解剖学启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建,调制和建模

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

该手稿详细描述了微组织工程神经网络的制造:三维微米大小的构建体,包括跨越聚集的神经元群体的长比例的轴突区域,其包裹在管状水凝胶中。这些生活支架可以作为功能性继电器来重建或调节神经回路,或者作为模拟灰白色神经解剖学的生物学检验床。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

由于抑制环境和神经发生能力有限,功能恢复很少发生在中枢神经系统(CNS)中的损伤或疾病诱导的变性之后。我们正在开发一种同时解决损伤的CNS内的神经元和轴突途径损失的策略。该手稿提出了微组织工程神经网络(微型TENN)的制造方案,由神经元组成的可植入构造物和跨越细胞外基质(ECM)腔的对准轴突束,其预先形成的直径为数百微米的水凝胶圆柱体可以延伸厘米长度。神经元聚集体被划分为三维包围的极端,并被轴突突起所跨越。微型TENN作为CNS重建的策略是独一无二的,模拟了脑连接体细胞结构的方面,并为潜在的网络替代提供了手段。神奈轮状聚集体可能与宿主组织突触形成新的功能性继电器,以恢复和/或调节丢失或损坏的电路。这些构建体也可以作为能够利用细胞迁移和轴索寻路的发育机制的再生“活支架”,基于再生状态提供协同的结构和可溶性线索。将微型TENN通过将液体水凝胶倒入含有纵向中心针的圆柱形模具中来制造。一旦水凝胶凝胶化,就去除针头,留下中空微柱。将ECM溶液加入腔内以提供适合于神经元粘附和轴突生长的环境。机械地聚集离解的神经元用于在微柱的一端或两端精确播种。该方法可靠地产生具有长突出的轴突束的自足的微型构造,其可以重现脑神经解剖学的特征。突触动物非标记和遗传编码的钙指标表明微TENN具有广泛的突触分布和内在的电活动。因此,微型TENN代表脑途径靶向神经外科重建的有希望的策略,也可作为生物学模型应用于体外研究神经生物学现象

Introduction

中枢神经系统疾病和疾病(CNS)的常见特征,如创伤性脑损伤(TBI),脊髓损伤(SCI),中风,阿尔茨海默病和帕金森病,是轴突途径和神经元细胞的断开损失1,2,3,4,5,6 。例如,当缺血性中风未经治疗时,估计轴突以每分钟轴突7英里的速度丢失5 。在TBI的情况下,每年约有170万人在美国经历,轴突变性可能在创伤后几年可能继续发生,因为初始损伤导致长期的神经变性状态4 。加剧这些有害影响,中枢神经系统受到严重限制城市再生1,7,8,9。受伤后,出现抑制环境,其特征在于缺乏远距离靶点的指导性指导,阻止神经突生长的髓磷脂相关抑制剂的存在,以及由反应性星形胶质细胞形成胶质瘢痕8,10,11,12。胶质瘢痕可作为再生的生化和物理障碍,硫酸软骨素蛋白多糖等分子阻碍轴突长出8,11。此外,即使在成人CNS中发现了神经干细胞,新神经元的产生也是有限的,因为在嗅球中仅发现了神经发生的一致证据,海马脊髓区域,脑室周围区域和脊髓中央管道13,14 。这些障碍阻碍了损伤或疾病后遗失的神经元和白质结构的功能恢复,导致这些病症经常改变生命和延长的效果。

尽管成人中枢神经系统缺乏再生能力,但是已经证明,如果向宿主神经元15,16,17,18提供足够的环境线索,则轴突再生是可能的。研究人员尝试提供和操纵生长因子( 神经生长因子,表皮生长因子,神经胶质依赖性生长因子和神经营养因子-3)和其他指导分子,以刺激可塑性和轴突再生14 / sup> 18,19 。即使这些研究已经证实成年轴突能够响应生长因子,这些策略受到血脑屏障的低渗透性和促进再生所需的特定空间和时间梯度的限制14,18,19。其他方法依赖于CNS神经元中再生相关转录因子的过度活化。例如,Stat3转录因子的过度表达刺激视神经中的轴突再生20 。然而,生物分子递送和转录因子的过表达都不能代替丢失的神经元群体。基于细胞的策略主要集中在将神经干细胞(NSCs)移植到CNS中,利用其替代CNS神经元的能力,释放营养因子,并支持在损伤后发生的神经发生的尝试17 。尽管如此,仍然存在阻碍这种方法的紧迫挑战,包括移植的神经细胞存活,与主机整合的阻碍能力,并且在空间上保持受限制的区域6,14,17,21。此外,单独的细胞传递不能恢复受损或丢失的轴突途径的细胞结构。解决细胞和药物/化学品输送策略面临的问题的另一种方法是将这些方法与生物材料14,22,23的使用相结合。生物材料如水凝胶能够模拟细胞外基质(ECM)的生物化学和物理性质,有助于细胞递送d保留在受伤区域内,并传递生长因子和其他生物活性分子与受控释放22 。这些基于生物材料的策略的有吸引力的特征已经导致在支架移植到损伤区域24,25,26,27,28,29,30之后体内轴突再生的证据。然而,无细胞生物材料策略不能代替丢失的神经元群体;当用作神经元,胶质细胞或神经元前体细胞的递送载体时,生物材料不能重建长距离轴突网络。开发解决轴突途径退化和与CNS损伤和疾病相关的神经元损失的方法的挑战仍然是<sup class =“xref”> 31。

我们的研究小组以前报告了可植入的微组织工程神经网络(micro-TENNs)的发展,这是一种由活性支架组成的神经细胞体,其限于琼脂糖水凝胶-EGC微柱的一端或两端,其中对齐的轴突束延伸穿过该三维(3D)包装1,10,31,32的整个内部。这种技术和以前的方法之间的主要区别之一是微TENN 的细胞结构在体外完全产生并在之后33,34,35,36,37,38 sup class =“xref”> 39,40,41。 体外制备提供了广泛的空间和时间控制细胞表型和取向,机械/物理性质,生物化学提示和外源性因素,这有利于这些支架与植入后的主体整合41,42 。 Micro-TENN是解剖学上的启发,因为它们模拟脑神经解剖学,显示类似于桥接不同功能区域的轴突区域( 图1A1 。因此,这种策略可能能够在植入损伤区域后物理上替代丢失的白质束和神经元。这种技术也受到发育机制的启发,其中由径向胶质细胞和开创性轴突形成的“天然生物支架”作为细胞的寻路指南分别从室下区和轴突向外移动43 。这些机制在微TENN的对齐轴突区域中重现,这可以通过轴突介导的轴突生长呈现神经细胞迁移和轴突再生的生物通路( 图1C43 。此外,该策略利用微TENN神经元和原生电路之间的突触整合,形成可能有助于功能恢复的新继电器( 图1B )。突触形成的能力也可以允许这种方法根据网络反馈调节CNS并响应宿主组织的能力。例如,可以通过突触相互作用刺激生物支架中的光遗传活性神经元来调节宿主神经元( 图1D )。

此外,基于生物材料的管状结构微TENN的作用为细胞粘附,生长,神经突延伸和信号传导提供了足够的环境,而构建体的微型尺寸可能允许微创植入,并提供部分隔离的微环境,用于逐渐融入脑中。事实上,最近的出版物已经证明了微型TENN在植入大鼠脑后模拟神经通路的潜力。在立体定位显微注射之后,我们以前报道了微TENN神经元存活的证据,轴突结构的维持和轴突延伸到主体皮质至少1个月的体内 10,31。此外,用突触蛋白标记提供了与天然组织突触整合的组织学证据10,31。总的来说,微型TENN可能独特地适用于重建和调制损坏CNS通过替换丢失的神经元,与主机电路进行突触整合,恢复损失的轴突细胞结构,并且在某些情况下,为再生轴突提供适当的寻路提示。

图1
图1:微组织工程神经网络(微型TENN)发展背后的原理和启示。A )Micro-TENN模拟大脑连接体(紫色)的细胞结构,其中功能上不同的区域以单向(红色,绿色)或双向(蓝色)方式通过长对准的轴突束连接。作为一个例子,微型TENN可以重建皮质丘脑和黑质纹状体途径或从内嗅皮质到海马的穿孔途径中的丢失的连接(改编自Struzyna ,2015) 1 。 ( B )单向图l和双向微型TENN(分别为红色和蓝色)与主机电路(紫色)进行突触式积分,以用作病变两端之间的功能继电器。 ( C )单向微-TENN(绿色)的轴突区的示意图,作为用于轴突促进再生主轴突(紫色)朝向与微TENN相互作用的靶标的指导。 ( D )使用光生物活性微TENNS作为神经调节剂的概念图,利用与兴奋性或抑制性神经元的突触整合(底部)。 请点击此处查看此图的较大版本。

目前的手稿详细介绍了使用胚胎衍生的大脑皮质神经元制造微型TENN的方法。值得注意的是,微TENN可以用其他类型的神经细胞制造。例如充足的,成功的微型TENN发展的初步报告是背根神经节(DRG)神经元32 。可以通过将液体琼脂糖加入到定制的激光切割的圆柱形通道阵列或毛细管中(均包含对准的针灸针)来产生水凝胶微柱( 图2A )。针形成内腔并确定微柱的内径(ID),而激光切割装置中的毛细管ID和圆柱体的直径决定了构造体的外径(OD)。 OD和ID可以根据所需的应用选择,分别选择器件/毛细管和针灸针的不同直径。微柱的长度也可以变化;到目前为止,我们已经报道了长达10毫米的微型TENN的建设10 ,并且正在积极追求更长的长度。琼脂糖凝胶和针灸后eedles被去除,通常由I型胶原和层粘连蛋白组成的ECM溶液被添加到构建体的内腔( 图2C )。 ECM核心提供支架,以支持神经细胞粘附和轴突生长。最初,使用解离的细胞悬浮液10,31,32,将原代大鼠皮质神经元电镀在微量柱中。然而,这种方法在所有情况下都没有产生靶细胞结构,其被定义为限于微柱末端的神经细胞体,其中心腔由纯对准的轴突区组成。从那时起,使用强制神经元聚集方法(基于Ungrin 等人改编的协议)使得具有理想结构的微TENN更加可靠和一致的制造( 图2B44 。除了描述当前方法论,本文将展示微型TENNs的代表性相位对比和共聚焦图像,证明随着时间的推移形成轴突束,以及完成的目标细胞结构。该手稿还将扩大协议的重要方面,还将展示微型TENN技术的未来挑战和未来发展方向。

图2
图2:三阶段微型TENN制造工艺的示意图。A )琼脂糖水凝胶的开发:(i)最初,将小针灸针( 例如 ,直径为180-350μm)插入定制的激光切割模具或毛细管的圆柱形通道中( 例如 ,直径380-700μm)。在下一步中,将DPBS中的液体琼脂糖引入圆柱形通道或毛细管中。 (ii)琼脂糖凝胶后,取出针头将模具拆开以产生中空的琼脂糖微柱。 (iii)然后将这些构建体灭菌并储存在DPBS中。 ( B )主要神经元培养和聚集方法:(i)神经元聚集在适合于12孔培养板的孔中的3D印刷模具铸造的金字塔微孔阵列中进行。 (ii)微TENN包括从胚胎-18天大鼠的胎脑分离的原代大鼠神经元。在用胰蛋白酶-EDTA和DNA酶I组织解离之后,制备密度为1.0-2.0×10 6个细胞/ mL的细胞溶液。 (iii)将12μL该溶液转移到锥体微孔阵列中的每个孔中。将含有这些微孔的板离心以产生细胞聚集体。 (iv)然后将它们在电镀之前在微柱中孵育过夜。 ( C )ECM核心制备和细胞接种:(i)细胞播种前,将含有1mg / mL I型胶原和1mg / mL的ECM溶液层粘连蛋白转移到微TENN的内部并使其聚合。 (ii)根据单向或双向微型TENN是否正在制造,聚集体分别放置在微柱的一个或两个极端。 (iii)经过一段时间的温育以促进粘附,将微型TENN在充满补充的胚胎神经元基础培养基的培养皿中培养。 (iv)在培养3-5天后,最终的微TENN结构应在微柱的极端处展示细胞聚集体,其轴突束跨越其长度。 请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

涉及动物的所有手续均由宾夕法尼亚大学的机构动物保护和使用委员会和Michael J. Crescenz退伍军人事务医疗中心批准,并遵守NIH公共卫生服务政策中关于人道关怀和使用实验室的指导原则动物(2015)。

1.开发琼脂糖水凝胶(微TENNs的无细胞成分)

  1. 琼脂糖溶液制备
    1. 在生物安全柜内,通过将20 mL Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)转移到两个10 cm培养皿中的每一个上,为微柱制备储存器。用热珠灭菌器灭菌精镊子和微型柱。
    2. 称量3 g琼脂糖,并将其转移到生物安全柜内的无菌烧杯中。加入100mL DPBS,终浓度为3%重量/体积(w / v)。包括一个干净的磁棒,并用铝制盖住烧杯数字箔。
    3. 用热板/搅拌器,在100℃下加热烧杯,以120-200rpm搅拌,使琼脂糖完全溶解(溶液将从浑浊转为澄清)。保持加热和搅拌,以防止凝胶化,并根据需要改变加热温度,以避免燃烧琼脂糖。
      注意:激光切割装置和毛细管的制造分别如下面的1.2和1.3小节。在完成两个小节中描述的步骤之后,继续到1.4节。对于两种微柱制造方法,快速加入液体琼脂糖,琼脂糖在冷却时迅速固化。当使用高压灭菌器在以下任一步骤中进行灭菌时,请使用标准条件应用于玻璃器皿。
  2. 使用激光切割装置的微柱制备
    注意:激光切割设备使用商用CO 2激光切割机从透明丙烯酸切割。 fabri通过激光切割对结构和器件的阳离子已经被广泛记录在一系列工程和研究应用 45,46,47 。该模具( 图3 )由五个圆柱形通道的阵列组成,每个具有398μm的直径和6.35mm的长度。这些圆柱形阵列沿其长度形成两片:下半部分(长度:25.4mm,宽度:6.35mm,高度:6.0mm)和上半部分(长度:31.5mm,宽度:6.35mm,高度:12.7mm ), 如图3A3B所示 。两个半部可以通过图3C (长度:31.5毫米,宽度:6.35毫米,高度:12.7毫米)观察到的前盖和后盖夹紧在一起,其特征在于四个对准孔与顶部和底部两个孔重合并且有助于在拧紧时将所有部件固定在一起。这些帽子也有公司裸体五个孔,与圆柱形通道同心,针刺针可以插入其中以形成微柱的内腔。
    1. 通过用铝箔覆盖并高压灭菌来灭菌图3所示的设备。通过将前盖和后盖仅与底部半部件对齐并将三个部件用两个#4-40螺钉和螺母(螺纹直径:3.05 mm)固定在底部对齐孔中,从而组装如图3D所示的设备。
    2. 将针刺针(直径:180μm,长度:30 mm)全面引入设备前盖或后盖上的针孔( 图3D )。使用微量移液管,在底部半部分上倒入足够的液体琼脂糖(5个通道约1 mL),以完全填充每个圆柱形通道半部。
    3. 立即将设备的上半部分放在下半部分,并施加压力,直到其牢固地插入完成圆柱形通道的位置(盖子和顶部件之间的摩擦将使后者保持在适当的位置)。在琼脂糖添加后等待约5分钟,以允许其在装置的通道内凝胶化。
    4. 从设备的帽子上的每个孔手动提取针头。拆下螺丝并手动将两个盖子和上半部分从下半部分分开,后者将保持水凝胶微柱。
    5. 使用细镊子轻轻地从下半部分的通道上移除微柱,并将它们放入预先制备的含有DPBS的培养皿中(步骤1.1.1)。再次利用该设备进行另一轮微柱制造。继续到1.4节。
  3. 使用毛细管的微柱制造
    1. 将玻璃毛细管(直径:398.78μm,长度:32 mm)转移到生物安全柜的内部。手动打破将长管切成2.0-2.5厘米的碎片,并将一个针灸针(直径:180μm,长度:30mm)全部插入每个片段( 图2A )。
    2. 将1 mL液体琼脂糖从烧杯转移到空培养皿的表面。握住毛细管和引入的针,将管的一端与液体琼脂糖池接触,通过毛细作用填充。搅动管以促进毛细血管上升。
      注意:用毛细管作用允许的液体琼脂糖填充毛细管;之后,根据所需的长度,这些微柱可被切成较小的结构。 1-mL琼脂糖池通常仅用于一个管,因为琼脂糖快速冷却和凝胶,防止进一步的毛细管作用。
    3. 当液体停止上升时,从泳池中取出毛细管并将其水平放置在培养皿的表面上。等待5分钟,使琼脂糖凝胶在管内/ LI>
    4. 将拇指和食指放在管的两侧并按压。另一只手用拇指和食指快速拉出针头,以防止微柱本身从管中滑出。将30号针插入毛细管,以将微量柱慢慢推入含有DPBS的培养皿中(步骤1.1.1)。
  4. 微柱修整和灭菌
    1. 使用细镊子精细地将一个微柱从DPBS转移到一个空盘中。用微量吸液管将10μLDBPS加入微柱顶部以防止干燥。将后面的盘放在立体镜下面进行视觉指导。
      注意:在整个方案中,微柱干燥或脱水是指采集视觉上与这些构造体的典型的水合外观相区别的皱巴巴结构。脱水微柱牢固地附着在培养皿表面,c注释容易移动,而水合构造物在用镊子操纵后倾向于滑过表面。完全干燥的微柱的相差图像显示在图8A中
    2. 用微型柱调整微柱,将其缩短到所需长度(这里为2-5 mm)。将精细钳子的微调柱运送到步骤1.1.1中制备的其他DPBS培养皿中。
    3. 对每个制造的微柱重复步骤1.4.1和1.4.2。
    4. 在紫外线(UV)光下灭菌含DPBS的培养皿中的微柱1小时。在ECM加入和细胞电镀之前,将培养皿储存在4℃。

原发性神经元培养和强迫细胞聚集方法

  1. 金字塔微孔阵列的制备
    注意:本节采用由圆柱形基座(直径:2.2厘米,高度:7.0毫米)组成的3D印刷模具在顶部(边长4.0mm,倾斜角度:60°)上设置9个方形金字塔,组织成3×3阵列, 如图3E所示 。使用市售3D打印机的添加剂制造工艺已有详细记录。计算机辅助设计软件可用于设计模具。然后,所得到的设计文件可以数字转换为3D打印机的工具路径。每个打印机都有不同的规格,并且有关设置和操作3D打印机的说明会有所不同。
    1. 使用3/32“钻头在10cm培养皿的盖子中央4×4阵列(侧面长度:4厘米,孔分离:1厘米)中刺穿16个孔。在化学通风橱内使用培养皿的底部,称重27g聚二甲基硅氧烷(PDMS)和3g固化剂(比例为1:10),用微型铲将其搅拌均匀。
    2. 用穿孔的盖子覆盖PDMS /固化剂。将软管的一端连接到真空m口,并将另一端插入漏斗的杆(口径:10厘米,茎长:3厘米,茎直径:1.5厘米)。
    3. 用1毫升移液管灯泡顶部的3/32“钻头打开一个开口,并将1,000μL微量吸头插入并固定到开口中(尖端向上),将灯泡和尖端放入软管中并拉软管向上,直到灯泡将软管密封到漏斗的阀杆中。
    4. 将漏斗放在穿孔的餐具盖上,并用可靠的支撑固定软管。打开真空阀5分钟抽吸,并将气泡带到表面。
    5. 关闭阀门,取出漏斗,并将培养皿与通风柜表面相撞约3次,以破坏任何剩余的气泡。
    6. 将一个金字塔形的3D印刷模具放入12孔培养板中的每个孔中,金字塔朝上。将PDMS /固化剂倒入模具顶部,直到t的每个孔他的盘子充满了。用盖子盖住12孔板,并在60℃下将其转移到烘箱中1小时以干燥。
    7. 用微型刮刀小心地从板上清除每个PDMS微孔阵列( 图3F )。用铝箔覆盖PDMS阵列,并通过高压灭菌消毒。在生物安全柜内,将一个微孔阵列插入12孔板的每个孔中( 图2B )。
  2. 皮质神经元与大鼠胎儿分离
    1. 在生物安全柜内加入约20mL Hank's平衡盐溶液(HBSS)至四至六个10cm培养皿(每个解剖组织一个)。将这些菜转移到解剖罩上并将其放在冰上。用热珠灭菌器灭菌清扫仪器,如微型柱,剪刀和镊子。
    2. 预温胚胎神经元基础培养基+2%无血清补充剂+ 0.4mM L-谷氨酰胺(简称“培养基”hereafter)和0.25%胰蛋白酶+ 1mM乙二胺四乙酸(EDTA)。将脱氧核糖核酸酶(DNase)I置于室温下。在HBSS中制备1.5 mL 0.15 mg / mL DNAse I溶液,并将溶液保持在冰上。
    3. 通过二氧化碳吸入安乐死一个定时怀孕的第18天大鼠,并通过斩首确认死亡。将尸体转移到无菌解剖罩上,将腹侧放置。用70%乙醇彻底冲洗腹部。
    4. 打开子宫,用剪刀将胎儿(通常〜11)从羊膜囊中取出,并用镊子将其转移到含有冷HBSS的培养皿中,如第48节所述。在立体镜下面放置一个冷藏(-20°C)花岗岩块。将培养皿放置在该冷块的表面上,以在整个解剖过程中保持HBSS的低温。
    5. 用HBSS冲洗小狗,然后将它们转移到下一个干净的盘中含有HBSS。借助于立体镜和解剖仪器,依次取出胎儿的头部,脑半球和皮质,并将每个组织用镊子转移到每个解剖后的新的HBSS填充的培养皿中。
    6. 用巴斯德吸管器仅吸取皮质,并将组织置于无菌的15 mL离心管中。丢弃其他解剖组织。通过用血清移液器依次加入和除去〜5 mL HBSS,冲洗皮质三次。不要使用时将管放在冰上。
    7. 将皮质用巴斯德吸管转移到含有预热的胰蛋白酶-EDTA(4-6皮质/ 5mL胰蛋白酶-EDTA)的15mL管中。手动搅拌一次,放置在37°C。每3分钟倒置管子以防止组织结块。
    8. 约10分钟后停止接触胰蛋白酶,用巴斯德吸管去除组织,并将其转移到干净的15 mL离心机管。用移液管将0.15 mg / mL DNase I溶液(1.5 mL)加入管中。
    9. 使用巴斯德吸管手动分解组织块,然后涡旋(〜30s),直到溶液看起来均匀,液体中没有剩余的组织碎片。如果不可能使溶液完全均匀化,则将其拉入巴斯德吸管的尖端来提取不溶性碎片。
    10. 将步骤2.2.9中获得的均质细胞溶液以200×g离心3分钟。用巴斯德吸管取出上清液,注意不要打扰沉淀的细胞。加入2 mL具有血清学移液管的培养基并涡旋以重悬细胞。
    11. 使用血细胞计数器计数在步骤2.2.10中制备的溶液中的细胞数;预期产量为3.0-5.0×10 6个细胞/皮层半球。在培养基中制备1 mL或更多的细胞悬浮液,密度为1.0-2.0 x 10 6 cells / mL。
  3. 形成神经细胞聚集体
    1. 使用微量移液管,将12μL1.0-2.0 x 10 6 / mL细胞悬浮液加入到PDMS阵列的每个微孔中(在步骤2.1.7中放置在平板中)。
      注意:可以根据微柱ID和所需的细胞聚集体大小调整细胞浓度,因为较高的浓度产生较大的聚集体。
    2. 以200×g离心板5分钟以迫使细胞在微孔底部聚集( 图2B )。小心地向每个PDMS阵列的顶部添加〜2mL的培养基,以覆盖所有接种的微孔,注意不要干扰聚集的细胞。
    3. 如果细胞不能用病毒载体转导,则在37℃和5%CO 2下将板孵育12-24小时,然后进行到第3部分。如果聚集体被转导,则跳过孵育并进入2.4节。
  4. 陈德良用病毒载体诱导观察钙信号
    注意:执行这些步骤以用含有遗传编码的钙指示剂(GECI)的病毒载体转导神经元。使用具有GCaMP6f的商业上可用的腺相关病毒(AAV)(血清型1),具有由绿色荧光蛋白(GFP),钙调素(CaM)和M13肽组成的快速动力学的GECI获得的本文中所示的结果,由人类突触蛋白I启动子驱动。病毒载体溶液可能需要在转导之前在无菌DPBS中稀释,这取决于原液的浓度。在一定范围的载体浓度下,必须随时间观察细胞的健康/形态和GCaMP6f信号强度。每个研究者必须执行此优化程序,以确定其自身细胞培养物的合适滴度。典型的GCaMP6f表达时间是在第一次孵育期间发生的转导后7-8天ep 2.4.2。
    1. 使用微量移液管,将所需体积的病毒载体溶液(最终浓度为〜3.0×10 9个基因组拷贝/聚合物)添加到培养基中,覆盖聚集体。缓慢吸取上下移液,确保载体溶液均匀分布在整个培养基中。
    2. 将培养板与接种的锥体微孔在37℃和5%CO 2孵育24小时以允许GCaMP6f的病毒转导。

3.微型TENN细胞成分的研制

  1. ECM核心制造
    1. 聚集培养后,在微量离心管中加入I型胶原蛋白和层粘连蛋白至培养基(浓度为1 mg / mL),制备ECM溶液。在室温下执行步骤3.1.2-3.1.4,但在不使用时将ECM保持在冰上,以防止过早凝胶化。
    2. 通过将1-2μL转移到石膏纸上来调整ECM溶液的pH,以验证初始pH,根据需要向ECM中加入1μL1N氢氧化钠(NaOH)和/或1N盐酸(HCl)并重复直到pH为7.2-7.4。通过上下移动来确保ECM溶液的均质化,同时避免形成气泡。
    3. 将无菌镊子的微柱从步骤1.4.3中的盘子转移到空的35或60毫米培养皿中。一次在4-5个微柱上工作以防止脱水。将附着在1000μL尖端的10μL尖端连接到微量移液管。使用立体镜进行视觉引导,将尖端放在微柱的一端并抽吸以从管腔中提取残留的DPBS和气泡。
    4. 在微量移液管中快速制备4-5μLECM。观察一下将微量吸头的尖端放置在微柱的一端,并排出足够的ECM以填充内腔。确认腔内没有气泡,因为这些可能会阻止通过ECM的轴突向外生长。如果存在气泡,请删除ECM,如步骤3.1.3所述,然后再次添加ECM。
    5. 为了防止脱水,在每个微量柱附近加入〜2μL的ECM。将培养皿中的水凝胶/ ECM微柱在37℃和5%CO 2下孵育25分钟。孵育后立即进行细胞接种。
      注意:步骤3.1.5中的潜伏期是为了允许时间在微柱内胶原和层粘连蛋白的聚合。
  2. 神经细胞种植在微柱中
    注意:要改变转导的聚集体的培养基,倾斜板,使用微量移液管去除沉积在孔壁上的培养基,然后缓慢加入〜1 mL墙壁(以避免扰乱锥体微孔中的聚集体)。重复此介质更换一次。
    1. 在步骤3.1.5中的潜伏期后,将大约10-20μL的培养基转移到携带微柱的培养皿中的两个自由区域。使用微量移液器将聚集体单独转移到含有构建物的培养皿中,并用镊子将其移动到培养基的一个小池中,以保持细胞健康。
    2. 在立体镜下观察时,在双向微型TENN的微型柱的两端插入一个聚集体,或者在使用镊子的情况下,在一端插入一个聚合体,用于单向结构(根据需要)。使用立体镜确认聚集体在微柱内的位置。使用镊子将种子微柱移动到另一个小型培养基池中,以避免脱水并保持总体健康。
    3. 在37℃和5%CO 2下孵育45分钟至a使聚集体能够粘附到ECM上。验证聚合体是否使用立体镜保留在微柱的末端;重新引入细胞聚集体并根据需要重复孵育步骤。
    4. 使用血清移液管,用培养基(分别为3或6 mL,分别为35或60 mm培养皿)将包含微量TENN的培养皿小心地灌洗。将培养皿放在37℃和5%CO 2的培养箱中进行长期培养。
    5. 用培养基每2天进行一次半媒体变化。用移液器小心地取出一半的旧培养基,并使用立体镜进行视觉指导,以避免吸入微型TENN。通过用移液管缓慢加入新鲜的预热培养基来代替。
    6. 为了重新利用PDMS微孔阵列,去除培养基,将去离子水中的阵列煮沸30分钟,并在高压釜中灭菌以进行另一轮聚集体形成和培养。
      注意:在所需的时间点,可以使用相差显微镜来验证微TENN的细胞结构。这里,使用5-8ms的曝光时间和10X(0.64μm/像素)和20X(0.32μm/像素)物镜来捕获相位对比图像。使用具有50 ms曝光时间的高速荧光显微镜,10X物镜(0.64μm/像素)和具有〜480的带通滤光片的固态光捕获与病毒转导的微TENN中钙浓度变化相关的荧光nm和〜510 nm,用于激发和发射,以显示GCaMP6f荧光信号。

体外免疫细胞化学研究

注意:对于本文所示的图像,使用以下一抗体:小鼠抗Tuj-1 /β-III微管蛋白(1:500)和兔抗突触蛋白-1(1:500)用于标记轴突和前体 - 突触反弹。二抗是驴抗- 568(1:500)和驴抗兔488(1:500)。所需体积的制备的一级和二级抗体溶液以及甲醛,马血清和洗涤剂溶液的体积取决于完全覆盖构建物所需的体积。可以使用疏水屏障笔来限制每个微柱周围的面积来最小化这些体积。

小心:本节采用甲醛和Hoechst。甲醛是一种已知致癌的有毒化合物,Hoechst是一种已知的诱变剂。因此,这些化合物必须处理在适当的废物容器中。使用适当的个人防护设备(如实验室外套,安全眼镜和手套)时,请务必在化学通风柜中处理。

  1. 在化学通风橱内的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备4.0%体积/体积(v / v)甲醛溶液。
  2. 从培养皿中取出培养基用微量移液管吸取微型TENN。将足够体积的甲醛溶液加入到盘中以完全覆盖微TENN。在18-24℃下将微量TENN在甲醛溶液中浸泡35分钟,将细胞固定在微柱内。
  3. 用吸管从培养皿中取出4.0%甲醛溶液,并按照适当的危险物质处理指南丢弃。
  4. 通过添加足够的PBS完全覆盖固定的微型TENN,然后用移液管去除PBS,进行两次快速冲洗。通过将构建体浸泡在PBS中10分钟来进行第三次漂洗。
    小心:丢弃用于漂洗的PBS,可能含有痕量的甲醛。
  5. 在PBS中的4%v / v马血清中制备0.3%v / v非离子型洗涤剂溶液。从含有固定微量TENN的培养皿中取出PBS,并加入足够体积的0.3%洗涤剂溶液以覆盖构建体。浸泡60分钟18-24&#176; C使细胞透化。
  6. 用移液器去除洗涤剂溶液。通过加入并随后除去PBS进行两次快速冲洗。然后,通过在每次冲洗过程中将构建体浸泡在PBS中5分钟,进行三次更长的冲洗。
  7. 在4%马血清中稀释一抗。从包含固定和透化的微TENN的培养皿中取出PBS。向微柱中加入足够的一抗溶液以完全覆盖它们。用石蜡膜密封培养皿以防止蒸发,并在4℃下孵育过夜(12-16小时)。
  8. 从培养皿中取出初级抗体溶液,如步骤4.6所述冲洗。在黑暗中,在4.0%马血清中制备二抗溶液。添加足够的二级抗体溶液以完全覆盖构建体,用铝箔覆盖培养皿,并在18-24℃下孵育2小时。
  9. 在PBS中制备Hoechst溶液(1:10,000)以染色细胞核。
  10. 注意:用激光共聚焦显微镜拍摄免疫标记的微型TENN的图像,分辨率为2048(〜8s /帧),10X物镜(0.64μm/像素),487nm激发和〜525nm发射波长,用于绿色荧光,561nm激发和〜595nm发射波长的红色荧光,以及〜3.22μm/切片,平均具有〜60个切片。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

使用相差显微镜监测微TENNs,以评估其细胞结构和轴突生长( 图4 )。在单向,2mm长的微TENNs中,神经元聚集体被限制在微柱的一端并且通过内核投射一束轴突。轴突将体外的整个长度跨越5天(DIV)( 图4A )。双向2 mm长的微型TENN中的初始轴突生长率较高,因为轴突通过3 DIV跨越整个微柱( 图4B )。通过5 DIV,双向微TENNs特征是密集的轴突区域,连接保持在微柱极端的聚集体。在5-mm微TENNs中也观察到这种细胞结构,轴突通过5 DIV跨越微柱( 图4C )。如在所有情况下观察到的,腔内的ECM和几何恢复琼脂糖提供的表达提供了形成轴突区域所需的方向性,其结构模拟天然神经解剖学的特征。

在该方案中应用免疫细胞化学技术,并采用共焦图像来验证微TENN结构的组分。用Hoechst(蓝色)染色的细胞核几乎完全定位在单向和双向微柱的极端聚集体内,内部基本上没有Hoechst染色( 图5 )。这一观察证实了从相位对比图像中推断的结果:神经元群体仅限于末端,只有轴突(红色)跨越微TENN的内腔。然而,在轴突穿过聚集体之后,观察到沿着轴突区域进入内腔的细胞迁移,如28DIV内部存在细胞核(蓝色)所观察到的,长2mm微小TENN( 图6 )。此外,在整个细胞体和轴突区域发现突触蛋白I免疫标记(绿色)( 图6 )。突触蛋白I是涉及神经递质释放调节的突触前终蛋白,并且指示当在点状分布中发现时突触前终点的存在;之前已经通过全细胞贴片记录49形成活动性突触相关。在微TENN的富含轴突的中心区域中的突触蛋白染色可能是点状突起以及从轴突向突触前端转运的突触素的组合。然而,微TENN聚集体内突触素斑点的存在表明,这些构建体具有通过突触通信的能力,尽管突触蛋白与突触后蛋白质的共定位将需要进一步的功能性突触的结构性证据。/ P>

还用含有GCaMP6f钙指示剂的AAV转导的聚集神经元来制备微TENN,以初步探测这些构建体的电生理学性质。这些构建体在整个长度上表达钙指示剂,如神经元聚集体和轴突区域中的荧光所示图7A )。请注意,由于旨在最大化聚集体强度的显微镜设置,轴突区域中的荧光显得更加明显。用高速荧光显微镜(无外部电刺激)随时间分析这些转导的微TENN,并在代表性的微TENN中随机选择几个细胞大小的感兴趣区域(ROI),以表征这些细胞的信号传导能力结构体。几乎所有的投资回报率都观察到钙浓度突发,这反映在相关领域随时间变化的荧光强度( 图7B )。特别地,各种ROI似乎显示钙浓度增加的近恒定周期( 图7B )。这些钙浓度变化被推断为自发的,固有的动作电位,个体聚集体内的细胞信号传导和/或来自不同聚集体的轴突信号的结果。需要进一步的分析来完全表征微TENN内神经元和轴突区的电生理特性。然而,这些初步结果表明微TENNs表现出强大的内源/基线电活动。

图3
图3:激光切割微柱制造装置的蓝图和用于细胞聚集的3D印刷金字塔微孔模具。A) - ( B )分别用于制造水凝胶微柱的圆柱形通道阵列的底部和上半部的蓝图和图像。 ( C )用于将设备保持在一起的蓝图和图像。前部和后部片段均具有相同的尺寸。 ( D )制造微柱所需的组装装置的图像。只有两个盖子和下半部分用下面的两个定位孔(左)中的螺钉夹紧在一起。虚线显示针刺针穿过每个帽子上的五个孔的位置。将液体琼脂糖添加到圆筒的下半部分,然后将上半部分(右)放置在装置上以将液体琼脂糖模塑成形。 ( E )用于制造PDMS微孔阵列的3D印刷模具的蓝图。 ( F )3D打印模具(左)和PDMS微孔阵列(右)的图像。所有尺寸均为毫米米(mm)。 请点击此处查看此图的较大版本。

图4
图4:通过单向和双向构建体的相差成像作为体外天数的函数观察微TENNS中的轴突生长。A )单向2 mm长的微型TENNs显示了通过5 DIV将微柱的几乎整个长度延伸的轴突束。 ( B )与单向微TENN相比,双向2mm微TENNs显示更快的轴突生长速率。 ( C )对于5 mm双向微TENN,轴突区域以5 DIV填充微柱的长度。这种架构至少保持到10 DIV。刻度棒=200μm。/ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。

图5
图5:用免疫标记的单向和双向微TENN的共聚焦图像观察到的微-TENN细胞结构。细胞染色细胞核(Hoechst;蓝色)和轴突(Tuj1;红色)。 ( A )5mm双向微型TENN(28DIV)的相位对比图像。分别为5mm双向(28DIV)和单向(25DIV)微型TENN的共焦重建( D ) - ( F )和( I ) - ( K )显示标记的细胞核( D ),( I )和轴突( E ),( J ),以及覆盖( F ),( K )。刻度棒:500μm。 ( A F )和( K )指神经元聚集体和轴突束的相位对比度( B ) - ( C )和共聚焦( G ) - ( H ),( L ) - ( M ) 。图像显示限制在微TENN的末端的聚集体,而管腔由对准的轴突束跨越。刻度棒=100μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图6
图6:突触前蛋白突触蛋白I在代表性的双向微TENN中的表达。构建体对细胞核(Hoechst;蓝色),轴突(Tuj1;红色)和突触前突触(突触蛋白I;绿色)进行染色。 ( A )Phase-contr在28 DIV的2 mm双向微型TENN的ast图像。 ( D ) - ( G )显示三个通道的细胞核( D ),轴突( E ),突触前突触( F )和覆盖物( G ))的共焦重建。盒子分别显示神经元聚集体的相位对比度和重叠图像的放大( B ) - ( C ),( H ) - ( I )。刻度棒=100μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图7
图7:通过表达遗传编码的钙指示剂观察到的双向微TENN中的自发信号传导活性。A )荧光灯e显微镜证实了GCaMP报告基因的表达,如通过聚集体和轴突中的荧光观察到的。刻度棒=100μm。 ( B )在几个感兴趣的区域(ROI)作为时间的函数测量与钙浓度变化相关的荧光变化。 ( A )中编号的彩色圆圈表示这些ROI。 请点击此处查看此图的较大版本。

图8
图8:微型TENN方法的常见故障模式的相位对比图像。A )在制造的初始阶段DPBS的去除和/或蒸发的结果是完全脱水/干燥的琼脂糖微柱。比例尺= 5081;米。 ( B )由于缺乏针刺针与毛细血管的同心对准,水凝胶微柱的管腔内衬建筑物的外壁。刻度棒=100μm。 ( C )具有两个聚集体的接种微量TENN存在于1DIV。 ( D )其中一个聚集体与3 DIV的( C )相同的微柱脱落。 ( E )4 DIV处的单向微型TENN。 ( F )( E )中的聚集体和轴突束从微柱中脱落,并保持在5DIV的培养基中漂浮。 ( C ) - ( E )= 300μm的比例尺。 请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CNS损伤和疾病通常导致构成脑连接的长途轴突途径的丧失或功能障碍,伴有或不伴有神经元变性。由于中枢神经系统有限的能力来促进神经发生和再生,所以复合化。尽管追求修复策略,如生长因子,细胞和生物材料传递作为个体或组合方法,这些技术不能同时解释神经元细胞的退化和轴突连接的损失14,22。技术上的这些差距限制了以受控和持续的方式修复,改变和探测神经网络的能力。因此,微型TENN技术被开发以解决对神经修复策略的需要,与现有方法相比,促进神经元替换和长轴突连接的重建。话筒ro-TENNs是可植入的生物支架,具有预先形成的细胞结构,其接近专门设计用于宿主神经回路的靶向重建,替换和修饰的大脑连接体的系统级构建块。这些支架由微小圆柱形琼脂糖水凝胶的含ECM腔内的长轴突束连接的离散群体组成。这些构建体可能能够用作突触中继来代替丢失的途径并动态调节本机电路。另外,在孤立的轴索变性(源神经元保持完整)的情况下,微TENN可能作为轴突再生的指导,基于轴突促进轴突再生的机制。该手稿提出了制造协议,以可靠地创建具有受控几何,表型和功能特征的微型TENN。相差显微镜,免疫细胞化学Stry和共聚焦显微镜证实,用方案产生的微TENNs显示所需的细胞结构并表达突触前蛋白突触蛋白。此外,显示出在不存在外部模拟的情况下,微TENN具有固有的信号传导活动,可能是由于动作电位引起的。这是通过存在与遗传编码的钙记者相关的荧光的近同步波动来确定的。

微型TENN开发可以通过三个步骤来总结:(1)中空水凝胶管的制造,(2)将ECM溶液加入到管腔中,和(3)将分离的神经元的聚集体接种到管端。微柱可以用玻璃毛细管或含有圆柱形通道的微制造装置制造。该设备可以用调查员可用的任何高精度微制造方法创建。液体将琼脂糖倒入装置的通道或装入含有中心针刺针的毛细管中以产生水凝胶微柱。在琼脂糖胶凝后,取出针刺针以产生中空管腔。在制造或生长过程中发生的几个常见的陷阱在图8中突出显示。注意, 图4中显示的一些图像和图8B中的极端情况示出了腔体部分不稳定地靠近圆柱体的壁。为了在使用毛细管法时产生均匀的壁厚,当与琼脂糖接触时,管针组件应保持直立,并且针应保持在管的中心。保持管 - 针组件相对于琼脂糖表面成一定角度,促进针的分散。然而,这些预防措施难以实施,而针头通常不是休息的阿隆g毛细管的壁。相反,微型装置的主要优点是它具有与圆柱形通道同心对准的针孔,从而分别促进针和管腔相对于通道和微柱的适当集中。此外,该装置通过促进同时制造几个微柱来增加产量。尽管设备提供了好处,但是仍然可以通过使用弯针针来创建离心腔。微制造技术也具有限制其有效性的内在宽容。通常,如果遵循整个协议中提供的建议,微柱脱水对图8A中显示极端情况的影响不应该是一个障碍。请注意,用于外包裹的琼脂糖的物理性质可能需要优化替代神经元亚型,因为改良的皮层神经元观察到较高(3-4%)和较低(1-2%)琼脂糖浓度的尿毒素和神经突生长10

微型TENN开发继续将ECM引入微柱腔,其用于提供足够的神经元粘附,存活和生长的环境。此外,ECM与由琼脂糖水凝胶提供的几何限制和低孔隙结合限制轴向长度方向的生长以产生必要的结构。 ECM解决方案的内容可以针对所用神经元的类型进行优化。例如,胶原单独促进DRG微TENN中的存活和轴突生长,而皮质神经元10需要胶原和层粘连蛋白的组合。此外,在细胞培养之前,微柱内的ECM聚合是关键的,因为具有未聚合的ECM的细胞的共同递送导致减少的神经突出现owth和fasciculation 31 。注意,即使微柱最初填充有ECM溶液,其内含物聚合成软凝胶,并且在孵育期间趋于收缩,形成允许插入细胞聚集体的空间。此外,重要的是通过立体镜检查来确认ECM进入微柱内部;丢失的ECM的完全缺失和/或口袋结构导致聚集体缺乏轴突生长。微型TENN制造最终导致了脚手架极端皮层神经元聚集体的种植。使用已知方法48从大鼠胎儿解剖这些神经元。可以推断,大多数分离的细胞是神经元,因为用于分离的妊娠时期的胚胎大鼠皮质由99%的神经元组成,并且方案中使用的限定的培养基是代谢限制胶质细胞增殖 49 。因此,应该有最小的胶质细胞污染,尽管特定标记物的染色需要确认。虽然本手稿提供了具有皮层神经元的微TENN制造,但是可以根据期望的应用使用来自不同脑区域( 例如黑质,丘脑和海马)或具有不同表型( 例如兴奋性,抑制性和多巴胺能)的神经元植入面积微型TENN制造方案的先前迭代涉及种子解离细胞10,31,32。虽然使用解离法获得了所需的细胞结构,但是在所有情况下都没有实现。在许多情况下,分离的细胞淹没了内部,并导致整个管腔中的几个细胞体团簇,其中过程将它们连接在广泛的3D网络参考文献10,31,另一方面,聚合方法确保细胞体到极限的存在,因此是微型TENN技术成功的组成部分( 图5 ),代表性的微型TENNs显示如图8D8E所示,与图8D8E所示的实施例相比, 图4-6中制备的聚集体较大,未完全插入,有时会导致聚集体从培养基中的微柱脱落,为了防止这种情况,完全插入微柱内部,如果在应用以前的策略后仍然出现这种情况,可以延长初始孵化期,为ECM提供足够的时间聚集,在培养过程中,微量TENN的温和处理是建议保持水凝胶包裹和细胞结构的完整性;微T期间的问题ENN操作是否定方向的轴突束获得的曲率的原因( 图5 )。然而,按照本文中提出的方案,应该导致具有预期神经元/轴突结构,突触前bouton分布和固有电活动的微TENN的一致制造。

尽管微型TENN承诺,仍然存在可能限制该技术应用的挑战。目前的微柱制造技术受到微柱腔分散的限制,这可能导致机械线索对细胞( 例如刚度)的不一致呈现,微柱壁的破裂和随后的轴突束暴露到外部,以及植入期间的问题。尽管与毛细管相比,微制造装置的使用提高了结果,但是更高精度的微观结构需要n种技术来增加这些构建体的尺寸再现性。该手稿的结果表明,微TENN方法可以可靠地产生由神经元和轴突区组成的生物支架,其类似于天然神经解剖学,特别是连接不同脑区的轴突区。然而,微TENN长度是一个障碍,取决于需要替换的宿主轴突途径的长度。例如,组织工程神经移植物(TENGs)是我们的研究小组利用的单独的生活支架策略来修复极长的神经损伤。为了取代这些长间隙,通过在定制的机械生物反应器1,23,50中施加连续的机械张力,TENG中的轴突可以延长到几十厘米。这种“拉伸生长”技术也被应用于操纵星形胶质细胞过程长度r模拟径向胶质细胞通路的结构51 。相反,目前的微型TENN技术还没有提供这种程度的控制;目前,最大可达到的长度受限基于传统的生长锥介导的延伸,轴突束可以在体外生长多长时间。此外,即使CNS具有响应于各种刺激的神经生理重新布线的内在能力,并且移植的细胞具有与天然电路突触整合的能力,该技术的另一个限制是微TENN依赖于天然大脑的可塑性以及主机网络与植入的构建体52,53,54,55功能地整合的能力。最后,所有基于种植体的方法(如微型TENN)的天生缺陷是其侵入性。由于神经元是通常在紧密的毛细血管附近,任何类型的外科手术都可能导致血脑屏障破裂,血液因子渗入脑实质,以及急性(甚至慢性)炎症反应31 。这种反应可能会损害宿主和微型TENN神经元,抵消了这种技术的有益方面。然而,植入大鼠皮质丘脑途径的微TENNs存活至少1个月,并显示与主体大脑皮层10,31结构整合的证据。此外,我们研究组的以前的出版物提出了一种方法,可以将微TENNs无针入植入大鼠脑31 。在这种方法中,这种水凝胶包装策略得到增强,包括一个薄(〜20μm)的羧甲基纤维素涂层,在轻度脱水后,呈现足够的硬度穿透大脑不需要针或引导件31 。这种无针注射方法与微柱的小横截面相结合,应尽可能减少立体定位植入过程中和之后对脑的损伤。

尽管微型TENN 在体内取得了初步的成功,但未来的研究将需要证实这些结构与天然组织突触整合,并调查是否在CNS损伤和神经变性疾病模型中获得功能恢复10,31。例如,定制的微型TENN可以被设计成具有特定的细胞表型并植入到相应的退化途径中以重建网络并恢复功能。为了减少植入后的急性炎症反应,微TENN水凝胶外壳可掺杂有抗炎和预存的试剂。替代制作可以开发技术( 例如, 3D打印)以更容易地产生水凝胶微柱,并具有更精确的特征,包括内腔的一致集中和尺寸的再现性。可以修改与微TENN相同的生物材料方案,以解决CNS损伤和疾病的其他特征性病理。例如,我们的团队以前已经开发出包括纵向排列的星形胶质细胞束的构造,沿着胶原包被的琼脂糖水凝胶腔,结构上模拟径向胶质通道和胶质管以促进轴突再生和神经元迁移。另外,干细胞,如人类胚胎干细胞(HESCs),诱导多能干细胞(iPSCs)和脂肪来源的干细胞(ASCs),可以纳入每个患者的基础上制造自体微TENN更多非常类似于丢失的细胞结构和细胞表型。这些futu重新修改将增加微TENNs 在体内取代退化途径的能力并且将允许重建更复杂的组织结构,结合星形胶质支持和轴突髓鞘形成以及其他特征。基因工程神经元也可以接种,以通过释放营养因子来增强微型TENN的再生作用,或通过光门控离子通道43的光生刺激来调节CNS。这些支架可以用兴奋性或抑制性神经元制造,以在诸如癫痫,抑郁症,药物成瘾或疼痛障碍的病症中突触调节现有的功能障碍宿主连接1 。例如,可以构建主要形成GABA能或谷氨酸能突触的微型TENN,以分别抑制或刺激通过突触整合和/或通过体神经的上调或下调通路o发射器释放。重要的是,这种自包含的调制结构在理论上将是基于主机网络反馈的响应1 。类似地,微TENN可以作为脑 - 计算机接口(BCI)应用,光电工程微型TENN用作大脑和无机刺激或记录装置之间的中间体。该应用可以是微电极BCI的替代物,其缺乏特异性细胞靶向和机械稳定性并且已经引起炎症反应,胶质瘢痕形成以及当渗入脑中时的神经元迁移或损失57,58

作为体外试验台,微型TENN可为神经生物学和电生理学研究提供强大的平台,作为神经系统的生物传感模型。另外,当用作神经注射时,3D构造可用作治疗策略的试验台尿病模型59 。作为3D构造,微型TENN能够模拟体内环境,其特征在于在所有空间方向上的复杂的细胞 - 细胞和细胞 - ECM相互作用,其不能在平面培养物42,60,61,62,63中精确表示 64,65 。事实上,许多研究已经确定,环境的类型对于细胞呈现在天然植物中呈现的形态,增殖,迁移,基因表达,分化和信号是至关重要的。这些支架的3D环境与大脑本身之间的相似之处在于这些构造物对其物理和生物化学物质的控制程度的补充操作42 。这允许使用不同组的机械,触觉和趋化性信号对微TENN进行工程化,以单独或协同地研究这些线索对神经元存活,成熟,轴突延伸,突触形成和机械转导的影响。此外,这种微组织工程技术的设计灵活性允许构建模仿脑组织的其他特征的生物支架,例如由连接体的轴突区跨越的新皮层的柱状,分隔的结构,以进一步增加这个系统的力量作为体外平台来研究大脑65 。作为研究平台,微型TENN利用典型体外模型的受控设置,组织中设计参数的广泛可用性Gineering方法,以及3D平台增加的生理和病理生理相关性,成为推进神经生物学知识的理想测试床。该技术的无数未来发展方向代表了微型TENN的多功能性。该手稿已经证明,微型TENN协议可以可靠地生产组织工程生物支架,其模拟脑神经解剖学的关键特征,为神经生物学现象,包括发育,疾病和修复过程提供新的见解。这些构建体还可以与天然组织突触整合以重建损伤的白质块,替代丢失的神经元细胞,并调节CNS损伤和疾病之后的失调途径。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可以披露的。

Acknowledgments

财政支持由美国国立卫生研究院U01-NS094340(Cullen),T32-NS043126(Harris)和F31-NS090746(Katiyar)提供),Michael J.Fox基金会(治疗管道计划#9998(Cullen)), Penn医学神经科学中心试点奖(Cullen),国家科学基金会(研究生研究奖学金DGE-1321851(Struzyna和Adewole)),退伍军人事务部(RR&D优异评估#B1097-I(Cullen)),美国协会的神经外科医生和神经外科医生大会(2015-2016 - 神经损伤与重症监护(Petrov)Codman研究金)和美国陆军医学研究和物资司令部(#W81XWH-13-207004(Cullen)和W81XWH-15-1- 0466(Cullen))。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16, (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67, (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27, (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31, (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48, (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21, (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26, (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11, (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6, (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106, (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6, (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11, (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3, (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20, (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3, (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14, (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23, (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116, (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24, (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80, (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25, (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44, (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5, (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics