الثقافة (لتركيز 1 ملغ / مل لكل منهما) في أنبوب ميكروسنتريفوج لإعداد حل إسم. تنفيذ الخطوات 3.1.2-3.1.4 في درجة حرارة الغرفة، ولكن الحفاظ على أنبوب مع إسم على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال لمنع الجليلة المبكرة.
    2. ضبط الرقم الهيدروجيني للحل إسم عن طريق نقل 1-2 ميكرولتر إلى ورقة ليتموس للتحقق من الرقم الهيدروجيني الأولي، مضيفا 1 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) و / أو 1 N حمض الهيدروكلوريك (هكل) إلى إسم، حسب الحاجة، وتكرار حتى الرقم الهيدروجيني هو 7.2-7.4. ضمان تجانس الحل إسم عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا مع تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
    3. نقل الأعمدة الصغيرة مع ملقط معقم من الأطباق في الخطوة 1.4.3 لتفريغ 35- أو 60 ملم أطباق بتري. العمل على 4-5 الأعمدة الصغيرة في وقت لمنع الجفاف. إرفاق نصيحة 10 ميكرولتر تعلق على نصيحة 1،000 ميكرولتر إلى ميكروبيبيت. باستخدام مجسام للإرشاد البصري، ووضع طرف في نهاية واحدة من الأعمدة الصغيرة والشفط لاستخراج دبس المتبقية والهواء فقاعات من التجويف.
    4. رسم بسرعة 4-5 ميكرولتر من إسم في ميكروبيبيت. مراقبة تحت ستيريوسكوب، ضع غيض من ميكروبيبيت في واحدة من نهايات الأعمدة الصغيرة وتصريف ما يكفي إسم لملء التجويف. تأكيد عدم وجود فقاعات الهواء في التجويف، وهذه قد تمنع نمو محور عصبي من خلال إسم. إذا وجدت فقاعات الهواء، وإزالة إسم، كما هو موضح في الخطوة 3.1.3، وإضافة إسم مرة أخرى.
    5. لمنع الجفاف، إضافة ~ 2 ميكرولتر من إسم حول كل عمود الصغير. احتضان هيدروجيل / إسم الأعمدة الصغيرة في أطباق بتري في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 25 دقيقة. انتقل إلى زرع الخلايا مباشرة بعد الحضانة.
      ملاحظة: ويهدف فترة الحضانة في الخطوة 3.1.5 للسماح الوقت للبلمرة من الكولاجين و لامينين داخل الأعمدة الصغيرة.
  2. الخلايا العصبية البذر في الأعمدة الصغيرة
    ملاحظة: لتغيير وسط الثقافة من المجاميع ترانسدوسد، إمالة لوحة، واستخدام ميكروبيبيت لإزالة المتوسطة التي برك على جدار البئر، ومن ثم إضافة ببطء ~ 1 مل ضدالجدار (لتجنب إزعاج المجاميع في الآبار الصغيرة الهرمية). كرر هذا الوسيط تغيير مرة ثانية.
    1. بعد فترة الحضانة في الخطوة 3.1.5، نقل ما يقرب من 10-20 ميكرولتر من الوسط الثقافي إلى منطقتين مجانا في أطباق بتري عقد الأعمدة الصغيرة. استخدام ميكروبيبيت لنقل فردي المجاميع إلى طبق بتري التي تحتوي على يبني ونقلها مع ملقط إلى واحدة من برك صغيرة من ثقافة المتوسطة للحفاظ على صحة الخلية.
    2. وفي حين تراقب تحت مجسام، تدرج مجاميع في كل طرف من أعمدة الأعمدة الصغرى لشبكات تينس ثنائية الاتجاه ثنائية الاتجاه أو في طرف واحد لهيكل أحادي الاتجاه (حسب الرغبة) باستخدام ملقط. تأكيد وضع المجاميع داخل الأعمدة الصغيرة باستخدام مجسام. استخدام ملقط لنقل المصنف الصغرى الأعمدة إلى بركة صغيرة أخرى من الوسط الثقافي لتجنب الجفاف والحفاظ على الصحة الإجمالية.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 45 دقيقة إلىإهداء المجاميع للانضمام إلى إسم. تحقق من أن المجاميع تبقى في نهايات الأعمدة الصغيرة باستخدام المجسام. إعادة إدخال المجاميع الخلية وتكرار خطوة الحضانة عند الضرورة.
    4. بعناية الفيضانات أطباق بتري التي تحتوي على تينس الصغرى مع وسط الثقافة (3 أو 6 مل لطبق 35 أو 60 ملم بتري، على التوالي) باستخدام ماصة المصلية. وضع الأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 للثقافة على المدى الطويل.
    5. إجراء تغييرات نصف الوسائط كل يومين مع وسط الثقافة. إزالة بعناية نصف المتوسطة القديمة مع ماصة واستخدام مجسام للإرشاد البصري لتجنب شفط تينس الصغرى. استبدال عن طريق إضافة ببطء الطازجة، المتوسطة قبل تحسنت مع ماصة.
    6. لإعادة صياغة بدمس مصفوفات جيدا جيدا، وإزالة وسط الثقافة، وتغلي صفائف في الماء منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة، وتعقيم في الأوتوكلاف لجولة أخرى من تشكيل الكلي والثقافة.
      ملاحظة: في تيمبوانتس المطلوب، ويمكن التحقق من الهندسة المعمارية من تينس الصغرى باستخدام المجهر المرحلة التباين. هنا، تم استخدام وقت التعرض من 5-8 مللي ثانية و 10 X (0.64 ميكرون / بكسل) و 20 X (0.32 ميكرون / بكسل) الأهداف لالتقاط الصور على النقيض من المرحلة. تم القبض على مضان يرتبط مع تغيرات تركيز الكالسيوم في ترانسدوسد فيروس تينس الصغرى باستخدام المجهر مضان عالية السرعة مع وقت التعرض 50 مللي ثانية، وهدف 10X (0.64 ميكرون / بكسل)، والضوء الحالة الصلبة مع مرشحات ممر الموجة من 480 ~ نانومتر و ~ 510 نانومتر للإثارة والانبعاثات، على التوالي، لتصور إشارة مضان GCaMP6f.

4. إمونوسيتوشيميستري للدراسات في المختبر

ملاحظة: بالنسبة للصور المعروضة هنا، تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الماوس المضادة توج 1 / بيتا - 3 توبولين (1: 500) والأرنب المضادة سينابسين -1 (1: 500) لوضع العلامات للمحاور عصبية وقبل -synaptic بوتونس، على التوالي. وكانت الأجسام المضادة الثانوية حمار المضادة-mouse 568 (1: 500) والحمار ضد الأرنب 488 (1: 500). الأحجام المطلوبة من المحضرات الأولية والثانوية الأجسام المضادة أعدت، فضلا عن حجم الفورمالديهايد، مصل الحصان، ومحاليل المنظفات، تعتمد على حجم المطلوبة لتغطية كليا البنيات. يمكن تقليل هذه المجلدات باستخدام قلم حاجز مسعور للحد من المنطقة المحيطة بكل عمود صغير.

تنبيه: هذا القسم توظف الفورمالديهايد وهويشت. الفورمالديهايد هو مركب سام يعرف أن يكون مسرطنا، و هوشست هو الطفرات المعروفة. ولذلك، يجب التخلص من هذه المركبات في حاوية النفايات المناسبة. دائما التعامل معها في غطاء الدخان الكيميائية أثناء استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، مثل معطف المختبر، نظارات السلامة، والقفازات.

  1. إعداد 4.0٪ حجم / حجم (الخامس / الخامس) محلول الفورمالديهايد في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) داخل غطاء الدخان الكيميائية.
  2. إزالة الوسط الثقافي من أطباق بيتري كونتينينغ تينس الصغرى مع ميكروبيبيت. إضافة حجم كاف من محلول الفورمالديهايد للأطباق لتغطية تماما تينس الصغرى. نقع تينس الصغرى في محلول الفورمالديهايد لمدة 35 دقيقة في 18-24 درجة مئوية لإصلاح الخلايا داخل الأعمدة الصغيرة.
  3. إزالة محلول الفورمالديهايد 4.0٪ من أطباق بتري مع ماصة وتجاهل المبادئ التوجيهية المناسبة التخلص من المواد الخطرة.
  4. أداء اثنين من الشطف سريع عن طريق إضافة ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية تماما تينس الثابتة الثابتة ومن ثم إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة. إجراء شطف طويل الثالث عن طريق تمرغ يبني في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
    تنبيه: تجاهل برنامج تلفزيوني يستخدم للشطف كما يحتمل أن تحتوي على آثار الفورمالديهايد.
  5. إعداد حل 0.3٪ الخامس / الخامس من المنظفات غير الأيونية في 4٪ الخامس / الخامس مصل الحصان في برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني من الأطباق بتري التي تحتوي على تينس الصغرى الثابتة وإضافة حجم كاف من محلول المنظفات 0.3٪ لتغطية يبني. نقع لمدة 60 دقيقة في 18-24 و #176؛ C ل بيرمابيليز الخلايا.
  6. إزالة محلول المنظفات مع ماصة. أداء اثنين من الشطفات السريعة عن طريق إضافة وبعد ذلك إزالة برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، أداء ثلاثة يشطف أطول من خلال تمرغ يبني في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق خلال كل شطف.
  7. تمييع الأجسام المضادة الأولية في 4٪ مصل الحصان. إزالة برنامج تلفزيوني من الأطباق بتري التي تحتوي على تينس الثابتة و بيرمبيليزد الصغرى. إضافة ما يكفي من حل الأجسام المضادة الأولية للأعمدة الصغيرة لتغطية لهم تماما. ختم الأطباق بتري مع بارافيلم لمنع التبخر واحتضان بين عشية وضحاها (12-16 ح) في 4 درجات مئوية.
  8. إزالة الحل الأجسام المضادة الأولية من الأطباق وشطف كما هو موضح في الخطوة 4.6. في الظلام، وإعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في مصل الحصان 4.0٪. إضافة ما يكفي من حل الأجسام المضادة الثانوية لتغطية كامل يبني، وتغطي الأطباق مع رقائق الألومنيوم، واحتضان لمدة 2 ساعة في 18-24 درجة مئوية.
  9. إعداد الحل هوشست (1: 10،000) في برنامج تلفزيوني لصمة عار النوى.
  10. ملاحظة: تم التقاط الصور ل إمونولابيلد الصغرى تينس مع المجهر متحد البؤر الليزر مع قرار من 2048 (~ 8 S / الإطار)، وهدف 10X (0.64 ميكرون / بكسل)، 487 نانومتر الإثارة و ~ 525 نانومتر موجات الانبعاثات ل مضان أخضر، 561 نانومتر الإثارة و ~ 595 نانومتر موجات الانبعاثات ل مضان أحمر، و ~ 3.22 ميكرون / شريحة مع ~ 60 شرائح في المتوسط ​​ل Z- مداخن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم رصد تينس الصغرى باستخدام مرحلة المجهر التباين لتقييم سيتوارشيتتيور ونمو محور عصبي ( الشكل 4 ). داخل أحادي الاتجاه، 2 مم طويلة تينس الصغرى، تم تقييد المجاميع العصبية إلى نهاية واحدة من العمود الصغير وتوقع حزمة من المحاور من خلال النواة الداخلية. محاور امتدت طول العمود بأكمله من قبل 5 أيام في المختبر (ديف) ( الشكل 4A ). كان هناك معدل نمو محوري أولي أكبر في ثنائية الاتجاه 2 مم طويلة تينس-تينس، كما محاور امتدت كامل العمود الصغير من قبل 3 ديف ( الشكل 4B ). بواسطة 5 ديف، ثنائي الاتجاه تينس الصغرى ظهرت مساحات محور عصبي كثيفة التي ربط المجاميع الحفاظ على أقصى الحدود العمود الصغير. لوحظت هذه الهندسة المعمارية أيضا في 5 ملم الصغرى تينس، مع محاور تمتد العمود الصغير من قبل 5 ديف ( الشكل 4C ). كما لوحظ في جميع الحالات، و إسم في التجويف و ريستري هندسيةكتيون المقدمة من الاغاروز توفر الاتجاه المطلوب لتشكيل المسارات محور عصبي التي تحاكي هيكليا ملامح العصبية الأم.

تم تطبيق تقنيات إمونوسيتوشيميستري في هذا البروتوكول، واتخذت الصور متحد البؤر للتحقق من مكونات العمارة تين الصغرى. تم توطين نوى الخلية الملون مع هويشت (الأزرق) بشكل حصري تقريبا داخل المجاميع على النقيض من أحادي الاتجاه و ثنائية الاتجاه الأعمدة الصغيرة، مع أساسا لا تلوين هويشت في المناطق الداخلية ( الشكل 5 ). وأكدت هذه الملاحظة ما تم الاستدلال عليه من الصور على النقيض من المرحلة: تم تقييد السكان العصبية إلى الغايات، ومحاور عصبية فقط (باللون الأحمر) امتدت التجويف من تينس الصغرى. ومع ذلك، بعد محاور عصبية عبرت المجاميع، لوحظ الهجرة الخلية على طول المسالك المحورية في التجويف الداخلي، كما لوحظ وجود نوى (الأزرق) في المناطق الداخلية في 28 ديف لمدة 2 ملم طويلة بديركتيونال الصغرى تين ( الشكل 6 ). وعلاوة على ذلك، تم العثور على سينابسين I إمونولابيلينغ (الأخضر) في جميع أنحاء الهيئات الخلية والمحاور العصبية المسالك ( الشكل 6 ). سينابسين الأول هو بروتين محطة قبل المشبكي متورطين في تنظيم الافراج العصبي ويدل على وجود محطات قبل المشبكي عندما وجدت في توزيع منقط. فقد كان يرتبط سابقا مع تشكيل نقاط الاشتباك العصبي النشطة من قبل تسجيلات خلية كاملة التصحيح 49 . تلطيخ سينابسين في المنطقة المركزية الغنية محوار عصبي من تين الصغرى هو على الأرجح مزيج من الثقب وكذلك سينابسين يجري نقلها أسفل محاور عصبية نحو محطات ما قبل متشابك. ومع ذلك، فإن وجود سينابسين بونكتا داخل المجاميع تين الصغرى تشير إلى أن هذه البنيات لديها القدرة على التواصل من خلال نقاط الاشتباك العصبي، على الرغم من أن كولوكاليزاتيون سينابسين مع بروتين ما بعد متشابك سيكون مطلوبا لمزيد من الأدلة الهيكلية لنقاط الاشتباك العصبي وظيفية. </ P>

تم تصنيعها تينس الصغرى أيضا مع الخلايا العصبية المجمعة التي ترانزدوسد مع آف تحتوي على مؤشر الكالسيوم GCaMP6f إلى مسبق التحقيق الخصائص الكهربية لهذه البنيات. هذه البنيات أعرب عن مؤشر الكالسيوم طوال طولها كله، كما هو مبين من قبل مضان في كل من المجاميع العصبية والمسالك محور عصبي ( الشكل 7A ). لاحظ أنه نظرا لإعدادات المجهر تهدف إلى تعظيم شدة في المجاميع، مضان في المسالك المحورية بدا أكثر فطاعة. تم تحليل هذه ترانسدوسد الصغرى تينس مع مرور الوقت مع المجهر مضان عالية السرعة (دون التحفيز الكهربائي الخارجي)، وتم اختيار العديد من المناطق ذات الحجم خلية من الفائدة (روي) عشوائيا في تين الصغرى ممثل لتمييز قدرة الإشارات من هذه يبني. وقد لوحظت رشقات تركيز الكالسيوم في جميع عوائد الاستثمار تقريبا، كما ينعكس مع أسوكإاتد متقلبة شدة مضان طوال الوقت ( الشكل 7B ). على وجه الخصوص، بدا مختلف روي لإظهار دورية شبه مستمرة من الزيادات تركيز الكالسيوم ( الشكل 7B ). يتم استدلال هذه التغيرات تركيز الكالسيوم ليكون نتيجة عفوية، الكامنة العمل الكامنة، إشارة الخلية داخل المجاميع الفردية، و / أو الإشارات عبر محاور عصبية من المجاميع متميزة. وهناك حاجة إلى مزيد من التحليلات لتوصيف خصائص الكهربية الكهربية من الخلايا العصبية والمحاور العصبية داخل تينس الصغرى. ومع ذلك، فإن هذه النتائج الأولية تبين أن تينس الصغرى تظهر قوية النشاط الكهربائي / خط الأساس الكهربائية.

الشكل 3
الشكل 3: مخططات ليزر قطع الجزئي جهاز تصنيع العمود و 3D المطبوعة هرمي الصغرى جيدا العفن لتجميع الخلايا. ( أ) - ( ب ) مخطط وصورة من النصف السفلي وأعلى من صفيف قناة اسطوانية، على التوالي، وتستخدم لتصنيع هيدروجيل الأعمدة الصغيرة. ( C ) مخطط وصورة من القبعات المستخدمة لعقد الجهاز معا. كل من القطع الأمامية والخلفية تشترك في نفس الأبعاد. ( D ) صورة من الجهاز تجميعها المطلوبة لافتعال الأعمدة الصغيرة. يتم تثبيت فقط اثنين من قبعات والنصف السفلي جنبا إلى جنب مع مسامير في أقل اثنين من الثقوب محاذاة (يسار). خطوط مكسورة تظهر وضع إبر الوخز بالإبر من خلال الثقوب الخمسة على كل غطاء. يتم إضافة الاغاروز السائل إلى النصف السفلي من الاسطوانات، وبعد ذلك، يتم وضع النصف العلوي (يمين) على الجهاز لقالب الاغاروز السائل في الشكل. ( E ) مخطط للقوالب 3D المطبوعة المستخدمة لجعل بدمس صفائف الدقيقة جيدا. ( F ) صور من قالب 3D المطبوعة (يسار) و بدمس صفائف الدقيقة جيدا (يمين). جميع الأبعاد هي في ملي متر (مم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: مراقبة نمو محور عصبي في تينس الصغرى من خلال التصوير المرحلة النقيض من يبني أحادي الاتجاه و ثنائي الاتجاه كدالة من أيام في المختبر . ( A ) أحادي الاتجاه 2 ملم طويلة الصغرى تينس تظهر مساحات محور عصبي تمتد تقريبا طول كامل العمود الصغير من قبل 5 ديف. ( B ) بالمقارنة مع أحادي الاتجاه تينس الصغرى، ثنائي الاتجاه 2 مم الصغرى تينس عرض معدل نمو محور عصبي أسرع. ( C ) ل 5 مم ثنائية الاتجاه الصغرى تينس، المسارات محور عصبي ملء طول العمود الصغير في 5 ديف. يتم الحفاظ على هذا العمارة على الأقل حتى 10 ديف. مقياس الحانات = 200 ميكرون./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5: ميكرو-تين الهندسة المعمارية لوحظ مع الصور متحد البؤر من إمونولابيلد أحادية الاتجاه و ثنائية الاتجاه تينس الصغرى. كانت ملطخة الخلايا لنوى الخلية (هويشت، الأزرق) والمحاور (Tuj1، الأحمر). ( A ) المرحلة على النقيض من صورة 5 مم ثنائية الاتجاه الصغرى تين (28 ديف). ( D ) - ( F ) و ( I ) - ( K ) من 5 مم ثنائي الاتجاه (28 ديف) و أحادي الاتجاه (25 ديف) تين الصغرى، على التوالي، تظهر نوى الخلية المسمى ( D )، ( I ) والمحاور ( E )، ( J )، فضلا عن تراكب ( F )، ( K ). الحانات مقياس: 500 ميكرون. الإدخال في ( A F ) و ( K ) إلى التباين الطوري ( B ) - ( C ) و البؤري ( G ) - ( H )، ( L ) - ( M ) التكبير في المجاميع العصبية و المحاور العصبية . تظهر الصور المجاميع تقتصر على نهايات تين الصغرى، في حين يمتد التجويف من قبل محاور محاور محاذاة. مقياس الحانات = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6
الشكل 6: التعبير عن سينابسين البروتين سينابتيك محطة قبل أنا في ممثل ثنائي الاتجاه الصغرى تين. كان ملطخة بناء لنوى الخلية (هويشت، الأزرق)، المحاور (Tuj1، الأحمر)، والبوتونات قبل متشابك (سينابسين الأول؛ الأخضر). ( A ) المرحلة كونترأست صورة من 2 مم ثنائي الاتجاه الصغرى تين في 28 ديف. ( D ) - ( G ) إعادة البناء متحد البؤر تظهر نوى الخلية ( D )، المحاور ( E )، بوتونس ما قبل متشابك ( F )، وتراكب ( G ) من القنوات الثلاث. تظهر صناديق التكبير الإضافية ( B ) - ( C )، ( H ) - ( I ) من الصور على النقيض من المرحلة وتراكب للمجاميع الخلايا العصبية، على التوالي. مقياس الحانات = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7
الشكل 7: نشاط الإشارات العفوية في تين-تين ثنائي الاتجاه لوحظ من خلال التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا. ( A ) فلورزنسوأكد المجهر الإلكتروني التعبير عن مراسل غمب، كما لوحظ من قبل مضان في جميع أنحاء المجاميع والمحاور. شريط مقياس = 100 ميكرون. ( ب ) تم قياس التغيرات مضان المرتبطة الاختلافات تركيز الكالسيوم دون التحفيز الخارجي في عدة مناطق من الفائدة (روي) كدالة من الزمن. الدوائر الملونة مرقمة في ( A ) تعيين هذه روي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8
الشكل 8: صور تباين الطور لأشكال الفشل الشائعة في منهجية تين الصغرى. ( A ) المجففة تماما / المجففة الاغاروز العمود الصغير نتيجة لإزالة و / أو تبخر دبس في المراحل الأولى من التصنيع. شريط مقياس = 5081؛ م. ( B ) هيدروجيل العمود الصغير مع التجويف بطانة الجدار الخارجي للبناء بسبب عدم وجود محاذاة متحدة المركز من إبرة الوخز بالإبر مع أنبوب شعري. شريط مقياس = 100 ميكرون. ( C ) تبذر الصغرى تين مع كل من المجاميع موجودة في 1 ديف. ( D ) واحدة من المجاميع سقطت من نفس العمود الصغير كما ( C ) في 3 ديف. ( E ) تين-تيون أحادي الاتجاه عند 4 ديف. ( F ) تراجعت المسالك الكلية والمحورية من العمود الصغير في ( E ) وظلت عائمة في وسط الاستزراع عند 5 ديف. شريط مقياس ل ( C ) - ( E ) = 300 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إصابة الجهاز العصبي المركزي والمرض يؤدي عادة إلى فقدان أو خلل في المسارات محور عصبي لمسافات طويلة التي تتألف من كونكتوم الدماغ، مع أو بدون يصاحبها انحطاط الخلايا العصبية. ويضاعف هذا من قبل قدرة محدودة من الجهاز العصبي المركزي لتعزيز الخلايا العصبية والتجدد. على الرغم من السعي لاستراتيجيات إصلاح مثل عامل النمو، والخلية، وتقديم المواد الحيوية كنهج الفردية أو التوافقي، وهذه التقنيات تفشل في حساب في وقت واحد لكل من انحطاط الخلايا العصبية وفقدان الاتصالات محور عصبي 14،22. هذه الثغرات في التكنولوجيا تحد من القدرة على إصلاح، وتغيير، والتحقق من الشبكات العصبية بطريقة تسيطر عليها ومستدامة. وبناء على ذلك، تم تطوير التكنولوجيا تين الدقيقة لمعالجة الحاجة إلى استراتيجية إصلاح العصبية التي، على النقيض من الأساليب الموجودة، ويسهل كلا استبدال الخلايا العصبية وإعادة بناء وصلات محور عصبي طويلة. هيئة التصنيع العسكريرو-تينس هي السقالات الحية زرع مع الهندسة المعمارية الخلوية بريفورميد التي تقترب من بناء على مستوى النظم من كتل الدماغ التي تم تصميمها خصيصا لإعادة الإعمار المستهدفة، واستبدال، وتعديل الدوائر العصبية المضيف. وتتكون هذه السقالات من السكان منفصلة (ق) من الخلايا العصبية متصلة من قبل محاور عصبية طويلة داخل التجويف الذي يحتوي على إسم من الهلاميات المائية الاغاروز أسطواني مصغرة. قد تكون هذه البنى قادرة على العمل كما التبديلات متشابك لاستبدال مسارات المفقودة وتحوير حيوي الدوائر المحلية. وبالإضافة إلى ذلك، في حالات انحطاط محور عصبي معزولة (مع الخلايا العصبية المصدر المتبقية سليمة)، قد تينس الصغرى بمثابة أدلة لتجديد محور عصبي على أساس آلية من محور عصبي تسهيل محور عصبي تجديد. قدمت هذه المخطوطة بروتوكول تلفيق لإنشاء موثوق تينس الصغرى، مع هندسة تسيطر عليها، النمط الظاهري، وخصائص وظيفية. المرحلة التباين المجهري، إمونوسيتوشيميستري، والمجهر متحد البؤر أظهرت أن تينس الصغرى المنتجة مع بروتوكول المعرض سيتوارتشيتتيور المطلوبة والتعبير عن سينابسين البروتين سينابتيك محطة قبل. وعلاوة على ذلك، تبين أن شبكات تينس الصغرى تمتلك نشاطا جوهريا للإشارات، ربما بسبب إمكانيات العمل، في غياب محاكاة خارجية. وقد تأكد هذا من وجود تقلبات شبه متزامنة في مضان المرتبطة مراسل الكالسيوم مشفرة وراثيا.

يمكن تلخيص التنمية مايكرو تين من خلال ثلاث خطوات: (1) تلفيق أنبوب هيدروجيل جوفاء، (2) إضافة حل إسم إلى التجويف من الأنبوب، و (3) البذر من المجاميع من الخلايا العصبية معزولة في نهايات الأنبوب. الأعمدة الصغيرة يمكن أن تكون ملفقة مع أنابيب زجاجية الشعرية أو مع جهاز الصغرى ملفقة تحتوي على قنوات أسطوانية. يمكن إنشاء هذا الجهاز مع أي طريقة الدقيقة الدقيقة تصنيع عالية المتاحة للمحقق. سائليتم سكب الاغاروز في قنوات الجهاز أو في أنابيب الشعرية التي تحتوي على إبرة الوخز بالإبر تركز على إنشاء هيدروجيل الأعمدة الصغيرة. بعد الاغاروز الهلام، تتم إزالة إبرة الوخز بالإبر لإنتاج التجويف أجوف. ويبرز الشكل 8 العديد من المزالق الشائعة التي تحدث أثناء التصنيع أو النمو. لاحظ أن بعض الصور المعروضة في الشكل 4 وحالة متطرفة في الشكل 8B تظهر الجزء اللمعية قريبة من جدار الاسطوانة. من أجل إنتاج سمك الجدار حتى عند استخدام طريقة أنبوب الشعرية، وينبغي عقد التجمع إبرة أنبوب في وضع مستقيم عند وضعها في اتصال مع الاغاروز، وينبغي الحفاظ على الإبرة في وسط الأنبوب. الحفاظ على التجمع إبرة أنبوب في زاوية نسبة إلى سطح الاغاروز يعزز اللامركزية من الإبرة. ومع ذلك، هذه الاحتياطات يصعب تنفيذها، والإبرة في كثير من الأحيان لا يستريح ألونز جدران أنابيب الشعرية. على العكس من ذلك، فإن الأصل الرئيسي للجهاز الصغير ملفقة هو أنه يتميز ثقوب إبرة محاذاة مركزيا مع القنوات الاسطوانية، وتعزيز مركزية كافية للإبرة والتجويف نسبة إلى القناة والعمود الصغير، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجهاز يزيد الإنتاجية من خلال تسهيل تصنيع العديد من الأعمدة الصغيرة في نفس الوقت. وعلى الرغم من الفوائد التي يوفرها الجهاز، لا يزال يمكن إنشاء شمعة خارج المركز باستخدام إبر الوخز بالإبر عازمة. تقنيات التصنيع الجزئي لها أيضا التسامح الكامن الذي يحد من فعاليتها. بشكل عام، الجفاف الصغرى العمود، والتي تظهر حالة متطرفة في الشكل 8A ، لا ينبغي أن يكون عائقا إذا اتبعت التوصيات المقدمة في جميع أنحاء البروتوكول. لاحظ أن الخصائص الفيزيائية للأغاروز المستخدمة للتخويف الخارجي قد تحتاج إلى تحسين الأنواع الفرعية العصبية البديلة، كما تحسين الخلايا العصبية القشرية(3 - 4٪) مقابل أقل (1-2٪) من تركيزات الاغاروز 10 .

ويستمر تطوير الصغرى تين مع إدخال إسم في التجويف العمود الصغير، والذي يعمل على توفير بيئة كافية للتصاق العصبية، والبقاء على قيد الحياة، ونمو. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إسم، بالاشتراك مع القيود الهندسية والمسامية المنخفضة التي تقدمها هيدروجيل أغاروس، يقيد نمو محور عصبي إلى الاتجاه الطولي لإنتاج الهندسة المعمارية المطلوبة. محتويات الحل إسم يمكن أن يكون الأمثل لنوع من الخلايا العصبية المستخدمة. على سبيل المثال، الكولاجين وحده يعزز البقاء على قيد الحياة ونمو محور عصبي في درغ الصغرى تينس، في حين أن هناك حاجة إلى مزيج من الكولاجين واللامينين للخلايا العصبية القشرية 10 . وعلاوة على ذلك، البلمرة إسم داخل العمود الصغير أمر بالغ الأهمية قبل طلاء الخلايا، كما تسليم مشترك من الخلايا مع إسم أونبوليمريزد يؤدي إلى انخفاض نيوريت أوغرأوث و فاسيكولاتيون 31 . لاحظ أنه على الرغم من ملء العمود الصغير في البداية مع الحل إسم، محتوياته بلمرة إلى هلام لينة وتميل إلى التعاقد خلال فترة الحضانة، وخلق مساحة تسمح بإدراج المجاميع الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن نؤكد أن إسم دخلت الداخلية العمود الصغير من خلال التفتيش تحت المجسام. غياب كامل و / أو جيوب المفقودين إسم يؤدي إلى عدم وجود نمو محور عصبي من المجاميع. تصنيع الدقيقة تين تتوج في البذر من المجاميع العصبية القشرية في أقصى السقالة. تم تشريح هذه الخلايا العصبية من الأجنة الفئران باستخدام الإجراءات المعروفة 48 . ويمكن الاستدلال على أن غالبية الخلايا المعزولة هي الخلايا العصبية لأن قشرة الفئران الجنينية في وقت الحمل المستخدمة لعزل يتكون من الخلايا العصبية 99٪، والمتوسطة ثقافة محددة المستخدمة في البروتوكول هو تحديد الأيض للانتشار الدبقية 49 . وبالتالي، ينبغي أن يكون هناك الحد الأدنى من التلوث الدبقية، على الرغم من تلطيخ لعلامات محددة مطلوب للتأكيد. في حين قدمت هذه المخطوطة تلفيق الصغرى تين مع الخلايا العصبية القشرية، ويمكن استخدام الخلايا العصبية من مناطق الدماغ المختلفة (على سبيل المثال، النيغرال ، المهادي، والحصين) أو مع المظاهر المختلفة (على سبيل المثال، مثيرة، المثبطة، والدوبامين) وفقا للتطبيق المطلوب و منطقة الزرع. التكرارات السابقة للبروتوكول تلفيق الصغرى تين تشارك البذر فصل الخلايا 10 ، 31 ، 32 . على الرغم من أن الهندسة المعمارية المطلوبة تم الحصول عليها باستخدام طريقة فصل، فإنه لم يتحقق في جميع الحالات. وفي كثير من الحالات، غمرت الخلايا المنفصلة المناطق الداخلية وأدت إلى عدة مجموعات من خلايا الجسم في جميع أنحاء التجويف، مع عمليات ربطها في شبكة 3D واسعةالمرجع "> 10 ، 31. الطريقة الإجمالية، من ناحية أخرى، يضمن احتواء أجسام الخلايا إلى أقصى الحدود، وبالتالي فهو جزء لا يتجزأ من نجاح التكنولوجيا الدقيقة تين ( الشكل 5 ). في الأشكال 4-6 تم تصنيعها مع المجاميع الكبيرة التي لم يتم إدراجها بالكامل، وهذا يمكن أن يؤدي في بعض الأحيان في المجاميع التي تسقط من الأعمدة الصغيرة في الثقافة، مثل الأمثلة المبينة في الشكل 8D و 8 E. لمنع هذا، يمكن أن المجاميع يتم إدراجها بالكامل داخل الداخلية العمود الصغير.إذا كان هذا الوضع يقدم نفسه حتى بعد تطبيق الاستراتيجية السابقة، يمكن تمديد فترة الحضانة الأولية لتوفير وقت كاف للتصاق الكلي إلى إسم.خلال الثقافة، والتعامل لطيف من تينس الصغرى هو وأوصت للحفاظ على سلامة التزحزح هيدروجيل والهندسة المعمارية؛ المشاكل أثناء الدقيقة Tإن التلاعب هي سبب الانحناءات التي تم الحصول عليها في محاذاة خلاف ذلك محاور المسالك ( الشكل 5 ). ومع ذلك، بعد البروتوكول المعروض في هذه المادة ينبغي أن يؤدي إلى تلفيق متسقة من تينس الصغرى مع الهندسة المعمارية العصبية / محور عصبي المتوقع، وتوزيع بوتون قبل المشبكي، والنشاط الكهربائي الجوهري.

وعلى الرغم من الوعد الذي تحظى به الشبكات الوطنية الصغرى للاتصالات (تين)، هناك تحديات متبقية قد تحد من تطبيقات هذه التكنولوجيا. وتقنية التصنيع الصغرى العمود الحالي محدودة من اللامركزية التجويف العمود الصغير، والتي قد تتسبب في عرض غير متناسقة من الإشارات الميكانيكية للخلايا (على سبيل المثال، وصلابة)، وتمزق جدار العمود الصغير والتعرض اللاحق من المسالك محور عصبي إلى الخارج، والمشاكل أثناء الزرع. على الرغم من أن استخدام جهاز الصغرى ملفقة قد تحسنت نتيجة مقارنة الأنابيب الشعرية، وارتفاع الدقة الصغرى فابريكاتيون مطلوبة لزيادة استنساخ الأبعاد لهذه البنيات. وأظهرت النتائج في هذه المخطوطة أن منهجية تين الصغرى يمكن أن تنتج موثوق السقالات الحية تتألف من الخلايا العصبية والمسارات محور عصبي التي تشبه العصبية الأم، وخاصة المسالك المحورية التي تربط مناطق الدماغ متميزة. ومع ذلك، طول تين الصغرى هو عقبة، وهذا يتوقف على طول مسار محور عصبي المضيف الذي يحتاج إلى استبداله. على سبيل المثال، الأنسجة الطعوم العصبية المهندسة (تنغس) هي استراتيجية سقالة المعيشة منفصلة التي تستخدمها مجموعة أبحاثنا لإصلاح إصابات الأعصاب طويلة للغاية. لاستبدال هذه الفجوات الطويلة، يمكن إطالة المحاور في تينغس إلى عشرات السنتيمترات من خلال تطبيق التوتر الميكانيكي المستمر في المفاعلات الحيوية الميكانيكية 1 ، 23 ، 50 . وقد تم تطبيق هذه التقنية "امتداد النمو" أيضا للتلاعب بطول العملية النجميةr تقليد هيكل مسارات شعاعي الدبقية 51 . على العكس من ذلك، فإن تكنولوجيا تين الصغرى الحالية لا تقدم حتى الآن هذا النطاق من السيطرة. والحد الأقصى طول يمكن بلوغه محدودة حاليا كم من الوقت يمكن أن تنمو المسارات محور عصبي في المختبر على أساس التقليدية المخروط النمو المخروط بوساطة. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن الجهاز العصبي المركزي لديه قدرة جوهرية لإعادة الأسلاك العصبية استجابة لمختلف المحفزات، والخلايا المزروعة لديها القدرة على دمج متشابك مع الدوائر المحلية، تقييد آخر لهذه التكنولوجيا هو أن تينس الصغرى تعتمد على مرونة من الدماغ الأصلي وقدرة الشبكات المضيفة على الاندماج وظيفيا مع بناء مزروع 52 ، 53 ، 54 ، 55 . وأخيرا، نقص الفطري في جميع النهج القائمة على زرع، مثل تينس الصغرى، هو الغزو. منذ الخلايا العصبيةعموما على مقربة من الشعيرات الدموية، أي نوع من العمليات الجراحية يمكن أن يسبب اضطراب في حاجز الدم في الدماغ، وتسرب عوامل الدم في لحمة الدماغ، والاستجابة الالتهابية الحادة (وحتى المزمن) 31 . هذه الاستجابة يمكن أن تلحق الضرر المضيف والخلايا العصبية تين الصغرى، وينفي الجوانب المفيدة لهذه التقنية. ومع ذلك، تينس الصغرى زرعها في المسار القشرية القشرية من الفئران نجا لمدة شهر واحد على الأقل وأظهرت أدلة على التكامل الهيكلي مع القشرة الدماغية المضيف 10 ، 31 . وعلاوة على ذلك، قدم منشور سابق من مجموعة أبحاثنا منهجية تمكين غرس أقل إبرة من تينس الصغرى في أدمغة الفئران 31 . في هذا النهج، تم زيادة هذه الاستراتيجية هيدروجيل التزييف لتشمل رقيقة (~ 20 ميكرون) طلاء كاربوكسيميثيلسيلولوس، والتي، على الجفاف معتدل، قدمت صلابة كافية لاختراقالدماغ دون الحاجة إلى إبرة أو دليل 31 . هذه الطريقة أقل زرع إبرة، إلى جانب مقطع صغير من الأعمدة الصغيرة، يجب تقليل الضرر إلى الدماغ أثناء وبعد إجراء زرع التجسيمي.

على الرغم من النجاح الأولي من تينس الصغرى في الجسم الحي ، فإن الدراسات المستقبلية تحتاج إلى تأكيد أن هذه التركيبات تتكامل بشكل متشابك مع الأنسجة المحلية والتحقيق في ما إذا كان يتم الحصول على الانتعاش وظيفية في نماذج إصابة الجهاز العصبي المركزي ومرض الاعصاب 10 ، 31 . على سبيل المثال، يمكن تصميم تينز الصغرى مصممة مع الظواهر خلية محددة وزرعها في مسار انحطاط المقابلة لإعادة بناء الشبكة واستعادة وظيفة. للحد من الاستجابة الالتهابية الحادة بعد زرع، قد تكون مخدر تين هيدروجيل قذيفة مع وكلاء مضادة للالتهابات والموالية للبقاء على قيد الحياة. تصنيع بديل(على سبيل المثال، الطباعة ثلاثية الأبعاد) يمكن تطويرها لتوليد الأعمدة الصغيرة هيدروجيل مع سهولة أكبر ومع ميزات أكثر دقة، بما في ذلك مركزية متسقة من التجويف واستنساخ الأبعاد. ويمكن تعديل نفس مخطط المواد الحيوية المستخدمة مع تينس الصغرى لمعالجة الأمراض المميزة الأخرى من إصابة الجهاز العصبي المركزي والمرض. على سبيل المثال، وقد وضعت مجموعتنا في وقت سابق البنايات تتألف من حزم أستروجيتيك محاذاة طوليا على طول تجويف المغلفة الكولاجين من هيدروجيل الاغاروز التي تحاكي هيكليا مسارات الدبقية شعاعي وأنبوب الدبقية لتسهيل تجديد محور عصبي وهجرة الخلايا العصبية 56 . بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج الخلايا الجذعية، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسس)، والخلايا الجذعية المحفزة المستحثة (إيبسس)، والخلايا الجذعية المستمدة من الشحوم (أسكس)، لتصنيع تينس ذاتي متناهي الصغر على أساس كل مريض إلى أكثر تشبه بشكل وثيق الهندسة المعمارية المفقودة والنمط الظاهري الخلية. هذه فوتووإعادة التعديلات من شأنها أن تزيد من قدرة تينس الصغرى لتحل محل مسارات المحطمة في الجسم الحي ، وسوف تسمح لإعادة بناء معمارية الأنسجة أكثر تطورا، ودمج الدعم الاستروجيلي و مييليناتيون محور عصبي، من بين غيرها من الميزات. ويمكن أيضا الخلايا العصبية المعدلة وراثيا أن تكون المصنفة إما زيادة العمل التجديدي من تينس الصغرى من خلال الافراج عن العوامل الغذائية أو تمكين تعديل الجهاز العصبي المركزي عن طريق التحفيز أوبتوجينيتيك من القنوات الأيونات الخفيفة بوابات 43 . يمكن أن تكون ملفقة هذه السقالات مع الخلايا العصبية استثارة أو مثبطة لتعديل متشابك التوصيلات المضيف المضيف مختل في ظروف مثل الصرع والاكتئاب وإدمان المخدرات، أو اضطرابات الألم 1 . على سبيل المثال، يمكن إنشاء تينس الصغرى التي تشكل في الغالب غابايرجيك أو المشابك غلوتاماترجيك لقمع أو تحفيز، على التوالي، حتى أو إلغاء تنظيم المسارات عن طريق التكامل متشابك و / أو عن طريق العصب السائبةأوترانزميتر الإفراج. والأهم من ذلك، أن مثل هذه التركيبات التضمينية القائمة بذاتها من الناحية النظرية ستكون مستجيبة على أساس التغذية المرتدة للشبكة المضيفة 1 . وبالمثل، يمكن تطبيق الشبكات الصغرى (تينس) الصغرى على أنها واجهات بين الدماغ والحواسيب (بسي)، حيث تعمل شبكات تينس الصغرى ذات البصريات البصرية على أن تكون وسيطة بين الدماغ وأجهزة تحفيز أو أجهزة غير عضوية. هذا التطبيق يمكن أن يكون بديلا ل بسيس ميكرولكترود، والتي تفتقر إلى استهداف الخلايا محددة والاستقرار الميكانيكي وتسببت في ردود التهابات، وتشكيل ندبة الدبقية، وهجرة الخلايا العصبية أو فقدان عندما توغلت في الدماغ 57 ، 58 .

كما هو الحال في سرير اختبار المختبر ، يمكن تينس الصغرى توفر منصة قوية لدراسة علم الأعصاب و الفيزيولوجيا الكهربية، بمثابة نماذج بيوفيديك من الجهاز العصبي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يبني 3D بمثابة أسرة اختبار لاستراتيجيات العلاج عند استخدامها كما جائع العصبيةنماذج الجفاف والمرض 59 . كما يبني 3D، تينس الصغرى هي قادرة على محاكاة البيئة في الجسم الحي ، والذي يتميز خلية معقدة خلية والتفاعلات إسم في جميع الاتجاهات المكانية التي لا يمكن تمثيلها بدقة في مستو الثقافات 42 و 60 و 61 و 62 و 63 ، 64 ، 65 . في الواقع، وقد أثبتت العديد من التحقيقات أن نوع البيئة أمر بالغ الأهمية للخلايا لتقديم التشكل، وانتشار، والهجرة، والتعبير الجيني، والتمايز، والإشارات المعروضة في الإعداد الأصلي 60 . أوجه التشابه بين بيئة 3D من هذه السقالات والدماغ نفسها تكملها درجة من السيطرة التي توفر هذه البنيات على بيأرهم الفيزيائية والكيميائية الحيويةأوبيرتيز 42 . وهذا يسمح للهندسة الصغرى تينس مع مجموعات مختلفة من الإشارات الميكانيكية، هابتوتاكسيك، والكيميائية لدراسة تأثير هذه العظة، بشكل فردي أو تآزري، على البقاء على قيد الحياة العصبية، والنضج، وتمديد محور عصبي، سينابتوجينيسيس، و ميكانوترانسدكتيون 32 ، 42 ، 63 . وعلاوة على ذلك، فإن مرونة تصميم هذه التقنية هندسة الأنسجة الدقيقة يسمح لبناء السقالات الحية التي تحاكي ميزات أخرى من أنسجة المخ، مثل عمودي، هيكل مقصورة من القشرة المخية الجديدة، التي امتدت من قبل محاور عصبية من كونكتوم، لزيادة قوة هذا النظام كمنصة في المختبر لدراسة الدماغ 65 . كما منصات التحقيق، تستفيد تينس الصغرى من الإعداد تسيطر على نماذج نموذجية في المختبر ، وتوافر توسعية المعلمات تصميم في الأنسجة أرونهج جينيرينغ، وزيادة الفسيولوجية والمرضية-ملاءمة المنصات 3D لتصبح سرير الاختبار المثالي للمضي قدما المعرفة العصبية الحيوية. عدد لا يحصى من الاتجاهات المستقبلية لهذه التكنولوجيا يجسد براعة الصغرى تينس. وقد أثبتت هذه المخطوطة أن بروتوكول تين الصغرى يمكن أن تنتج بشكل موثوق السقالات الحية المهندسة الأنسجة التي تحاكي السمات الحاسمة من الدماغ العصبي لتقديم رؤى جديدة في الظواهر العصبية الحيوية، بما في ذلك التنمية والمرض، وعمليات الإصلاح. هذه التركيبات قد تتكامل أيضا بشكل متشابك مع الأنسجة الأصلية لإعادة بناء مساحات المادة البيضاء التالفة، واستبدال الخلايا العصبية المفقودة، وتعديل مسارات ديسريغولاتد التالية إصابة الجهاز العصبي المركزي والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقدم الدعم المالي من قبل المعاهد الوطنية للصحة U01-NS094340 (كولين)، T32-NS043126 (هاريس)، و F31-NS090746 (كاتيار))، ومؤسسة مايكل J. فوكس (برنامج خط العلاج العلاجي # 9998 (كولين))، والرابطة الوطنية للعلوم (زمالات بحوث الدراسات العليا دج-1321851 (ستروزينا وأديوول))، وإدارة شؤون المحاربين القدامى (ر & D استعراض ميرت # B1097-I (كولين))، والجمعية الأمريكية من الجراحين العصبية وكونجرس الجراحين العصبية (2015-2016 زمالة كودمان في نيوروتراوما والرعاية الحرجة (بتروف))، والبحوث الطبية الجيش الأميركي وقيادة العتاد (# W81XWH-13-207004 (كولين) و W81XWH-15-1- 0466 (كولين)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16, (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67, (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27, (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31, (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48, (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21, (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26, (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11, (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6, (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106, (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6, (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11, (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3, (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20, (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3, (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14, (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23, (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116, (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24, (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80, (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25, (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44, (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5, (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics