Мульти-отверстие криопробирку Исключает Замораживание Артефакты при мышечной ткани непосредственно погружали в жидкий азот

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол описывает процедуру, чтобы заморозить мышечную ткань, погружая их непосредственно в жидкий азот. Этот протокол также подчеркивает новый криопробирку, которые могут избежать «эффекта» веерной газообразного азота, когда жидкость контактирует азота поверхность ткани образца.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Исследования по физиологии скелетной мышцы сталкиваются с технической проблемой соответствующей обработки образцов, чтобы получить участки с четко видимыми цитоплазматическими отсеками. Другим препятствием является жесткой аппозиция миофибрилл в окружающие ткани. Поскольку процесс фиксации ткани и парафин приводит к усадке мышечных волокон, замораживание является оптимальным средством упрочнения мышечной ткани для секционирования. Тем не менее, обычно встречается проблема, образование кристаллов льда, происходит во время приготовления замороженных срезов из-за высокого содержания воды в мышцах. Протокол, представленные здесь в первую очередь описывает простой и эффективный метод замораживания должным мышечной ткани путем погружения их в жидком азоте. Проблема с использованием жидкого азота в одиночку является то, что он приводит к образованию газового барьера азота рядом с тканью, которая действует как изолятор и препятствует охлаждению тканей. Чтобы избежать этого эффекта «пара одеяла», а пж криопробирка была разработана, чтобы увеличить скорость потока жидкости вокруг поверхности ткани. Это было достигнуто путем штамповки в общей сложности 14 впускных отверстий в стенке флакона. В соответствии с динамикой пузыря, более высокая скорость потока жидкости приводит в небольших пузырьков и меньше шансов образовать газовый барьер. Когда жидкий азот поступает в криопробирку через впускные отверстия, скорость потока вокруг ткани достаточно быстро, чтобы устранить газовый барьер. По сравнению с методом замораживания мышечной ткани с использованием предварительно охлажденный изопентана, этот протокол является более простым и более эффективным и может быть использован, чтобы заморозить мышцы в пропускной способности образом. Кроме того, этот метод является оптимальным для учреждений, которые не имеют доступ к изопентану, что крайне воспламеняется при комнатной температуре.

Introduction

Скелетная мышца является наиболее ценным компонентом мяса по производству животного из пищевой и перерабатывающей точки зрения. В мясной промышленности, есть два особенно важный аспект: эффективность роста мышц и качество получаемого мяса. В качестве основного компонента мышцы, мышечные волокна имеют непосредственное отношение к динамике роста и свежему качеству мяса у животных 1. Например, общее количество волокон (TNF), и площадь поперечного сечения волокон (CSAF), в основном определяют мышечную массу и качество мяса; Кроме того , Тип волокна Состав (FTC) сильно влияет на качество свежего мяса 2. Таким образом, манипулирование характеристик мышечных волокон у животных является весьма эффективным методом для повышения рентабельности и основной конкурентоспособности ферм 1.

На сегодняшний день, несколько внутренних и внешних факторов, были идентифицированы, чтобы манипулировать мышечных волокон characteristектронные 1. Эта манипуляция может быть достигнуто за счет целенаправленного отбора животных с определенными генами, такими как миостатин гена у крупного рогатого скота, 3 гена Callipyge у овец, 4 и RYR1 и генов Igf2 у свиней 5. Кроме того , контроль диеты и лечение с определенными гормонами играют важную роль в мышечных волокнах характеристик 6. Таким образом, подход, который сочетает в себе генетические и пищевые факторы могут быть в состоянии улучшить постное содержание мяса и качество мяса. Однако исследования мышечных волокон ограничены в мясной промышленности, так как выяснение структуры мышечных волокон, по-прежнему является проблемой.

свойства мышечного волокна, идентифицируют с использованием гистохимических методов, таких как анализ миозина аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы). Этот метод основан на том факте, что ферменты, расположенной в тонких (6-8 мкм) замороженных секциймышечные волокна могут быть химически реагируют с определенными продуктами. Однако, содержание воды в мышцах у свиней, кроликов, мышей и человека больше , чем 75%, независимо от положения (то есть спины, живота или задних конечностей) 7. Такое высокое содержание влаги в мышцах вызывает часто встречается вопрос - замораживание - артефакты при подготовке криосрезов, как описано ранее , 8, 9. В большинстве случаев это практически невозможно правильно заморозить мышечные ткани в производственной линии скотобойни, согласно нашему опыту.

Протокол, представленные здесь описывает простой и эффективный метод, используемый в нашей лаборатории, чтобы заморозить мышечные ткани для cryosectioning в высокой пропускной образом. Момент этого метода является новой криопробиркой, который предназначен для флэша-замораживания мышечной ткани в жидком азоте. Тока рабочий процесс может одновременно облегчить тканизамораживания и обработки для отличной мышечной cryosection, с четко видимым цитоплазматическим отсеком и плотно аппозициями миофибрилл к окружающей ткани. Кроме того, этот протокол может быть применен к широкому спектру вариантов для анализа ткани, потому что жидкий азот не смешивается с тканями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Текущий метод был создан и подтвержден для сбора и хранения более 1000 образцов мышц для гистологического окрашивания в нашей лаборатории. Все процедуры, связанные с уходом за животными и использование в соответствии с руководящими установленные Министерством сельского хозяйства Китая.

1. Оборудование для сбора проб

  1. Этикетка идентичности образца на каждую криогенной флаконе.
    Примечание: криогенное флакон специально разработано , чтобы заморозить образцы свежей ткани для процедуры cryosection (рис 1А). Пробирки изготовлены из полипропилена в формовочной заводе (рис 1C).
  2. Получить следующее оборудование: жидкий азот в соответствующем резервуаре с жидким азотом, защитные очки или защитную маску, Морозильник перчатки 10 см щипцов, 25 см пинцетом, а Styrofoam охладитель (внутренние размеры: 20 см в длину в ширину х 13,5 см высокий х 12 см ; внешние размеры: 24 см в длину х 16 см в ширину х 15 см в высоту), пластиковая пленка (2,5 см длиной х 0,8 см толщиной в ширину и 0,1 мм),скальпель, и А4 ПВХ привязки крышки (21 см х 29,5 см) (Фигура 1В).

2. Подготовка образцов Muscle

  1. Заполните охладитель Styrofoam с жидким азотом 5 мин перед сбора проб.
    Примечание: большая колонна жидкого азота имеет важное значение, так как часть жидкого азота выкипает и превращается в газ, когда свежие образцы прикоснуться к ней. Для того чтобы уменьшить частоту передачи жидкого азота для пополнения потерь, соответствующего размером Пенопласта охладитель должен быть приобретен заранее в соответствии с количеством образцов.
  2. После того, как образец получаются, аккуратно поместите его на листке А4 ПВХ связывающей крышки и наблюдать направление мышечных волокон.
    Примечание: Здесь мы использовали поперечное сечение длиннейшей мышцы Дорис от первого до последнего поясничного позвонка у свиней. Образцы имеют длину около 12 см, шириной 8 см и высотой 5 см.
  3. Используйте скальпель, чтобы сделать два параллельных надрезов через образец Iп направление мышечных волокон, около 3 см в длину и 0,6 см друг от друга. Обрежьте резанным мышцы в прямоугольник примерно 0,6 см в ширину и 0,6 см в длину высоких х 1,5 см.
    Примечание: Надежность измерения площади поперечного сечения мышечных волокон в основном, зависит от ориентации волокон в врезной мышце.
  4. Используйте 10 см щипцов , чтобы аккуратно поместить образец на кусок полиэтиленовой пленки, с продольной осью вырезанной мышцы параллельно длинной стороне пленки (фиг.2А).
    Примечание: Пластиковая пленка имеет две функции: функция удержания, которая помогает в установлении ориентации мышечных волокон и функции адгезии, которая предотвращает трещины в образце из-за быстрое замораживание.
  5. Использование щипцов, поместить мышечную ткань в нижнюю середину меченого криогенного флакона, только между впускными отверстиями, а затем пробирки плотно закрывают (фигура 2В).

3. Замораживание и хранение Muscle Samples

  1. С помощью пинцета 25 см, быстро погрузить весь криогенный флакон в жидком азоте в предварительно охлажденном охладителе пенополистирола, ожидая, пока жидкий азот не не кипит (примерно 10-20 лет).
    Примечание: криопробирка будет плавать, когда жидкий азот кипит, так тщательно погрузить флакон в кипящем жидком азоте в течение 10-20 с.
  2. Передача образцы мышц в резервуар для хранения жидкого азота или -80 ° C морозильник в течение длительного хранения.

4. Подготовка слайдов

  1. Предварительное охлаждение криостата до температуры между -20 ° C и -22 ° C.
  2. Удаляю старое микротомное лезвие, протереть держатель ножа и стабилизирующую пластину в криостате, установите новое микротомное лезвие в криостате, и установить толщину резания до 8 мкм.
  3. Передача пробы мышц в криогенном флаконе из жидкого резервуара для хранения азота или -80 ° C морозильника до криостата, транспортировки его в жидком азоте или на сухом льде. Подождите 30 мин для образца для уравновешивания с температурой криостата.
    Примечание: Любое оборудование, которое может касаться образца должен быть предварительно охлаждены, так как высокая температура может вызвать образование кристаллов льда в образце.
  4. Установить образец в держателе образца по оптимальной рецептуре температуры резки водорастворимых гликолей и смол (ОКТ). Вырезать 8 мкм секций.
    Примечание: Регулировка угла резания перпендикулярно к ориентации мышечных волокон, потому что CSAF площадь поперечного сечения мышечных волокон.
  5. Установите секции по направлению к центру при комнатной температуре предметного стекла. Сразу же место слайда в коробку слайдов в -80 ° C морозильник. Не позволяйте слайд высохнуть при комнатной температуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Криопробирка иллюстрация и общее лабораторное оборудование для замораживания мышц во время приготовления замороженных срезов показаны на рисунке 1. В криопробирки изготовлены из полипропилена на заводе пресс-формы. Каждый флакон имеет в общей сложности 14 впускных отверстий: один на крышке; другой находится в нижней части; а остальные 12 образуют четыре параллельные линии, каждая с четырьмя отверстиями под углом 90 ° друг к другу. Эти входные отверстия могут ускорить скорость потока жидкого азота рядом с тканью, чтобы избежать эффекта «пара одеяла», когда жидкий азот контактирует с тканью. Следовательно, очень немногие кристаллы льда в замороженных образцах. Важно отметить, что изопентан, чрезвычайно летучая и легковоспламеняющаяся жидкость с температурой кипения при 28 ° C, не является необходимым в этой процедуре.

Для дальнейшего подчеркнуть преимущества этого метода, мы заморозили длиннейшей мышцы спиныу свиней с использованием пяти замораживания методов , а затем наблюдали их свойства окрашивания и гистологические деталей с использованием гематоксилин / эозином (HE) пятно (рисунок 3). Широко встречается вопрос, было образование кристаллов льда во время подготовки мышц для cryosection. Когда образец был помещен непосредственно в -80 ° С морозильным (фиг.3А), крупные кристаллы льда образуются , а затем вызывали хорошо известный эффект «швейцарский сыр» в мышечной cryosection. Кроме того, кристаллы льда также образуется , когда мышечная ткань была погружена непосредственно в жидком азоте (рис 3B). Даже если жидкий азот является очень холодной жидкостью (-190 ° С), его теплотой постоянным крайне мал. Когда любой образец контактирует с жидким азотом, пары одеяло может накапливаться рядом с тканью и изолирует проникновение холода в ткань. Кроме того, обычная процедура для замораживания образцов в лабораториях патологии еще не применима к мышечной ткани.ы показано на фиг.3С, многие игольчатые кристаллы льда , образующиеся в цитоплазматической отсеке миофибрилл после того , как мышечная ткань погружали в OCT монтажной среды в правильной ориентации , а затем быстро замораживали в виде суспензии изопентана (-160 ° С). В заключении, соответствующая скорость замораживания мышечной ткани должна быть строго встретилась в эксплуатации.

Текущий протокол обеспечивает превосходную целостность образца, с четко видимым цитоплазматическим отсеком и плотно аппозициями миофибрилл в окружающих ткани (рис 3D). Это позволяет для превосходной визуализации метаболических свойств мышечных волокон с использованием миозина АТФазы анализа (рис 3E). Для этого теста, миозина АТФазы анализировали основано на том факте, что быстро подрядные мышечные волокна (тип млекопитающих 2А и 2В) гидролизовать АТФ быстрее, чем медленно сжимающих волокон (типа 1) у млекопитающих. Когда дано equivaодолжил раз, быстро договаривающиеся волокна выглядят светлыми, с двумя степенями, и медленно договаривающиеся волокна выглядят черными. Важно отметить, что этот метод может быть эффективно использован в среде с высокой пропускной способностью, потому что это легко выполнить и экономит время (Рисунок 4). В настоящее время, хорошо установленный метод замораживания , чтобы погрузить мышечную ткань в суспензии изопентана без контакта с ОКТ монтажной средой, как описано ранее , 8, 9 (рисунок 3F). В этой процедуре, она занимает приблизительную 30 мин для жидкого цементного теста состояния твердых и жидких фазами 240 мл изопентана , чтобы быть достигнут путем предварительного охлаждения изопентана в жидком азоте и перемешивания до небольших белых осадки не появляются в нижней части (Рисунок 4). Есть три практические трудности, с которыми сталкиваются исследователи при попытке заморозить мышечные ткани в предварительно охлажденный изопентан: (1) твердое тело-жидкость суспензии состояние isopantane трудно поддерживать, когдаВремя выборки составляет более 1 ч. В наших прошлых попыток, морозильные артефакты обычно имели место в образцах, которые были сделаны на средних и поздних стадиях процесса, когда были собраны десятки раз мышечных тканей. (2) В качестве опасной жидкости, isopantane не допускается в любом месте на общественном транспорте. (3) изопентан недоступен, за исключением лабораторий. Многие мяса науки исследователи, как правило, замерзают мышечной ткани на бойне, которая находится далеко от лаборатории, и что не разрешено иметь изопентан. Кроме того, диагностические биопсии мышц часто неоптимально обрабатывается из-за отсутствия изопентана в медицинских учреждениях. Таким образом, наш протокол является важным событием для замораживания образцов мышц в ситуациях, когда изопентан недоступен.

Рисунок 1
Рисунок 1: Устройство для замораживания мышцы. (А) На иллюстрацияхиз криопробирки, используемой в данном исследовании. 14 впускные отверстия пробиты в стенке трубки: одна находится на крышке; другой находится в нижней части; а остальные 12 образуют четыре параллельные линии, каждая с четырьмя отверстиями под углом 90 ° друг к другу. (Б) Фотография устройства замораживания. Безопасное и эффективное средство замораживания мышцы в жидком азоте предполагает использование криопробирки, пластиковой пленки, защитные очков, перчатки, морозильник 10 см щипцов, 25 см пинцета, Пенополистирол охладителя, скальпеля и А4 ПВХ крышки связывания. (С) Иллюстрации криопробирку пресс - формы , представленной инженером, Йонгуа Ванг, на заводе пресс - формы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Получение Muscle образцов. (A (В) мышечной ткани должна быть помещена между впускными отверстиями в криогенном флаконе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Представитель Изображения гистологической оценки Pig длиннейшей мышцы спины Мышцы после того, как они заморожены , используя пять различных методов.
Кристаллы льда разрушают читаемость мышц криосрезов изображаемыхов с HE окрашивания , когда мышцы замораживают для гистологического анализа с использованием неподходящих методов, как показано в (AC). Значительные артефакты замораживания произошло , когда образцы мышц непосредственно помещают в 80 ° С морозильной (А) или смоченной в жидкостиазота (В). Многие игольчатые кристаллы льда образуются в отдельных мышечных клеток после того, как мышечная ткань погружали в OCT , а затем непосредственно помещали в суспензию изопентана (C). Протокол , представленный в данном исследовании , можно исключить образование кристаллов льда , когда мышечная ткань просто погружает в жидком азоте (D). Этот протокол применит к анализу активности фермента в замороженной мышце , основанный на анализе миозина АТФазы (E). Стандартный метод замораживания мышцы не выполняет лучше; мышечная ткань погружают в суспензию изопентана без непосредственного контакта с ОКТ монтажной среды (F). Все изображения находятся под объективом 10Й, для тех, с черными краями (20й), за исключением. Шкала бар: 100 мкм. Arrowhead на рисунке 3C показывает небольшие, игольчатые кристаллы льда. Стрелолист и текст на рисунке 3Е указывают тип мышечных волокон: тип 1 представляет собой медленный тяжелой цепи миозина волокон, т2A означает ип промежуточного тяжелой цепи миозина волокон и типа 2B показывает быстрый тяжелой цепи миозина волокон. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Сравнение рабочих процессов для жидкого азота на основе и изопентан на основе морозильных процедур. В жидком протоколе на основе азота, мышечная ткань в новом криопробирки погружает в жидком азоте. В протоколе изопентана на основе суспензии состояние изопентана должна быть достигнута заранее предварительным охлаждением изопентана в жидком азоте и перемешивания до небольших, белых осадки не появляются в нижней части. Затем, мышечная ткань погружали в предварительно охлажденный изопентан. По сравнению с 35 мин в процедуре изопентана на основе, как описано на фигуре 3F, она занимает только 5 мин т о завершении процедуры замораживания, представленной в данном протоколе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Жидкость Расход азота через острые края отверстия. При погружении всей несколькими отверстиями криопробирку в жидком азоте, сил атмосферного давления жидкого азота в трубу через входные отверстия 14. Наличие отверстий делает поток ускорить через них, тем самым увеличивая скорость. Поток рециркуляционного (синий цвет) развивается непосредственно после отверсти (в оранжевом цвете). D1 обозначает диаметр отверстия на стенке трубки и D2 представляет собой расстояние между отверстием и образцом мышц (в красном).= «_blank»> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем новую, с несколькими отверстиями для криопробирки замораживания и хранения мышечной ткани для выполнения гистологических оценок функции мышц. Критические модифицированы шагом в этом протоколе является то, что образец в многодырчатой ​​криопробирке непосредственно погружал в жидком азоте. Насколько нам известно, это самый простой и rapidest способ получить отличные замороженные образцы для мышц cryosectioning среди существующих методов замораживания (см репрезентативных результатов).

Техническая задача, стоящая перед исследователями мышц является то, что кристаллы льда, скорее всего, образуются при использовании замораживания в качестве средства для затвердевают мышечной ткани для секционирования. Как было отмечено в представительных результатах, три фактор играет существенную роль в определении надлежащего замораживания мышц для патологических исследований, в том числе выбора соответствующего источника холода, сводя к минимуму влажности образца, и увеличивая процент от общей поверхности в контакте с источником холода. Первый,скорость замораживания имеет решающее значение, чтобы избежать повреждений во время подготовки замороженной ткани для секционирования. Когда замораживание происходит медленно, замороженные мышцы показывают хорошо известный эффект «швейцарский сыр», так как крупные кристаллы льда образуются внеклеточно. Когда замораживание происходит быстро, но не достаточно быстро, большое количество мелких, игольчатых кристаллов льда образуются в отдельных мышечных клетках. Эти игольчатые кристаллы льда вызывают небольшие обнаруживаемые структурные повреждения, но они приводят следующие эффекты: митохондрии повреждены 10, размер мышечных волокон искусственно завышены 11, и целостность волокнистых структур разрушается 11. Таким образом, холодный источник при достаточно низкая температура и достаточная скорость замораживания имеет важные значение, чтобы избежать образования кристаллов льда в мышечных криосрезах.

В идеале, холодный источник при экстремально низких температурах и расположен тЗамыкающий контакт всех поверхностей. И жидкий азот (-190 ° C), и изопентан в твердое тело-жидкость смешанного состояния (-160 ° С) удовлетворяют этому условию. Тем не менее, два замораживание средств массовой информации имеют свои собственные недостатки. Жидкий азот имеет очень низкое удельное постоянное тепло. Результатом является то , что контакт между жидким азотом и ткани вызывает паровой барьер , который накапливается рядом с тканью и значительно замедляет проникновение холода в ткань 12. Таким образом, значительные артефакты замораживания происходят внутри замороженных мышц. Состояние суспензии изопентана является идеальной средой замораживания, которая не образует пары барьеров, но основная проблема заключается в том, что изопентан должен быть использован в сочетании с жидким азотом, с тем, чтобы достичь температуры жидкости ванны 160 ° C. Кроме того, изопентан является чрезвычайно летучей и воспламеняются жидкостью при комнатной температуре. Во-вторых, мышца содержит чрезмерное количество воды (> 75%), так что любой способ введения экзогенной влаги в образце приведет к замораживанию артефактов. Например, Октябрь гистологическая среда добавляет дополнительную воду к мышце, поэтому кристаллы льда гораздо более заметным в тех мышечных криосрезах по сравнению с таковыми без ОКТА монтажной среды. Наконец, толщина мышечной ткани также важна, чтобы надлежащим образом заморозить его, так как скорость замораживания частично зависит от процента от общей поверхности в контакте с холодным источником (обычно, толщина <0,5 см). Соответственно, единственный существующий способ правильно заморозить ткань, чтобы погрузить мышечную ткань с толщиной менее 0,5 см в предварительно охлажденном изопентан (160 ° С), как описано ранее 8.

Этот протокол первым описывает, как правильно заморозить мышечную ткань, погружая их непосредственно в жидком азоте. Проблема с использованием жидкого азота в одиночку является образованием газообразного азота над поверхностью ткани, действуя в качестве изолятора и препятствует охлаждению ткание "> 13. Такой пар покрывало может образовывать только тогда , когда слияние пузырьков происходит настолько быстро , что газ азот может отделить ткань от жидкого азота. В соответствии с динамикой пузырьков, более быстрый поток жидкости приведет к более мелкие пузырьки, как это имеет меньше шансов объединить 14. Таким образом, мы перфорированные 14 отверстий в стенку криопробирки , чтобы увеличить скорость потока жидкости вокруг ткани и помочь избежать эффекта «пара одеяла» , когда жидкость контактирует азот ткань.

Учитывая, что одним из факторов, который определяет экспериментальный успех является скоростью потока жидкости вокруг ткани, три параметра криопробирки очень важен, в том числе положения и количества отверстий, диаметра впускных отверстий, а расстояние между отверстием и образец. Жидкая динамика показывает, что скорость потока через отверстие определяется диаметром отверстий и что поток рециркулирующего развивается сразу внизПоток отверстия (рисунок 5) 15, 16. Соответственно, расстояние между отверстием и образцом основном определяет площадь контакта между потоком текучей среды с высокой скоростью и образцом, как показано на рисунке 5. Следовательно, с несколькими отверстиями криопробирку на рисунке 1А подходит для образца мышц , что составляет 0,6 см в ширину и 0,6 см в высоту х 1.5 см длиной. Для более крупных фрагментов мышц, то стоит попробовать этот метод с большей трубкой и более отверстиями. Тем не менее, этот протокол не подходит для замораживания образцов мышц от небольших животных, такие, как в мышиной модели, так как входные отверстия могут быть слишком большими для меньших образцов.

Кроме того, три критические шаги должны быть строго соблюдены в протоколе. Во-первых, жидкий азот должен быть достаточным, чтобы погрузить весь криопробирку и криогенный флакон должен быть полностью ниже уровня жидкости. Во-вторых, необходимо кнедействительный случайный контакт между замороженными мышцами и контейнерами комнатной температуры или инструментами. Так, например, без тщательных транспортировок, новые кристаллы льда могут образовываться при переносе замороженного образца из жидкостного резервуара для хранения азота или -80 ° C морозильника до криостата. В-третьих, не должно быть слишком много октября используется, когда образцы смонтированы на держателе из-за высокой вероятности образования кристаллов льда вокруг зоны контакта между замороженным мышц и ОКТ.

В мясной промышленности, процедура мышц cryosection является необходимой, так как процесс фиксации формалина и парафина вызывает усадку в мышечных волокнах, что ухудшает оценку некоторых мышечных признаков, такие как TNF и CSAF. Кроме того, замороженные мышцы требуются при оценке FTC с использованием анализа миозина АТФазы. Как показано на рисунке оГО, этот протокол может удовлетворить требования как патологического анализ и гистохимическое пятно в мышцах. Подготовкаиз cryosection является рутинной операцией в клинической мышечной патологии лаборатории. Как описано Мэн и др. 8, стандартная рабочая процедура для замораживания мышечной ткани, чтобы погрузить образцы аутопсии в предварительно охлажденный изопентан. Тем не менее, изопентан недоступен, чтобы заморозить образцы аутопсии в учреждениях без клинических лабораторий патологии мышц. Следовательно, диагностические биопсии мышц часто неоптимально обрабатывается во многих медицинских учреждениях. Таким образом, наш протокол может существенно улучшить способность для небольших больниц или лабораторий для выполнения диагностической биопсии мышц надлежащего качества. Учитывая высокую эффективность и простоту в эксплуатации этого протокола, это может быть перспективной альтернативой текущего изопентана на основе методы замораживания и может быть широко применено к гистологическим исследованиям в будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов, финансового или иного, объявляются авторами.

Acknowledgments

Этот проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC): 31301950 и 31671288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95, (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84, (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2, (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38, (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57, (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69, (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8, (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12, (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53, (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71, (9), 300-309 (2012).

Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics