神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

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Summary

この原稿では、微細組織工学ニューラルネットワークの作成について詳しく述べる。三次元のミクロンサイズの構造物は、管状ヒドロゲルに包まれた凝集ニューロン集団にまたがる長い整列した軸索路からなる。これらの生存足場は、神経回路を再構成または調節するための機能的中継として、または灰白色物質の神経解剖学を模倣するバイオフィリックテストベッドとして役立ち得る。

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Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

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Abstract

機能回復は、中枢神経系(CNS)内での損傷または疾患誘発性変性の後に、抑制的環境および神経発生のための限られた能力のためにほとんど起こらない。私たちは、損傷したCNS内のニューロンおよび軸索経路の消失に同時に対処するための戦略を開発している。この原稿では、ミクロ組織工学ニューラルネットワーク(マイクロTENNs)、ニューロンと、直径が数百ミクロンであり、センチメートルに伸びる予備形成されたヒドロゲルシリンダーの細胞外マトリックス(ECM)内腔にまたがる配列された軸索路からなる移植可能な構築物長さで。ニューロン凝集体は、三次元包囲体の極端に区切られ、軸索突起によって広がっている。マイクロTENNは、脳結合サイト構造の側面をエミュレートし、潜在的にネットワーク置換の手段を提供する、CNS再構成のための戦略として独特に準備されている。ニューロナル凝集体は宿主組織とシナプス結合して、欠損または損傷した回路を修復および/または調節するための新しい機能的な中継を形成し得る。これらの構築物はまた、細胞遊走および軸索経路探索のための発生機構を利用して、再生状態に基づいて相乗的な構造的および可溶性キューを提供することができる、前駆再生的「生きた足場」として作用し得る。微小TENNは、液体ハイドロゲルを長手方向に中心の針を含む円筒形の鋳型に注入することによって製造される。ヒドロゲルがゲル化したら、針を除去し、中空マイクロカラムを残す。内腔にECM溶液を添加して、ニューロン接着および軸索伸長に適した環境を提供する。解離したニューロンは、マイクロカラムの一方または両方の端部内で正確な播種のために機械的に凝集される。この方法論は、脳の神経解剖学の特徴を再現する可能性のある長期間突出した軸索路を有する自己完結型の小型構築物を確実に産生する。シナプスイム非標識および遺伝的にコード化されたカルシウム指標は、マイクロTENNが広範なシナプス分布および固有の電気活性を有することを示唆している。したがって、マイクロTENNは、脳経路の標的化された神経外科的再建のための有望な戦略であり、インビトロで神経生物学的現象を研究するためのバイオフィジックモデルとして適用されてもよい。

Introduction

外傷性脳損傷(TBI)、脊髄損傷(SCI)、脳卒中、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの中枢神経系(CNS)の障害および疾患の共通の特徴は、軸索経路および神経細胞の切断である損失1、2、3、4、5、6。例えば、虚血性脳卒中が治療されなくなると、軸索が1分間に軸索7マイルの速度で失われると推定される5 。米国だけで約170万人が毎年経験しているTBIの場合、初期の損傷が長期の神経変性状態を引き起こすため、軸索変性は外傷後数年間続くことがあります4 。これらの有害な影響をさらに悪化させるCNSは、再生のための都市1、7、8、9。傷害後、遠方の標的への誘導指向の欠如、神経突起伸長を妨げるミエリン関連阻害剤の存在、および反応性星状細胞によるグリア瘢痕の形成8,10,11,12を特徴とする阻害環境が生じる。グリアの傷跡は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのような分子が軸索の伸長を妨害する分子で、再生に対する生化学的および物理的障壁として働く8,11。さらに、成人CNSにおいて神経幹細胞が見出されているにもかかわらず、ニューロン新生の一貫した証拠が嗅球、海馬顆粒周囲領域、および脊髄13,14の中心管を含むが、これらに限定されない。これらの障害は、傷害または疾患後の失われたニューロンおよび白質構造の機能的回復を妨げ、しばしばこれらの状態の人生の変化および長期間の影響をもたらす。

成体CNSにおける再生能力の欠如にもかかわらず、十分な環境的合図が宿主ニューロン15,16,17,18に提示される場合、軸索再生が可能であることが実証されている。研究者らは、成長因子( 例えば、神経成長因子、上皮増殖因子、グリア依存性成長因子、および神経栄養因子-3)および可塑性および軸索再生を刺激する他の誘導分子を送達し19,19 。これらの研究は、成人軸索が成長因子に応答することができることを確認したが、これらの戦略は、血液脳関門の低透過性および再生を促進するのに必要な特定の空間的および時間的勾配によって制限される14,18,19。他のアプローチは、CNSニューロンにおける再生関連転写因子の過剰活性化に依存してきた。例えば、Stat3転写因子の過剰発現は、視神経20における軸索再生を刺激した。それにもかかわらず、転写因子の生体分子送達および過剰発現の両方が、失われたニューロン集団を置換することに失敗する。細胞ベースの戦略は、主に、神経幹細胞(NSC)をCNSに移植することに中心を置いており、CNSニューロンを置換するそれらの能力を利用し、栄養因子を放出し、損傷後に起こる神経発生の試みを支持する。それにもかかわらず、移植された神経細胞が生存し、宿主と一体化し、損傷領域6,14,17,21に空間的に制限されたままである妨げられた能力を含む、このアプローチを妨げる挑戦が依然として強く残っている。さらに、細胞送達だけでは、損傷または失われた軸索経路の細胞構造を回復することができない。細胞および薬物/化学物質の送達戦略に直面する問題に対処する別のアプローチは、これらのアプローチを生体材料14,22,23の使用と組み合わせることである。ヒドロゲルなどの生体材料は、細胞外マトリックス(ECM)の生化学的および物理的特性を模倣することができ、細胞送達を助け、損傷部位内の保持、および制御放出を伴う成長因子および他の生物活性分子の送達22 。これらの生体材料に基づく戦略の魅力的な特徴 、足場を病変領域24,25,26,27,28,29,30に移植した後のin vivo軸索再生の証拠をもたらした。しかしながら、無細胞生物材料戦略は、失われたニューロン集団を置換するものではない。ニューロン、神経膠またはニューロン前駆細胞の送達媒体として使用される場合、生体材料は、長距離軸索ネットワークを再構成することができない。 CNS傷害および疾患に関連する軸索経路変性およびニューロン損失の両方に対処するアプローチを開発する課題は、sup class = "xref"> 31。

私たちの研究グループは以前、アガロースヒドロゲル-ECMマイクロカラムの一端または両端に制限されたニューロン細胞体からなる「生きた足場」の一種である移植可能なマイクロ組織工学ニューネットワーク(マイクロTENN)の開発を報告したこの三次元(3D)包帯1,10,31,32の内部全体にわたって伸びている整列した軸索路を有する。この技術と以前のアプローチとの主な違いの1つは、マイクロTENNの細胞構造がインビトロで完全に作製され、その後に33,34,35,36,37,38 sup class = "xref"> 39,40,41。 インビトロでの作製は、細胞の表現型および配向、機械的/物理的特性、生化学的キューおよび外因性因子の広範な空間的および時間的制御を提供し、移植後のこれらの足場の宿主との統合に有益である41,42 。マイクロTENNは解剖学的にインスピレーションを受けています。なぜなら、それらは脳の神経機能を模倣し、脳の別個の機能領域を橋渡しするものと同様の軸索路を示すからです( 図1A )。したがって、この戦略は、病変領域への移植後に失われた白質路およびニューロンを物理的に置き換えることができる可能性がある。この技術はまた、放射状グリア細胞および先駆軸索によって形成される「天然の生存足場」が細胞のための経路探索ガイドとして作用する発達メカニズムによっても刺激される脳室下領域からの移動および軸索伸長、それぞれ43 。これらのメカニズムは、神経細胞の移動および軸索介在軸索伸長による軸索再生のための生きている経路を提示することができるマイクロTENNの整列した軸索領域に再現される( 図1C43 。さらに、この戦略は、マイクロTENNニューロンとネイティブ回路との間のシナプス統合を利用して、機能的回復に寄与する可能性がある新しいリレーを形成する( 図1B43 。シナプス形成能力はまた、このアプローチに、ネットワークフィードバックに従ってCNSを調節し、宿主組織に応答する能力を付与し得る。例えば、生体スキャホールド中のオプトエレクトロニクス的に活性なニューロンは、シナプス相互作用を介して宿主ニューロンを調節するように刺激され得る( 図1D )。

さらに、生体材料に基づく管状構造物マイクロTENNの作用は、細胞接着、成長、神経突起伸長およびシグナル伝達のための適切な環境を提供する一方で、構築物の小型寸法は潜在的に最小侵襲移植を可能にし、脳への徐々に統合するための部分的に隔離された微小環境を提供する。実際、最近の刊行物は、ラットの脳への移植後に神経経路を模倣するマイクロTENNの可能性を実証している。定位固定マイクロインジェクション後、我々は先に、マイクロTENNニューロン生存、軸索管構造の維持、及びインビボで少なくとも1ヶ月までの宿主皮質への神経突起伸長の証拠を報告した10,31。さらに、シナプシンによる標識は、天然組織とのシナプス統合の組織学的証拠を提供した10,31。全体として、マイクロTENNは、損傷した組織を再構築し、調節するために失われたニューロンを置換すること、CNSを宿主回路とシナプス的に統合すること、失われた軸索の細胞構造を回復すること、および場合によっては再生軸索に適切な経路探索の手がかりを提供することによって、

図1
図1:マイクロティッシュエンジニアリングニューラルネットワーク(マイクロTENN)の開発の原則とインスピレーションA )Micro-TENNは、機能的に異なる領域が、一方向(赤、緑)または双方向(青)の様式で長い整列した軸索路によって連結されている脳結合細胞(紫)の細胞構造を模倣する。一例として、微小TENNは、皮質および神経突起の経路または嗅内皮質から海馬への有孔経路(Struzyna et al。 、2015に適合)に失われた接続を再構成することができる1 。 ( B )単方向の図1および双方向マイクロTENN(それぞれ赤色および青色)を宿主回路(紫色)とシナプス的に統合して、病変の両端間の機能的中継として機能する。 ( C )マイクロTENNが相互作用する標的に向かって軸索を促進して宿主軸索(紫色)を再生するためのガイドとして機能する一方向性マイクロTENN(緑色)の軸索路図。 ( D )興奮性または抑制性ニューロンとのシナプス統合を利用して、神経調節物質としてのオプトジェネティックに活性なマイクロTENNSの使用の概念図(下)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

現在の原稿は、胚由来の大脳皮質ニューロンを用いてマイクロTENNを作製するために利用される方法論を詳述している。特に、マイクロTENNは、他のタイプの神経細胞で作製することができた。 ex十分に、成功したマイクロTENN開発の最初の報告は背側根神経節(DRG)ニューロンを特徴とした32 。ヒドロゲルマイクロカラムは、カスタムメイドのレーザーカット円筒状チャンネルアレイまたは毛細管(これはともに整列した鍼針を含む)に液体アガロースを添加することによって生成することができる( 図2A )。ニードルは内腔を形成し、マイクロカラムの内径(ID)を決定する一方、毛細管IDおよびレーザー切断装置内のシリンダーの直径は構造体の外径(OD)を決定する。 ODおよびIDは、デバイス/キャピラリーチューブおよび鍼針の異なる直径をそれぞれ選択することによって、所望の用途に応じて選択することができる。マイクロカラムの長さも変えることができる。今日まで、我々は、長さ20mmまでのマイクロTENNの構築を報告しており、より長い時間を積極的に追求している。アガロースゲルおよび鍼n後eedlesを除去し、一般にI型コラーゲンおよびラミニンからなるECM溶液を構築物の内腔に添加する( 図2C )。 ECMコアは、ニューロン細胞接着および軸索伸長を支持する足場を提供する。最初に、解離した細胞懸濁液10,31,32を用いて、初代ラット皮質ニューロンをマイクロカラムに播種した。しかしながら、このアプローチは、全ての場合において標的細胞構造を生成せず、これはマイクロカラムの端部に限定された神経細胞体として定義され、中心管腔は純粋に整列した軸索管で構成された。それ以来、強制的なニューロン凝集法(Ungrin らのプロトコールに基づくプロトコル)を使用することにより、理想的な構造( 図2B )のマイクロTENNのより信頼性の高い一貫した作製が可能になった。電流の説明に加えてこの記事では、最終的な標的細胞構造だけでなく、経時的な軸索管の形成を示すマイクロTENNの代表的な位相差および共焦点画像を示す。この原稿はまた、プロトコルの注目すべき側面と、残りの課題と、マイクロTENN技術の将来の方向性を拡大する予定です。

図2
図2:3段マイクロTENN製作プロセスの概略図A )アガロースヒドロゲルの開発:(i)最初に、小径の針( 例えば直径180~350μm)をカスタムメイドのレーザーカットモールドまたはキャピラリーチューブの円筒チャネルに挿入する。 、直径380~700μm)。次のステップでは、DPBS中の液体アガロースを円筒形チャネルまたは毛管に導入する。 (ii)アガロースゲル後、針を外し、金型を解体して中空アガロースマイクロカラムを得る。 (iii)これらの構築物を滅菌し、DPBSに保存する。 ( B )一次ニューロン培養および凝集法:(i)ニューロン凝集は、12ウェル培養プレートのウェルに適合する、3D印刷された鋳型から鋳造された角錐マイクロウェルアレイにおいて行われる。 (ii)Micro-TENNには、18日目のラットの胎児の脳から解離した初代ラットニューロンが含まれる。トリプシン-EDTAおよびDNase Iによる組織解離に続いて、1.0〜2.0×10 6細胞/ mLの密度を有する細胞溶液を調製する。 (iii)この溶液12μLを角錐マイクロウェルアレイの各ウェルに移す。これらのマイクロウェルを含むプレートを遠心分離して細胞凝集体を生成する。 (iv)これらをマイクロカラムに播種する前に一晩インキュベートする。 ( C )ECMコア作製および細胞播種:(i)細胞播種の前に、1mg / mLのI型コラーゲンおよび1mg / mLを含有するECM溶液ラミニンをマイクロTENNの内部に移し、重合させる。 (ii)一方向性または双方向性のマイクロTENNが製造されているかどうかに応じて、凝集体をマイクロカラムの一方または両方の極端に置く。 (iii)接着を促進するためのインキュベーションの期間の後、マイクロTENNを、補充された胚ニューロン基底培地で満たされたペトリ皿で培養する。 (iv)培養3〜5日後、最終的なマイクロTENN構造は、その長さに及ぶ軸索路を有するマイクロカラムの極端に細胞凝集体を示すはずである。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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Protocol

動物を含むすべての処置は、ペンシルバニア大学の機関動物用ケアおよび使用委員会およびマイケルJ.クレセンツ退役軍人医療センターによって承認され、NIH公衆衛生サービス政策のヒューマンケアおよび実験室使用に関するガイドラインに従った動物(2015年)。

1.アガロースヒドロゲル(マイクロTENNの無細胞成分)の開発

  1. アガロース溶液調製
    1. バイオセーフティキャビネット内で、20mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を2枚の10cmペトリ皿に移すことにより、マイクロカラム用のリザーバーを準備する。熱いビーズ滅菌器で細かい鉗子とマイクロアルペルを滅菌します。
    2. アガロース3gを秤量し、バイオセーフティキャビネット内の無菌ビーカーに移す。 3%重量/体積(w / v)の最終濃度のために100mLのDPBSを加える。きれいな磁気棒を入れて、ビーカーをアルミで覆うnum箔。
    3. ホットプレート/スターラーで100℃でビーカーを暖め、120〜200rpmで攪拌してアガロースを完全に溶解させます(溶液は曇りから透明に変わります)。その後、加熱と攪拌を続けてゲル化を防ぎ、必要に応じて加熱温度を変えて、アガロースを燃焼させないようにしてください。
      注記:レーザ切断装置とキャピラリチューブの両方での製造は、下のセクション1.2と1.3にそれぞれ示されています。いずれかのサブセクションに記載されている手順を完了した後、サブセクション1.4に進みます。両方のマイクロカラムの製造方法では、アガロースが冷却するにつれて急速に凝固するので、液体アガロースを迅速に添加します。次のいずれかの手順でオートクレーブで滅菌する場合は、ガラス器具に適用される標準条件を使用してください。
  2. レーザーカット装置を用いたマイクロカラムの作製
    注:レーザー切断装置は、市販のCO 2レーザーカッターを使用して透明アクリルから切断されています。ファブリレーザ切断による構造およびデバイスのカチオンは、一連の工学および研究アプリケーション45,46,47について十分に文書化されている。この金型( 図3 )は、直径が398μm、長さが6.35mmの5つの円筒状チャネルのアレイからなる。これらの円筒状アレイは、その長さに沿って、下半分(長さ:25.4mm、幅:6.35mm、高さ:6.0mm)と上半分(長さ:31.5mm、幅:6.35mm、高さ:12.7mm ( 図3Aおよび3Bにそれぞれ示す)。 2つの半分は、 図3C (長さ:31.5mm、幅:6.35mm、高さ:12.7mm)で観察された前後のキャップによって互いに締め付けられ、上下の2つの穴に一致する4つの位置合わせ穴を特徴とするねじ止めするとすべての部品を一緒に固定するのに役立ちます。これらのキャップはまたinc円筒形の溝と同心の5つの孔があり、そこに鍼針を挿入してマイクロカラムの内腔を形成することができる。
    1. 図3に示すデバイスをアルミホイルで覆い、オートクレーブで滅菌します。前部と後部のキャップを下半部のみに合わせ、2つの#4-40ネジとナット(ネジ径:3.05 mm)で3つの部分を下の位置合わせ穴に固定して、 図3Dに示すように装置を組み立てます。
    2. 装置の前部または後部キャップの針の穴に針(直径180μm、長さ30mm)を完全に挿入します( 図3D )。マイクロピペットを用いて、下半分に十分な液体アガロース(5つのチャネルについて約1mL)を注ぎ、各円筒状チャネル半分を完全に満たす。
    3. 直ちに、デバイスの上半分を下半分に置き、しっかりと収まるまで圧力をかけます円筒形の溝を完成させるための場所(キャップ​​と頂部ピースとの間の摩擦は、後者を適所に維持する)。アガロースを添加した後、室温で約5分間放置して、デバイスのチャネル内部でゲル化させる。
    4. 装置のキャップの各穴から針を手動で取り出します。スクリューを取り外し、2つのキャップと上半分を下半分の片から手動で分離します。下半分の部分は、後者がヒドロゲルマイクロカラムを保持します。
    5. 細かい鉗子を使用して、下半分の部分の溝からマイクロカラムを静かに取り出し、予め調製したDPBSを含むペトリ皿に入れる(ステップ1.1.1)。マイクロカラム製造の別のラウンドのためにデバイスを再利用する。 1.4節に進んでください。
  3. キャピラリーチューブを用いたマイクロカラムの作製
    1. ガラスキャピラリーチューブ(直径398.78μm、長さ32 mm)をバイオセーフティキャビネットの内部に移す。手動で壊す長いチューブを2.0~2.5cmの断片に置き、各断片に1本の鍼刺入針(直径180μm、長さ30mm)を完全に挿入する( 図2A )。
    2. 1mLの液体アガロースをビーカーから空のペトリ皿の表面に移す。キャピラリーチューブと導入されたニードルを保持し、チューブの一端を液体アガロースプールに接触させて毛細管作用で充填します。毛細血管の上昇を促進するためにチューブを撹拌する。
      注:キャピラリーチューブに液体アガロースを充填してください。その後、これらのマイクロカラムを所望の長さに応じてより小さな構造に切断することができる。アガロースが冷却して急速にゲル化するので、1mLのアガロースプールは典型的には1本のチューブにのみ使用され、さらなる毛細管現象を防止します。
    3. 液体が上昇しなくなったら、毛細管をプールから取り出し、ペトリ皿の表面に水平に置きます。チューブ内にアガロースゲルを入れるために5分間待つ</ li>
    4. 親指と人​​差し指をチューブの両側に置き、押してください。もう一方の手で、親指と人差し指を使って針を素早く引っ張って、マイクロカラム自体がチューブから滑り落ちないようにします。キャピラリーチューブに30ゲージの針を挿入して、マイクロカラムをDPBSを含む皿にゆっくりと押し込みます(ステップ1.1.1)。
  4. マイクロカラムのトリミングと滅菌
    1. 細かい鉗子を使用して、DPBSから空の皿に微量に1つのマイクロカラムを移す。乾燥を防ぐためにマイクロピペットを用いて10μLのDBPSをマイクロカラム上部に添加する。ビジュアルガイダンスのために後者の料理をステレオスコープの下に置きます。
      注記:プロトコール全体を通して、マイクロカラム乾燥または脱水とは、これらの構築物の典型的な、水和した外観と視覚的に区別できる、くずがついた構造の獲得を指す。脱水されたマイクロカラムはペトリ皿の表面にしっかりと付着し、c水晶体は鉗子で操作された後に表面を横切ってスライドする傾向があるのに対して、容易に動かすことができる。完全に乾燥したマイクロカラムの位相差画像を図8Aに示す
    2. マイクロカラムでマイクロカラムをトリムして、所望の長さ(ここでは2〜5mm)に短くします。細かい鉗子でトリムマイクロカラムをステップ1.1.1で準備した他のDPBSペトリ皿に移す。
    3. 作製したマイクロカラムごとにステップ1.4.1と1.4.2を繰り返します。
    4. DPBS含有ペトリ皿中のマイクロカラムを紫外線(UV)光下で1時間滅菌する。 ECM添加および細胞プレーティングの前に4℃でペトリ皿を保存する。

2.一次ニューロン培養および強制細胞凝集法

  1. ピラミッド型マイクロウェルアレイの作製
    注:このセクションでは、円筒形のベース(直径:2.2 cm、高さ:7.0 mm)からなる3D印刷モールドを採用しています図3Eに示すように、3×3のアレイに組織化された、頂部に9つの四角ピラミッド(側部長さ:4.0mm、傾斜角:60°)を有する。市販の3Dプリンタを使用する添加剤製造プロセスは十分に文書化されている。コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して型を設計することができる。得られたデザインファイルは、3Dプリンタ用のツールパスにデジタル変換されます。各プリンタには異なる仕様があり、3Dプリンタの設定と操作の手順はそれに応じて異なります。
    1. 3/32 "のドリルビットを使用して、10cmのペトリ皿の蓋を中心に、4×4アレイ(側面長さ:4cm、穴の分離:1cm)に16穴を穿孔する。 27gのポリジメチルシロキサン(PDMS)と3gの硬化剤(1:10の比)を計量するペトリ皿の底部片。マイクロスパーテルで攪拌して、剤を均一に分散させる。
    2. PDMS /硬化剤を穿刺した蓋で覆う。ホースの一端を真空に接続する口の直径10cm、茎の長さ3cm、茎の直径1.5cm)の茎に他端を挿入する。
    3. 1 mLのピペットバルブの上部にある3/32インチのドリルビットで開口部を作り、1,000μLのマイクロピペットチップを開口部に挿入して(尖った端を上にして)、バルブとチップをホースに入れて引っ張りますバルブがホースを漏斗のステム内に密封するまで、ホースを上方に押し上げる。
    4. 漏斗を穿刺した皿の蓋の上に置き、頑丈なサポートでホースを固定します。真空バルブを5分間開いて吸引し、表面に気泡を持ってきてください。
    5. バルブを閉じ、漏斗を取り外し、ペトリ皿をヒュームフードの表面に約3回当てて、残りの気泡を破裂させます。
    6. ピラミッドを上向きにして、12ウェル培養プレートの各ウェルにピラミッド型の3D印刷モールドを置く。金型の上にPDMS /硬化剤を注ぎます彼はプレートがいっぱいです。 12ウェルプレートをその蓋で覆い、60℃で1時間オーブンに移して乾燥させる。
    7. 各PDMSマイクロウェルアレイ( 図3F )をマイクロスパチュラでプレートから注意深く取り外す。 PDMSアレイをアルミホイルで覆い、オートクレーブで滅菌します。バイオセーフティキャビネット内で、1つのマイクロウェルアレイを12ウェルプレートの各ウェルに挿入します( 図2B )。
  2. ラット胎仔からの皮質ニューロン単離
    1. バイオセーフティキャビネット内の4〜6個の10 cmペトリ皿(各解剖された組織ごとに1個)に〜20 mLのハンクス平衡塩類溶液(HBSS)を加えます。これらの料理を解剖フードに移し、氷上に置きます。マイクロビーズ、はさみ、鉗子などの解剖器具をホットビーズ滅菌器で滅菌します。
    2. プレ - ウォーム胚ニューロン基底培地+ 2%無血清サプリメント+ 0.4mM L-グルタミン(ここでは「培養培地」と呼ばれる)r)および0.25%トリプシン+ 1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で37℃で培養した。デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)Iを室温に置くことにより解凍する。 HBSS中0.15mg / mLのDNAseI溶液1.5mLを調製し、氷上で溶液を維持する。
    3. 二酸化炭素の吸入により妊娠した妊娠18日目のラットを安楽死させ、断頭により死亡を確認する。カーカスを滅菌した切開フードに移し、腹側を上にして置く。 70%エタノールで腹部を完全にすすぐ。
    4. 子宮を開き、ハサミで羊嚢から胎児(通常〜11)を取り出し、冷たいHBSSを含むペトリ皿に鉗子で移します( 48を参照) 。ステレオスコープの下に冷却(-20℃)の花崗岩ブロックを置きます。このコールドブロックの表面にペトリ皿を置き、切開処置中のHBSSの低温を保つ。
    5. HBSSを振り回して子犬を洗い流し、次の清潔な料理に移しなさいHBSSを含む。ステレオスコープと解剖器具の助けを借りて、胎児の頭部、大脳半球および皮質を順次除去し、各切開部48の後に鉗子で各組織​​を新しいHBSS充填皿に移す。
    6. パスツールピペットで皮質のみを吸引し、組織を滅菌15 mL遠心チューブに入れます。他の解剖された組織を捨てる。血清ピペットを用いて5mLのHBSSを連続的に添加して除去することにより、皮質を3回すすぐ。チューブを使用しないときは氷上に置きます。
    7. Pasteurピペットで皮質を、予め加温したトリプシン-EDTA(5mLのトリプシン-EDTAに対して4-6皮質)を含む15mLチューブに移す。手動でチューブを一度撹拌し、37℃に置く。 3分ごとにチューブを反転させて、組織の凝集を防ぐ。
    8. パスツールピペットで組織を除去し、清潔な15 mL遠心分離機に移して約10分後にトリプシンへの曝露を停止するチューブ。 0.15 mg / mL DNase I溶液(1.5 mL)をピペットでチューブに加えます。
    9. パスツールピペットを使用して、手動で組織塊を壊してから、溶液が均質に見え、液体中に組織片が残らなくなるまでボルテックス(約30秒)します。溶液を完全に均質化することができない場合は、不溶性断片をパスツールピペットの先端に引っ張って抽出する。
    10. ステップ2.2.9で得られた均質な細胞溶液を200 xgで3分間遠心分離する。ペレット細胞を妨害しないように注意しながら、パスツールピペットで上清を除去する。血清学的ピペットおよびボルテックスを含む培地2mLを添加して、細胞を再懸濁する。
    11. 血球計算器を使用してステップ2.2.10で調製した溶液中の細胞の数を数える。予想される収率は3.0〜5.0×10 6細胞/皮質半球である。 1.0〜2.0×10 6 cells / mLの密度で培養液中の細胞懸濁液1 mL以上を調製する。
  3. ニューロン細胞凝集体の形成
    1. マイクロピペットを用いて、PDMSアレイ(ステップ2.1.7のプレートに置かれた)の各マイクロウェルに1.0〜2.0×10 6 / mLの細胞懸濁液12μLを加える。
      注:細胞濃度は、より高い濃度でより大きな凝集物を生じるので、マイクロカラムIDおよび所望の細胞凝集体サイズに応じて調整することができる。
    2. プレートを200 xgで5分間遠心分離して、マイクロウェルの底に細胞を凝集させます( 図2B )。慎重に〜2mLの培地を各PDMSアレイの上部に加えて、播種したすべてのマイクロウェルをカバーし、凝集した細胞を乱さないように注意してください。
    3. 細胞がウイルスベクターで形質導入されない場合は、プレートを37℃、5%CO 2で12〜24時間インキュベートし、次にセクション3に進んでください。凝集物が形質導入される場合、インキュベーションをスキップしてセクション2.4 。
  4. トランカルシウムシグナル伝達を観察するためのウイルスベクターによる誘導
    注意:これらのステップは、遺伝的にコード化されたカルシウム指示薬(GECI)を含むウイルスベクターでニューロンを形質導入するために行われる。この論文に示された結果は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン(CaM)、およびM13ペプチドからなる高速動力学を有するGECIであるGCaMP6fを有する市販のアデノ随伴ウイルス(AAV)(血清型1)ヒトシナプシンIプロモーターによって駆動される。ウイルスベクター溶液は、ストック溶液の濃度に応じて、形質導入の前に滅菌DPBSで希釈する必要があります。細胞の健康/形態およびGCaMP6fシグナル強度は、ある範囲のベクター濃度について経時的に観察されなければならない。この最適化手順は、各研究者が独自の細胞培養に適した力価を決定するために実施する必要があります。典型的なGCaMP6f発現時間は、stにおいて行われたインキュベーション中に起こる形質導入の7〜8日後であるep 2.4.2。
    1. マイクロピペットを用いて、必要な量のウイルスベクター溶液(凝集物あたり約3.0×10 9ゲノムコピーの最終濃度)を培地に加え、凝集物を覆う。ゆっくりピペットで上下に動かし、ベクター溶液が培地全体に均一に分散されるようにします。
    2. GCaMP6fのウイルス形質導入を可能にするために、37℃および5%CO 2で24時間、播種したピラミッドマイクロウェルでプレートをインキュベートする。

3.マイクロTENNsの細胞成分の開発

  1. ECMコア製造
    1. 凝集培養の後、ECM溶液を調製するために、マイクロ遠心チューブ中でI型コラーゲンおよびラミニンを培養培地(それぞれ1mg / mLの濃度)に添加する。室温でステップ3.1.2-3.1.4を実行するが、使用しないときは氷上でECMを維持して、早すぎるゲル化を防ぐ。
    2. リットマス紙に1~2μLを移して初期pHを確認し、必要に応じて1N水酸化ナトリウム(NaOH)および/または1N塩酸(HCl)をECMに添加してECM溶液のpHを調整し、 pHが7.2-7.4になるまで繰り返す。気泡の発生を避けながら上下にピペッティングすることにより、ECM溶液の均質化を確保する。
    3. ステップ1.4.3の皿から滅菌鉗子を用いてマイクロカラムを移し、空の35または60mmペトリ皿に移す。脱水を防ぐために一度に4-5マイクロカラムで作業してください。 1000μLのチップに添付された10μLのチップをマイクロピペットに取り付けます。ビジュアルガイダンスのためにステレオスコープを使用して、チップをマイクロカラムの一端に置き、吸引して残留DPBSおよび気泡を管腔から抽出する。
    4. マイクロピペットに4〜5μLのECMをすばやく作成します。 steの下で観察マイクロカラムの端の1つにマイクロピペットの先端を置き、管腔を満たすのに十分なECMを放出する。内腔に気泡がないことを確認します。これは、ECMによる軸索の伸長を阻害する可能性があるためです。気泡が存在する場合は、ステップ3.1.3で説明したようにECMを取り外し、ECMを再度追加します。
    5. 脱水を防ぐために、各マイクロカラムの周りに約2μLのECMを加える。ペトリ皿中のヒドロゲル/ ECMマイクロカラムを37℃および5%CO 2で25分間インキュベートする。インキュベーションの直後に細胞播種に進む。
      注:ステップ3.1.5のインキュベーション時間は、マイクロカラム内のコラーゲンとラミニンの重合時間を可能にすることを目的としています。
  2. マイクロカラムの神経細胞播種
    注:変換された凝集体の培地を交換するには、プレートを傾け、マイクロピペットを使用してウェルの壁に溜まっている培地を除去し、〜1mLを壁(ピラミッド型マイクロウェル内の凝集体を妨害しないため)。この媒体の変更をもう一度繰り返します。
    1. ステップ3.1.5のインキュベーション期間の後、マイクロカラムを保持するペトリ皿中の2つの自由領域に約10-20μLの培地を移す。マイクロピペットを使用して、凝集体を個々にペトリ皿に移し、細胞の健康を保つために小さな培地のプールの1つに鉗子で移動させます。
    2. ステレオスコープで観察しながら、双方向マイクロTENNのマイクロコラムの各端に集約を挿入するか、鉗子を使用して片方向アーキテクチャ(必要に応じて)を一方の端に挿入します。ステレオスコープを使用してマイクロカラム内に集合体の配置を確認する。鉗子を使用して、シードされたマイクロカラムを他の小さな培養液のプールに移動させ、脱水を防ぎ、凝集体の健康状態を保存します。
    3. 37℃、5%CO 2で45分間インキュベートし、集約がECMに従うようにする。ステレオスコープを使用して凝集体がマイクロカラムの端に残っていることを確認する。細胞凝集物を再導入し、必要に応じてインキュベーション工程を繰り返す。
    4. 血清学的ピペットを用いて、マイクロTENNを含むペトリ皿を培地(それぞれ35または60 mmのペトリ皿の場合は3または6 mL)で慎重にあふれさせます。 37℃、5%CO 2のインキュベーターに皿を置き、長期培養します。
    5. 培養培地で2日間毎にハーフ培地の交換を行う。慎重にピペットで古い培地の半分を取り出し、視覚的なガイダンスのために立体顕微鏡を使用してマイクロTENNの吸引を避ける。新鮮な、予熱した培地をピペットでゆっくりと加えて交換する。
    6. PDMSマイクロウェルアレイを再利用するために、培地を除去し、アレイを脱イオン水で30分間沸騰させ、オートクレーブ内で滅菌して、凝集体形成および培養の別のラウンドを行う。
      注:希望の時点で、マイクロTENNの細胞構造は、位相差顕微鏡法を用いて検証することができる。ここでは、5~8msおよび10X(0.64μm/ピクセル)および20X(0.32μm/ピクセル)対物レンズの露光時間を利用して、位相コントラスト画像を捕捉した。ウイルスで形質導入されたマイクロTENNのカルシウム濃度変化に関連する蛍光は、50msの曝露時間、10X対物レンズ(0.64μm/ピクセル)、およびバンドパスフィルターが約480の固体光を用いた高速蛍光顕微鏡を用いて捕捉したGCaMP6f蛍光シグナルを視覚化するために、それぞれ励起および発光について約5nm、約510nmおよび約510nmであった。

4. インビトロ研究のための免疫細胞化学

マウス抗Tuj-1 /β-IIIチューブリン(1:500)およびウサギ抗シナプシン-1(1:500)を用いて、軸索およびプレ - シナプス・ブーティン。二次抗体は、ロバ抗体- マウス568(1:500)およびロバ抗ウサギ488(1:500)。調製された一次および二次抗体溶液の必要量ならびにホルムアルデヒド、ウマ血清、および洗剤溶液の容量は、構築物を完全にカバーするのに必要な容量に依存する。これらの容積は、疎水性バリアペンを使用して最小化されて、各マイクロカラムを囲む領域を制限することができる。

注意:このセクションではホルムアルデヒドとHoechstを使用しています。ホルムアルデヒドは発癌性であることが知られている毒性化合物であり、Hoechstは既知の変異原である。したがって、これらの化合物は適切な廃棄容器に処分する必要があります。ラボコート、安全眼鏡、手袋などの適切な個人用保護具を使用しながら、化学薬品フードで常に取り扱うこと。

  1. ケミカルヒュームフード内で1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中4.0%体積/体積(v / v)ホルムアルデヒド溶液を調製する。
  2. ペトリ皿から培地を除去するmicro-TENNsにマイクロピペットを使用してください。ホルムアルデヒド溶液を皿に十分に加え、マイクロTENNを完全に覆います。マイクロカラム内の細胞を固定するために、ホルムアルデヒド溶液中のマイクロTENNを18〜24℃で35分間浸します。
  3. ペトリ皿から4.0%ホルムアルデヒド溶液をピペットで取り出し、適切な危険物質処分ガイドラインに従って廃棄します。
  4. 固定されたマイクロTENNを完全にカバーするのに十分なPBSを添加し、次にピペットでPBSを除去することによって、2回の迅速なすすぎを行う。 10分間、PBSに構築物を浸すことにより、3回目のすすぎを行う。
    注意:すすぎに使用するPBSは、ホルムアルデヒドの痕跡が残っているものとして廃棄してください。
  5. PBS中の4%v / vウマ血清中の非イオン性界面活性剤の0.3%v / v溶液を調製する。固定されたマイクロTENNを含むペトリ皿からPBSを取り出し、構築物を覆うのに十分な量の0.3%の界面活性剤溶液を加える。 60分、18-24および#細胞を透過性にするために176℃である。
  6. ピペットで洗剤溶液を除去する。 PBSを添加し、続いて除去することにより、2回のすすぎを行う。その後、各すすぎ中に5分間PBS中に構築物を浸漬することにより、3回のより長い洗浄を行う。
  7. 一次抗体を4%ウマ血清で希釈する。固定された透過性マイクロTENNを含むペトリ皿からPBSを除去する。それらを完全に覆うのに十分な一次抗体溶液をマイクロカラムに加える。蒸発を防ぐためにパラフィルムでペトリ皿をシールし、4℃で一晩(12〜16時間)インキュベートする。
  8. ステップ4.6で説明したように、ディッシュから一次抗体溶液を取り出し、すすぎます。暗所で、4.0%ウマ血清中の二次抗体溶液を調製する。構築物を完全にカバーするのに十分な二次抗体溶液を添加し、皿をアルミニウムホイルで覆い、18-24℃で2時間インキュベートする。
  9. 核を染色するためにPBS中のHoechst溶液(1:10,000)を調製する。
  10. 注:免疫標識されたマイクロTENNの画像は、2,048(〜8秒/フレーム)、10X対物レンズ(0.64μm/ピクセル)、487nm励起および〜525nm発光波長の解像度を有するレーザー共焦点顕微鏡緑色蛍光、赤色蛍光については561nm励起および約595nm発光波長、zスタックについては平均約60スライスの〜3.22μm/スライスである。

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Representative Results

マイクロTENNを位相差顕微鏡法を用いてモニターし、細胞構造および軸索伸長を評価した( 図4 )。一方向、2mmの長さのマイクロTENN内で、ニューロン凝集体はマイクロカラムの一端に限定され、内部コアを通して軸索の束を投影した。軸索は、 インビトロで 5日間(DIV)カラムの全長に及んだ( 図4A )。軸索が3DIV( 図4B )でマイクロカラム全体に及ぶので、双方向2mm長のマイクロTENNにおいてより大きな初期軸索成長速度があった。 5DIVにより、双方向マイクロTENNは、マイクロカラムの極端に維持された凝集体を連結する高密度軸索管を特徴とした。この細胞構造は、5-DINマイクロTENNにおいても観察され、軸索は5 DIVによってマイクロカラムに広がっていた( 図4C )。すべての場合に観察されるように、内腔のECMおよび幾何学的再刺激アガロースによって提示されたカチオンは、天然の神経解剖学の特徴を構造的に模倣する軸索領域を形成するのに必要な指向性を提供した。

免疫細胞化学技術をこのプロトコールで適用し、マイクロTENN構造の成分を確認するために共焦点画像を採取した。 Hoechst(青色)で染色された細胞核は、一方向および双方向マイクロカラムの極端に凝集体内にほぼ独占的に局在し、本質的に内部にHoechst染色はなかった( 図5 )。この観察は、位相差画像から推測されたことを確認した:ニューロン集団は末端に限定され、軸索(赤色)のみが微小TENNの内腔に及んだ。しかしながら、軸索が凝集体を横断した後、2mm長の二肢用の28DIVの内部の核(青色)の存在によって観察されるように、細胞の移動が軸索に沿って内腔に観察されたマイクロミニTENN( 図6 )。さらに、シナプシンI免疫標識(緑色)は細胞体および軸索管全体で見られた( 図6 )。シナプシンIは、神経伝達物質放出の調節に関与するシナプス前末端タンパク質であり、点状分布で見出される時にシナプス前末端の存在を示す;それは、全細胞パッチ記録49による活性シナプスの形成と以前に相関していた49 。マイクロTENNの軸索に富む中心ゾーンにおけるシナプシン染色は、おそらく、シナプス前末端に向かって軸索を輸送されるシナプシンと同様に、穿刺の組み合わせである可能性がある。それにもかかわらず、マイクロTENN集団内にシナプス穿刺が存在することは、これらの構築物がシナプスを介して伝達する能力を有することを示唆しているが、シナプス後のタンパク質との共局在化は、/ p>

これらの構築物の電気生理学的特性を予備的にプローブするために、GCaMP6fカルシウム指示薬を含有するAAVで形質導入された凝集ニューロンを用いてマイクロTENNも作製した。これらの構築物は、ニューロン凝集体および軸索路の両方で蛍光によって示されるように、その全長にわたってカルシウム指示薬を発現した( 図7A )。凝集体中の強度を最大にすることを目的とする顕微鏡設定のために、軸索管における蛍光はより薄く見えたことに留意されたい。これらの形質導入マイクロTENNを高速蛍光顕微鏡(外部電気刺激なし)で経時的に分析し、代表的なマイクロTENNにおいていくつかの細胞サイズの関心領域(ROI)を無作為に選択してこれらのシグナル伝達能力を特徴付けた構築物。カルシウム濃度バーストは、ほぼすべてのROIで観察され、assocで反映された時間の経過とともに変動する蛍光強度を生じた( 図7B )。特に、様々なROIは、カルシウム濃度の増加にほぼ一定の周期性を示すようであった( 図7B )。これらのカルシウム濃度の変化は、自発的、固有の活動電位、個々の凝集体内の細胞シグナル伝達、および/または異なる凝集体からの軸索を通したシグナル伝達の結果であると推測される。マイクロTENN内のニューロンおよび軸索管の電気生理学的特性を完全に特徴付けるためには、さらなる分析が必要である。それにもかかわらず、これらの初期の結果は、マイクロTENNが強い内因性/ベースラインの電気的活性を示すことを示している。

図3
図3:レーザーカットマイクロカラム製造装置および細胞凝集用の3Dプリントピラミッドマイクロウェルモールドの青写真。A) - ( B )ヒドロゲルマイクロカラムを製造するために使用される円筒形チャネルアレイの下半分および上半分の青写真および画像。 ( C )装置を一緒に保持するために使用されるキャップの青写真とイメージ。前部と後部の両方のピースは同じ寸法を共有しています。 ( D )マイクロカラムを製造するのに必要な組み立てられたデバイスのイメージ。 2つのキャップと下側の半分だけが下側の2つの位置合わせ穴(左)にねじで締め付けられます。破線は、各キャップの5つの穴を通る鍼の針の配置を示す。液体アガロースをシリンダーの下半分に加え、その後、上半分(右)を装置上に置き、液体アガロースを成形する。 ( E )PDMSマイクロウェルアレイを作製するために使用される3D印刷された型の青写真。 ( F )3D印刷されたモールドの画像(左)およびPDMSマイクロウェルアレイ(右)。すべての寸法はミリ単位ですメートル(mm)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4
図4: インビトロでの日の関数としての単方向および二方向性構築物の位相差イメージングによるマイクロTENNSにおける軸索成長の観察。A )一方向性の2mm長のマイクロTENNは、マイクロカラムのほぼ全長にわたって5DIVだけ伸長した軸索管を示す。 ( B )単方向マイクロTENNと比較して、双方向2mmマイクロTENNはより速い軸索成長速度を示す。 ( C )5mm双方向マイクロTENNの場合、軸索管はマイクロカラムの長さに5DIVを占める。このアーキテクチャは、少なくとも10 DIVまで維持されます。スケールバー=200μm。/ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5
図5:免疫標識された単方向および双方向微小TENNの共焦点画像で観察された微小TENN細胞構造。細胞核(Hoechst;青色)および軸索(Tuj1;赤色)について細胞を染色した。 ( A )5mm双方向マイクロTENN(28DIV)の位相差画像。 5mm双方向(28DIV)および一方向(25DIV)マイクロTENNの共焦点再構築( D )〜( F )および( I )〜( K )は、標識細胞核( D )、および軸索( E )、( J )ならびにオーバーレイ( F )、( K )を含む。スケールバー:500μm。インセット( A B ) - ( C )および共焦点( G ) - ( H )、( L ) - ( M )ズームインを指す。 。画像は、マイクロTENNの末端に限定された凝集体を示し、内腔は、軸索の整列された領域によって広がっている。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図6
【図6】代表的な双方向マイクロTENNにおけるシナプス前末端タンパク質シナプシンIの発現。構築物を細胞核(Hoechst;青色)、軸索(Tuj1;赤色)、シナプス前部(シナプシンI;緑色)について染色した。 ( A )Phase-contr28 DIVでの2 mm双方向マイクロTENNの画像。 ( D ) - ( G )3つのチャネルの細胞核( D )、軸索( E )、シナプス前部( F )、およびオーバーレイ( G )を示す共焦点再構成。ボックスは、それぞれ、神経細胞凝集体の位相コントラスト画像およびオーバーレイ画像のズームイン( B ) - ( C )、( H ) - ( I )を示す。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図7
図7:遺伝的にコード化されたカルシウムインジケータの発現によって観察された双方向マイクロTENNにおける自発的シグナル伝達活性。A )Fluorescence顕微鏡法は、凝集体および軸索全体の蛍光によって観察されるように、GCaMPレポーターの発現を確認した。スケールバー=100μm。 ( B )カルシウム濃度変動に伴う蛍光変化を、時間の関数としていくつかの関心領域(ROI)で外部刺激なしで測定した。 ( A )の番号の付いた色の円は、これらのROIを示しています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図8
図8:マイクロTENN方法論における一般的な故障モードの位相コントラスト画像。A )製造の初期段階におけるDPBSの除去および/または蒸発の結果としての、完全脱水/乾燥アガロースマイクロカラム。スケールバー= 5081; m。 ( B )縫合針と毛管との同心的な整列の欠如のために、構築物の外壁を覆う内腔を有するヒドロゲルマイクロカラム。スケールバー=100μm。 ( C )1 DIVに存在する両方の凝集体を有する播種したマイクロTENN。 ( D )3つのDIVにおいて、凝集体の1つが( C )と同じマイクロカラムから脱落した。 ( E )4 DIVでの一方向マイクロテン。 ( F )凝集および軸索の管は、( E )のマイクロカラムから脱落し、5DIVで培地中に浮遊したままであった。 ( C ) - ( E )=300μmのスケールバー。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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Discussion

CNS傷害および疾患は、典型的には、付随するニューロン変性の有無にかかわらず、脳結合細胞を含む長距離軸索経路の喪失または機能不全をもたらす。これは、神経新生および再生を促進するCNSの限られた能力によって増強される。個々のまたはコンビナトリアルアプローチとしての成長因子、細胞および生体物質送達などの修復戦略の追求にもかかわらず、これらの技術は、神経細胞の変性および軸索結合の喪失の両方を同時に説明することができない14,22。これらの技術のギャップは、制御された持続的な方法でニューラルネットワークを修復し、変更し、探索する能力を制限する。したがって、マイクロTENN技術は、既存の方法とは対照的に、ニューロンの置換および長い軸索接続の再構築の両方を容易にする神経修復戦略の必要性に対処するために開発された。マイクro-TENNsは、宿主神経回路の標的再構築、置換および修飾のために特別に設計された脳結合細胞のシステムレベル構築ブロックに近づく予め形成された細胞構造を有する移植可能な生体足場である。これらの足場は、小型円柱アガロースヒドロゲルのECM含有管腔内の長い軸索路によって連結されたニューロンの個別の集団から構成される。これらの構築物は、失われた経路を置換し、ネイティブ回路を動的に調節するためのシナプスリレーとして機能することができる。さらに、単離された軸索変性の場合(元のニューロンが無傷のままである)、マイクロTENNは軸索再生促進のメカニズムに基づいて軸索再生のためのガイドとして役立つ可能性がある。この原稿は、制御された形状、表現型、および機能的特性を有するマイクロTENNを確実に作製するための製造プロトコルを提示した。位相差顕微鏡法、免疫細胞化学ストリーおよび共焦点顕微鏡法は、プロトコールで作製されたマイクロTENNが必要な細胞構造を示し、シナプス前末端タンパク質シナプシンを発現することを示した。さらに、マイクロTENNsは、おそらく活動電位に起因する内的シグナル伝達活性を、外部シミュレーションがない場合に有することが示された。これは、遺伝的にコードされたカルシウムレポーターに関連する蛍光のほぼ同期的な変動の存在によって確認された。

Micro-TENNの開発は、(1)中空のヒドロゲル管の作製、(2)管の内腔へのECM溶液の添加、および(3)単離されたニューロンの凝集体の管の端部。マイクロカラムは、ガラス毛細管で、または円筒形チャネルを含む微細加工デバイスで製造することができる。このデバイスは、研究者が入手できる高精度の微細加工方法で作成できます。液体アガロースを、デバイスのチャネルまたは中心の鍼針を含む毛管に注ぎ、ヒドロゲルマイクロカラムを作製する。アガロースゲル化に続いて、鍼の針を除去して中空管腔を生成する。製造または成長中に発生するいくつかの一般的な落とし穴が図8に強調表示されている図4に表示された画像の一部および図8Bの極端なケースは、シリンダの壁に不安定に近い内腔部分を示すことに留意されたい。キャピラリーチューブ法を使用する際に均一な壁厚を生成するためには、アガロースと接触させたときにチューブ - ニードルアセンブリを直立状態に保持し、ニードルをチューブの中心に保持する必要があります。管 - 針アセンブリをアガロース表面に対してある角度に保つことにより、針の分散が促進される。それにもかかわらず、これらの予防措置は実施が困難であり、針はより頻繁に休んでいるよりもgは毛管の壁である。反対に、マイクロ加工されたデバイスの主な資産は、円筒形チャネルと同心円状に整列したニードルホールを特徴とし、チャネルおよびマイクロカラムそれぞれに対するニードルおよび管腔の適切な集中を促進することである。さらに、デバイスは、同時に複数のマイクロカラムの製造を容易にすることによってスループットを増加させる。装置によってもたらされる利益にもかかわらず、屈曲した鍼針を使用することによって、中心から外れた内腔を形成することができる。微細加工技術はまた、その有効性を制限する固有の公差を有する。一般に、極端な場合を図8Aに示すマイクロカラム脱水は、プロトコル全体を通して提供された推奨事項を守れば支障であってはならない。外側包帯に使用されるアガロースの物理的特性は、改善された皮質ニューロンとして、代替的なニューロンサブタイプの最適化を必要とし得ることに留意されたいより高い(3〜4%)対低い(1〜2%)アガロース濃度での腹水および神経突起伸長が観察された10

Micro-TENNの開発は、ニューロンの接着、生存、および伸長に適した環境を提供するために役立つマイクロカラム内腔へのECMの導入を続けています。さらに、ECMは、アガロースヒドロゲルによって提供される幾何学的制限および低多孔性と組み合わせて、必要な構造を生成するために軸索の成長を縦方向に制限する。 ECM解の内容は、使用されるニューロンのタイプに対して最適化することができる。例えば、コラーゲン単独ではDRGマイクロTENNの生存と軸索伸長を促進するのに対して、皮質ニューロン10にはコラーゲンとラミニンの組み合わせが必要である10 。さらに、マイクロカラム内でのECM重合は、細胞を未プレーン化ECMで同時送達すると、神経突起のoutgrが減少するため、細胞播種前に重要である負担と束縛31 。マイクロカラムが最初にECM溶液で満たされていても、その内容物は重合して柔らかいゲルになり、インキュベーション期間中に収縮しやすくなり、細胞凝集物の挿入を可能にする空間を作り出すことに留意されたい。さらに、ECMがステレオスコープの下で検査することによってマイクロコラムの内部に入ったことを確認することが重要である。失われたECMの完全な欠如および/またはポケットは、凝集物からの軸索伸長の欠如をもたらす。 Micro-TENN製作は足場の極端に皮質ニューロン集合体の播種に至る。これらのニューロンを、既知の手順48を用いてラット胎児から解剖した。分離のために使用された妊娠期の胚ラットの皮質は99%のニューロンで構成されており、プロトコールで使用される規定された培養培地はグリア増殖の代謝的に制限されているので、単離された細胞の大部分はニューロンであると推測することができる 49 。その結果、確認のためには特定のマーカーの染色が必要であるが、グリアの汚染は最小限に抑えられるべきである。この原稿は、皮質ニューロンを用いた微小TENN構築を提示したが、異なる脳領域( 例えば、黒質、視床および海馬)または異なる表現型( 例えば興奮性、抑制性およびドーパミン作動性)からのニューロンを、移植領域。マイクロTENN製造プロトコルのこれまでの反復には、解離した細胞を播種することが含まれていた10,31,32。解離法を用いて所望の細胞構造が得られたにもかかわらず、全ての場合に達成されたわけではなかった。多くの場合、解離した細胞は内部に浸水し、内腔全体にいくつかの細胞体クラスターが形成され、広範囲の3Dネットワーク一方、凝集体法は、細胞体を極限まで封じ込めることを保証し、マイクロTENN技術の成功に不可欠である( 図5 )。示された代表的なマイクロTENNsは、 図4~図6は、完全に挿入されていない大きな凝集体を用いて作製されたものであり、これにより、 図8Dおよび8Eに示す例のように、培養中のマイクロカラムから凝集体が落ちることがある。マイクロカラムの内部に完全に挿入されていなければならない。この状況が以前のストラテジーを適用した後でさえも現れれば、初期インキュベーション期間を延長して、ECMへの凝集接着に十分な時間を提供することができる。ヒドロゲル容器および細胞構造の完全性を保つために推奨される;マイクロTの間の問題ENN操作は、そうでなければ整列した軸索路で得られた湾曲の原因である( 図5 )。それにもかかわらず、この記事で提示されたプロトコルに従い、予期されるニューロン/軸索構造、シナプス前の分布、および固有の電気的活動を伴うマイクロTENNの一貫した作製がもたらされるはずである。

マイクロTENNが持つ約束にもかかわらず、この技術の適用を制限するかもしれない課題が残っています。現在のマイクロカラム製造技術は、マイクロカラム内腔の非集中化によって制限されており、細胞に対する機械的手がかり( 例えば、剛性)の不一致、マイクロカラム壁の破裂およびその後の軸索路の曝露外部への移植、および移植中の問題が挙げられる。微細加工されたデバイスを使用することにより、キャピラリーチューブと比較して結果が改善されたにもかかわらず、より精密な微細加工これらの構造物の寸法再現性を高めるためには技術が必要である。この原稿の結果は、マイクロTENN方法論が、神経細胞および固有の神経解剖学に似た軸索管、特に異なる脳領域を結ぶ軸索管からなる生存足場を確実に産生することができることを示した。それにもかかわらず、マイクロTENNの長さは、置換が必要な宿主軸索経路の長さに依存する障害である。例えば、組織工学的神経移植片(TENG)は、非常に長い神経損傷を修復するために我々の研究グループによって利用される別個の生存足場戦略である。これらの長い間隙を置換するために、カスタムメカノバイオリアクター1,2,3,4に連続的な機械的張力を加えることによって、TENGの軸索を数十センチメートルまで延長することができる。この「ストレッチ成長」技術は、星状細胞プロセスの長さをベットするためにも適用されているrは、放射状グリア経路51の構造を模倣する。対照的に、現在のマイクロTENN技術は、この程度の制御を提供していない。達成可能な最大の長さは、伝統的な成長円錐仲介伸長に基づいて、軸索管がインビトロでどのくらい長く成長得るかによって現在制限されている。さらに、CNSは様々な刺激に応答して神経生理学的再配線のための固有の能力を有し、移植された細胞は天然回路とシナプス的に一体化する能力を有するが、この技術のもう一つの限界は、マイクロTENNが天然脳の可塑性および移植された構築物52,53,54,55と機能的に統合するための宿主ネットワークの能力に依存する。最後に、マイクロTENNのようなすべてのインプラントに基づくアプローチの本質的な欠点は、その侵襲性である。ニューロンは一般に毛細血管に非常に近接しているため、任意のタイプの外科的処置が、血液脳関門の破壊、脳実質への血液因子の漏出、および急性の(そして慢性の)炎症反応を引き起こす可能性がある31 。この反応は、宿主および微小TENNニューロンに損傷を与え、この技術の有益な側面を否定する可能性がある。それにもかかわらず、ラットのコルチコータムラミン経路に移植された微小TENNは、少なくとも1ヶ月間生存し、宿主大脳皮質との構造的統合の証拠を示した10,31。さらに、我々の研究グループの以前の出版物は、マイクロTENNのラット脳への無針植込みを可能にする方法論を提示した31 。このアプローチでは、このヒドロゲル包装戦略は、軽度の脱水時に、浸透するのに十分な剛性を示したカルボキシメチルセルロースの薄い(約20μm)コーティングを含むように増大された針やガイド31を必要とせずに脳を刺激する。マイクロニードルの小さな断面に結合されたこの針なし植え込み法は、定位固定手術中およびその後の脳への損傷を最小限に抑えるべきである。

インビボでの微小TENNの予備的成功にもかかわらず、将来の研究では、これらの構築物が天然組織とシナプス的に一体化することを確認し、CNS傷害および神経変性疾患のモデルにおいて機能回復が得られるかどうかを調べる必要がある10,31。例えば、調整されたマイクロTENNは、特定の細胞表現型で設計され、対応する変性された経路に移植されて、ネットワークを復元し、機能を回復させる。移植後の急性炎症応答を減少させるために、マイクロTENNヒドロゲルシェルに抗炎症剤および生存促進剤をドープすることができる。代替製造内腔の一貫した集中および寸法の再現性を含む、より容易かつより正確な特徴を有するヒドロゲルマイクロカラムを生成するための技術( 例えば、 3D印刷)を開発することができる。マイクロTENNと共に用いられる同じ生体材料スキームは、CNS傷害および疾患の他の特徴的病理に取り組むように改変され得る。例えば、我々のグループは、構造的にラジアルグリア経路を模倣するアガロースヒドロゲルのコラーゲンコート内腔に沿った縦に並んだ星状細胞束と、軸索再生と神経細胞移動を促進するグリア管からなる構築物を以前開発した56 。さらに、ヒト胚性幹細胞(HESC)、誘導された多能性幹細胞(iPSC)、および脂肪由来幹細胞(ASC)などの幹細胞を組み込んで、患者ごとに自家マイクロTENNをより多く失われた細胞構造および細胞表現型に非常に類似している。これらのfutuインビボで縮重した経路を置換するマイクロTENNの能力を増大させ、他の特徴の中でも、アストログリア支持および軸索ミエリン形成を組み込んだ、より洗練された組織構造の再構成を可能にする。遺伝的に改変されたニューロンは、栄養因子の放出によってマイクロTENNの再生作用を増強するか、または光依存性イオンチャンネルの光発生刺激によってCNSの調節を可能にするために播種することもできる。これらの足場は、興奮性または抑制性のニューロンを用いて作製され、てんかん、うつ病、薬物中毒または疼痛障害などの病態における既存の機能不全の宿主結合をシナプス調節することができる。例えば、主にGABA作動性またはグルタミン酸作動性シナプスを形成するマイクロTENNは、シナプス統合および/またはバルクニューールを介してそれぞれ上方または下方調節された経路を抑制または刺激するように構築され得る送信機のリリース。重要なことに、そのような自己内蔵型調節構築物は、理論的には宿主ネットワークのフィードバックに基づいて応答するであろう1 。同様に、マイクロTENNは、脳と無機刺激または記録デバイスとの間の中間体として働くオプトジェネティックに設計されたマイクロTENNを有する脳 - コンピュータインターフェース(BCI)として適用することができる。このアプリケーションは、特異的な細胞標的化および機械的安定性を欠き、炎症反応、グリア瘢痕形成、および脳内に侵入した場合のニューロンの移動または喪失を引き起こした微小電極BCIの代替物となり得る。

試験管内試験ベッドのように、マイクロTENNsは、神経系のバイオフィディックモデルとして役立つ神経生物学と電気生理学の研究のための強力なプラットフォームを提供することができます。さらに、3D構築物は、神経注射剤として使用される場合の治療戦略のためのテストベッドとして役立ち得るuryと病気のモデル59 。 3次元構築物として、マイクロTENNは、平面培養物42,60,61,62,63において正確に表現することができないすべての空間方向の複雑な細胞 - 細胞および細胞-ECM相互作用を特徴とするin vivo環境を模擬することができる 64,65 。実際に、ネイティブセッティング60に示される形態、増殖、移動、遺伝子発現、分化、およびシグナル伝達を提示するためには、細胞の環境の種類が重要であることが数多くの研究によって立証されている。これらの足場の3D環境と脳自体との類似点は、これらの構築物がその物理的および生化学的なprよりも優れている制御の程度によって補完される42 。これは、ニューロンの生存、成熟、軸索伸長、シナプス形成およびメカノトランスダクション32,42,63に個々にまたは相乗的に、これらの手がかりの効果を研究するために、異なるセットの機械的、走行性および走化性シグナルを有するマイクロTENNの工学を可能にする。さらに、このミクロ組織工学技術の設計の柔軟性は、コネクトomeの軸索領域にまたがる新皮質の柱状の区画化された構造のような、脳組織の他の特徴を模倣する生存した足場の構築を可能にし、脳を研究するためのインビトロプラットフォームとしてのこのシステムの能力65 。研究プラットフォームとして、マイクロTENNは典型的なインビトロモデルの制御された設定、組織内の設計パラメータの広範な利用可能性3Dプラットフォームの生理学的および病態生理学的関連性の増大により、生物学的知識を向上させるための理想的なテストベッドとなります。この技術の今後の方向性は、マイクロTENNの多様性を示しています。この原稿は、マイクロTENNプロトコルが、脳神経造影の重要な特徴を模倣する組織工学の生存足場を確実に生成して、発生、病気、および修復プロセスを含む神経生物学的現象に新しい洞察を提供することを実証した。これらの構築物はまた、損傷した白質路を再構築し、失われたニューロン細胞を置換し、CNS傷害および疾患後の異常調節された経路を調節するために、天然組織とシナプス的に統合し得る。

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Disclosures

著者は何も開示することはない。

Acknowledgments

財政的支援は、米国国立衛生研究所(U01-NS094340(Cullen)、T32-NS043126(Harris)、F31-NS090746(Katiyar))、Michael J. Fox財団(Therapeutic Pipeline Program#9998(Cullen) (Cullen)、国立科学財団(大学院研究フェローシップDGE-1321851(Struzyna and Adewole))、退役軍人局(RR&Dメリットレビュー#B1097-I(カレン))、アメリカン・アソシエーション神経外科医および神経外科医会議(2015-2016年の神経外傷および重大なケアにおけるコッドマンフェローシップ(ペトロフ))および米国陸軍医学研究および物質試験(#W81XWH-13-207004(カレン)およびW81XWH- 0466(カレン))。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

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