Anatomisk inspirerede tredimensionale mikrovæv-konstruerede neurale netværk til nervesystem rekonstruktion, modulering og modellering

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette manuskript beskriver fremstillingen af ​​mikrovæv-manipulerede neurale netværk: tredimensionale mikronstørrelseskonstruktioner bestående af langjusterede aksonale kanaler, der spænder over aggregerede neuronal populationer indkapslet i en rørformet hydrogel. Disse levende stilladser kan fungere som funktionelle relæer til rekonstruktion eller modulering af neurale kredsløb eller som biofideliske test-senge, der efterligner grå-hvid stof neuroanatomi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Funktionel opsving opstår sjældent efter skade eller sygdomsfremkaldt degeneration i centralnervesystemet (CNS) på grund af det hæmmende miljø og den begrænsede kapacitet til neurogenese. Vi udvikler en strategi til samtidig at behandle neuronal og axonal baneforløb inden for det beskadigede CNS. Dette manuskript præsenterer fremstillingsprotokollen for mikrovæv-manipulerede neurale netværk (mikro-TENNer), implanterbare konstruktioner bestående af neuroner og justerede axonale kanaler, der spænder over den ekstracellulære matrix (ECM) lumen af ​​en præformeret hydrogelcylinder hundredvis af mikron i diameter, der kan strække sig centimeter i længden. Neuronal aggregater er afgrænset til ekstremerne af den tredimensionelle indkapsling og spændes af aksonale fremspring. Mikro-TENN'er er unikt justeret som en strategi for CNS rekonstruktion, emulerende aspekter af hjerne-forbindelse cytoarkitektur og potentielt tilvejebringe midler til netværksudskiftning. Den neuRonale aggregater kan synaps med værtsvæv til at danne nye funktionelle relæer til at genoprette og / eller modulere manglende eller beskadigede kredsløb. Disse konstruktioner kan også virke som proregenerative "levende stilladser", der er i stand til at udnytte udviklingsmekanismer til celle-migration og axonal pathfinding, der tilvejebringer synergistiske strukturelle og opløselige signaler baseret på regenereringstilstanden. Mikro-TENN'er fremstilles ved at hælde flydende hydrogel i en cylindrisk form indeholdende en langsgående centreret nål. Når hydrogelen har geleret, fjernes nålen og efterlader en hul mikrokolonne. En ECM-opløsning tilsættes til lumenet for at tilvejebringe et miljø egnet til neuronal vedhæftning og axonal udvækst. Dissocierede neuroner er mekanisk aggregeret til præcis podning i en eller begge ender af mikrokolonnen. Denne metode giver pålideligt selvstændige miniaturekonstruktioner med langt fremspringende aksonale kanaler, der kan genopbygge træk ved hjernens neuroanatomi. Synaptisk immUnolabeling og genetisk kodede kalciumindikatorer tyder på, at mikro-TENN'er har en omfattende synaptisk fordeling og iboende elektrisk aktivitet. Derfor repræsenterer mikro-TENN'er en lovende strategi for målrettet neurokirurgisk rekonstruktion af hjerneveje og kan også anvendes som biofideliske modeller til at studere neurobiologiske fænomener in vitro .

Introduction

En fælles karakteristika for lidelser og sygdomme i centralnervesystemet (CNS), såsom traumatisk hjerneskade (TBI), rygmarvsskade (SCI), slagtilfælde, Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom er afbrydelsen af ​​aksonale veje og neuronale celler Tab 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . For eksempel, når et iskæmisk slagtilfælde går ubehandlet, estimeres det, at axoner går tabt med en hastighed på 7 miles af axoner pr. Minut 5 . I tilfælde af TBI, som ca. 1,7 millioner mennesker oplever hvert år alene i USA, kan axonal degeneration fortsætte med at forekomme år efter traumer, da den oprindelige skade udfælder en langtids neurodegenerativ tilstand 4 . Forværring af disse skadelige virkninger har CNS en stærkt begrænset capaBy til regenerering 1 , 7 , 8 , 9 . Efter skader udvikler et hæmmende miljø, der er kendetegnet ved manglende rettet vejledning til fjerne mål, tilstedeværelsen af ​​myelin-associerede inhibitorer, der forhindrer neuritudvæksten og dannelsen af ​​et glialær ved reaktive astrocytter 8 , 10 , 11 , 12 . Glialæren tjener som en biokemisk og fysisk barriere for regenerering med molekyler som chondroitinsulfatproteoglycaner, der forhindrer axonudvækst 8 , 11 . Selvom neurale stamceller er blevet fundet i det voksne CNS, er produktionen af ​​nye neuroner begrænset, da konsistente tegn på neurogenese kun er blevet fundet i lygtepæren, den hippocampaleSubgranulær zone, det periventrikulære område og den centrale kanal i rygmarven 13 , 14 . Disse hindringer forhindrer funktionel genopretning af tabte neuroner og hvid materiel arkitektur efter skade eller sygdom, hvilket resulterer i de ofte livsforandrende og langvarige virkninger af disse tilstande.

På trods af manglen på regenerativ kapacitet i det voksne CNS, er det blevet påvist, at axonal regenerering er mulig, hvis der fremlægges passende miljømærker til værtsneuroner 15 , 16 , 17 , 18 . Forskere har forsøgt at levere og manipulere vækstfaktorer ( fx nervevækstfaktor, epidermal vækstfaktor, glialafhængig vækstfaktor og neurotrofisk faktor-3) og andre vejledningsmolekyler til stimulering af plasticitet og axonregenerering 14 , </ Sup> 18 , 19 . Selv om disse undersøgelser har bekræftet, at voksne axoner er i stand til at reagere på vækstfaktorer, er disse strategier begrænset af den lave permeabilitet af blodhjernebarrieren og de specifikke rumlige og tidsmæssige gradienter, der kræves for at fremme regenerering 14 , 18 , 19 . Andre fremgangsmåder har påberåbt hyperaktiviteten af ​​regenerationsrelaterede transkriptionsfaktorer i CNS neuroner. For eksempel stimulerede overekspression af stat3-transkriptionsfaktoren axonal regenerering i optisk nerve 20 . Ikke desto mindre undlader både biomolekylafgivelse og overekspression af transkriptionsfaktorer at erstatte tabte neuronale populationer. Cellebaserede strategier har hovedsageligt centreret om transplantation af neurale stamceller (NSC'er) i CNS, idet de udnytter deres evne til at erstatte CNS-neuroner, frigive trofiske faktorer,Og støtte de forsøg på neurogenese, der opstår efter skade 17 . På trods af dette er der stadig presserende udfordringer, der forhindrer denne tilgang, herunder transplanterede neurale cellers hæmmede evne til at overleve, integrere med værten og forbliver rumligt begrænset til det skadede område 6 , 14 , 17 , 21 . Desuden er celleafgivelse alene ude af stand til at genetablere cytoarkitekturen af ​​beskadigede eller tabte axonale veje. En alternativ tilgang, der behandler problemerne med celle- og lægemiddel / kemikalieleveringsstrategier, kombinerer disse fremgangsmåder med anvendelsen af ​​biomaterialerne 14 , 22 , 23 . Biomaterialer såsom hydrogeler er i stand til at emulere de biokemiske og fysiske egenskaber af den ekstracellulære matrix (ECM), der hjælper med celletilførsel ogD retention inden for det skadede område og levere vækstfaktorer og andre bioaktive molekyler med kontrolleret frigivelse 22 . De attraktive egenskaber ved disse biomaterialebaserede strategier har resulteret i beviser for in vivo axonal regenerering efter transplantation af stilladser til det læsionerede område 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Imidlertid erstatter acellulære biomaterialestrategier ikke tabte neuronale populationer; Når de anvendes som leveringskøretøjer til neuronale, glial- eller neuronale precursorceller, er biomaterialer ikke i stand til at rekonstituere langdistance-axonale netværk. Udfordringen med at udvikle en tilgang, der tackler både den axonale path degeneration og neuronale tab forbundet med CNS skade og sygdom er stadig <Sup class = "xref"> 31.

Vores forskergruppe har tidligere rapporteret udviklingen af ​​implanterbare mikrovæv-manipulerede neurale netværk (mikro-TENN'er), som er en type "levende stillads" bestående af neuronelle celleorganer begrænset til en eller begge ender af en agarosehydrogel-ECM mikrosøjle , Med justerede aksonale kanaler, der strækker sig gennem det indre af denne tredimensionale (3D) indkapsling 1 , 10 , 31 , 32 . En af de største forskelle mellem denne teknik og tidligere tilgange er, at cytoarkitekturen af ​​mikro-TENN'er er skabt helt in vitro og transplanteres bagefter 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , <Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . In vitro- fremstilling giver omfattende rumlig og tidsmæssig kontrol af cellulær fænotype og orientering, mekaniske / fysiske egenskaber, biokemiske signaler og eksogene faktorer, hvilket gavner værten efter integrationen af ​​disse stilladser efter implantation 41 , 42 . Mikro-tenner er anatomisk inspireret, fordi de efterligner hjernens neuroanatomi, viser axonale kanaler, som ligner dem, der broerer de forskellige funktionelle regioner i hjernen ( figur 1A ) 1 . Derfor kan denne strategi være i stand til fysisk at erstatte tabte hvide stofkerner og neuroner efter implantation i en læsioneret region. Denne teknik er også inspireret af udviklingsmekanismer, hvor "naturlige levende stilladser" dannet af radiale glialceller og banebrydende axoner virker som vejledende guider for celleMigration fra subventriculær zone og aksonal udvækst, henholdsvis 43 . Disse mekanismer er rekapituleret i de justerede aksonale kanaler i mikro-TENN'er, som kan fremvise levende veje for neuralcellemigration og axonal regenerering ved axonformidlet aksonal udvækst ( figur 1C ) 43 . Desuden udnytter denne strategi fordel af synaptisk integration mellem mikro-TENN-neuronerne og det oprindelige kredsløb, der danner nye relæer, der kan bidrage til funktionel opsving ( figur 1B ) 43 . Kapaciteten til synapsdannelse kan også give denne tilgang evnen til at modulere CNS og reagere på værtsvæv ifølge netværksfeedback. For eksempel kan optogenetisk aktive neuroner i de levende stilladser stimuleres til at modulere værtsneuroner gennem synaptiske interaktioner ( figur 1D ).

Derudover vil den biomaterialebaserede rørformede konstrUgn af mikro-tenner giver et passende miljø til celleadhæsion, vækst, neuritilvækst og signalering, mens konstruktionernes miniaturedimensioner muliggør muligvis minimalt invasiv implantering og tilvejebringer en delvis sekvestreret mikromiljø for gradvis integration i hjernen. Faktisk har nyere publikationer vist potentialet hos mikro-tenner til at efterligne neurale veje efter implantation i rottehjerne. Efter stereotaxisk mikroinjektion rapporterede vi tidligere tegn på mikro-TENN-neuronal overlevelse, vedligeholdelse af aksonalkanalarkitektur og neurit forlængelse i værtscortex ud til mindst 1 måned in vivo 10 , 31 . Endvidere tilvejebragte mærkning med synapsin histologisk bevis for synaptisk integration med nativt væv 10 , 31 . Samlet set kan mikro-tennene være særligt velegnede til at rekonstruere og modulere beskadigedeCNS ved at erstatte tabte neuroner, synaptisk integrering med værts kredsløb, genoprette tabt aksonal cytoarkitektur og i visse tilfælde at tilvejebringe regenererende axoner med de relevante vejsøgningsindikatorer.

figur 1
Figur 1: Principper og inspiration bag udviklingen af ​​mikrovæv-manipulerede neurale netværk (mikro-tenner). ( A ) Mikro-TENN'er efterligner cytoarkitekturen i hjernekoblingen (lilla), hvor funktionelt adskilte regioner er forbundet med lange, justerede aksonale kanaler i en retningsretning (rød, grøn) eller tovejs (blå) måde. Som et eksempel kunne mikro-tenner rekonstruere tabte forbindelser i kortikothalamiske og nigrostriatale veje eller i den perforere vej fra entorhinal cortex til hippocampus (tilpasset fra Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagram af en ensrettet retningL og tovejs mikro-TENN (henholdsvis rød og blå) synaptisk integrering med værts kredsløb (lilla) for at fungere som et funktionelt relæ mellem begge ender af en læsion. ( C ) Skematisk af aksonale kanaler af en ensrettet mikro-TENN (grøn), der tjener som en vejledning til akson-faciliteret regenerering af værtsaksoner (lilla) mod et mål, som mikro-tennene interagerer med. ( D ) Konceptdiagram over brugen af ​​optogenetisk aktive mikro-TENNS som neuromodulatorer, idet man udnytter synaptisk integration med excitatoriske eller hæmmende neuroner (bund). Klik her for at se en større version af denne figur.

Det nuværende manuskript beskriver den metode, der anvendes til fremstilling af mikro-TENN'er ved anvendelse af embryonalt afledte cerebrale kortikale neuroner. Især kan mikro-tenn fremstilles med andre typer af neurale celler. For eksempelDe oprindelige rapporter om succesfuld mikro-TENN-udvikling omfattede dorsale rodganglion (DRG) neuroner 32 . Hydrogelmikrokolonnerne kan genereres ( figur 2A ) ved tilsætning af flydende agarose til et skræddersyet, laserskæret cylindrisk kanalarray eller til kapillarrør, der begge indeholder indstillede akupunkturnåle. Nålen danner lumen og bestemmer mikrokolonnens indvendige diameter (ID), medens kapillarrørets ID og diameteren af ​​cylindrene i den laserskårne anordning dikterer konstruktionernes ydre diameter (OD). OD og ID kan vælges ifølge den ønskede ansøgning ved at vælge forskellige diametre for henholdsvis anordning / kapillærrør og akupunktur nåle. Længden af ​​mikrokolonnerne kan også varieres; Til dato har vi rapporteret opførelsen af ​​mikro-tenner op til 20 mm i længden 10 og arbejder aktivt med længere længder. Efter agarosegelene og akupunkturen nEedler fjernes, en ECM-opløsning, som generelt består af type I-collagen, og laminin tilsættes til konstruktionens lumen ( figur 2C ). ECM-kernen tilvejebringer et stillads til understøttelse af neuronal celleadhæsion og axonal udvækst. I første omgang blev primære rottekortiske neuroner udpladet i mikrokolonnerne under anvendelse af dissocierede cellesuspensioner 10 , 31 , 32 . Denne fremgangsmåde producerede imidlertid ikke mål-cytoarkitekturen i alle tilfælde, som blev defineret som de neuronale cellelegemer, der var begrænset til enderne af mikrokolonnerne, med det centrale lumen bestående af renjusterede aksonale kanaler. Siden da har brugen af ​​en tvungen neuronal aggregeringsmetode (baseret på protokoller tilpasset fra Ungrin et al .) Muliggjort en mere pålidelig og ensartet fremstilling af mikro-tenner med den ideelle struktur ( figur 2B ) 44 . Ud over at beskrive strømmenMetode, vil denne artikel vise repræsentative fasekontrast og konfokale billeder af mikro-TENN'er, der demonstrerer dannelsen af ​​axonale kanaler over tid, såvel som den færdige mål-cytoarkitektur. Dette manuskript vil også udvide på bemærkelsesværdige aspekter af protokollen og de resterende udfordringer og fremtidige retninger af mikro-TENN teknologien.

Figur 2
Figur 2: Skematisk diagram over tre-trins mikro-TENN fabrikationsprocessen. ( A ) Udvikling af agarosehydrogelen: (i) Indledningsvis indsættes en lille akupunkturnål ( f.eks . 180-350 μm i diameter) i en cylindrisk kanal af en skræddersyet laserskæret form eller et kapillarrør ( f.eks. , Diameter 380-700 μm). I det næste trin introduceres flydende agarose i DPBS i de cylindriske kanaler eller kapillarrør. (Ii) Efter agarosegelene fjernes nålen ogFormen er adskilt for at give de hule agarosemikolonner. (Iii) Disse konstruktioner steriliseres derefter og opbevares i DPBS. ( B ) Primær neuronkultur og aggregatmetoden: (i) Neuronal aggregering udføres i pyramidale mikrobrøndsarrayer, støbt fra 3D-trykte forme, der passer ind i brøndene på en 12-brønds kulturplade. (Ii) Mikro-TENN'er indbefatter primære rotte neuroner dissocieret fra føtalhjerner af embryonaldag-18 rotter. Efter vævsdissociation med trypsin-EDTA og DNase I fremstilles en celleopløsning med en densitet på 1,0-2,0 x 106 celler / ml. (Iii) 12 μl af denne opløsning overføres til hver brønd i den pyramide mikrobrøndsarray. Pladen indeholdende disse mikrobrønde centrifugeres for at fremstille celleaggregater. (Iv) Disse inkuberes derefter natten over inden plating i mikrokolonnerne. ( C ) ECM-kernefabrikation og celledannelse: (i) Forud for cellesædning blev en ECM-opløsning indeholdende 1 mg / ml type I-kollagen og 1 mg / mlLaminin overføres til det indre af mikro-tennene og får lov til at polymerisere. (Ii) Afhængigt af om ensrettet eller tovejs mikro-tenn fremstilles, anbringes et aggregat i henholdsvis en eller begge ekstremer af mikrokolonnen. (Iii) Efter en inkubationsperiode for at fremme vedhæftning dyrkes mikro-TENN i petriskåle oversvømmet med suppleret embryonalt neuronalt basalt medium. Iv) Efter 3-5 dage i dyrkning skal den endelige mikro-TENN-struktur demonstrere celleaggregater ved yderpunkterne af mikrokolonnen, med aksonale kanaler, der strækker sig over længden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr, blev godkendt af de institutionelle dyrepleje- og brugskomitéer ved University of Pennsylvania og Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center og fulgte retningslinjerne i NIH's folkesundhedspolitik om human pleje og brug af laboratorium Dyr (2015).

1. Udvikling af agarosehydrogelen (acellulær komponent af mikro-tenner)

  1. Agaroseopløsningspræparat
    1. Inden for et biosikkerhedsskab skal du forberede reservoirer til mikrokolonnerne ved at overføre 20 ml Dulbeccos fosfatbuffede saltvand (DPBS) til hver af to 10 cm petriskåle. Steriliser fine pincett og mikroskalpeller med en varm pearl sterilisator.
    2. Væg 3 g agarose og overfør den til et sterilt bæger inde i biosikkerhedskabinet. Tilsæt 100 ml DPBS til en slutkoncentration på 3% vægt / volumen (w / v). Medtag en ren magnetisk bar og dække bægeret med alumiNum folie.
    3. Med en varm plade / omrører, varm bægeret ved 100 ° C og omrør ved 120-200 omdr./min for fuldstændigt at opløse agarosen (opløsningen bliver fra overskyet til rydning). Oprethold opvarmningen og omrøringen bagefter for at forhindre gelering og ændre varmetemperaturen efter behov for at undgå at brænde agarosen.
      BEMÆRK: Fremstilling med både den laserskærede enhed og kapillærrørene er vist nedenfor i henholdsvis afsnit 1.2 og 1.3. Fortsæt til underafsnit 1.4 efter afslutning af trinene beskrevet i begge underafsnit. Til begge mikrokolonnefabrikationsmetoder tilsættes flydende agarose hurtigt, da agarose størkner hurtigt, når det afkøles. Når du steriliserer med en autoklav i et af følgende trin, skal du bruge de standardbetingelser, der anvendes på glasvarer.
  2. Fremstilling af mikrokolonne ved brug af en laserskæret enhed
    BEMÆRK: Den laserskærede enhed skæres i gennemsigtig akryl ved hjælp af en kommerciel CO 2 laserskærer. FabKation af strukturer og indretninger gennem laserskæring er veldokumenteret for en række tekniske og forskningsanvendelser 45 , 46 , 47 . Denne form ( figur 3 ) består af en række af fem cylindriske kanaler, hver med en diameter på 398 μm og en længde på 6,35 mm. Disse cylindriske arrays er dannet langs deres længde af to stykker: en bundhalvdel (længde: 25,4 mm, bredde: 6,35 mm, højde: 6,0 mm) og en øverste halvdel (længde: 31,5 mm, bredde: 6,35 mm, højde: 12,7 mm ) Som vist i fig. 3A og 3B . De to halvdele kan fastspændes sammen af ​​de forreste og bageste hætter, der observeres i figur 3C (længde: 31,5 mm, bredde: 6,35 mm, højde: 12,7 mm), der har fire indstillingshuller, der falder sammen med to huller hver på toppen og bunden Stykker, og det hjælper med at sikre alle dele sammen, når de skrues. Disse hætter også incLude fem huller, koncentriske til de cylindriske kanaler, i hvilke acupuncture nåle kan indsættes for at danne lumen af ​​mikro-søjler.
    1. Steriliser apparatet vist i figur 3 ved at dække det med aluminiumsfolie og autoklavering. Saml enheden som vist i Figur 3D ved at tilpasse de forreste og bageste hætter med kun nederste halvdel og fastgør de tre dele med to # 4-40 skruer og møtrikker (gevinddiameter: 3,05 mm) i nederste justeringshuller.
    2. Fuldt introducere en akupunkturnål (diameter: 180 μm, længde: 30 mm) i nålhullerne på enten den forreste eller bageste hætte af enheden ( Figur 3D ). Med en mikropipette hældes tilstrækkelig flydende agarose (~ 1 ml til de fem kanaler) på bundstykket til fuldstændigt at fylde hver af de cylindriske kanalhalvdeler.
    3. Anbring straks den øverste halvdel af enheden over bunden og tryk på, indtil den er fastSted for at fuldføre de cylindriske kanaler (friktion mellem hætter og topstykke vil holde sidstnævnte på plads). Vent ~ 5 minutter ved stuetemperatur efter agarose-tilsætning for at tillade dets gelering inde i apparatets kanaler.
    4. Udtræk nålen manuelt fra hvert af hullerne på apparatets hætter. Fjern skruerne og separér de to hætter og den øverste halvdel manuelt fra bundstykket, hvor sidstnævnte holder hydrogelmikolonnerne.
    5. Brug fine pincet til forsigtigt at fjerne mikrokolonnerne fra kanalerne på bundstykket og placere dem i den tidligere fremstillede petriskål, der indeholder DPBS (trin 1.1.1). Genanvend enheden til en anden runde med mikrokolonnefabrikation. Fortsæt til underafsnit 1.4.
  3. Mikrosøjlefabrikation ved hjælp af kapillærrør
    1. Overfør glaskapillærrør (diameter: 398.78 μm, længde: 32 mm) på indersiden af ​​biosikkerhedsskabinet. Manuelt brydeLange rør ind i 2,0-2,5 cm fragmenter og indsæt helt en akupunkturnål (diameter: 180 μm, længde: 30 mm) i hvert fragment ( figur 2A ).
    2. Overfør 1 ml flydende agarose fra bægeret til overfladen af ​​en tom petriskål. Hold kapillærrøret og den indførte nål, og placér den ene ende af røret i kontakt med den flydende agarosepulje for at fylde den ved kapillarvirkning. Agitér røret for at fremme kapillarforøgelse.
      BEMÆRK: Fyld kapillarrørene med flydende agarose så højt som kapillarvirkningen tillader; Bagefter kan disse mikrokolonner skæres i mindre konstruktioner afhængigt af den ønskede længde. 1 ml agarosepuljen anvendes typisk kun for et rør, da agarosen afkøles og geler hurtigt, hvilket forhindrer yderligere kapillarvirkning.
    3. Når væsken ophører med at stige, fjern kapillarrøret fra poolen og læg det vandret på overfladen af ​​en petriskål. Vent i 5 minutter for at lade agarosegelen inde i rørene. </ Li>
    4. Placer tommelfingeren og pekefingeren på hver side af røret og tryk mod den. Brug den anden hånd til hurtigt at trække nålen ud, mens du bruger tommelfingeren og pegefingeren for at forhindre, at mikrokolonnen selv glider ud af røret. Indsæt en 30 gauge nål i kapillarrøret for langsomt at skubbe mikrokolonnen ud i en skål, der indeholder DPBS (trin 1.1.1).
  4. Mikrosøjle trimning og sterilisering
    1. Overfør en mikrokolonne delvist fra DPBS til en tom skål med fine tang. Tilsæt 10 μl DBPS til toppen af ​​mikrokolonnen med en mikropipette for at forhindre tørring. Placer sidstnævnte skål under et stereoskop for visuel vejledning.
      BEMÆRK: I hele protokollen refererer mikrokolonne tørring eller dehydrering til opkøb af en krøllet struktur, som er synligt at skelne fra det typiske hydratiserede udseende af disse konstruktioner. Dehydreret mikrosøjler fastgøres fast til overfladen af ​​Petri-skålene og cAnnot bevæges let, mens hydraterede konstruktioner har tendens til at glide over overfladen efter manipulation med tang. Et fasekontrastbillede af en fuldstændigt tørret mikrokolonne er vist i figur 8A .
    2. Trim mikrokolonnen med en mikroskalpel for at forkorte den til den ønskede længde (her 2-5 mm). Transport den trimmede mikrokolonne med fine tang til den anden DPBS Petri skål fremstillet i trin 1.1.1.
    3. Gentag trin 1.4.1 og 1.4.2 for hver fremstillet mikrokolonne.
    4. Steriliser mikrokolonnerne i de DPBS-holdige petriskåle under ultraviolet (UV) lys i 1 time. Opbevar petriskålene ved 4 ° C inden ECM-tilsætning og celleplating.

2. Primære neuronkultur og tvungen celleaggregeringsmetode

  1. Fremstilling af den pyramide mikrobrøndsarray
    BEMÆRK: Dette afsnit anvender en 3D-trykt form bestående af en cylindrisk base (diameter: 2,2 cm, højde: 7,0 mm) aNd ni firkantede pyramider på toppen (sidelængde: 4,0 mm, skrå vinkel: 60 °), organiseret i et 3 x 3-array, som vist i figur 3E . Tilsætningsfremstillingsprocessen ved hjælp af kommercielt tilgængelige 3D-printere er veldokumenteret. Computer-aided design software kan bruges til at designe støbeformen. Den resulterende designfil kan derefter digitalt omdannes til en værktøjssti til en 3D-printer. Hver printer har forskellige specifikationer, og instruktionerne til opsætning og betjening af en 3D-printer varierer i overensstemmelse hermed.
    1. Brug en 3/32 "borekrone til at punktere 16 huller i et 4 x 4 array (sidelængde: 4 cm, hulseparation: 1 cm), centreret i låget på en 10 cm petriskål. Indenfor en kemisk dampkåle skal du bruge Den nederste del af Petri-skålen til at veje 27 g polydimethylsiloxan (PDMS) og 3 g hærdemiddel (i forholdet 1:10). Rør med en mikrospatel for at fordele agenset jævnt.
    2. Dæk PDMS / hærdningsmidlet med det punkterede låg. Tilslut den ene ende af en slange til vakuumetM udstødningsdåse og indsæt den anden ende i en tragtstang (munddiameter: 10 cm, stængelængde: 3 cm, stangdiameter: 1,5 cm).
    3. Lav en åbning med en 3/32 "borekrone øverst på en 1 ml pipettepære og sæt en 1000 μL mikropipettip i åbningen (med spidsen opad). Placer pæren og spidsen ind i slangen og træk Slangen opad, indtil pæren forsegler slangen ind i tragten.
    4. Placér tragten på det punkterede skållåg og fastgør slangen med en ledig stabil støtte. Åbn vakuumventilen i 5 minutter til sugning og bring luftboblerne til overfladen.
    5. Luk ventilen, tag tragtet ud, og rør Petri-skålen mod overkåden ~ 3 gange for at sprænge resterende luftbobler.
    6. Anbring en pyramid-brønd 3D-trykt støbeform i hver af brøndene i en 12-brønds kulturplade, med pyramiderne pegende op. Hæld PDMS / hærdningsmidlet oven på forme indtil hver brønd af tHan pladen er fyldt. Dæk 12-brøndspladen med låget og overfør den til en ovn i 1 time ved 60 ° C for at tørre.
    7. Fjern forsigtigt hver PDMS mikrobrøndsopstilling ( Figur 3F ) fra pladen med en mikrospatel. Dæk PDMS arrays med aluminiumsfolie og steriliser ved autoklavering. Inden i et biosikkerhedsskabe skal du indsætte et mikrobrøndsarray i hver brønd på en 12-brønds plade ( figur 2B ).
  2. Cortisk neuron isolation fra rottefostre
    1. Tilsæt ~ 20 ml Hank's balancerede saltopløsning (HBSS) til hver af fire til seks 10 cm petriskåle (en til hvert dissekeret væv) inde i et biosikkerhedsskabe. Overfør disse retter til en dissektion hætte og placere dem på is. Steriliser dissektionsinstrumenter, såsom mikroskalle, saks og pincet, med en sterilisationssterilisator.
    2. Forvarmet embryonalt neuron basalt medium + 2% serumfrit supplement + 0,4 mM L-glutamin (benævnt "dyrkningsmedium" herafteR) og 0,25% trypsin + 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) ved 37 ° C. Optø deoxyribonuklease (DNase) I ved at placere den ved stuetemperatur. Forbered 1,5 ml af en 0,15 mg / ml DNAse I opløsning i HBSS og oprethold opløsningen på is.
    3. Euthanize en tidsbegrænset-gravid embryonal-18-rotte ved indtagelse af kuldioxid og bekræft døden ved aftagning. Overfør slagtekroppen til en steril disseksionshætte og læg den ventral-side op. Skyl maven grundigt med 70% ethanol.
    4. Åbn livmoderen og fjern fostrene (normalt ~ 11) fra fostervoksene med saks og overfør dem med pincet til en petriskål, der indeholder koldt HBSS, som beskrevet 48 . Anbring en kold granitblok (-20 ° C) under stereoskopet. Placer petriskålen på overfladen af ​​denne kolde blok for at bevare den lave temperatur af HBSS gennem dissektionsproceduren.
    5. Skyl pigerne ved at svinge HBSS rundt og overfør dem derefter til den næste rene skålIndeholdende HBSS. Ved hjælp af stereoskopet og dissektionsinstrumenterne fjerner sekventielt hovedene, cerebrale halvkuglerne og cortices af fostrene og overfører hvert væv med tang til en ny HBSS-fyldt skål efter hver dissektion 48 .
    6. Aspirér kun cortices med en Pasteur pipette og læg vævet i et sterilt 15 ml centrifugerør. Kassér de andre dissekerede væv. Skyll cortices tre gange ved sekventielt tilsætning og fjernelse af ~ 5 mL HBSS med en serologisk pipette. Placer røret på is, når det ikke er i brug.
    7. Overfør cortices med en Pasteur pipette til et 15 ml rør indeholdende forvarmet trypsin-EDTA (4-6 cortices pr 5 mL trypsin-EDTA). Rør røret manuelt og læg det ved 37 ° C. Inverter røret hvert 3. minut for at forhindre væv i at klumpe.
    8. Stop eksponeringen for trypsin efter ~ 10 minutter ved at fjerne vævet med en Pasteur pipette og overføre det til en ren 15 ml centrifugerør. Tilsæt 0,15 mg / ml DNase I-opløsningen (1,5 ml) til røret med en pipette.
    9. Brug en Pasteur pipette til manuelt at bryde op vævsklumper og derefter hvirvel (~ 30 s), indtil opløsningen virker homogen, og der er ingen resterende vævsfragmenter i væsken. Hvis det ikke er muligt at fuldstændig homogenisere opløsningen, ekstraheres de uopløselige fragmenter ved at trække dem ind i spidsen af ​​en Pasteur pipette.
    10. Centrifug den homogene celleopløsning opnået i trin 2.2.9 ved 200 xg i 3 minutter. Fjern supernatanten med en Pasteur pipette, pas på at ikke forstyrre de pelleterede celler. Tilsæt 2 ml dyrkningsmedium med en serologisk pipette og hvirvel til resuspendering af cellerne.
    11. Tæl antallet af celler i opløsningen fremstillet i trin 2.2.10 ved anvendelse af et hæmocytometer; Det forventede udbytte er 3,0-5,0 x 106 celler / kortikale halvkugle. Forbered 1 ml eller mere af cellesuspension i dyrkningsmedium med en densitet på 1,0-2,0 x 106 celler / ml.
  3. Dannelse af neuronelle celleaggregater
    1. Med en mikropipette tilsættes 12 μl af 1,0-2,0 x 10 6 / ml celle suspensionen i hver mikrobrønd i PDMS arrayet (som blev anbragt i pladen i trin 2.1.7).
      BEMÆRK: Cellekoncentrationen kan justeres afhængigt af mikrokolonne ID og den ønskede celleaggregatstørrelse, da højere koncentrationer giver større aggregater.
    2. Centrifuger pladen ved 200 xg i 5 minutter for at tvinge aggregeringen af ​​celler i bunden af ​​mikrobrøndene ( figur 2B ). Tilsæt forsigtigt ~ 2 ml dyrkningsmedium til toppen af ​​hvert PDMS-array for at dække alle de podede mikrobrønde, og pas på ikke at forstyrre de aggregerede celler.
    3. Hvis cellerne ikke transduceres med en viral vektor, inkuberes pladen i 12-24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 og derefter fortsættes til sektion 3. Hvis aggregaterne transduceres, springes inkuberingen og fortsættes til afsnit 2.4 .
  4. TranSvejsning med en viral vektor for at observere kalciumsignalering
    Bemærk: Disse trin udføres for at transducere neuroner med en viral vektor indeholdende en genetisk kodet calciumindikator (GECI). Resultaterne vist i denne artikel blev opnået under anvendelse af en kommercielt tilgængelig adenoassocieret virus (AAV) (serotype 1) med GCaMP6f, et GECI med hurtig kinetik bestående af grønt fluorescerende protein (GFP), calmodulin (CaM) og M13 peptidet, Drevet af den humane Synapsin I-promotor. Den virale vektoropløsning kan kræve fortynding i sterilt DPBS før transduktion afhængigt af koncentrationen af ​​stamopløsningen. Cellehygiejne / morfologi og GCaMP6f signalstyrke skal over tid overholdes for en række vektorkoncentrationer. Denne optimeringsprocedure skal udføres af hver efterforsker for at bestemme den passende titer for deres egen cellekulturer. Den typiske GCaMP6f ekspressionstid er 7-8 dage efter transduktionen, der finder sted under inkubationen udført i stEp 2.4.2.
    1. Med en mikropipette tilsættes det krævede volumen af ​​viral vektoropløsning (til en slutkoncentration på ~ 3,0 x 10 9 genomiske kopier pr. Aggregat) til dyrkningsmediet, der dækker aggregaterne. Langsomt pipetter op og ned for at sikre, at vektoropløsningen er homogent fordelt gennem dyrkningsmediet.
    2. Inkuber pladen med de podede pyramide mikrobrønde i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 for at tillade viral transduktion af GCaMP6f.

3. Udvikling af den cellulære komponent af mikro-tenner

  1. ECM kernefabrikation
    1. Efter aggregeret inkubation tilsættes type I-kollagen og laminin til dyrkningsmediet (i en koncentration på 1 mg / ml hver) i et mikrocentrifugerør for at fremstille ECM-opløsningen. Udfør trin 3.1.2-3.1.4 ved stuetemperatur, men hold røret med ECM på is, når det ikke er i brug for at forhindre for tidlig gelering.
    2. Juster pH i ECM-opløsningen ved at overføre 1-2 μL til litmuspapir for at verificere den indledende pH, tilsæt 1 μL 1 N natriumhydroxid (NaOH) og / eller 1 N saltsyre (HCI) til ECM efter behov, Og gentagelse indtil pH er 7,2-7,4. Sørg for homogenisering af ECM-opløsningen ved pipettering op og ned, samtidig med at der opstår luftbobler.
    3. Overfør mikrokolonnerne med steriliserede pincetter fra opvasken i trin 1.4.3 for at tømme 35 eller 60 mm petriskåle. Arbejd på 4-5 mikrokolonner ad gangen for at forhindre dehydrering. Vedhæft en 10 μl spids fastgjort til en 1000 μl spids til en mikropipette. Brug stereoskopet til visuel vejledning ved at placere spidsen i den ene ende af mikrokolonnerne og sug for at ekstrahere resterende DPBS og luftbobler fra lumen.
    4. Opret hurtigt 4-5 μL ECM i en mikropipette. Observation under en steReoskop, læg spidsen af ​​mikropipetten i en af ​​enderne af mikrokolonnerne og aflad tilstrækkelig ECM til at fylde lumen. Bekræft, at der ikke er luftbobler i lumen, da disse kan hæmme axonal udvækst gennem ECM. Hvis der findes luftbobler, skal du fjerne ECM'en som forklaret i trin 3.1.3 og tilføje ECM igen.
    5. For at forhindre dehydrering tilsættes ~ 2 μL ECM omkring hver mikrokolonne. Inkuber hydrogel / ECM mikrosøjlerne i petriskålene ved 37 ° C og 5% CO2 i 25 minutter. Fortsæt med cellesæd straks efter inkubation.
      BEMÆRK: Inkubationsperioden i trin 3.1.5 er beregnet til at tillade tid til polymerisering af collagen og laminin inde i mikrokolonnerne.
  2. Neuronal celledannelse i mikrokolonnerne
    BEMÆRK: For at ændre dyrkningsmediet for de transducerede aggregater, vippe pladen, brug en mikropipette til at fjerne mediet, der puljer på brøndens væg, og tilsæt derefter langsomt ~ 1 ml modVæg (for at undgå at forstyrre aggregaterne i de pyramide mikrobrønde). Gentag denne mellemliggende ændring en anden gang.
    1. Efter inkubationsperioden i trin 3.1.5 overføres ca. 10-20 μl dyrkningsmedium til to frie områder i petriskåle med mikrokolonnerne. Brug en mikropipette til individuelt at overføre aggregaterne til petriskålen, der indeholder konstruktionerne, og flyt dem med tang til en af ​​de små puljer af kulturmedium for at bevare cellehelsen.
    2. Mens du observerer under et stereoskop, skal du indsætte et aggregat i hver ende af mikrokolonnerne for tovejs mikro-tenner eller i den ene ende for en ensrettet arkitektur (som ønsket) ved hjælp af tang. Bekræft placeringen af ​​aggregaterne inde i mikrokolonnerne ved hjælp af stereoskopet. Brug pincet til at flytte de podede mikrokolonner til den anden lille pulje af kulturmedium for at undgå dehydrering og for at bevare aggregeret helbred.
    3. Inkuber ved 37 ° C og 5% C02 i 45 minutter til aLøft aggregaterne for at klæbe til ECM. Kontroller, at aggregaterne forbliver i enderne af mikrokolonnerne ved hjælp af stereoskopet; Genindføre celleaggregaterne og gentag inkubationstrinet som nødvendigt.
    4. Overfyld forsigtigt Petri-fadene, der indeholder mikro-tennene med dyrkningsmedium (3 eller 6 ml for henholdsvis en 35 eller 60 mm petriskål) ved anvendelse af en serologisk pipette. Placer opvasken i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 til langsigtet kultur.
    5. Udfør halvmedieændringer hver 2. dag med dyrkningsmedium. Fjern forsigtigt halvdelen af ​​det gamle medium med en pipette og brug stereoskopet til visuel vejledning for at undgå at suge mikro-tennene. Udskift ved langsomt at tilføje frisk, forvarmet medium med en pipette.
    6. For at genbruge PDMS mikrobrøndsarrayerne, fjern kulturmediet, kog arraysne i deioniseret vand i 30 minutter og sterilisere i en autoklave for en anden runde af aggregatdannelse og -kultur.
      BEMÆRK: Ved ønskede tidspunkter, erCytoarkitektur af mikro-tenner kan verificeres ved anvendelse af faskontrastmikroskopi. Her blev der brugt en eksponeringstid på 5-8 ms og 10X (0,64 μm / pixel) og 20X (0,32 μm / pixel) mål for at indfange fasekontrastbillederne. Fluorescensen associeret med calciumkoncentrationsændringer i viraltransducerede mikro-TENN'er blev indfanget ved anvendelse af et fluorescensmikroskop med høj hastighed med en eksponeringstid på 50 ms, et 10X objektiv (0,64 μm / pixel) og solid state-lys med båndpasfiltre på ~ 480 Nm og ~ 510 nm for excitation og emission for at visualisere GCaMP6f fluorescenssignalet.

4. Immunocytokemi for In Vitro Studies

Bemærk: For de her viste billeder blev følgende primære antistoffer anvendt: mus anti-Tuj-1 / beta-III tubulin (1: 500) og kanin-anti-synapsin-1 (1: 500) til mærkning af axoner og præ -synaptiske boutons, henholdsvis. De sekundære antistoffer var æsel-anti-mouse 568 (1: 500) og æsel-anti-kanin 488 (1: 500). De nødvendige mængder af de fremstillede primære og sekundære antistofopløsninger såvel som mængderne af formaldehyd-, hesteserum- og detergentopløsningerne afhænger af det volumen der kræves for fuldstændigt at dække konstruktionerne. Disse volumener kan minimeres ved anvendelse af en hydrofob barrierepen for at begrænse området omkring hver mikrokolonne.

FORSIGTIG: Dette afsnit beskæftiger formaldehyd og Hoechst. Formaldehyd er en giftig forbindelse, der vides at være kræftfremkaldende, og Hoechst er en kendt mutagen. Derfor skal disse forbindelser bortskaffes i en passende affaldsbeholder. Håndter dem altid i en kemisk dampplade, mens du bruger passende personlige værnemidler, som f.eks. Lab coat, sikkerhedsbriller og handsker.

  1. Forbered en 4,0% volumen / volumen (volumen / volumen) formaldehydopløsning i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) inde i en kemisk dampplade.
  2. Fjern kulturmediet fra Petri-skåleneNg mikro-tennene med en mikropipette. Tilsæt tilstrækkeligt volumen formaldehydopløsningen til opvasken for helt at dække mikro-tennene. Sug mikro-tennene i formaldehydopløsningen i 35 minutter ved 18-24 ° C for at fixere cellerne i mikrokolonnerne.
  3. Fjern 4.0% formaldehydopløsningen fra petriskålene med en pipette og kassér efter passende retningslinjer for bortskaffelse af farligt materiale.
  4. Udfør to hurtige skylninger ved at tilføje nok PBS til helt at dække de faste mikro-tenner og derefter fjerne PBS med en pipette. Udfør en tredje lang skylning ved blødning af konstruktionerne i PBS i 10 minutter.
    FORSIGTIG: Kassér PBS'en, der anvendes til skylning, som muligvis indeholdende spor af formaldehyd.
  5. Forbered en 0,3% vol / vol opløsning af ikke-ionisk vaskemiddel i 4% vol / vol hesteserum i PBS. Fjern PBS fra petriskålene, der indeholder de faste mikro-tenner, og tilsæt et tilstrækkeligt volumen af ​​0,3% vaskeopløsningen til at dække konstruktionerne. Blød i 60 minutter kl 18-24 & #176; C for at permeabilisere cellerne.
  6. Fjern rengøringsopløsningen med en pipette. Udfør to hurtige skylninger ved at tilføje og efterfølgende fjerne PBS. Derefter udføres tre længere skylninger ved blødning af konstruktionerne i PBS i 5 minutter under hver skylning.
  7. Fortynd primære antistoffer i 4% hesteserum. Fjern PBS fra Petriskålene, der indeholder de faste og permeabiliserede mikro-TENN'er. Tilsæt nok primær antistofopløsning til mikrokolonnerne til at dække dem fuldstændigt. Tæt petriskålene med parafilm for at forhindre fordampning og inkuber natten over (12-16 timer) ved 4 ° C.
  8. Fjern den primære antistofopløsning fra opvasken og skyll som beskrevet i trin 4.6. I mørket fremstilles den sekundære antistofopløsning i 4,0% hesteserum. Tilsæt nok sekundær antistofopløsning til fuldt ud at dække konstruktionerne, dække opskålene med aluminiumsfolie og inkuber i 2 timer ved 18-24 ° C.
  9. Forbered Hoechst-opløsningen (1: 10.000) i PBS for at plette kernerne.
  10. BEMÆRK: Billeder til de immunomærkede mikro-tenner blev taget med et laser-konfokalt mikroskop med en opløsning på 2.048 (~ 8 s / frame), en 10X objektiv (0,64 μm / pixel), 487 nm excitation og ~ 525 nm emissionsbølgelængder for Grøn fluorescens, 561 nm excitation og ~ 595 nm emissionsbølgelængder for rød fluorescens og ~ 3,22 μm / skive med ~ 60 skiver i gennemsnit for z-stablerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikro-tenner blev overvåget ved anvendelse af faskontrastmikroskopi til vurdering af deres cytoarkitektur og axonal udvækst ( figur 4 ). Inden for retningsrettede 2 mm lange mikro-tenner blev neuronalaggregater begrænset til den ene ende af mikrokolonnen og projicerede et bundt af axoner gennem den indre kerne. Axons spændte hele længden af ​​søjlen med 5 dage in vitro (DIV) ( figur 4A ). Der var en større indledende aksonal vækst i tovejs 2 mm lange mikro-tenner, da axoner spændte hele mikrokolonnen med 3 DIV ( figur 4B ). Ved 5 DIV viste tovejs mikro-TENN'er tætte aksonale kanaler, som forbund de aggregater, der blev opretholdt ved yderpunkterne af mikrokolonnen. Denne cytoarkitektur blev også observeret i 5 mm mikro-TENN'er, hvor axoner spænder mikrokolonnen med 5 DIV ( figur 4C ). Som iagttaget i alle tilfælde, ECM i lumen og den geometriske restriCtion præsenteret af agarosen tilvejebragte den retningsretning, der kræves for at danne aksonale kanaler, der strukturelt efterligner træk ved indfødt neuroanatomi.

Immunocytokemiteknikker blev anvendt i denne protokol, og konfokale billeder blev taget for at verificere komponenterne i mikro-TENN-arkitekturen. Cellekerner farvet med Hoechst (blå) lokaliseres næsten udelukkende inden for aggregater ved ekstremerne af ensrettet og tovejs mikrokolonne, med i det væsentlige ingen Hoechst-farvning i det indre ( figur 5 ). Denne observation bekræftede, hvad der blev afledt af fasekontrastbillederne: neuronpopulationer var begrænset til enderne, og kun axoner (i rødt) spændte lumen af ​​mikro-tennene. Imidlertid, efter at axoner krydsede aggregaterne, blev cellemigration observeret langs aksonale kanaler i det indre lumen, som observeret ved forekomsten af ​​kerne (blå) i det indre ved 28 DIV for en 2 mm lang bidirektorCtional micro-TENN ( figur 6 ). Endvidere blev synapsin I immunolabelling (grøn) fundet i hele cellelegeme og aksonale kanaler ( figur 6 ). Synapsin I er et præsynaptisk terminalprotein impliceret i reguleringen af ​​neurotransmitterfrigivelse og er indikativ for tilstedeværelsen af ​​præ-synaptiske terminaler, når de findes i en punkteringsfordeling; Det har tidligere været korreleret med dannelsen af ​​aktive synapser ved hjælp af helcelleplastoptagelser 49 . Synapsinfarvningen i den aksonrige centrale zone af mikro-TENN er sandsynligvis en kombination af puncta såvel som synapsin, der transporteres ned axoner i retning af pre-synaptiske terminaler. Ikke desto mindre antyder tilstedeværelsen af ​​synapsin puncta inden for mikro-TENN aggregaterne, at disse konstruktioner har kapacitet til at kommunikere gennem synaps, selv om colokalisering af synapsin med et postsynaptisk protein ville være påkrævet for yderligere strukturelle tegn på funktionelle synapser. </ P>

Mikro-TENN'er blev også fremstillet med aggregerede neuroner, der blev transduceret med et AAV, der indeholdt GCaMP6f calciumindikatoren til forsigtigt sonde de elektrofysiologiske egenskaber af disse konstruktioner. Disse konstruktioner udtrykte calciumindikatoren i hele deres længde som vist ved fluorescens i både de neuronale aggregater og axonalt kanalerne ( figur 7A ). Bemærk at på grund af mikroskopindstillinger, der har til formål at maksimere intensiteten i aggregaterne, syntes fluorescensen i aksonale kanaler svagere. Disse transducerede mikro-TENN'er blev analyseret over tid med højhastighedsfluorescensmikroskopi (uden ekstern elektrisk stimulering), og flere cellestørrelsesområder af interesse (ROI'er) blev tilfældigt valgt i et repræsentativt mikro-TENN for at karakterisere signalkapaciteten af ​​disse konstruktionerne. Calciumkoncentrationsudbrud blev observeret i næsten alle ROI'er, som afspejlet med assocIerede fluktuerende fluorescensintensiteter gennem tiden ( figur 7B ). Især syntes forskellige ROI'er at vise en næsten konstant periodicitet af calciumkoncentrationsstigninger ( figur 7B ). Disse calciumkoncentrationsændringer udledes som følge af spontane, iboende aktionspotentialer, cellesignalering inden for individuelle aggregater og / eller signalering på tværs af axoner fra forskellige aggregater. Yderligere analyser er nødvendige for fuldt ud at karakterisere de elektrofysiologiske egenskaber hos neuroner og aksonale kanaler inden for mikro-TENN. Ikke desto mindre viser disse indledende resultater, at mikro-TENN'er udviser robust endogen / baseline elektrisk aktivitet.

Figur 3
Figur 3: Blueprints af den laserskårne mikrokolonnefabrikationsanordning og den 3D-trykte pyramidale mikrobrøndskimmel til celleaggregering. ( A) - ( B ) Blueprint og billede af henholdsvis den nederste og den øverste halvdel af den cylindriske kanalgruppe anvendt til fremstilling af hydrogelmikrokolonnerne. ( C ) Blueprint og billede af de hætter, der bruges til at holde enheden sammen. Både for- og bakstykker deler de samme dimensioner. ( D ) Billede af den samlede enhed, der kræves for at fremstille mikrokolonnerne. Kun de to hætter og den nederste halvdel er fastspændt sammen med skruer i de nederste to justeringshuller (til venstre). De brudte linjer viser placeringen af ​​akupunktur nåle gennem de fem huller på hver hue. Den flydende agarose tilsættes til den nederste halvdel af cylindrene, og efterfølgende placeres den øverste halvdel (højre) på anordningen for at forme væskagaroten i form. ( E ) Blueprint af de 3D-trykte forme bruges til at lave PDMS mikrobrøndsarrayer. ( F ) Billeder af den 3D-trykte form (venstre) og PDMS mikrobrøndsarrayerne (højre). Alle dimensioner er i milli Meter (mm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Observation af axonal vækst i mikro-TENNS ved fase-kontrastbilleddannelse af ensretnings- og tovejskonstruktioner som en funktion af dage in vitro . ( A ) Envejsgående 2 mm lange mikro-tenner viser aksonale kanaler, der strækker sig næsten hele længden af ​​mikrokolonnen med 5 DIV. ( B ) Sammenlignet med ensrettet mikro-TENN'er viser tovejs 2 mm mikro-tenner en hurtigere axonal vækstrate. ( C ) For 5 mm tovejs mikro-tenner, fylder aksonale kanaler længden af ​​mikrokolonnen ved 5 DIV. Denne arkitektur opretholdes i det mindste indtil 10 DIV. Skalestænger = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5
Figur 5: Mikro-TENN-cytoarkitektur observeret med konfokale billeder af immunomærkede ensrettet og tovejs mikro-tenner. Celler blev farvet for cellekerner (Hoechst; Blå) og axoner (Tuj1; Rød). ( A ) Fase-kontrastbillede af en 5 mm tovejs mikro-TENN (28 DIV). Konfokale rekonstruktioner ( D ) - ( F ) og ( I ) - ( K ) af en 5 mm tovejs (28 DIV) og en ensrettet (25 DIV) mikro-TENN viser henholdsvis mærket cellekerner ( D ), ( I ) Og axoner ( E ), ( J ), såvel som overlejringen ( F ), ( K ). Skalestænger: 500 μm. Indsæt i ( A F ) og ( K ) refererer til fasekontrast ( B ) - ( C ) og konfokal ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) zoom-ins af neuronal aggregater og aksonale kanaler . Billederne viser aggregaterne begrænset til enderne af mikro-tennene, mens lumen spændes af justerede aksonale kanaler. Skalestænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6
Figur 6: Ekspression af den præsynaptiske terminale proteinsynapsin I i et repræsentativt tovejs mikro-TENN. Konstruktionen blev farvet for cellekerner (Hoechst; blå), axoner (Tuj1; rød) og præsynaptiske bons (synapsin I; green). ( A ) Phase-contrAst billede af en 2 mm tovejs mikro-TENN ved 28 DIV. ( D ) - ( G ) Konfokale rekonstruktioner, der viser cellekernerne ( D ), axoner ( E ), presynaptiske bolte ( F ) og en overlejring ( G ) af de tre kanaler. Kasser viser zoom-ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) af fasekontrast- og overlejringsbillederne for de neuronale aggregater. Skalestænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7
Figur 7: Spontan signalaktivitet i en tovejs mikro-TENN observeret gennem ekspression af en genetisk kodet calciumindikator. ( A ) FluorescensE-mikroskopi bekræftede udtrykket af GCaMP-reporteren, som observeret ved fluorescens gennem aggregaterne og axonerne. Målestang = 100 μm. ( B ) Fluorescensændringer associeret med calciumkoncentrationsvariationer blev målt uden ekstern stimulering ved flere interessante regioner (ROI'er) som en funktion af tiden. De nummererede farvede cirkler i ( A ) angiver disse ROI'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8
Figur 8: Fase-kontrastbilleder af almindelige fejlformer i mikro-TENN-metoden. ( A ) En fuldstændigt dehydreret / tørret agarosemikrokolonne som et resultat af fjernelsen og / eller fordampningen af ​​DPBS i de indledende fremstillingsstadier. Skalestang = 5081; m. ( B ) Hydrogelmikrokolonne med lumen, der forer den ydre væg af konstruktionen på grund af manglen på koncentrisk orientering af akupunkturnålen med kapillarrøret. Målestang = 100 μm. ( C ) Seeded micro-TENN med begge aggregater til stede ved 1 DIV. ( D ) Et af aggregaterne faldt fra samme mikrokolonne som ( C ) ved 3 DIV. ( E ) Unidirectional micro-TENN ved 4 DIV. ( F ) De aggregerede og aksonale kanaler falder ud fra mikrokolonnen i ( E ) og forbliver flydende i dyrkningsmediet ved 5 DIV. Skalestang for ( C ) - ( E ) = 300 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CNS-skade og sygdom resulterer typisk i tab eller dysfunktion af de langsgående axonale veje, der omfatter hjernekoblet, med eller uden samtidig neuronal degenerering. Dette forværres af den begrænsede kapacitet af CNS til at fremme neurogenese og regenerering. På trods af udøvelsen af ​​reparationsstrategier som vækstfaktor, celle og biomaterialetilførsel som individuelle eller kombinatoriske tilgange, undlader disse teknikker samtidig at tage hensyn til både degenerationen af ​​neuronale celler og tabet af aksonale forbindelser 14 , 22 . Disse huller i teknologi begrænser evnen til at reparere, ændre og sonde neurale netværk på en kontrolleret og vedvarende måde. Derfor blev mikro-TENN teknologien udviklet for at imødekomme behovet for en neurale reparationsstrategi, som i modsætning til eksisterende metoder letter både neuronal erstatning og rekonstruktion af lange axonale forbindelser. MicRo-TENNs er implanterbare levende stilladser med en præformeret cytoarkitektur, der nærmer sig systemblokken på hjernekoblingen, der er specielt designet til målrettet rekonstruktion, udskiftning og modifikation af værtsneuralkredsløb. Disse stilladser består af diskrete populationer af neuroner forbundet med lange aksonale kanaler inden for ECM-holdige lumen af ​​miniaturecylindriske agarosegrogeler. Disse konstruktioner kan være i stand til at fungere som synaptiske relæer for at erstatte tabte baner og dynamisk modulerende indfødte kredsløb. Desuden kan mikro-tenner i tilfælde af isoleret axonal degeneration (med kilde neuroner forblev intakte) muligvis tjene som vejledninger for axonal regenerering baseret på mekanismen for axon-faciliteret axonregenerering. Dette manuskript præsenterede fremstillingsprotokollen for pålideligt at skabe mikro-tenner med styret geometri, fænotype og funktionelle egenskaber. Fase-kontrastmikroskopi, immuncytokemiStry og konfokal mikroskopi viste, at mikro-TENN'er produceret med protokollen udviser den krævede cytoarkitektur og udtrykker det synopsiske terminalsproteinsynapsin. Endvidere blev det vist, at mikro-TENN'er har egen signalaktivitet, muligvis på grund af handlingspotentialer, i mangel af ekstern simulering. Dette blev konstateret ved tilstedeværelsen af ​​nærsynkroniske fluktuationer i fluorescensen forbundet med en genetisk kodet calciumreporter.

Mikro-TENN-udvikling kan opsummeres ved tre trin: (1) fremstillingen af ​​det hule hydrogelrør, (2) tilsætningen af ​​ECM-opløsning til rørets lumen og (3) såningen af ​​aggregater af isolerede neuroner i Enderne af røret. Mikrosøjlerne kan fremstilles med glaskapillærrør eller med en mikrofabrikeret anordning indeholdende cylindriske kanaler. Denne enhed kan oprettes ved hjælp af en mikro-fabrikationsmetode med høj præcision, der er tilgængelig for efterforskeren. VæskeAgarose hældes i indretningens kanaler eller ind i kapillærrør indeholdende en centreret akupunkturnål til dannelse af hydrogelmikrokolonnerne. Efter agarosegelering fjernes akupunkturnålen for at fremstille det hule lumen. Flere almindelige faldgruber, der opstår under fremstilling eller vækst, fremhæves i figur 8 . Bemærk at nogle af billederne vist i figur 4 og et ekstremt tilfælde i figur 8B viser den luminale del usikre tæt på cylinderens væg. For at opnå en jævn vægtykkelse ved anvendelse af kapillarrørmetoden bør rørnålenheden holdes oprejst, når den kommer i kontakt med agarose, og nålen skal opretholdes i midten af ​​røret. At holde rørnålenheden i en vinkel i forhold til agarosoverfladen fremmer decentralisering af nålen. Ikke desto mindre er disse forholdsregler vanskelige at gennemføre, og nålen er oftere end ikke hvilende alonG kapillarrørets vægge. Tværtimod er det vigtigste aktiv i den mikrofabrikerede anordning, at den har nålhuller koncentreret rettet imod de cylindriske kanaler, hvilket fremmer en passende centralisering af nålen og lumen i forhold til kanalen og mikrokolonnen. Desuden øges anordningen gennemstrømning ved at lette fremstillingen af ​​flere mikrokolonner samtidig. På trods af den fordel, der ydes af enheden, kan off-center lumens stadig oprettes ved hjælp af bøjede akupunktur nåle. Mikrofabrikationsteknikker har også en iboende tolerance, der begrænser deres effektivitet. Generelt må mikrokolonne dehydrering, for hvilket et ekstremt tilfælde er vist i figur 8A , ikke være en hindring, hvis anbefalingerne i hele protokollen følges. Bemærk at de fysiske egenskaber af agarosen, der anvendes til ydre indkapsling, muligvis kræver optimering for alternative neuronale subtyper, som forbedret cortical neuron sUrvival og neurit udvækst ved højere (3-4%) versus lavere (1-2%) agarosekoncentrationer blev observeret 10 .

Mikro-TENN-udvikling fortsætter med indførelsen af ​​ECM i mikrokolonne lumen, som tjener til at tilvejebringe et miljø, der er passende til neuronal vedhæftning, overlevelse og udvækst. Desuden begrænser ECM i kombination med den geometriske begrænsning og den lave porøsitet tilvejebragt af agaroshydrogelen den aksonale vækst i længderetningen for at frembringe den fornødne arkitektur. Indholdet af ECM-opløsningen kan optimeres for den anvendte type neuron. For eksempel fremmer kollagen alene overlevelse og axonal udvækst i DRG-mikro-TENN'er, hvorimod en kombination af collagen og laminin er påkrævet for kortikale neuroner 10 . Desuden er ECM-polymerisering inde i mikrokolonnen kritisk forud for celleplettering, da co-afgivelsen af ​​celler med upolymeriseret ECM fører til nedsat neurit outgrOwth og fasciculation 31 . Bemærk, at selvom mikrokolonnen først er fyldt med ECM-opløsning, polymeriserer dens indhold i en blød gel og har tendens til at indgå i inkubationsperioden, hvilket skaber et rum, der tillader indsættelse af celleaggregaterne. Derudover er det vigtigt at bekræfte, at ECM'en er kommet ind i mikrokolonne interiøret ved at inspicere under stereoskopet; Fuldstændig fravær og / eller lommer af manglende ECM-resultater resulterer i mangel på axonal udvækst fra aggregaterne. Mikro-TENN-fabrikation kulminerer i såningen af ​​kortikale neuronaggregater ved yderst på stilladset. Disse neuroner blev dissekeret fra rottefostre ved anvendelse af kendte procedurer 48 . Det kan udledes, at størstedelen af ​​isolerede celler er neuroner, fordi den embryonale rottecortex i den svangerskabsperiode, der anvendes til isolation, består af 99% neuroner, og det definerede kulturmedium, der anvendes i protokollen, er metabolisk begrænsende for glialproliferation 49 . Derfor bør der være minimal glialkontaminering, selvom der kræves farvning til specifikke markører til bekræftelse. Mens dette manuskript præsenterede mikro-TENN-fremstilling med kortikale neuroner, kunne neuroner fra forskellige hjerneområder ( fx nigral, thalamid og hippocampal) eller med forskellige fænotyper ( fx excitatorisk, hæmmende og dopaminerg) anvendes i overensstemmelse med den ønskede anvendelse og Implantationsområde. Tidligere gentagelser af mikro-TENN-fremstillingsprotokollen involverede podning af dissocierede celler 10 , 31 , 32 . Skønt den ønskede cytoarkitektur er blevet opnået under anvendelse af dissocieret metode, blev det ikke opnået i alle tilfælde. I mange tilfælde oversvømmede dissocierede celler interiøret og resulterede i flere celleklynger i hele lumenet med processer, der forbinder dem i et omfattende 3D-netværkRef "> 10 , 31. Den aggregerede metode sikrer på den anden side indeslutningen af ​​cellelegemer til ekstremerne og er derfor integreret i mikro-TENN-teknologiens succes ( figur 5 ). De repræsentative mikro-TENN'er, der vises I figur 4-6 blev der fremstillet med større aggregater, som ikke var fuldstændigt indsat, og dette kan lejlighedsvis resultere i aggregater, der falder ud af mikrokolonnerne i kultur, som eksemplerne vist i figur 8D og 8E . For at forhindre dette kan aggregaterne Indsættes fuldt ind i mikrokolonne-interiøret. Hvis denne situation præsenterer sig selv efter anvendelse af den foregående strategi, kan den oprindelige inkubationsperiode udvides til at give tilstrækkelig tid til aggregeret vedhæftning til ECM. Under dyrkning er blid håndtering af mikro-tenner Anbefales at bevare integriteten af ​​hydrogelindkapslingen og cytoarkitekturen; problemer under mikro-TENN-manipulation er årsagen til de krumninger, der opnås i de ellers justerede aksonale kanaler ( figur 5 ). Ikke desto mindre bør følgende protokol, der præsenteres i denne artikel, resultere i en konsekvent fremstilling af mikro-tenner med den forventede neuronal / aksonal arkitektur, presynaptisk boutfordeling og egen elektrisk aktivitet.

På trods af det løfte om, at mikro-TENN'er holder, er der resterende udfordringer, der kan begrænse anvendelserne af denne teknologi. Den nuværende mikrokolonnefabrikationsteknik er begrænset af decentralisering af mikrokolonne lumen, hvilket kan forårsage en inkonsekvent præsentation af mekaniske signaler til celler ( fx stivhed), rupturering af mikrokolonnevæggen og den efterfølgende eksponering af aksonale kanaler Til ydersiden og problemer under implantation. Selvom brugen af ​​en mikrofremstillet enhed har forbedret udfaldet sammenlignet med kapillærrør, højere præcision mikro-fabricationN teknikker er nødvendige for at øge den dimensional reproducerbarhed af disse konstruktioner. Resultaterne i dette manuskript viste, at mikro-TENN-metoden pålideligt kan producere levende stilladser, der består af neuroner og aksonale kanaler, der minder om indfødt neuroanatomi, især de axonale kanaler, som forbinder forskellige hjerneområder. Ikke desto mindre er mikro-TENN-længden en forhindring afhængig af længden af ​​den værtsaksonale vej, der skal udskiftes. For eksempel er tissue-engineered nerve grafts (TENGs) en separat levende stillads strategi udnyttet af vores forskningsgruppe til at reparere ekstremt lange nerveskader. For at erstatte disse lange huller kan axonerne i TENG'er forlænges til tituscentimeter ved at anvende kontinuerlig mekanisk spænding i brugerdefinerede mechano-bioreaktorer 1 , 23 , 50 . Denne "stretch growth" -teknik er også blevet anvendt til at manipulere astrocytiske proceslængder til betteR efterligne strukturen af ​​radiale glialbaner 51 . Tværtimod tilbyder den nuværende mikro-TENN-teknologi endnu ikke denne grad af kontrol; Den maksimale opnåelige længde begrænses i øjeblikket af, hvor længe aksonale kanaler kan vokse in vitro baseret på traditionel vækstkegleformidlet forlængelse. Endvidere, selvom CNS har en egenkapacitet til neurofysiologisk omdannelse som reaktion på forskellige stimuli, og transplanterede celler har evne til at synaptisk integrere med indfødte kredsløb, er en yderligere begrænsning af denne teknologi, at mikro-TENN'er stole på plasticiteten af ​​den oprindelige hjerne Og værtsnetværkernes evne til funktionelt at integrere med den implanterede konstruktion 52 , 53 , 54 , 55 . Endelig er en medfødt mangel på alle implantatbaserede tilgange, såsom mikro-tenner, deres invasivitet. Da neuroner erGenerelt i nærheden af ​​kapillærer kan enhver form for kirurgisk indgreb forårsage forstyrrelser i blod-hjernebarrieren, lækage af blodfaktorer i hjernens parenchyma og en akut (og endda kronisk) inflammatorisk respons 31 . Dette svar kan beskadige værts- og mikro-TENN-neuroner, idet man negerer de gavnlige aspekter ved denne teknik. Ikke desto mindre overlevede mikro-tenner implanteret i den corticothalamiske vej af rotter i mindst 1 måned og viste tegn på strukturel integration med værts cerebral cortex 10 , 31 . Desuden præsenterede en tidligere publikation fra vores forskningsgruppe en metode, der muliggjorde nåleløs implantation af mikro-tenner i rottehjerne 31 . Ved denne fremgangsmåde blev denne hydrogel-indkapslingsstrategi forstærket for at indbefatte en tynd (~ 20 μm) coating af carboxymethylcellulose, som ved mild dehydrering frembragte tilstrækkelig stivhed til at trænge indHjernen uden at kræve en nål eller guide 31 . Denne nåleløse implantationsmetode kombineret med mikrokolonnens lille tværsnit bør minimere skader på hjernen under og efter den stereotaxiske implantationsprocedure.

På trods af mikro-TENNers foreløbige succes in vivo skal fremtidige undersøgelser bekræfte, at disse konstruktioner synaptisk integreres med indfødte væv og undersøge, om funktionelt opsving er opnået i modeller af CNS-skade og neurodegenerativ sygdom 10 , 31 . For eksempel kan skræddersyede mikro-tenner være designet med specifikke cellefænotyper og implanteret i den tilsvarende degenererede vej for at rekonstruere netværks- og gendannelsesfunktionen. For at reducere den akutte inflammatoriske reaktion efter implantation kan mikro-TENN hydrogelskallen dopes med antiinflammatoriske og pro-overlevelsesmidler. Alternativ fabrikationTeknikker ( f.eks. 3D-udskrivning) kan udvikles til at fremstille hydrogelmikrokolonnerne med større lethed og med mere præcise funktioner, herunder konsistent centralisering af lumen og reproducerbarhed af dimensioner. Den samme biomaterialeskema, der anvendes til mikro-TENN'er, kan modificeres til at tackle andre karakteristiske patologier for CNS-skade og sygdom. For eksempel har vores gruppe tidligere udviklet konstruktioner bestående af longitudinalt orienterede astrocytiske bundter langs den kollagenbelagte lumen af ​​en agaroshydrogel, der strukturelt emulerer radiale glialbaner og glialrøret for at lette axonal regenerering og neuronal migration 56 . Derudover kan stamceller, såsom humane embryonale stamceller (HESC'er), inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) og adiposeafledte stamceller (ASC'er) inkorporeres til fremstilling af autologe mikro-TENN'er pr. Patientbasis til mere Ligner nøje den fortabte cytoarkitektur og cellefænotype. Disse futuRe-modifikationer ville øge mikro-tenners evne til at erstatte degenererede veje in vivo og ville muliggøre rekonstruktion af mere sofistikerede vævsarkitekturer, der indbefatter astrogial støtte og axonal myelinering blandt andre funktioner. Genetisk manipulerede neuroner kan også podes for enten at forøge den regenerative virkning af mikro-TENN'er ved frigivelse af trofiske faktorer eller muliggøre modulering af CNS ved den optogenetiske stimulering af lysdæmpede ionkanaler 43 . Disse stilladser kunne fremstilles med excitatoriske eller hæmmende neuroner for at synaptisk modulere eksisterende dysfunktionelle værtsforbindelser under forhold som epilepsi, depression, narkotikamisbrug eller smerteforstyrrelser 1 . For eksempel kan mikro-TENN'er, der danner overvejende GABAergiske eller glutamatergiske synapser, konstrueres til at undertrykke eller stimulere henholdsvis op- eller de-regulerede veje via synaptisk integration og / eller ved bulknerveOtransmitter release. Vigtigt nok vil sådanne selvstændige modulerende konstruktioner teoretisk reagere på baggrund af værtsnetværksfeedback 1 . Tilsvarende kunne mikro-TENN'er anvendes som hjerne-computer-grænseflader (BCI'er) med optogenetisk udviklede mikro-tenner, der tjener som mellemprodukter mellem hjernen og uorganiske stimulerende eller optageenheder. Denne ansøgning kan være et alternativ til mikroelektrode BCI'er, som mangler specifik celle-målretning og mekanisk stabilitet og har forårsaget inflammatoriske responser, glialærdannelse og neuronal migration eller tab, når de trænger ind i hjernen 57 , 58 .

Som in vitro- test-senge kan mikro-tenner give en stærk platform til undersøgelsen af ​​neurobiologi og elektrofysiologi, der fungerer som biofideliske modeller af nervesystemet. Derudover kan 3D-konstruktioner tjene som test-senge til behandlingsstrategier, når de anvendes som neurale injUry og sygdom modeller 59 . Som 3D-konstruktioner er mikro-TENN'er i stand til at simulere in vivo- miljøet, som er karakteriseret ved komplekse celleceller og celle-ECM-interaktioner i alle rumlige retninger, som ikke kan repræsenteres nøjagtigt i plane kulturer 42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 . Faktisk har mange undersøgelser vist, at typen af ​​miljø er kritisk for cellerne til at præsentere morfologi, proliferation, migration, genekspression, differentiering og signalering udstillet i den oprindelige indstilling 60 . Lighederne mellem disse stilladsers 3D-miljø og selve hjernen suppleres af den grad af kontrol, som disse konstruktioner tilbyder over deres fysiske og biokemiske prOperier 42 . Dette tillader konstruktion af mikro-tenner med forskellige sæt mekaniske, haptotaxiske og kemotaksiske signaler til at undersøge effekten af ​​disse signaler, individuelt eller synergistisk, på neuronal overlevelse, modning, axonal forlængelse, synaptogenese og mekanotransduktion 32 , 42 , 63 . Desuden tillader fleksibiliteten i denne mikrovævstekniske teknik at opbygge levende stilladser, der efterligner andre træk i hjernevæv, såsom den kolonnerede, komprimerede struktur af neocortexen, spændt af aksonalkanalerne af forbindelsen, for yderligere at forøge Kraften i dette system som en in vitro platform til at studere hjernen 65 . Som undersøgelsesplatforme udnytter mikro-tennene den kontrollerede indstilling af typiske in vitro- modeller, den ekspansive tilgængelighed af designparametre i væv ogGineering tilgange og den øgede fysiologiske og patofysiologiske relevans af 3D-platforme til at blive en ideel test-seng for at fremme neurobiologisk viden. De utallige fremtidige retninger for denne teknologi indikerer alsidigheden af ​​mikro-tenner. Dette manuskript har vist, at mikro-TENN-protokollen pålideligt kan producere vævsmonterede levende stilladser, der efterligner afgørende træk ved hjernens neuroanatomi for at give nye indblik i neurobiologiske fænomener, herunder udvikling, sygdom og reparationsprocesser. Disse konstruktioner kan også synaptisk integrere med nativt væv til rekonstruktion af beskadigede hvide stofkanaler, erstatte tabte neuronale celler og modulere dysregulerede veje efter CNS-skade og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Finansiel støtte blev ydet af National Institutes of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) og F31-NS090746 (Katiyar)), Michael J. Fox Foundation (Therapeutic Pipeline Program # 9998 (Cullen)), Penny Medicine Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation (Graduate Research fellowships DGE-1321851 (Struzyna og Adewole)), Department of Veterans Affairs (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), American Association Af neurologiske kirurger og kongres for neurologiske kirurger (Codman Society for Neurotrauma og Critical Care, 2015-2016) og US Army Medical Research and Materiel Command (# W81XWH-13-207004 (Cullen) og W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16, (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67, (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27, (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31, (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48, (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21, (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26, (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11, (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6, (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106, (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6, (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11, (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3, (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20, (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3, (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14, (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23, (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116, (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24, (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80, (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25, (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44, (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5, (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics