Anatomiskt inspirerade tredimensionella mikrovävnadsgenererade neurala nätverk för nervsystemet återuppbyggnad, modulering och modellering

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta manuskript beskriver tillverkningen av mikrovävnadsmetriska neurala nätverk: tredimensionella mikronstorlekskonstruktioner bestående av långlinjerade axonala kanaler som spänner över aggregerade neuronpopulationer som är inneslutna i en tubulär hydrogel. Dessa levande byggnadsställningar kan fungera som funktionella reläer för att rekonstruera eller modulera neurala kretsar eller som biofideliska testbäddar som efterliknar gråvit substans neuroanatomi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Struzyna, L. A., Adewole, D. O., Gordián-Vélez, W. J., Grovola, M. R., Burrell, J. C., Katiyar, K. S., Petrov, D., Harris, J. P., Cullen, D. K. Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (123), e55609, doi:10.3791/55609 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Funktionell återhämtning sker sällan efter skada eller sjukdomsinducerad degenerering inom centrala nervsystemet (CNS) på grund av den inhiberande miljön och den begränsade kapaciteten för neurogenes. Vi utvecklar en strategi för att samtidigt ta itu med neuronal och axonal banaförlust inom det skadade nervsystemet. Detta manuskript presenterar tillverkningsprotokollet för mikrovävnaderstekniska neurala nätverk (mikro-TENN), implanterbara konstruktioner som består av neuroner och inriktade axonala kanaler som spänner över den extracellulära matrisen (ECM) lumen av en förformad hydrogelcylinder hundratals mikron i diameter som kan sträcka sig i centimeter i längd. Neuronala aggregat är avgränsade till ytterdimensionerna av den tredimensionella kåpan och spänns av axonala utsprång. Mikro-TENN är unikt balanserade som en strategi för återuppbyggnad av CNS, emulerande aspekter av cytomarkitektur i hjärnans kontakt och möjligen tillhandahålla medel för nätverksbyte. Den neuRonala aggregat kan synaps med värdvävnad för att bilda nya funktionella reläer för att återställa och / eller modulera saknade eller skadade kretsar. Dessa konstruktioner kan också fungera som proregenerativa "levnadsställare" som kan exploatera utvecklingsmekanismer för cellmigration och axonal pathfinding, vilket ger synergistiska strukturella och lösliga signaler baserat på regenereringsstatus. Mikro-tenn tillverkas genom att hälla flytande hydrogel i en cylindrisk form som innehåller en längsgående centrerad nål. När hydrogelen har gelat, avlägsnas nålen och lämnar en ihålig mikrokolonn. En ECM-lösning läggs till lumenet för att ge en miljö lämplig för neuronadhesion och axonal utväxt. Dissocierade neuroner aggregeras mekaniskt för exakt sådd i en eller båda ändarna av mikrokolonnen. Denna metod ger tillförlitligt självständiga miniatyrkonstruktioner med långprojektiva axonala områden som kan rekapitulera egenskaper hos neuroanatomi i hjärnan. Synaptisk immUnolabeling och genetiskt kodade kalciumindikatorer antyder att mikro-TENN har en omfattande synaptisk fördelning och inneboende elektrisk aktivitet. Följaktligen representerar mikro-tenn en lovande strategi för målinriktad neurokirurgisk rekonstruktion av hjärnvägar och kan även användas som biofideliska modeller för att studera neurobiologiska fenomen in vitro .

Introduction

En vanlig egenskap hos störningar och sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS), såsom traumatisk hjärnskada (TBI), ryggmärgsskada (SCI), stroke, Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom är avbrytandet av axonala vägar och neuronal cell Förlust 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . När exempelvis en ischemisk stroke går obehandlad uppskattas det att axoner förloras med en hastighet av 7 miles axon per minut 5 . När det gäller TBI, som ungefär 1,7 miljoner människor upplever varje år i USA ensam, kan axonal degeneration fortsätta att inträffa år efter trauma, eftersom den initiala skaden utfäller ett långtids neurodegenerativt tillstånd 4 . Försvårande av dessa skadliga effekter har CNS en kraftigt begränsad capaStad för regenerering 1 , 7 , 8 , 9 . Efter skada utvecklas en hämmande miljö som kännetecknas av brist på riktad vägledning till avlägsna mål, närvaron av myelinhämmande hämmare som hindrar neuritutväxten och bildandet av ett glialär av reaktiva astrocyter 8 , 10 , 11 , 12 . Glialärret tjänar som en biokemisk och fysisk barriär mot regenerering, med molekyler som kondroitinsulfatproteoglykaner som hindrar axonutväxten 8 , 11 . Dessutom, även om neurala stamceller har hittats i vuxna CNS, är produktionen av nya neuroner begränsad, eftersom konsekventa bevis på neurogenes endast har hittats i luktlampan, den hippocampalaSubgranulär zon, periventrikulärt område och ryggmärgs 13 , 14 centrala kanal. Dessa hinder hindrar funktionell återhämtning av förlorade neuroner och vit materia arkitektur efter skada eller sjukdom, vilket resulterar i de ofta livsförändrande och långvariga effekterna av dessa tillstånd.

Trots bristen på regenerativ kapacitet hos vuxna CNS har det visat sig att axonal regenerering är möjlig om adekvata miljöanpassningar presenteras för värdvärdena neuroner 15 , 16 , 17 , 18 . Forskare har försökt leverera och manipulera tillväxtfaktorer ( t.ex. nervtillväxtfaktor, epidermal tillväxtfaktor, glialberoende tillväxtfaktor och neurotrofisk faktor-3) och andra vägledningsmolekyler för att stimulera plasticitet och axonregenerering 14 , </ Sup> 18 , 19 . Trots att dessa studier har bekräftat att vuxna axoner är kapabla att reagera på tillväxtfaktorer begränsas dessa strategier av lågt permeabilitet hos blod-hjärnbarriären och de specifika rumsliga och temporala gradienterna som krävs för att främja regenerering 14 , 18 , 19 . Andra tillvägagångssätt har åberopat hyperaktivering av regenerationsrelaterade transkriptionsfaktorer i CNS-neuroner. Till exempel stimulerade överuttryck av stat3-transkriptionsfaktorn axonal regenerering i optisk nerv 20 . Ändå misslyckas både biomolekylavgivning och överuttryck av transkriptionsfaktorer att ersätta förlorade neuronpopulationer. Cellbaserade strategier har huvudsakligen koncentrerat sig på transplantation av neurala stamceller (NSC) i CNS, med fördel av deras förmåga att ersätta CNS-neuroner, frigöra trofiska faktorer,Och stödja försöken på neurogenes som uppträder efter skada 17 . Trots detta finns det fortfarande pressande utmaningar som hindrar detta tillvägagångssätt, inklusive de transplanterade neurala cellernas hämmade förmåga att överleva, integrera med värden och förbli spatialt begränsad till det skadade området 6 , 14 , 17 , 21 . Dessutom är celltillförsel enbart oförmögen att återinföra cytoarkitekturen av skadade eller förlorade axonala vägar. Ett alternativt tillvägagångssätt som behandlar problemen med cell- och läkemedels- och kemikalieleveransstrategier är att kombinera dessa metoder med användningen av biomaterial 14 , 22 , 23 . Biomaterial som hydrogeler kan emulera de biokemiska och fysikaliska egenskaperna hos den extracellulära matrisen (ECM), som hjälper till vid celltillförsel enD retention inom det skadade området och leverera tillväxtfaktorer och andra bioaktiva molekyler med kontrollerat frisättning 22 . De attraktiva egenskaperna hos dessa biomaterialbaserade strategier har resulterat i bevis på in vivo axonal regenerering efter transplantation av byggnadsställningar till det belastade området 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Emellertid ersätter acellulära biomaterialstrategier inte förlorade neuronala populationer; När de används som leveransfordon för neuron-, glial- eller neuronprekursorceller, är biomaterialen inte kapabla att rekonstituera axonala nätverk på lång avstånd. Utmaningen att utveckla ett tillvägagångssätt som tacklar både den axonala vävnadsdegenerationen och neuronförlusten i samband med CNS-skada och sjukdom kvarstår <Sup class = "xref"> 31.

Vår forskningsgrupp rapporterade tidigare utvecklingen av implanterbara mikrovågsmetallerade neurala nätverk (mikro-TENN), som är en typ av "levnadsställare" som består av neuroncellceller som är bundna till en eller båda ändarna av en agaroshydrogel-ECM-mikrokolonn , Med orienterade axonala kanaler som sträcker sig genom det inre av denna tredimensionella (3D) inneslutning 1 , 10 , 31 , 32 . En av de största skillnaderna mellan denna teknik och tidigare tillvägagångssätt är att cytoarkitekturen av mikro-TENN är skapad helt in vitro och transplanteras efteråt 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , <Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . In vitro- tillverkning erbjuder omfattande rumslig och tidsmässig kontroll av cellulär fenotyp och orientering, mekaniska / fysikaliska egenskaper, biokemiska signaler och exogena faktorer, vilket gynnar integrationen av dessa byggnadsställningar med värden efter implantationen 41 , 42 . Mikro-Tenn är anatomiskt inspirerade eftersom de emulerar neuroanatomi i hjärnan, som visar axonala områden som liknar de som överbryggar distinkta funktionella regioner i hjärnan ( Figur 1A ) 1 . Därför kan denna strategi kunna fysiskt ersätta förlorade vita substansområden och neuroner efter implantation till en belastad region. Denna teknik är också inspirerad av utvecklingsmekanismer där "naturliga levnadsställningar" som bildas av radiella glialceller och banbrytande axoner fungerar som vägleder guider för cellMigration från subventrikulär zon och axonal utväxt, respektive 43 . Dessa mekanismer återfinns i de anpassade axonala områdena av mikro-TENN, som kan presentera levande vägar för neural cellmigration och axonal regenerering genom axonmedierad axonal utväxt ( Figur 1C ) 43 . Vidare utnyttjar denna strategi synaptisk integration mellan mikro-TENN-neuronerna och de inhemska kretsarna, som bildar nya reläer som kan bidra till funktionell återhämtning ( Figur 1B ) 43 . Kapaciteten för synapsbildning kan också ge detta tillvägagångssätt förmågan att modulera CNS och reagera på värdvävnad enligt nätverksåterkoppling. Till exempel kan optogenetiskt aktiva neuroner i de levande ställningarna stimuleras för att modulera värdneuroner genom synaptiska interaktioner ( Figur 1D ).

Dessutom är den biomaterialbaserade rörformigaUgn av mikro-TENN erbjuder en lämplig miljö för celladhesion, tillväxt, neuritillägg och signalering, medan konstruktionens miniatyrdimensioner möjliggör minimalt invasiv implantering och ger en delvis sekvestrerad mikromiljö för gradvis integration i hjärnan. Faktum är att senaste publikationer har visat potentialen hos mikro-tenn att efterlikna neurala vägar efter implantation i råtthjärnan. Efter stereotaxisk mikroinjektion rapporterade vi tidigare bevis på mikro-TENN-neuronal överlevnad, underhåll av axonaltraktionsarkitektur och neuritillförsel i värdcortexen till minst 1 månad in vivo 10 , 31 . Vidare gav märkning med synapsin histologiska bevis på synaptisk integration med nativ vävnad 10 , 31 . Sammantaget kan mikro-tenn vara unikt anpassade för att rekonstruera och modulera skadadeCNS genom att ersätta förlorade neuroner, synaptiskt integrera med värdkretsen, återställa förlorad axonal cytoarkitektur och, i vissa fall, tillhandahålla regenererande axoner med lämpliga sökvägsljus.

Figur 1
Figur 1: Principer och inspiration bakom utvecklingen av mikrovävnadstekniska neurala nätverk (mikro-TENN). ( A ) Micro-TENNs efterliknar cytoarkitekturen i hjärnans anslutning (lila), i vilken funktionellt distinkta regioner är kopplade med långa, inriktade axonala områden i enriktad (röd, grön) eller dubbelriktad (blå) väg. Till exempel kan mikro-tenn rekonstruera förlorade förbindelser i kortikotalamiska och nigrostriatala vägar eller i perforantvägen från entorhinal cortex till hippocampus (anpassad från Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagram över en enhetlig riktningL och dubbelriktad mikro-TENN (röd respektive blå) synaptiskt integrera med värdkretsen (lila) för att fungera som ett funktionellt relä mellan båda ändarna av en lesion. ( C ) Schematisk av axonaltraktionerna i en enriktad mikro-TENN (grön) som tjänar som en vägledning för axon-underlättad regenerering av värdaxoner (lila) mot ett mål som mikro-TENN interagerar med. ( D ) Konceptuellt diagram över användningen av optogenetiskt aktiva mikro-TENNS som neuromodulatorer, utnyttja synaptisk integration med excitatoriska eller hämmande neuroner (botten). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Det nuvarande manuskriptet beskriver den metod som används för att tillverka mikro-TENN med användning av embryonellt härledda cerebrala kortikala nervceller. Speciellt kan mikro-tenn tillverkas med andra typer av neurala celler. För exRiklig, de första rapporterna om framgångsrik mikro-TENN-utveckling presenterade dorsala root ganglion (DRG) neuroner 32 . Hydrogelmikrokolumnerna kan alstras ( Figur 2A ) genom att tillsätta flytande agaros till en skräddarsydd, laserskärd cylindrisk kanalgrupp eller till kapillärrör, vilka båda innehåller inriktade akupunkturnålor. Nålen bildar lumen och bestämmer mikrokolonnens innerdiameter (ID), medan kapillärrörets ID och diametern hos cylindrarna i den laserskärda anordningen dikterar konstrukternas ytterdiameter (OD). OD och ID kan väljas enligt önskad applikation genom att välja olika diametrar för anordning / kapillärrör respektive akupunkturnålar. Längden på mikrokolumnerna kan också varieras; Hittills har vi rapporterat konstruktionen av mikro-tenn upp till 20 mm i längd 10 och arbetar aktivt med längre längder. Efter agarosgelerna och akupunkturen nEedlar avlägsnas, en ECM-lösning som i allmänhet består av kollagen av typ I och laminin tillsätts till konstruktionens lumen ( figur 2C ). ECM-kärnan ger en byggnadsställning som stödjer neuronal celladhesion och axonal utväxt. Ursprungligen pläterades primära råtta-kortikala neuroner i mikrokolonnerna med användning av dissocierade cellsuspensioner 10 , 31 , 32 . Detta tillvägagångssätt producerade emellertid inte målcytoarkitekturen i alla fall, som definierades som neuroncellcellerna begränsade till ändarna av mikrokolumnerna, varvid den centrala lumen bestod av rena inriktade axonala kanaler. Sedan dess har användningen av en tvungen neuronal aggregeringsmetod (baserat på protokoll anpassade från Ungrin et al .) Möjliggjort en mer pålitlig och konsekvent tillverkning av mikro-TENN med den ideala strukturen ( Figur 2B ) 44 . Förutom att beskriva strömmenMetodik, kommer denna artikel att visa representativa faskontrast och konfokala bilder av mikro-TENN som visar bildandet av axonala kanaler över tiden, såväl som den slutliga målcytokarchitecturen. Detta manuskript kommer också att expandera på anmärkningsvärda aspekter av protokollet och återstående utmaningar och framtida riktningar för mikro-TENN-tekniken.

Figur 2
Figur 2: Schematiskt diagram över tre-stegs mikro-TENN-tillverkningsprocessen. ( A ) Utveckling av agaroshydrogelen: (i) Initialt införs en liten akupunkturnål ( t.ex. 180-350 um diameter) i de cylindriska kanalerna av en skräddarsydd, laserskärd form eller ett kapillärrör ( t.ex. , 380-700 pm i diameter). I nästa steg införs flytande agaros i DPBS i de cylindriska kanalerna eller kapillärrören. (Ii) Efter agarosgelerna avlägsnas nålen ochFormen avmonteras för att ge de ihåliga agarosmikolonnerna. (Iii) Dessa konstruktioner steriliseras sedan och lagras i DPBS. ( B ) Primär neuronkultur och aggregatmetoden: (i) Neuronal aggregering utförs i pyramidala mikrobrunnsarrayer, gjutna av 3D-tryckta formar, som passar in i brunnarna i en 12-brunns odlingsplatta. (Ii) Mikro-TENN inkluderar primära råttneuroner dissocierade från fostrets hjärnor av embryonala-18-råttor. Efter vävsdissociation med trypsin-EDTA och DNas I framställs en celllösning med en densitet av 1,0-2,0 x 106 celler / ml. (Iii) 12 | il av denna lösning överförs till varje brunn i den pyramidala mikrobrunnmatrisen. Plattan innehållande dessa mikrobrunnar centrifugeras för framställning av cellaggregat. (Iv) Dessa inkuberas sedan över natten före plätering i mikrokolonnerna. ( C ) ECM-kärntillverkning och cellsåning: (i) Före cellsåkning fick en ECM-lösning innehållande 1 mg / ml typ I-kollagen och 1 mg / mlLaminin överförs till det inre av mikro-tenn och tillåts polymerisera. (Ii) Beroende på huruvida enriktad eller dubbelriktad mikro-TENN tillverkas, placeras ett aggregat vid respektive ena eller båda extremiteterna av mikrokolonnen. (Iii) Efter en inkubationsperiod för att främja vidhäftning odlas mikro-TENN i petriskålar som översvämmas med kompletterat embryonalt neuronalt basalt medium. Iv) Efter 3-5 dagar i odling bör den slutliga mikro-TENN-strukturen demonstrera cellaggregat vid ytterkolumnerna, med axonala kanaler som sträcker sig över längden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som involverar djur godkändes av institutionella djurvårds- och användarkommittéer vid University of Pennsylvania och Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center och följde de riktlinjer som anges i NIH: s folkhälso-servicepolicy om humanvård och användning av laboratorium Djur (2015).

1. Utveckling av agaroshydrogelen (acellulär komponent av mikro-TENN)

  1. Agaroslösningspreparat
    1. Inom ett biosäkerhetsskåp skapar man reservoarer för mikrokolonnerna genom att överföra 20 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) till vardera av två 10 cm petriskålar. Sterilisera fina pincett och mikroskalor med en varmpärlsterilisator.
    2. Väg 3 g agaros och överför den till en steril bägare inuti biosäkerhetskåpan. Tillsätt 100 ml DPBS för en slutlig koncentration av 3% vikt / volym (vikt / volym). Inkludera en ren magnetisk bar och täck bägaren med alumiNum folie.
    3. Värm bägaren vid 100 ° C med en varmplatta / omrörare och rör om 120-200 rpm för att helt lösa agarosen (lösningen kommer att vända från grumligt till rens). Håll uppvärmningen och omrörningen efteråt för att förhindra gelning och byt upp värmningstemperaturen som behövs för att undvika att bränna agarosen.
      ANMÄRKNING: Tillverkning med både den laserskärda enheten och kapillärrören presenteras nedan i respektive avsnitt 1.2 och 1.3. Gå vidare till avsnitt 1.4 efter att ha slutfört de steg som beskrivs i endera avsnitten. För båda mikrokolonn tillverkningsmetoder, tillsätt den flytande agarosen snabbt, eftersom agaros stelnar snabbt när det kyls. Vid sterilisering med en autoklav i något av följande steg använd de standardförhållanden som tillämpas på glasvaror.
  2. Mikrokolonnberedning med hjälp av en laserskärad enhet
    OBS! Den laserskärda enheten är skuren av transparent akryl med en kommersiell CO 2 laserskärare. FabKatjon av strukturer och anordningar genom laserskärning är väl dokumenterad för en rad tekniska och forsknings- applikationer 45 , 46 , 47 . Denna form ( Figur 3 ) består av en uppsättning av fem cylindriska kanaler, var och en med en diameter av 398 um och en längd av 6,35 mm. Dessa cylindriska arrays är utformade längs deras längd med två stycken: en bottenhalvdel (längd: 25,4 mm, bredd: 6,35 mm, höjd: 6,0 mm) och en övre halva (längd: 31,5 mm, bredd: 6,35 mm, höjd: 12,7 mm ), Såsom visas i figurerna 3A respektive 3B . De två halvorna kan klämmas samman av de främre och bakre kepsarna som observeras i figur 3C (längd: 31,5 mm, bredd: 6,35 mm, höjd: 12,7 mm), vilka har fyra inriktningshål som sammanfaller med två hål vardera på toppen och botten Bitar och som hjälper till att säkra alla delar tillsammans när de skruvas. Dessa kepsar ökar ocksåLude fem hål koncentriska mot de cylindriska kanalerna, i vilka akupunkturnålarna kan sättas in för att bilda mikrokolonnernas lumen.
    1. Sterilisera enheten som visas i Figur 3 genom att täcka den med aluminiumfolie och autoklavera. Montera enheten enligt Figur 3D genom att anpassa de främre och bakre kåporna med endast bottenhalvdelen och säkra de tre delarna med två # 4-40 skruvar och muttrar (tråddiameter: 3,05 mm) i bottenjusteringshålen.
    2. Fullständigt introducera en akupunkturnål (diameter: 180 μm, längd: 30 mm) i nålhålen på antingen den främre eller bakre delen av enheten ( Figur 3D ). Häll tillräckligt med flytande agaros (~ 1 ml för de fem kanalerna) på bottenhalvdelen med en mikropipett för att fylla i varje av de cylindriska kanalhalvorna.
    3. Placera omedelbart den övre delen av enheten över bottenhalvdelen och tryck på tills den sitter ordentligtPlats för att slutföra de cylindriska kanalerna (friktion mellan kepsarna och toppstycket kommer att hålla sistnämnda på plats). Vänta ~ 5 minuter vid rumstemperatur efter agarosatillsats för att tillåta gelning inuti enhetens kanaler.
    4. Extrahera nålen manuellt från var och en av hålen på enhetens lock. Ta bort skruvarna och separera manuellt de två locken och den övre halvan från bottenhalvdelen, där den senare håller hydrogelmikrokolumnerna.
    5. Använd fina tångar för att försiktigt avlägsna mikrokolonnerna från kanalerna på bottenhalvdelen och placera dem i den tidigare beredda petriskålen som innehåller DPBS (steg 1.1.1). Återanvänd enheten för en annan omgång med mikrokolonnfabrikation. Fortsätt till underavsnitt 1.4.
  3. Mikrokolonnfabrikation med kapillärrör
    1. Överför glaskapillärrör (diameter: 398,78 μm, längd: 32 mm) till insidan av biosäkerhetskåpan. Bryt manuelltLånga rör i 2,0-2,5 cm-fragment och sätt helt in en akupunkturnål (diameter: 180 μm, längd: 30 mm) i varje fragment ( figur 2A ).
    2. Överför 1 ml flytande agaros från bägaren till ytan på en tom petriskål. Håll kapillärröret och den införda nålen, placera den ena änden av röret i kontakt med vätskeagarospoolen för att fylla den genom kapillärverkan. Agitera röret för att främja kapillärhöjning.
      OBS: Fyll kapillärrören med flytande agaros så hög som kapillärverkan tillåter; Efteråt kan dessa mikrokolumner skäras till mindre konstruktioner beroende på önskad längd. 1 ml-agarospoolen användes vanligen endast för ett rör, eftersom agarosen kyler och geler snabbt, vilket förhindrar ytterligare kapillärverkan.
    3. När vätskan upphör att stiga, ta bort kapillärröret från poolen och placera det horisontellt på ytan av en petriskål. Vänta i 5 min för att låta agarosgelén inuti rören. </ Li>
    4. Placera tummen och pekfingret på vardera sidan av röret och tryck mot det. Använd den andra handen för att snabbt dra ut nålen när du använder tummen och pekfingret för att förhindra att mikrokolonnen själv glider ut ur röret. Sätt i en 30-gauge nål i kapillärröret för att långsamt trycka mikrokolonnen ut i en skål som innehåller DPBS (steg 1.1.1).
  4. Mikro-kolonn trimning och sterilisering
    1. Överför en mikrokolonn från DPBS till en tom maträtt med fina tangar. Tillsätt 10 μl DBPS till toppen av mikrokolonnen med en mikropipett för att förhindra torkning. Placera den senare skålen under ett stereoskop för visuell vägledning.
      OBS! Under protokollet hänvisar mikrokolonnstorkning eller uttorkning till förvärv av en krympad struktur som är synligt urskiljbar från det typiska hydratiserade utseendet hos dessa konstruktioner. Dehydrerade mikrokolonnerna fästs fast på ytan av petriskålar och cAnnot flyttas lätt, medan hydratiserade konstruktioner tenderar att glida över ytan efter att ha manipulerats med tång. En fas-kontrastbild av en helt torkad mikrokolonn visas i figur 8A .
    2. Trim mikrokolonnen med en mikroskalpel för att förkorta den till önskad längd (här 2-5 mm). Transport den trimmade mikrokolonnen med fina pincett till den andra DPBS Petri-skålen som framställts i steg 1.1.1.
    3. Upprepa steg 1.4.1 och 1.4.2 för varje tillverkad mikrokolonn.
    4. Sterilisera mikrokolonnerna i de DPBS-innehållande petriskålarna under ultraviolett (UV) ljus under 1 timme. Förvara Petriskålarna vid 4 ° C före ECM-tillsats och cellplätering.

2. Primär neuron-kultur och tvångscellaggregeringsmetod

  1. Framställning av den pyramidala mikrobrunnmatrisen
    OBS! I detta avsnitt används en 3D-tryckad form bestående av en cylindrisk bas (diameter: 2,2 cm, höjd: 7,0 mm) aNio fyrkantiga pyramider på toppen (sidolängd: 4,0 mm, snedvinkel: 60 °), organiserad i en 3 x 3-grupp, som visas i figur 3E . Additivtillverkningsprocessen med kommersiellt tillgängliga 3D-skrivare är väl dokumenterad. Datorstödd designprogramvara kan användas för att designa formen. Den resulterande designfilen kan sedan omvandlas digitalt till en verktygsled för en 3D-skrivare. Varje skrivare har olika specifikationer, och anvisningarna för installation och drift av en 3D-skrivare varierar i enlighet därmed.
    1. Använd en 3/32 "borrbit för att punktera 16 hål i en 4 x 4-serie (sidlängd: 4 cm, hålskillnad: 1 cm), centrerad i locket på en petriskål på 10 cm. Bottenstycket av Petriskålen för att väga 27 g polydimetylsiloxan (PDMS) och 3 g härdningsmedel (för ett förhållande 1:10). Rör om med en mikrospatel för att fördela medlet jämnt.
    2. Täck PDMS / härdningsmedlet med det punkterade locket. Anslut en ände av en slang till vakuuM utloppsöppning och sätt in den andra änden i en trattstång (mundiameter: 10 cm, stånglängd: 3 cm, stångdiameter: 1,5 cm).
    3. Gör en öppning med en 3/32 "borr på toppen av en 1 ml pipettlampa och sätt in och säkra en 1000 μL mikropipettspets i öppningen (med spetsänden uppåt). Placera glödlampan och spetsen i slangen och dra Slangen uppåt tills glödlampan tätar slangen i trappstången.
    4. Placera tratten på det punkterade skålen och säkra slangen med ett tillgängligt, stabilt stöd. Öppna vakuumventilen i 5 min till sug och ta luftbubblorna till ytan.
    5. Stäng ventilen, ta bort tratten och slå Petri-skålen mot fläktens yta ~ 3 gånger för att spränga eventuella återstående luftbubblor.
    6. Placera en pyramid-brunns 3D-tryckad form i varje brunn i en 12-brunns odlingsplatta, med pyramiderna som pekar upp. Häll PDMS / härdningsmedlet ovanpå formen tills varje brunn av tHan plattan är fylld. Täck 12-brunnsplattan med locket och överför den till en ugn i 1 h vid 60 ° C för att torka.
    7. Ta försiktigt bort varje PDMS-mikrobrunnmatris ( Figur 3F ) från plattan med en mikrospatel. Täck PDMS-arraderna med aluminiumfolie och sterilisera genom autoklavering. Inne i ett biosäkerhetsskåp, sätt in ett mikrobrunnsarray i varje brunn i en 12-brunnsplatta ( Figur 2B ).
  2. Kortikal neuron isolering från råttafoster
    1. Tillsätt ~ 20 ml Hank balanserad saltlösning (HBSS) till varje av fyra till sex 10 cm petriskålar (en för varje dissekerad vävnad) inuti ett biosäkerhetsskåp. Överför dessa diskar till en dissektionskåpa och lägg dem på is. Sterilisera dissektionsinstrument, såsom mikroskalor, sax och tångar, med en sterilisator med varmpärlor.
    2. Förvärmande embryonalt neuronbasalt medium + 2% serumfritt tillägg + 0,4 mM L-glutamin (hänvisat till som "odlingsmedium" härafteR) och 0,25% trypsin + 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vid 37 ° C. Tina deoxiribonukleas (DNas) I genom att placera det vid rumstemperatur. Förbered 1,5 ml av en 0,15 mg / ml DNAse I lösning i HBSS och behåll lösningen på is.
    3. Euthanisera en tidig-gravid embryonal-18-råtta genom koldioxidinhalation och bekräfta döden genom avkapning. Överför slaktkroppen till en steril dissektionskåpa och lägg den ventrala sidan uppåt. Skölj magen noggrant med 70% etanol.
    4. Öppna livmodern och ta bort fostren (vanligen ~ 11) från amniotiska säckarna med sax och överför dem med pincett till en petriskål som innehåller kall HBSS, enligt beskrivningen 48 . Placera ett kyldt (-20 ° C) granitblock under stereoskopet. Placera petriskålen på ytan av detta kylblock för att bevara HBSS låga temperatur under hela dissektionsförfarandet.
    5. Skölj pupparna genom att svänga HBSS runt och sedan överföra dem till nästa rena skålenInnehållande HBSS. Med hjälp av stereoskopet och dissektionsinstrumenten avlägsnar sekvensiellt huvudet, cerebrala hemisfärerna och kortikalerna hos fostrarna och överför varje vävnad med pincett till en ny HBSS-fylld maträtt efter varje dissektion 48 .
    6. Aspirera endast corticesna med en Pasteur pipette och placera vävnaden i ett sterilt 15 ml centrifugrör. Kassera de andra dissekerade vävnaderna. Skölj cortices tre gånger genom att i följd tillsätta och ta bort ~ 5 mL HBSS med en serologisk pipett. Placera röret på is när det inte används.
    7. Överför corticesna med en Pasteur pipette till ett 15 ml rör innehållande förvärmt trypsin-EDTA (4-6 cortices per 5 ml trypsin-EDTA). Rör röret manuellt en gång och placera det vid 37 ° C. Vänd röret var 3: e minut för att förhindra att vävnaden klumpas.
    8. Stoppa exponeringen för trypsin efter ~ 10 minuter genom att ta bort vävnaden med en Pasteur pipette och överföra den till en ren 15 ml centrifugrör. Tillsätt 0,15 mg / ml DNase I-lösningen (1,5 ml) till röret med pipett.
    9. Använd en Pasteur pipette för att manuellt bryta upp vävnadsklumparna och sedan virvel (~ 30 s) tills lösningen verkar homogen och det finns inga kvarvarande vävnadsfragment i vätskan. Om det inte är möjligt att helt homogenisera lösningen, extrahera de olösliga fragmenten genom att dra dem in i spetsen av en Pasteur pipette.
    10. Centrifugera den homogena celllösningen erhållen i steg 2.2.9 vid 200 xg under 3 min. Ta bort supernatanten med en Pasteur pipette, var försiktig så att inte de pelleterade cellerna störs. Tillsätt 2 ml odlingsmedium med en serologisk pipett och virvel för att resuspendera cellerna.
    11. Räkna antalet celler i lösningen beredd i steg 2.2.10 med användning av en hemocytometer; Det förväntade utbytet är 3,0-5,0 x 106 celler / kortikala halvklotet. Bered 1 ml eller mer av cell-suspension i odlingsmedium med en densitet av 1,0-2,0 x 106 celler / ml.
  3. Bildande av neuronala cellaggregat
    1. Med en mikropipett tillsättes 12 μl av 1,0-2,0 x 10 6 / ml cellsuspensionen i varje mikrobrunn i PDMS-matrisen (som placerades i plattan i steg 2.1.7).
      OBS: Cellkoncentrationen kan justeras beroende på mikrokolonn ID och önskad cellaggregatstorlek, eftersom högre koncentrationer ger större aggregat.
    2. Centrifugera plattan vid 200 xg under 5 min för att tvinga aggregation av celler i botten av mikrobrunnarna ( Figur 2B ). Lägg försiktigt ~ 2 ml odlingsmedium till toppen av varje PDMS-matris för att täcka alla utsatta mikrobrunnar, var noga med att inte störa de aggregerade cellerna.
    3. Om celler inte transduceras med en viral vektor, inkubera plattan i 12-24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 och fortsätt sedan till sektion 3. Om aggregaten transduceras, hoppa över inkubationen och fortsätt till avsnitt 2.4 .
  4. TranSduktion med en viral vektor för att observera kalciumsignalering
    Obs! Dessa steg utförs för att transducera neuroner med en viral vektor innehållande en genetiskt kodad kalciumindikator (GECI). Resultaten som visas i denna artikel erhölls med användning av ett kommersiellt tillgängligt adenoassocierat virus (AAV) (serotyp 1) med GCaMP6f, en GECI med snabb kinetik bestående av grönt fluorescerande protein (GFP), calmodulin (CaM) och M13-peptiden, Driven av den humana Synapsin I-promotorn. Den virala vektorlösningen kan kräva utspädning i steril DPBS före transduktion, beroende på koncentrationen av stamlösningen. Cellhälsa / morfologi och GCaMP6f signalstyrka måste observeras över tiden för en rad vektorkoncentrationer. Detta optimeringsförfarande måste utföras av varje undersökare för att bestämma lämplig titer för sina egna cellkulturer. Den typiska GCaMP6f-uttryckstiden är 7-8 dagar efter den transduktion som inträffar under inkubationen gjord i stEp 2.4.2.
    1. Med en mikropipett tillsättes den önskade volymen viral vektorlösning (för en slutlig koncentration av ~ 3,0 x 10 9 genomiska kopior per aggregat) till odlingsmediet som täcker aggregaten. Långsamt pipettera upp och ner för att säkerställa att vektorgrocessen är homogent fördelad i odlingsmediet.
    2. Inkubera plattan med de seedade pyramidala mikrobrunnarna i 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 för att tillåta viraltransduktion av GCaMP6f.

3. Utveckling av den cellulära komponenten av mikro-tenn

  1. ECM-kärnfabrikation
    1. Efter aggregatinkubering, tillsätt kollagen av typ I och laminin till odlingsmediet (för en koncentration av 1 mg / ml vardera) i ett mikrocentrifugrör för att framställa ECM-lösningen. Utför steg 3.1.2-3.1.4 vid rumstemperatur, men håll röret med ECM på is när det inte används för att förhindra för tidig gelning.
    2. Justera pH i ECM-lösningen genom att överföra 1-2 μL till litmuspapper för att verifiera det ursprungliga pH-värdet, tillsätt 1 μL 1 N natriumhydroxid (NaOH) och / eller 1 N saltsyra (HCl) till ECM, efter behov, Och upprepa tills pH är 7,2-7,4. Se till att homogenisering av ECM-lösningen sker genom att pipettera upp och ner samtidigt som luftbubblor bildas.
    3. Överför mikrokolonnerna med steriliserade tångar från disken i steg 1.4.3 för att tömma 35 eller 60 mm petriskålar. Arbeta på 4-5 mikrokolonner i taget för att förhindra uttorkning. Fäst en 10-μl-spets fäst på ett 1000-μl-spets till en mikropipett. Använd stereoskopet för visuell vägledning genom att placera spetsen i ena änden av mikrokolonnerna och sug för att extrahera kvarstående DPBS och luftbubblor från lumenet.
    4. Rita snabbt 4-5 μL ECM i en mikropipett. Observation under en steReoskop, placera toppen av mikropipetten vid en av ändarna av mikrokolonnerna och töm tillräckligt med ECM för att fylla lumenet. Bekräfta frånvaron av luftbubblor i lumen, eftersom dessa kan hämma axonal utväxt genom ECM. Om luftbubblor finns, ta bort ECM, som förklaras i steg 3.1.3, och lägg till ECM igen.
    5. För att förhindra uttorkning, tillsätt ~ 2 μL ECM runt varje mikrokolonn. Inkubera hydrogel / ECM-mikrokolonnerna i petriskålarna vid 37 ° C och 5% CO2 i 25 minuter. Fortsätt till cellsåning direkt efter inkubation.
      OBS: Inkubationsperioden i steg 3.1.5 är avsedd att tillåta tid för polymerisering av kollagen och laminin inuti mikrokolonnerna.
  2. Neuroncells sådd i mikrokolonnerna
    ANMÄRKNING: För att ändra odlingsmediet hos de transducerade aggregaten, luta plattan, använd en mikropipett för att avlägsna mediet som poolar på brunnens vägg och tillsätt därefter långsamt ~ 1 ml motVägg (för att undvika störning av aggregaten i pyramidala mikrobrunnar). Upprepa denna medianändring en gång till.
    1. Efter inkubationsperioden i steg 3.1.5, överför ca 10-20 μl odlingsmedium till två fria områden i petriskålarna som håller mikrokolonnerna. Använd en mikropipett för att individuellt överföra aggregaten till petriskålen som innehåller konstruktionerna och flytta dem med tång till en av de små poolerna av odlingsmedium för att bevara cellhälsan.
    2. Medan du observerar under ett stereoskop, sätt in ett aggregat i varje ände av mikrokolonnerna för dubbelriktad mikro-TENN eller vid ena änden för en enriktad arkitektur (enligt önskemål) med hjälp av tangor. Bekräfta placeringen av aggregaten i mikrokolumnerna med stereoskopet. Använd tångar för att flytta de utsatta mikrokolonnerna till den andra lilla poolen av odlingsmedium för att undvika uttorkning och för att bevara aggregathälsan.
    3. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 i 45 minuter till aLåsa aggregaten för att hålla fast vid ECM. Verifiera att aggregaten förblir i ändarna av mikrokolonnerna med stereoskopet; Återinföra cellaggregaten och upprepa inkubationsteget som nödvändigt.
    4. Översväm försiktigt Petriskålarna som innehåller mikro-TENN med odlingsmedium (3 eller 6 ml för en 35 respektive 60 mm petriskål) med användning av en serologisk pipett. Placera disken i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för långsiktig odling.
    5. Utför halvmedieändringar varannan dag med odlingsmedium. Ta försiktigt bort hälften av det gamla mediet med pipett och använd stereoskopet för visuell vägledning för att undvika att suga mikro-tennarna. Byt ut genom att långsamt tillsätta färskt, förvärmt medium med pipett.
    6. För att återutnyttja PDMS-mikrobrunnsarrayerna, avlägsna odlingsmediet, koka arraysna i avjoniserat vatten i 30 minuter och sterilisera i en autoklav för en annan omgång av aggregatbildningen och odlingen.
      OBS: Vid önskat tidpunkt,Cytoarkitektur av mikro-TENN kan verifieras med användning av faskontrastmikroskopi. Här användes en exponeringstid på 5-8 ms och 10X (0,64 μm / pixel) och 20X (0,32 μm / pixel) mål för att fånga faskontrastbilderna. Fluorescensen associerad med kalciumkoncentrationsförändringar i viraltransducerade mikro-TENN-er fångades med användning av ett fluorescensmikroskop med hög hastighet med en exponeringstid på 50 ms, en 10X-målsättning (0,64 um / pixel) och solid state-ljus med bandpassfilter av ~ 480 Nm och ~ 510 nm för excitation och emission, för att visualisera GCaMP6f fluorescenssignalen.

4. Immunocytokemi för In Vitro Studies

Anmärkning: För de bilder som visas här användes följande primära antikroppar: mus anti-Tuj-1 / beta-III-tubulin (1: 500) och kanin-anti-synapsin-1 (1: 500) för märkning av axoner och pre -synaptiska boutons, respektive. De sekundära antikropparna var åsna-anti-mouse 568 (1: 500) och åsna-anti-kanin 488 (1: 500). De erforderliga volymerna av de framställda primära och sekundära antikroppslösningarna, såväl som volymerna av formaldehyd-, hästserum- och detergentlösningarna beror på den volym som krävs för att helt täcka konstruktionerna. Dessa volymer kan minimeras med användning av en hydrofob barriärpenna för att begränsa området kring varje mikrokolonn.

VARNING: I detta avsnitt används formaldehyd och Hoechst. Formaldehyd är en giftig förening som är känd för att vara cancerframkallande och Hoechst är en känd mutagen. Därför måste dessa föreningar bortskaffas i en lämplig avfallsbehållare. Hantera dem alltid i en kemisk avluftningshuvud när du använder lämplig personlig skyddsutrustning, som en lab coat, skyddsglasögon och handskar.

  1. Förbered en 4,0% volym / volym (volym / volym) formaldehydlösning i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en kemisk avloppsugn.
  2. Ta bort odlingsmediet från petriskålarnaNg mikro-tenn med en mikropipett. Tillsätt tillräckligt mycket volym formaldehydlösningen till disken för att helt täcka mikro-tennarna. Blöt mikro-tennarna i formaldehydlösningen under 35 minuter vid 18-24 ° C för att fixera cellerna i mikrokolonnerna.
  3. Ta bort 4,0% formaldehydlösningen från petriskålarna med en pipett och kassera enligt lämpliga instruktioner för hantering av farligt material.
  4. Utför två snabba sköljningar genom att tillsätta tillräckligt med PBS för att helt täcka de fasta mikro-tennarna och sedan ta bort PBS med en pipett. Utför en tredje lång sköljning genom att blötlägga konstruktionerna i PBS under 10 minuter.
    VARNING: Kassera PBS som används för sköljning som eventuellt innehåller spår av formaldehyd.
  5. Förbered en 0,3% volym / volym lösning av nonjoniskt tvättmedel i 4% vol / vol hästserum i PBS. Ta bort PBS från petriskålarna som innehåller de fasta mikro-tennarna och tillsätt en tillräcklig volym av 0,3% tvättmedelslösningen för att täcka konstruktionerna. Blötlägg i 60 min vid 18-24 & #176; C för att permeabilisera cellerna.
  6. Ta bort tvättmedelslösningen med en pipett. Utför två snabba sköljningar genom att lägga till och därefter ta bort PBS. Efteråt utför tre längre sköljningar genom att blöta konstruktionerna i PBS under 5 min under varje sköljning.
  7. Späd primära antikroppar i 4% hästserum. Ta bort PBS från petriskålarna som innehåller de fasta och permeabiliserade mikro-tennarna. Tillsätt tillräckligt med primär antikroppslösning till mikrokolonnerna för att täcka dem fullständigt. Tät petriskålen med parafilm för att förhindra avdunstning och inkubera över natten (12-16 h) vid 4 ° C.
  8. Ta bort den primära antikroppslösningen från disken och skölj enligt förklaringen i steg 4.6. I mörkret, förbered den sekundära antikroppslösningen i 4,0% hästserum. Lägg till tillräckligt med sekundär antikroppslösning för att helt täcka konstruktionerna, täcka disken med aluminiumfolie och inkubera i 2 h vid 18-24 ° C.
  9. Förbered Hoechst-lösningen (1: 10 000) i PBS för att fläcka kärnorna.
  10. OBS! Bilderna för de immunomärkta mikro-tennerna togs med ett laser-konfokalmikroskop med en upplösning på 2,048 (~ 8 s / ram), en 10X objektiv (0,64 μm / pixel), 487 nm excitations och ~ 525 nm utsläppsvåglängder för Grön fluorescens, 561 nm excitations och ~ 595 nm utsläppsvåglängder för röd fluorescens och ~ 3,22 pm / skiva med ~ 60 skivor i medelvärdet för z-staplarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikro-TENNs övervakades med användning av faskontrastmikroskopi för att bedöma deras cytoarkitektur och axonal utväxt ( Figur 4 ). Inom enriktad, 2 mm lång mikro-tenn begränsades neuronalaggregat till ena änden av mikrokolonnen och projicerade ett bunt av axoner genom den inre kärnan. Axonerna sträckte sig över hela längden av kolonnen med 5 dagar in vitro (DIV) ( Figur 4A ). Det fanns en större initial axonal tillväxthastighet i tvåriktiga 2 mm långa mikro-TENN, eftersom axonerna spände över hela mikrokolonnen med 3 DIV ( Figur 4B ). Vid 5 DIV uppvisade tvåriktiga mikro-tenn täta axonala kanaler som kopplade aggregaten som upprätthölls vid mikrokolonnens ytterpunkter. Denna cytoarkitektur observerades också i 5-tums mikro-TENN, med axoner som spände över mikrokolonnen med 5 DIV ( Figur 4C ). Som observerat i alla fall, ECM i lumen och geometrisk restriCtion som presenteras av agarosen gav den riktning som krävs för att bilda axonala områden som strukturellt efterliknar egenskaper hos nativ neuroanatomi.

Immunocytokemitekniker användes i detta protokoll, och konfokala bilder togs för att verifiera komponenterna i mikro-TENN-arkitekturen. Cellkärnor färgade med Hoechst (blå) lokaliserades nästan uteslutande inom aggregat vid ytterligheterna av enriktade och dubbelriktade mikrokolonner, med väsentligen ingen Hoechst-färgning i det inre ( Figur 5 ). Denna observation bekräftade vad som härleddes från faskontrastbilderna: neuronpopulationer var begränsade till ändarna, och endast axoner (i rött) spände över mikro-tennens lumen. Men efter axoner korsade aggregaten observerades cellmigration längs axonaltraktionerna in i inre lumen, vilket observerades genom närvaron av kärnor (blå) i inredningen vid 28 DIV för en 2 mm lång bidirektorCtional micro-TENN ( Figur 6 ). Vidare hittades synapsin I immunomärkning (grön) genom cellkropparna och axonala kanalerna ( Figur 6 ). Synapsin I är ett presynaptiskt terminalprotein inblandat i regleringen av neurotransmittorfrisättning och indikerar närvaron av presynaptiska terminaler när de hittas i en punktlig fördelning; Det har tidigare korrelerat med bildandet av aktiva synapser genom helcellsplåtsinspelningar 49 . Synapsinfärgningen i den axonrika centrala zonen i mikro-TENN är sannolikt att en kombination av puncta och synapsin transporteras ner axons mot presynaptiska terminaler. Icke desto mindre antyder närvaron av synapsin puncta inom mikro-TENN aggregaten att dessa konstruktioner har förmåga att kommunicera genom synapser, även om kolokalisering av synapsin med ett postsynaptiskt protein skulle krävas för ytterligare strukturella tecken på funktionella synapser. </ P>

Mikro-tenn tillverkades också med aggregerade neuroner som transducerades med en AAV innehållande GCaMP6f-kalciumindikatorn för att preliminärt sondra de elektrofysiologiska egenskaperna hos dessa konstruktioner. Dessa konstruktioner uttryckte kalciumindikatorn under hela sin längd, såsom visas genom fluorescens i både de neuronala aggregaten och axonala kanalerna ( Figur 7A ). Observera att på grund av mikroskopinställningar som syftar till att maximera intensiteten i aggregaten såg fluorescensen i axonaltraktionerna färre. Dessa transducerade mikro-TENN analyserades med tiden med höghastighetsfluorescensmikroskopi (utan extern elektrisk stimulering) och flera cellstorleksområden av intresse (ROI) valdes slumpmässigt i en representativ mikro-TENN för att karakterisera signalkapaciteten hos dessa konstruktioner. Kalkkoncentrationsbrott observerades i nästan alla ROI, vilket återspeglas med assocFluktuationsintensiteter under hela tiden ( Figur 7B ). Särskilt visade olika avkastningar att de uppvisade en nästan konstant periodicitet av kalciumkoncentrationsökningar ( Figur 7B ). Dessa förändringar av kalciumkoncentrationen är avledda för att vara resultatet av spontana, inneboende aktionspotentialer, cellsignalering inom individuella aggregat och / eller signalering över axoner från olika aggregeringar. Ytterligare analyser är nödvändiga för att fullt ut karakterisera de elektrofysiologiska egenskaperna hos neuroner och axonala områden inom mikro-TENN. Ändå visar dessa initiala resultat att mikro-tenn uppvisar robust endogen / baslinje elektrisk aktivitet.

Figur 3
Figur 3: Blueprints av den laserskurna mikrokolonnfabrikationsanordningen och den 3D-tryckta pyramidala mikrobrunnformen för cellaggregation. ( A) - ( B ) Blueprint och bild av botten- och övre halvorna av den cylindriska kanaluppsättningen användes för att tillverka hydrogelmikrokolumnerna. ( C ) Blueprint och bild av kapslarna som används för att hålla enheten ihop. Både främre och bakre bitar delar samma dimensioner. ( D ) Bild av den monterade enheten som krävs för att tillverka mikrokolonnerna. Endast de två kapslarna och bottenhalvan är fastklämda med skruvar i de nedre två inriktningshålen (vänster). De trasiga linjerna visar placeringen av akupunkturnålen genom de fem hålen på varje lock. Den flytande agarosen läggs till bottenhalvan av cylindrarna och därefter placeras den övre halvan (höger) på anordningen för att forma den flytande agarosen i form. ( E ) Blueprint av de 3D-tryckta formarna som används för att göra PDMS-mikrobrunnsarrayer. ( F ) Bilder av den 3D-tryckta formen (vänster) och PDMS-mikrobrunnskivorna (höger). Alla mått är i milli Meter (mm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: Observation av axonal tillväxt i mikro-TENNS genom faskontrastbildning av enriktade och dubbelriktade konstruktioner som en funktion av dagar in vitro . ( A ) Enriktad 2 mm lång mikro-tenn visar axonala kanaler som sträcker sig nästan hela längden av mikrokolonnen med 5 DIV. ( B ) Jämfört med enriktad mikro-TENN, visar tvåriktad 2 mm mikro-tenn en snabbare axonal tillväxt. ( C ) För 5 mm dubbelriktad mikro-TENN, fyller axonala områden längden på mikrokolonnen vid 5 DIV. Denna arkitektur upprätthålls åtminstone till 10 DIV. Skalstänger = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5
Figur 5: Mikro-Tenn-cytoarkitektur observerad med konfokala bilder av immunomärkta enriktade och dubbelriktade mikro-tenn. Celler färgades för cellkärnor (Hoechst; blå) och axoner (Tuj1; röd). ( A ) Fas-kontrastbild av en 5 mm dubbelriktad mikro-TENN (28 DIV). Konfokala rekonstruktioner ( D ) - ( F ) och ( I ) - ( K ) av en 5 mm dubbelriktad (28 DIV) och en enriktad (25 DIV) mikro-TENN, visar märkta cellkärnor ( D ), ( I ) Och axoner ( E ), ( J ), såväl som överlagret ( F ), ( K ). Skalstänger: 500 μm. Insatser i ( A F ) och ( K ) hänvisar till faskontrast ( B ) - ( C ) och konfokala ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) inzoom av neuronalaggregat och axonala områden . Bilderna visar aggregaten begränsade till ändarna av mikro-TENN, medan lumen spänns av inriktade axonala områden. Skalstänger = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6
Figur 6: Uttryck av presynaptiska terminala proteinsynapsin I i en representativ dubbelriktad mikro-TENN. Konstruktionen färgades för cellkärnor (Hoechst; blå), axoner (Tuj1; röd) och presynaptiska bons (synapsin I; green). ( A ) Fas-kontrAst bild av en 2 mm dubbelriktad mikro-TENN vid 28 DIV. ( D ) - ( G ) Konfokala rekonstruktioner som visar cellkärnorna ( D ), axoner ( E ), presynaptiska bons ( F ) och en överlagring ( G ) hos de tre kanalerna. Lådor visar zoom-ins ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) av faskontrast- och överlagringsbilderna för de neuronala aggregaten. Skalstänger = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7
Figur 7: Spontan signalaktivitet i en dubbelriktad mikro-TENN observerad genom uttryck av en genetiskt kodad kalciumindikator. ( A ) FluorescensE-mikroskopi bekräftade uttrycket av GCaMP-reportern, såsom observerats genom fluorescens genom aggregaten och axonerna. Skalstång = 100 μm. ( B ) Fluorescensförändringar associerade med kalciumkoncentrationsvariationer uppmättes utan extern stimulering vid flera intressanta regioner (ROI) som en funktion av tiden. De numrerade färgade cirklarna i ( A ) anger dessa ROI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8
Figur 8: Fas-kontrastbilder av vanliga felsätt i mikro-TENN-metoden. ( A ) En fullständigt dehydrerad / torkad agarosmikrokolonn som ett resultat av avlägsnandet och / eller indunstningen av DPBS i de initiala tillverkningsstadierna. Skala bar = 5081; m. ( B ) Hydrogelmikrokolonn med lumen som beklär konstruktionen på grund av bristen på koncentrisk inriktning av akupunkturnålen med kapillärröret. Skalstång = 100 μm. ( C ) Seeded micro-TENN med båda aggregaten närvarande vid 1 DIV. ( D ) En av aggregaten föll av från samma mikrolumkolonn som ( C ) vid 3 DIV. ( E ) Enriktad mikro-TENN vid 4 DIV. ( F ) De aggregerade och axonala områdena föll ut från mikrokolonnen i ( E ) och förblev flytande i odlingsmediet vid 5 DIV. Skalbalk för ( C ) - ( E ) = 300 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CNS-skada och sjukdom resulterar typiskt i förlust eller dysfunktion hos de långväga axonala vägarna som innefattar hjärnans anslutning, med eller utan samtidig neuronal degenerering. Detta förhöjs av den begränsade kapaciteten hos CNS för att främja neurogenes och regenerering. Trots strävan efter reparationsstrategier, såsom tillväxtfaktor, cell- och biomaterialleverans som individuella eller kombinatoriska tillvägagångssätt, misslyckas dessa tekniker samtidigt för att ta hänsyn till både degenerationen av neuronala celler och förlusten av axonala anslutningar 14 , 22 . Dessa luckor i teknik begränsar möjligheten att reparera, ändra och sätta neurala nätverk på ett kontrollerat och hållbart sätt. Följaktligen utvecklades mikro-TENN-tekniken för att tillgodose behovet av en neural reparationsstrategi som i motsats till befintliga metoder underlättar både neuronal ersättning och rekonstruktion av långa axonala anslutningar. MicRo-tenn är implanterbara levande byggnadsställningar med en förformad cytoarkitektur som närmar sig systemnivåbyggnadsblocken i hjärnans anslutning som är speciellt utformade för målinriktad rekonstruktion, ersättning och modifiering av värdneuroplan. Dessa byggnadsställningar består av diskret population (er) av neuroner som är förbundna med långa axonala områden inom ECM-innehållande lumen av miniatyrcylindriska agaroshydrogeler. Dessa konstruktioner kan vara kapabla att fungera som synaptiska reläer för att ersätta förlorade vägar och dynamiskt modulerande nativa kretsar. Dessutom kan mikro-tenn i fall av isolerad axonal degenerering (med källa neuroner kvar i intakt) möjligen fungera som guider för axonal regenerering baserat på mekanismen för axon-underlättad axonregenerering. Detta manuskript presenterade tillverkningsprotokollet för att på ett tillförlitligt sätt skapa mikro-tenn, med kontrollerad geometri, fenotyp och funktionella egenskaper. Fas-kontrastmikroskopi, immuncytokemiStry och konfokalmikroskopi visade att mikro-TENN producerade med protokollet uppvisar den erforderliga cytoarkitekturen och uttrycker presynaptisk terminal proteinsynapsin. Vidare visades att mikro-TENN har egen signalaktivitet, eventuellt på grund av åtgärdspotentialer, i avsaknad av extern simulering. Detta fastställdes genom närvaron av närasynkrona fluktuationer i fluorescensen associerad med en genetiskt kodad kalciumreporter.

Mikro-TENN-utveckling kan sammanfattas med tre steg: (1) tillverkningen av det ihåliga hydrogelröret, (2) tillsatsen av ECM-lösningen till rörets lumen och (3) sådd av aggregat av isolerade neuroner i Ändarna av röret. Mikropolonnerna kan tillverkas med glaskapillärrör eller med en mikrofabrikad anordning innehållande cylindriska kanaler. Denna enhet kan skapas med alla mikrokomponenter med hög precision som finns tillgängliga för utredaren. FlytandeAgaros hälls i anordningens kanaler eller i kapillärrör innehållande en centrerad akupunkturnål för att skapa hydrogelmikrokolumnerna. Efter agarosgelering avlägsnas akupunkturnålen för att producera den ihåliga lumen. Flera vanliga fallgropar som uppstår under tillverkning eller tillväxt framhävs i figur 8 . Observera att några av bilderna som visas i Figur 4 och ett extremt fall i Figur 8B visar den luminala delen osäkert nära cylinderns vägg. För att skapa en jämn väggtjocklek vid användning av kapillärrörmetoden bör rörnålen monteras upprätt när den kommer i kontakt med agaros och nålen bibehålls i mitten av röret. Att hålla rörnålenheten i en vinkel relativt agarosytan främjar decentralisering av nålen. Dessa försiktighetsåtgärder är emellertid svåra att genomföra, och nålen är oftare än att inte vila sigG kapillärrörens väggar. Tvärtom är den huvudsakliga aktiviteten hos den mikrofabrikerade anordningen att den har nålhål koncentrerade i linje med de cylindriska kanalerna, vilket främjar en adekvat centralisering av nålen och lumenet i förhållande till kanalen respektive mikrokolonnen. Dessutom ökar enheten genomströmning genom att underlätta tillverkningen av flera mikropolonner samtidigt. Trots nytta som tillhandahålls av enheten kan off-center lumens fortfarande skapas genom att använda böjda akupunkturnålor. Mikrofabrikationstekniker har också en inneboende tolerans som begränsar deras effektivitet. I allmänhet bör mikrokolonnets uttorkning, för vilket ett extremt fall visas i figur 8A , inte vara ett hinder om rekommendationerna som tillhandahålls genom protokollet följs. Observera att de fysikaliska egenskaperna hos agarosen som används för yttre kappning kan behöva optimering för alternativa neuronella subtyper, som förbättrad kortikal neuron sUrvival och neurit utväxt vid högre (3-4%) jämfört med lägre (1-2%) agaros-koncentrationer observerades 10 .

Mikro-Tenn-utveckling fortsätter med införandet av ECM i mikrokolonnens lumen, vilket tjänar till att ge en miljö som är tillräcklig för neuronal vidhäftning, överlevnad och utväxt. Dessutom begränsar ECM i kombination med den geometriska begränsningen och den låga porositeten som tillhandahålls av agaroshydrogelen axonal tillväxt i längdriktningen för att åstadkomma den erforderliga arkitekturen. Innehållet i ECM-lösningen kan optimeras för den typ av neuron som används. Till exempel främjar kollagen ensam överlevnad och axonal utväxt i DRG-mikro-TENN, medan en kombination av kollagen och laminin erfordras för kortikala neuroner 10 . Vidare är ECM-polymerisation inuti mikrokolonnen kritisk före cellplätering, eftersom samavgivning av celler med opolymeriserad ECM leder till minskad neuritgränsOwth och fasciculation 31 . Observera att även om mikrokolonnen initialt är fylld med ECM-lösning polymeriserar dess innehåll i en mjuk gel och tenderar att kontraheras under inkubationsperioden, vilket skapar ett utrymme som tillåter införandet av cellaggregaten. Dessutom är det viktigt att bekräfta att ECM har gått in i mikrokolonnens inre genom att inspektera under stereoskopet. Fullständiga frånvaro och / eller fickor med saknade ECM-resultat i brist på axonal utväxt från aggregaten. Mikro-Tenn-tillverkning kulminerar i sådd av kortikala neuronaggregat vid ytterstommen på byggnadsstället. Dessa neuroner dissekerades från råttafoster med användning av kända förfaranden 48 . Det kan utläsas att majoriteten av isolerade celler är neuroner eftersom den embryonala råttcortexen vid gestationstiden som används för isolering består av 99% neuroner och det definierade odlingsmediet som används i protokollet är metaboliskt begränsande för glialproliferation 49 . Följaktligen bör det finnas minimal glialkontaminering, även om färgning för specifika markörer krävs för bekräftelse. Även om detta manuskript presenterade mikro-TENN-tillverkning med kortikala nervceller, kan neuroner från olika hjärnregioner ( t.ex. nigral, thalamid och hippocampal) eller med olika fenotyper ( t.ex. excitatorisk, hämmande och dopaminerg) utnyttjas enligt önskad applikation och Implantationsområde. Tidigare iterationer av mikro-TENN-tillverkningsprotokollet involverade sådd dissocierade celler 10 , 31 , 32 . Fastän den önskade cytoarkitekturen har erhållits med användning av dissocierad metod uppnåddes det inte i alla fall. I många fall översvämmade dissocierade celler interiören och resulterade i flera cellkroppskluster i hela lumen, med processer som förbinder dem i ett omfattande 3D-nätverkRef "> 10 , 31. Den aggregerade metoden å andra sidan säkerställer inneslutning av cellkroppar till ytterligheterna och är därför integrerad i mikro-TENN-teknologins framgång ( Figur 5 ). De representativa mikro-TENN-erna som visas I figurerna 4-6 tillverkades med större aggregat som inte fullständigt infördes, och detta kan ibland resultera i att aggregat faller ut ur mikrokolonnerna i odling, som exemplen visade i figur 8D och 8E . För att förhindra detta kan aggregaten Fullständigt införd i mikrokolonnens inre. Om denna situation presenterar sig, även efter tillämpning av den tidigare strategin, kan den initiala inkubationsperioden förlängas för att ge tillräcklig tid för aggregerad vidhäftning till ECM. Under kulturen är mild hantering av mikro-tenn Rekommenderas för att bevara integriteten hos hydrogelkroppen och cytoarkitekturen, problem under mikro-TENN-manipulation är orsaken till de krökningar som erhållits i de ömsesidiga axonala kanalerna ( Figur 5 ). Efter det protokoll som presenteras i den här artikeln borde det emellertid resultera i konsekvent tillverkning av mikro-tenn med den förväntade neuronala / axonala arkitekturen, presynaptisk boutfördelning och inneboende elektrisk aktivitet.

Trots det löften som mikro-TENN håller, finns det kvar utmaningar som kan begränsa användningen av denna teknik. Den nuvarande mikrokolonnebearbetningstekniken är begränsad av decentraliseringen av mikrokolonnens lumen, vilket kan orsaka en inkonsekvent presentation av mekaniska signaler till celler ( t.ex. styvhet), rupturering av mikrokolonnväggen och efterföljande exponering av axonala områden Till utsidan och problem vid implantering. Även om användningen av en mikrofabrikat har förbättrat utfallet jämfört med kapillärrör, högre precisionsmikro-fabricationN-tekniker erfordras för att öka den dimensionala reproducerbarheten hos dessa konstruktioner. Resultaten i detta manuskript visade att mikro-TENN-metoden på ett tillförlitligt sätt kan producera levande byggnadsställningar bestående av neuroner och axonala områden som liknar inhemsk neuroanatomi, särskilt de axonala områden som förbinder distinkta hjärnregioner. Ändå är mikro-TENN-längden en hinder, beroende på längden på den värdaxonala vägen som behöver bytas ut. Till exempel är vävnadsgenererade nervtransplantat (TENG) en separat levnadsställningsstrategi som används av vår forskargrupp för att reparera extremt långa nervskador. För att ersätta dessa långa luckor kan axonerna i TENG förlängas till tiotals centimeter genom att applicera kontinuerlig mekanisk spänning i anpassade mekano-bioreaktorer 1 , 23 , 50 . Denna "sträcktillväxt" -teknik har också tillämpats för att manipulera astrocytisk processlängd till betteR imitera strukturen hos de radiella glialbanorna 51 . Tvärtom erbjuder den nuvarande mikro-TENN-tekniken ännu inte denna omfattning av kontrollen; Den maximala uppnådda längden begränsas för närvarande av hur länge axonala kanaler kan växa in vitro baserat på traditionell tillväxt-konformad förlängning. Dessutom, även om CNS har en egen förmåga för neurofysiologisk omkoppling som svar på olika stimuli och transplanterade celler har förmågan att synaptiskt integrera med nativa kretsar, är en annan begränsning av denna teknik att mikro-tenn förlita sig på plasticiteten hos den ursprungliga hjärnan Och värdnätverkens förmåga att funktionellt integrera med den implanterade konstruktionen 52 , 53 , 54 , 55 . Slutligen är en medfödd brist på alla implantatbaserade tillvägagångssätt, såsom mikro-tenn, deras invasivitet. Eftersom neuroner ärAllmänt i närheten av kapillärer kan varje typ av kirurgiskt ingrepp orsaka störningar i blod-hjärnbarriären, läckage av blodfaktorer i hjärnparenchymen och ett akut (och till och med kroniskt) inflammatoriskt svar 31 . Detta svar kan skada värd- och mikro-TENN-neuroner, och negativisera de fördelaktiga aspekterna av denna teknik. Emellertid överlevde mikro-TENN som implanterades i den kortikotalamiska vägen hos råttor i minst 1 månad och visade bevis på strukturell integration med värdens cerebrala cortex 10 , 31 . Vidare presenterade en tidigare publikation från vår forskargrupp en metod som möjliggjorde nållös implantation av mikro-tenn i råtthjärnor 31 . I detta tillvägagångssätt utvidgades denna hydrogelkodningsstrategi att innefatta en tunn (~ 20 um) beläggning av karboximetylcellulosa, som vid mild uttorkning uppvisade tillräcklig styvhet för att tränga inHjärnan utan att behöva en nål eller guide 31 . Denna nållösa implantationsmetod, i kombination med mikrokolonnens lilla tvärsnitt, bör minimera skador på hjärnan under och efter den stereotaxiska implantationsproceduren.

Trots Micro-Tenns preliminära framgångar in vivo måste framtida studier bekräfta att dessa konstruktioner synaptiskt integreras med inhemsk vävnad och undersöka om funktionell återhämtning erhålls i modeller av CNS-skada och neurodegenerativ sjukdom 10 , 31 . Till exempel kan skräddarsydda mikro-tenn konstrueras med specifika cellfenotyper och implanteras i motsvarande degenererade vägen för att rekonstruera nätverks- och återställningsfunktionen. För att minska det akuta inflammatoriska svaret efter implantation kan mikro-TENN hydrogelskalet dopas med antiinflammatoriska och pro-överlevnadsmedel. Alternativ tillverkningTekniker ( t.ex. 3D-utskrift) kan utvecklas för att generera hydrogelmikrokolumnerna med större lätthet och med mer exakta egenskaper, inklusive konsekvent centralisering av lumen och reproducerbarhet av dimensioner. Samma biomaterialschema som används med mikro-TENN kan modifieras för att ta itu med andra karakteristiska patologier av CNS-skada och sjukdom. Till exempel har vår grupp tidigare utvecklat konstruktioner som består av longitudinellt inriktade astrocytiska buntar längs den kollagenbelagda lumen av en agaroshydrogel som strukturellt emulerar radiella glialbanor och glialröret för att underlätta axonal regenerering och neuronal migration 56 . Dessutom kan stamceller, såsom humana embryonala stamceller (HESC), inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) och adiposa-härledda stamceller (ASC), införlivas för att tillverka autologa mikro-TENN per patient till mer Nära liknar den förlorade cytoarkitekturen och cellfenotypen. Dessa futuRe-modifieringar skulle öka förmågan hos mikro-tenn att ersätta degenererade vägar in vivo och möjliggöra rekonstruktion av mer sofistikerade vävnadsarkitekturer, innefattande astroglial stöd och axonal myelinering bland andra funktioner. Genetiskt manipulerade neuroner kan också utsädes för att antingen öka den regenerativa verkan hos mikro-TENN genom frisättning av trofiska faktorer eller möjliggöra modulering av CNS genom den optogenetiska stimuleringen av lätta gatedjonskanaler 43 . Dessa byggnadsställningar skulle kunna tillverkas med excitatoriska eller hämmande neuroner för att synaptiskt modulera existerande dysfunktionella värdanslutningar under sådana förhållanden som epilepsi, depression, drogmissbruk eller smärtlidor 1 . Exempelvis kan mikro-TENN som bildar övervägande GABAergiska eller glutamatergiska synapser konstrueras för att undertrycka eller stimulera respektive upp- eller avreglerade vägar via synaptisk integration och / eller genom bulkneurOtransmitterfrisättning. Viktigt är att sådana självständiga modulerande konstruktioner teoretiskt skulle vara responsiva baserat på värdnätverksåterkoppling 1 . På liknande sätt kan mikro-tenn användas som hjärn-dator gränssnitt (BCI), med optogenetiskt konstruerade mikro-TENN som tjänar som mellanprodukter mellan hjärnan och oorganiska stimulerande eller inspelningsanordningar. Denna applikation kan vara ett alternativ till mikroelektrode BCI, som saknar specifik cellinriktning och mekanisk stabilitet och har orsakat inflammatoriska reaktioner, glialärbildning och neuronal migration eller förlust när de trängdes in i hjärnan 57 , 58 .

Som in vitro -testbäddar kan mikro-tennor ge en kraftfull plattform för studier av neurobiologi och elektrofysiologi, som fungerar som biofideliska modeller av nervsystemet. Dessutom kan 3D-konstruktioner fungera som testbäddar för behandlingsstrategier när de används som neurala injUry- och sjukdomsmodeller 59 . Som 3D-konstruktioner kan mikro-tenn simulera in vivo- miljön, som kännetecknas av komplexa cellceller och cell-ECM-interaktioner i alla rumsliga riktningar som inte kan representeras korrekt i plana kulturer 42 , 60 , 61 , 62 , 63 64 , 65 . Faktum är att många undersökningar har fastställt att typen av miljö är kritisk för att celler ska presentera morfologi, proliferation, migration, genuttryck, differentiering och signalering uppvisad i den ursprungliga inställningen 60 . Likheterna mellan 3D-miljön hos dessa byggnadsställen och själva hjärnan kompletteras av graden av kontroll som dessa konstruktioner erbjuder över deras fysiska och biokemiska prOperties 42 . Detta möjliggör konstruktion av mikro-TENN med olika uppsättningar mekaniska, haptotaxiska och kemotaxiska signaler för att studera effekten av dessa signaler, individuellt eller synergistiskt, på neuronal överlevnad, mognad, axonal förlängning, synaptogenes och mekanotransduktion 32 , 42 , 63 . Dessutom tillåter designflexibiliteten hos denna mikrovävnadstekniksteknik byggandet av levande byggnadsställningar som efterliknar andra egenskaper hos hjärnvävnaden, såsom den kolonnära, fackformiga strukturen hos neocortexen, som sträcker sig genom axonaltraktionerna hos anslutningen, för att ytterligare öka Kraften i detta system som en in vitro- plattform för att studera hjärnan 65 . Som undersökningsplattformar utnyttjar mikro-TENNs den kontrollerade inställningen av typiska in vitro- modeller, den expansiva tillgängligheten av designparametrar i vävnad enGineering-tillvägagångssätt och den ökade fysiologiska och patofysiologiska relevansen av 3D-plattformar för att bli en ideell testbädd för att främja neurobiologisk kunskap. Mångfalden av framtida riktningar för denna teknik indikerar mångsidigheten hos mikro-tenn. Detta manuskript har visat att mikro-TENN-protokollet på ett tillförlitligt sätt kan producera vävnadsmönstret levnadsställningar som efterliknar viktiga egenskaper hos neuroanatomi i hjärnan för att erbjuda nya insikter i neurobiologiska fenomen, inklusive utveckling, sjukdom och reparationsprocesser. Dessa konstruktioner kan också synaptiskt integreras med nativ vävnad för att rekonstruera skadade vita substansområden, ersätta förlorade neuronala celler och modulera dysreglerade vägar efter CNS-skada och sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Finansiellt stöd tillhandahölls av National Institute of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) och F31-NS090746 (Katiyar)), Michael J. Fox Foundation (Therapeutic Pipeline Program # 9998 (Cullen) Penny Medicine Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation (forskarutbildning stipendier DGE-1321851 (Struzyna och Adewole)), Veteransfrågor (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), American Association Neurologiska kirurger och kongress för neurologiska kirurger (Codman Society of Neurotrauma och Critical Care, 2015-2016) och US Army Medical Research and Materials Command (# W81XWH-13-207004 (Cullen) och W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laser cutter Universal Laser Systems PLS4.75 Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts -------------- -------------- #4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter) Lhasa Medical sj.16X40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter) Fisher 21170D The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Mouse laminin Corning 354232 Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium Invitrogen 21103049 Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement Invitrogen 12587010 Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine  Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Objet30 3D-Printer Stratasys  -------------- Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold Custom-made -------------- Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent Fisher NC9285739 Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel Fisher 10-348C
1 ml pipette bulb Sigma Z509035
Micro-spatula Fisher S50821
12-well culture plate EMESCO 1194-353043
Oven Fisher 11-475-154
Incubator Fisher 13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 UPenn Vector Core 36373 Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. 
Triton X-100 Sigma T8787 Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum Gibco 16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody Sigma T8578-200UL Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody Synaptic Systems 106-001 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope  Nikon -------------- Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope  Nikon -------------- Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope Nikon -------------- Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software Nikon Instruments -------------- Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10, (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16, (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67, (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27, (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37, (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407, (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34, (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21, (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67, (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3, (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296, (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214, (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209, (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39, (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31, (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48, (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21, (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26, (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13, (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18, (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11, (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6, (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106, (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6, (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11, (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3, (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20, (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18, (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3, (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14, (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23, (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15, (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116, (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24, (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80, (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25, (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44, (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5, (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5, (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11, (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35, (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10, (9), 1362-1373 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics