एक बहु-छेद cryovial समाप्त कलाकृतियों बर्फ़ीली जब मांसपेशियों के ऊतकों सीधे तरल नाइट्रोजन में डूबे हैं

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Biology

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Summary

यह प्रोटोकॉल उन्हें तरल नाइट्रोजन में सीधे जल्दी से आगे बढ़नेवाला से मांसपेशियों के ऊतकों फ्रीज करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। यह प्रोटोकॉल भी एक नया cryovial कि नाइट्रोजन गैस की "कंबल प्रभाव" से बच सकते हैं पर प्रकाश डाला गया जब तरल नाइट्रोजन संपर्क एक नमूना के ऊतक सतह।

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Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

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Abstract

कंकाल की मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान पर अध्ययन उचित रूप से नमूनों प्रसंस्करण स्पष्ट रूप से दिखाई cytoplasmic डिब्बों के साथ वर्गों प्राप्त करने के लिए की तकनीकी चुनौती का सामना। एक और बाधा आसपास के ऊतकों को myofibers की तंग समानाधिकरण है। क्योंकि ऊतक निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग की प्रक्रिया मांसपेशी फाइबर के दबाव की ओर जाता है, ठंड सेक्शनिंग के लिए मांसपेशियों के ऊतकों सख्त का एक इष्टतम साधन है। हालांकि, एक आम तौर पर सामना करना पड़ा मुद्दा, बर्फ के क्रिस्टल के गठन, पेशी के उच्च पानी सामग्री की वजह से जमे हुए वर्गों की तैयारी के दौरान होता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले ठीक से उन्हें तरल नाइट्रोजन में विसर्जित करके मांसपेशियों के ऊतकों ठंड के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का वर्णन है। अकेले तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर के साथ समस्या यह है कि यह ऊतक है, जो एक विसंवाहक के रूप में कार्य और ऊतकों को ठंडा करने को रोकता है के बगल में एक नाइट्रोजन गैस बाधा के गठन का कारण बनता है। इस "वाष्प कंबल" प्रभाव एक ne बचने के लिए,डब्ल्यू cryovial ऊतक सतह के चारों ओर तरल प्रवाह की गति को बढ़ाने के लिए डिजाइन किया गया था। इस शीशी की दीवार में 14 इनलेट छेद की कुल छिद्रण द्वारा हासिल की थी। बुलबुला गतिशीलता के अनुसार, छोटे बुलबुले और अवसर कम में तरल प्रवाह परिणामों की एक उच्च दर एक गैस बाधा के रूप में। तरल नाइट्रोजन इनलेट छेद के माध्यम से cryovial में प्रवाहित होती है तो ऊतक के आसपास प्रवाह वेग काफी तेजी से गैस बाधा को खत्म करने की है। पूर्व ठंडा isopentane का उपयोग कर मांसपेशियों के ऊतकों ठंड की विधि की तुलना में, इस प्रोटोकॉल सरल और अधिक कुशल है और एक throughput ढंग से मांसपेशियों को फ्रीज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि संस्थानों कि isopentane है, जो कमरे के तापमान पर अत्यंत ज्वलनशील है के लिए उपयोग की जरूरत नहीं है के लिए इष्टतम है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी को देखने के पोषण और प्रसंस्करण बिंदु से एक मांस उत्पादक जानवर की सबसे मूल्यवान घटक है। मांसपेशियों की वृद्धि की दक्षता और जिसके परिणामस्वरूप मांस की गुणवत्ता: मांस उद्योग में, दो विशेष रूप से महत्वपूर्ण पहलू हैं। पेशी के एक मुख्य घटक के रूप में, मांसपेशी फाइबर सीधे वृद्धि प्रदर्शन और जानवरों 1 में ताजा मांस गुणवत्ता से संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, रेशे की कुल संख्या (TNF) और रेशों का क्रॉस अनुभागीय क्षेत्र (CSAF) ज्यादातर मांसपेशियों और मांस गुणवत्ता निर्धारित; भी, फाइबर प्रकार संरचना (FTC) दृढ़ता से ताजा मांस गुणवत्ता 2 प्रभावित करता है। इसलिए, पशुओं में पेशी फाइबर विशेषताओं के हेरफेर एक बेहद कारगर तरीका कोर लाभप्रदता और खेतों 1 की प्रतिस्पर्धात्मकता को बढ़ाने के लिए है।

तिथि करने के लिए, कई आंतरिक और बाह्य कारकों पेशी फाइबर लक्षण हेरफेर करने के लिए पहचान की गई हैआईसीएस 1। इस हेरफेर ऐसे सूअरों 5 में मवेशी 3 में Myostatin जीन, भेड़ 4 में callipyge जीन, और RYR1 और IGF2 जीन के रूप में विशिष्ट जीन, के साथ जानवरों की लक्षित चयन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता। इसके अलावा, आहार नियंत्रण और विशिष्ट हार्मोन के साथ उपचार पेशी फाइबर विशेषताओं 6 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस प्रकार, एक दृष्टिकोण है कि आनुवंशिक और पोषण संबंधी कारकों को जोड़ती है दुबला मांस सामग्री और मांस की गुणवत्ता में सुधार करने में सक्षम हो सकता है। हालांकि, मांसपेशी फाइबर पर अध्ययन मांस उद्योग में सीमित हैं क्योंकि मांसपेशी फाइबर के संरचना की व्याख्या अभी भी एक चुनौती है।

स्नायु फाइबर गुण ऐसे मायोसिन एडेनोसाइन triphosphatase (ATPase के सक्रियण) परख के रूप में histochemical तरीकों का उपयोग कर पहचाने जाते हैं। इस विधि तथ्य यह है कि की पतली (6-8 सुक्ष्ममापी) जमे हुए वर्गों में स्थित एंजाइमों पर निर्भर करता हैमांसपेशी फाइबर रासायनिक कुछ उत्पादों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की जा सकती है। हालांकि, मांसपेशियों के पानी की मात्रा सूअर, खरगोश, चूहों, और मनुष्यों में अधिक से अधिक 75% से, स्थिति (यानी, पीठ, पेट, या hindlimb) 7 की परवाह किए बिना है। जैसा कि पहले 8, 9 में वर्णित है, cryosections की तैयारी के दौरान - ठंड कलाकृतियों - मांसपेशियों में इस तरह के उच्च नमी की मात्रा एक सामान्य का सामना करना पड़ा समस्या होती है। ज्यादातर मामलों में, यह उचित रूप से, एक कसाईखाना उत्पादन लाइन में मांसपेशियों के ऊतकों फ्रीज करने के हमारे अनुभव के अनुसार लगभग असंभव है।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक उच्च throughput ढंग से cryosectioning के लिए मांसपेशियों के ऊतकों फ्रीज करने के हमारे प्रयोगशाला में इस्तेमाल एक सरल और प्रभावी विधि का वर्णन है। इस विधि का मुख्य आकर्षण एक नया cryovial कि तरल नाइट्रोजन में फ्लैश ठंड मांसपेशियों के ऊतकों के लिए बनाया गया है। वर्तमान कार्यप्रवाह समवर्ती ऊतक सुविधा कर सकते हैंठंड और एक उत्कृष्ट मांसपेशी cryosection के लिए प्रसंस्करण, एक स्पष्ट रूप से दिखाई cytoplasmic डिब्बे और आसपास के ऊतकों में myofibers की तंग समानाधिकरण के साथ। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल क्योंकि तरल नाइट्रोजन ऊतकों के साथ मिश्रण नहीं है ऊतक विश्लेषण के लिए विकल्प की एक विस्तृत सरणी के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

वर्तमान पद्धति की स्थापना की और फसल और हमारे प्रयोगशाला में ऊतकीय धुंधला के लिए 1,000 से अधिक मांसपेशियों के नमूने संग्रहीत करने के लिए मान्य किया गया है। पशु देखभाल और उपयोग से जुड़े सभी प्रक्रियाओं के दिशा निर्देशों चीन के कृषि मंत्रालय द्वारा स्थापित किया गया।

1. नमूना संग्रह के लिए उपकरण

  1. प्रत्येक क्रायोजेनिक शीशी पर नमूना पहचान लेबल करें।
    नोट: क्रायोजेनिक शीशी विशेष रूप से cryosection प्रक्रिया (चित्रा 1 ए) के लिए नए सिरे से ऊतक के नमूने फ्रीज करने के लिए बनाया गया है। शीशियों एक साँचे में ढालना कारखाने (चित्रा 1C) में polypropylene से बना रहे हैं।
  2. एक उपयुक्त तरल नाइट्रोजन टैंक में तरल नाइट्रोजन, सुरक्षा चश्मा या फेस शील्ड, फ्रीजर दस्ताने, 10 सेमी संदंश, 25 सेमी चिमटी, एक स्टायरोफोम कूलर (भीतरी आयामों: 20 सेमी लंबी x 12 सेमी चौड़ा x 13.5 सेमी उच्च निम्नलिखित उपकरण प्राप्त ; बाहरी आयाम: 24 सेमी लंबा x 16 सेमी चौड़ा x 15 सेमी उच्च), प्लास्टिक फिल्म (2.5 सेमी लंबे x 0.8 सेमी चौड़ा x 0.1 मिमी मोटी),एक छुरी, और ए 4 पीवीसी बंधन कवर (21 सेमी x 29.5 सेमी) (चित्रा 1 बी)।

2. स्नायु नमूने की तैयारी

  1. तरल नाइट्रोजन 5 मिनट नमूना संग्रह से आगे के साथ स्टायरोफोम कूलर भरें।
    नोट: तरल नाइट्रोजन के बड़े स्तंभ आवश्यक है क्योंकि तरल नाइट्रोजन का हिस्सा दूर फोड़े और जब ताजा नमूनों इसे छूने गैस में बदल जाता है है। आदेश नुकसान की भरपाई करने के लिए तरल नाइट्रोजन के हस्तांतरण की आवृत्ति को कम करने के लिए, एक उचित रूप से आकार स्टायरोफोम कूलर नमूनों की संख्या के अनुसार अग्रिम में प्राप्त कर लिया जाना चाहिए।
  2. एक बार एक नमूना प्राप्त किया जाता है, धीरे यह ए 4 पीवीसी बंधन कवर के एक टुकड़े पर जगह है और मांसपेशी फाइबर की दिशा का पालन।
    नोट: यहाँ, हम सूअरों में पिछले कटिय मेरुदंड करने के लिए पहले से longissimus डोरिस पेशी के पार अनुभाग का इस्तेमाल किया। नमूनों के बारे में 12 सेमी लंबा, 8 सेमी चौड़ा, और 5 सेमी अधिक हैं।
  3. नमूना मैं के माध्यम से दो समानांतर चीरों बनाने के लिए एक छुरी का प्रयोग करेंn मांसपेशी फाइबर की दिशा, लंबाई में लगभग 3 सेमी और अलग 0.6 सेमी। एक आयत लगभग 0.6 सेमी चौड़ा x 0.6 सेमी उच्च x 1.5 सेमी लंबी में छिन्न मांसपेशियों ट्रिम।
    नोट: मांसपेशी फाइबर के पार-अनुभागीय क्षेत्र को मापने की विश्वसनीयता ज्यादातर छिन्न पेशी के फाइबर उन्मुखीकरण पर निर्भर करता है।
  4. 10 सेमी संदंश का प्रयोग धीरे फिल्म (चित्रा 2A) की लंबी बढ़त के लिए, प्लास्टिक की फिल्म के एक टुकड़े पर नमूना डाल करने के लिए छिन्न मांसपेशी समानांतर के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ।
    नोट: एक होल्डिंग समारोह है कि मांसपेशी फाइबर के उन्मुखीकरण और एक आसंजन समारोह है कि नमूने में दरारें तेजी से ठंड की वजह से बचाता है फिक्सिंग में मदद करता है: प्लास्टिक फिल्म दो कार्य है।
  5. संदंश का प्रयोग, एक लेबल क्रायोजेनिक शीशी के निचले बीच में मांसपेशियों के ऊतकों जगह, बस के बीच इनलेट छेद, और फिर कसकर शीशी (चित्रा 2 बी) टोपी।

3. बर्फ़ीली और भंडारण स्नायु नमूनारों

  1. 25 सेमी चिमटी का उपयोग करना, जल्दी से पूर्व ठंडा स्टायरोफोम कूलर में तरल नाइट्रोजन में पूरे क्रायोजेनिक शीशी डूब, जब तक तरल नाइट्रोजन उबाल नहीं है (लगभग 10-20 रों) इंतजार कर।
    नोट: जब तरल नाइट्रोजन उबलते है cryovial तैर सकती है, इसलिए सावधानी से 10-20 रों के लिए उबलते तरल नाइट्रोजन में शीशी विसर्जित।
  2. एक तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक या एक -80 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए फ्रीजर को पेशी के नमूने स्थानांतरण।

4. स्लाइड तैयारी

  1. -20 डिग्री सेल्सियस और -22 डिग्री सेल्सियस के बीच करने के लिए एक cryostat Precool।
  2. निकालें और पुराने सूक्ष्म ब्लेड त्यागें, cryostat में चाकू धारक और विरोधी रोल प्लेट नीचे पोंछ, cryostat में एक नया सूक्ष्म ब्लेड स्थापित करते हैं, और 8 सुक्ष्ममापी को काटने मोटाई निर्धारित किया है।
  3. cryostat के लिए तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से क्रायोजेनिक शीशी में पेशी नमूना स्थानांतरण या -80 सी फ्रीजर °, तरल नाइट्रोजन में या सूखी बर्फ पर यह परिवहन। नमूना cryostat के तापमान के साथ संतुलित करने के लिए के लिए 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: किसी भी उपकरण है कि नमूना स्पर्श हो सकता है पहले से ठंडा किया जाना चाहिए, क्योंकि एक उच्च तापमान के नमूने में बर्फ के क्रिस्टल के गठन के कारण हो सकता।
  4. पानी में घुलनशील ग्लाइकॉल्स और रेजिन (OCT) का इष्टतम काटने तापमान सूत्रीकरण के तहत नमूना धारक में नमूना माउंट करें। 8-सुक्ष्ममापी वर्गों काटें।
    नोट:, मांसपेशी फाइबर के उन्मुखीकरण के लंबवत काटने कोण समायोजित करें क्योंकि CSAF मांसपेशी फाइबर के पार-अनुभागीय क्षेत्र है।
  5. एक कमरे के तापमान microslide के केंद्र की ओर वर्गों माउंट करें। इसके तत्काल बाद एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक स्लाइड बॉक्स में स्लाइड जगह। स्लाइड आरटी पर सुखाने के लिए अनुमति न दें।

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Representative Results

Cryovial चित्रण और जमे हुए वर्गों की तैयारी के दौरान मांसपेशियों ठंड के लिए आम प्रयोगशाला उपकरणों चित्र 1 में दिखाया गया है। cryovials एक साँचे में ढालना कारखाने में polypropylene से बना रहे हैं। प्रत्येक शीशी 14 इनलेट छेद में कुल: एक टोपी पर है; एक और नीचे स्थित है; और शेष 12 प्रपत्र चार समानांतर रेखाओं, एक दूसरे से 90 डिग्री पर चार छेद के साथ प्रत्येक। ये इनलेट छेद "वाष्प कंबल" प्रभाव जब तरल नाइट्रोजन संपर्क ऊतक से बचने के लिए ऊतक के बगल में तरल नाइट्रोजन के प्रवाह वेग में तेजी लाने के कर सकते हैं। नतीजतन, बहुत कुछ बर्फ के क्रिस्टल जमे हुए नमूनों में के रूप में। महत्वपूर्ण रूप से, isopentane, 28 डिग्री सेल्सियस पर एक उबलते बिंदु के साथ बेहद अस्थिर और ज्वलनशील तरल, आवश्यक नहीं है इस प्रक्रिया में है।

आगे इस विधि का लाभ बताने के लिए, हम longissimus dorsi पेशी सील कर दीसूअरों में पाँच ठंड तरीकों का उपयोग कर और फिर अपनी धुंधला गुण और ऊतकीय विवरण एक Hematoxylin / Eosin (एचई) दाग (चित्रा 3) का उपयोग करते हुए मनाया। एक आम तौर पर सामना करना पड़ा मुद्दा cryosection के लिए मांसपेशियों की तैयारी के दौरान बर्फ के क्रिस्टल के गठन किया गया था। जब नमूना एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर (चित्रा 3 ए) में सीधे रखा गया था, बड़े बर्फ के क्रिस्टल का गठन और उसके बाद मांसपेशियों cryosection में एक प्रसिद्ध "स्विस पनीर" प्रभाव का कारण बना। इसके अलावा, बर्फ के क्रिस्टल भी जब मांसपेशियों के ऊतकों तरल नाइट्रोजन (चित्रा 3 बी) में सीधे डूब गया था का गठन किया। हालांकि तरल नाइट्रोजन एक बहुत ठंड तरल (-190 डिग्री सेल्सियस) है, इसकी गर्मी लगातार बेहद कम है। किसी भी नमूना संपर्कों तरल नाइट्रोजन, एक भाप कंबल ऊतक के बगल में निर्माण और ऊतकों में ठंड के प्रवेश बचाने कर सकते हैं। साथ ही, विकृति विज्ञान प्रयोगशालाओं में ठंड नमूनों के लिए एक नियमित प्रक्रिया अभी तक मांसपेशियों के ऊतकों पर लागू नहीं है। एचित्रा -3 सी दिखाई दे, कई सुई की तरह बर्फ के क्रिस्टल myofibers की cytoplasmic डिब्बे में गठन के बाद मांसपेशियों के ऊतकों उचित उन्मुखीकरण में अक्टूबर बढ़ते मध्यम में डूबा हुआ था और तब तेजी से isopentane के घोल में जमे हुए (-160 डिग्री सेल्सियस)। अंत में, मांसपेशियों के ऊतकों के लिए उपयुक्त ठंड दर सख्ती से आपरेशन में पूरा किया जाना चाहिए।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक स्पष्ट रूप से दिखाई cytoplasmic डिब्बे और आसपास के ऊतकों (चित्रा 3 डी) के लिए myofibers की तंग समानाधिकरण के साथ उत्कृष्ट नमूना अखंडता को प्राप्त होता है,। यह मायोसिन ATPase के सक्रियण परख (चित्रा 3E) का उपयोग मांसपेशी फाइबर के चयापचय गुणों का उत्कृष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस परख के लिए, मायोसिन ATPase के सक्रियण गतिविधि तथ्य यह है कि तेजी से करार मांसपेशी फाइबर (स्तनधारी प्रकार 2A और 2 बी) hydrolyze एटीपी तेजी से धीमी गति से करार फाइबर (स्तनधारी प्रकार 1) की तुलना में के आधार पर विश्लेषण किया गया था। जब दी Equivaउधार बार, तेजी से करार फाइबर प्रकाश दिखाई देते हैं, दो डिग्री के साथ, और धीमी गति से करार फाइबर काला दिखाई देते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि एक उच्च throughput वातावरण में कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि यह प्रदर्शन करने के लिए आसान है और समय (चित्रा 4) की बचत होती है। आजकल, एक अच्छी तरह से स्थापित ठंड पद्धति के रूप में पहले से 8, 9 (चित्रा 3F) में वर्णित, अक्टूबर बढ़ते मध्यम के साथ संपर्क के बिना isopentane के घोल में मांसपेशियों के ऊतकों डूब रहा है। इस प्रक्रिया में, यह isopentane की 240 एमएल का एक ठोस तरल घोल राज्य के लिए अनुमानित 30 मिनट के तरल नाइट्रोजन में isopentane पूर्व ठंडा और जब तक छोटे सफेद अवक्षेप नीचे (चित्रा 4) पर दिखाई देते हैं सरगर्मी द्वारा प्राप्त किया जा करने के लिए ले जाता है। तीन व्यावहारिक शोधकर्ताओं द्वारा सामना करना पड़ा पूर्व ठंडा isopentane में मांसपेशियों के ऊतकों को फ्रीज करने का प्रयास करते समय कठिनाइयों कर रहे हैं: (1) isopantane का एक ठोस तरल घोल राज्य बनाए रखने के लिए जब मुश्किल हैसमय के नमूने से अधिक 1 घंटे है। हमारे अतीत प्रयासों में, ठंड कलाकृतियों आमतौर पर नमूने है कि प्रक्रिया, जब मांसपेशियों के ऊतकों के दर्जनों एक बार एकत्र किए गए थे के मध्य और अंतिम चरणों में किया गया था में हुई। (2) एक खतरनाक तरल के रूप में, isopantane सार्वजनिक परिवहन पर भी अनुमति नहीं है। (3) isopentane प्रयोगशालाओं में छोड़कर उपलब्ध नहीं है। कई मांस विज्ञान शोधकर्ताओं आम तौर पर एक कसाईखाना दूर एक प्रयोगशाला से दूर है और वह isopentane रखने की अनुमति नहीं है कि में मांसपेशियों के ऊतकों फ्रीज। इसके अलावा, नैदानिक ​​मांसपेशी बायोप्सी अक्सर चिकित्सा सुविधाओं में isopentane की कमी के कारण उप बेहतर संसाधित कर रहे हैं। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल स्थितियों में, जहां isopentane अनुपलब्ध है में पेशी नमूनों ठंड के लिए एक महत्वपूर्ण विकास है।

आकृति 1
चित्र 1: स्नायु बर्फ़ीली के लिए उपकरण। (ए) चित्रइस अध्ययन में इस्तेमाल cryovial की। 14 इनलेट छेद ट्यूब दीवार में मुक्का मारा जाता है: एक टोपी पर है; एक और नीचे स्थित है; और शेष 12 प्रपत्र चार समानांतर रेखाओं, एक दूसरे से 90 डिग्री पर चार छेद के साथ प्रत्येक। (बी) ठंड तंत्र की एक तस्वीर। तरल नाइट्रोजन में ठंड की मांसपेशियों का एक सुरक्षित और कुशल साधन एक cryovial, प्लास्टिक फिल्म, सुरक्षा चश्मा, फ्रीजर दस्ताने, 10 सेमी संदंश, 25 सेमी चिमटी, एक स्टायरोफोम कूलर, एक छुरी, और ए 4 पीवीसी बंधन कवर का उपयोग शामिल है। (सी) एक इंजीनियर, योंघुआ वैंग, ढालना कारखाने में द्वारा प्रदान की cryovial मोल्ड के चित्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: स्नायु नमूने तैयार करना। (ए (बी) मांसपेशियों के ऊतकों क्रायोजेनिक शीशी में प्रवेश छेद के बीच रखा जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: सुअर longissimus dorsi स्नायु के histological मूल्यांकन के प्रतिनिधि छवियाँ के बाद वे पांच विभिन्न विधियों का उपयोग जमे हुए कर रहे हैं।
बर्फ के क्रिस्टल वह धुंधला जब मांसपेशियों अनुचित तरीकों का उपयोग कर ऊतकीय विश्लेषण के लिए जमे हुए हैं, के रूप में (एसी) में दिखाया गया है से ली मांसपेशियों cryosections की पठनीयता को नष्ट कर। काफी ठंड कलाकृतियों हुई जब पेशी के नमूने सीधे एक 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर (ए) में रखा गया था या तरल में डूबा हुआनाइट्रोजन (बी)। कई सुई की तरह बर्फ के क्रिस्टल व्यक्ति मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर का गठन करने के बाद मांसपेशियों के ऊतकों अक्टूबर में डूबा हुआ था और तब सीधे (सी) isopentane के घोल में डाल दिया। इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल बर्फ के क्रिस्टल के गठन को समाप्त कर सकते हैं जब मांसपेशियों के ऊतकों बस तरल नाइट्रोजन (डी) में डूब जाता है। यह प्रोटोकॉल मायोसिन ATPase के सक्रियण परख (ई) के आधार पर जमे हुए मांसपेशियों में एंजाइम गतिविधि के विश्लेषण के लिए लागू है। मांसपेशियों में बेहतर प्रदर्शन नहीं कर रहा है के लिए मानक ठंड विधि; मांसपेशियों के ऊतकों अक्टूबर लगाने मध्यम (एफ) के साथ सीधे संपर्क के बिना isopentane के घोल में डूबा हुआ है। सभी छवियों काले किनारों (20X) के साथ उन लोगों के लिए छोड़कर, एक 10X उद्देश्य के तहत कर रहे हैं। स्केल सलाखों: 100 सुक्ष्ममापी। चित्रा -3 सी में तीर छोटे, सुई की तरह बर्फ के क्रिस्टल इंगित करता है। तीर और चित्रा 3E में पाठ को संकेत मांसपेशी फाइबर के प्रकार: टाइप 1 धीमी मायोसिन भारी श्रृंखला फाइबर का प्रतिनिधित्व करता है, टीype 2A मध्यवर्ती मायोसिन भारी श्रृंखला फाइबर का मतलब है, और टाइप 2 बी तेजी मायोसिन भारी श्रृंखला फाइबर इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: तरल नाइट्रोजन आधारित और isopentane आधारित बर्फ़ीली प्रक्रियाओं के लिए वर्कफ़्लो की तुलना। तरल नाइट्रोजन आधारित प्रोटोकॉल में, नए cryovial में मांसपेशियों के ऊतकों तरल नाइट्रोजन में डूब जाता है। isopentane आधारित प्रोटोकॉल में, isopentane का एक घोल राज्य तरल नाइट्रोजन में isopentane पूर्व ठंडा और जब तक छोटे, सफेद अवक्षेप निचले भाग में दिखाई सरगर्मी से अग्रिम में प्राप्त किया जाना चाहिए। फिर, मांसपेशियों के ऊतकों precooled isopentane में डूबा हुआ है। isopentane आधारित प्रक्रिया में 35 मिनट के साथ तुलना में, चित्रा 3F में वर्णित है, यह केवल 5 मिनट के टी लेता है ओ इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत ठंड प्रक्रिया को पूरा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: एक तेज़ धार छिद्र के माध्यम से तरल नाइट्रोजन प्रवाह। जब 14 इनलेट छेद के माध्यम से ट्यूब में तरल नाइट्रोजन, वायुमंडलीय दबाव बलों तरल नाइट्रोजन में पूरे बहु छेद cryovial डुबाया गया होगा। होल की उपस्थिति का प्रवाह उन के माध्यम से तेजी लाने, इस प्रकार वेग बढ़ बनाता है। (नीले रंग में) एक रीसर्क्युलेटिंग प्रवाह छिद्र (नारंगी में) के तुरंत नीचे की ओर विकसित करता है। डी 1 ट्यूब की दीवार पर छिद्र के व्यास को इंगित करता है और डी 2 छिद्र और मांसपेशियों नमूना (लाल रंग में) के बीच की दूरी का प्रतिनिधित्व करता है।= "_ Blank"> कृपया यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ, हम एक नया, बहु छेद ठंड और मांसपेशियों के ऊतकों के संचय मांसपेशी समारोह के ऊतकीय आकलन करने के लिए के लिए cryovial का वर्णन। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम है कि संशोधित बहु छेद cryovial में नमूना सीधे तरल नाइट्रोजन में डूब जाता है है। हमारे ज्ञान करने के लिए, यह मौजूदा ठंड तरीकों के बीच पेशी cryosectioning के लिए उत्कृष्ट जमे हुए नमूनों (प्रतिनिधि परिणाम देखें) प्राप्त करने के लिए सबसे आसान और rapidest तरीका है।

तकनीकी चुनौती पेशी शोधकर्ताओं को पेश आ रही है कि बर्फ के क्रिस्टल सबसे जब साधन सेक्शनिंग के लिए मांसपेशियों के ऊतकों कठोर के रूप में ठंड का उपयोग कर के रूप में की संभावना है। के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में बताया गया है, तीन कारकों एक उपयुक्त ठंड स्रोत चयन करते समय, नमूना के नमी को कम करने, और ठंड स्रोत के साथ संपर्क में कुल सतह का प्रतिशत बढ़ रही सहित रोग अध्ययन, के लिए उचित मांसपेशी ठंड का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। प्रथम,ठंड की दर सेक्शनिंग के लिए जमे हुए ऊतकों की तैयारी के दौरान नुकसान से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। जब ठंड धीमी है, जमे हुए मांसपेशियों को अच्छी तरह से ज्ञात "स्विस पनीर" प्रभाव दिखाने क्योंकि बड़े बर्फ के क्रिस्टल extracellularly बनते हैं। जब ठंड तेजी से लेकिन पर्याप्त रूप से जल्दी नहीं है, छोटे, सुई की तरह बर्फ के क्रिस्टल की बड़ी संख्या को अलग-अलग मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर का गठन कर रहे हैं। ये सुई की तरह बर्फ के क्रिस्टल थोड़ा पता लगाने योग्य संरचनात्मक क्षति है, लेकिन वे निम्न प्रभाव लाने: माइटोकॉन्ड्रिया 10 क्षतिग्रस्त हो रहे हैं, मांसपेशी फाइबर के आकार कृत्रिम रूप से 11 बढ़ रहे हैं, और रेशेदार संरचनाओं की अखंडता को 11 नष्ट हो जाता है। इस प्रकार, एक पर्याप्त ठंडा तापमान पर एक ठंडा स्रोत और एक पर्याप्त ठंड गति मांसपेशी cryosections में बर्फ के क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए आवश्यक हैं।

आदर्श रूप में, ठंड स्रोत बेहद ठंडे तापमान पर है और टी की व्यवस्था हैओ सभी सतहों से संपर्क करें। दोनों तरल नाइट्रोजन (-190 डिग्री सेल्सियस) और एक ठोस तरल मिश्रित राज्य में isopentane (-160 डिग्री सेल्सियस) इस शर्त को पूरा। हालांकि, दो ठंड मीडिया को अपने स्वयं के नुकसान हैं। तरल नाइट्रोजन एक बहुत ही कम विशिष्ट ऊष्मा निरंतर है। नतीजा यह है कि तरल नाइट्रोजन और ऊतक के बीच संपर्क एक भाप बाधा है कि ऊतक के बगल में है और बहुत बनाता है ऊतक 12 में ठंड के प्रवेश को धीमा कर देती कारण बनता है। इस प्रकार, महत्वपूर्ण ठंड कलाकृतियों जमे हुए पेशी के अंदर होते हैं। isopentane का घोल राज्य एक आदर्श ठंड मध्यम कि वाष्प बाधाओं नहीं बना पाता है, लेकिन मुख्य समस्या यह है कि isopentane आदेश 160 डिग्री सेल्सियस के तरल स्नान तापमान प्राप्त करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए है। इसके अलावा, isopentane कमरे के तापमान पर एक बेहद अस्थिर और ज्वलनशील तरल है। दूसरा, मांसपेशी अत्यधिक पानी (> 75%), तो नमूना में बहिर्जात नमी लागू करने के लिए किसी भी तरह से शामिल ठंड कलाकृतियों का कारण होगा। उदाहरण के लिए, अक्टूबर बढ़ते मध्यम, मांसपेशियों के लिए अतिरिक्त पानी जोड़ता है, ताकि बर्फ के क्रिस्टल अक्टूबर बढ़ते मध्यम के बिना लोगों के साथ तुलना में बहुत अधिक उन मांसपेशियों cryosections में प्रमुख हैं। अंत में, मांसपेशियों के ऊतकों की मोटाई भी उचित यह फ्रीज करने क्योंकि ठंड की दर आंशिक रूप से ठंड स्रोत (आमतौर पर, मोटाई <0.5 सेमी) के साथ संपर्क में कुल सतह का प्रतिशत पर निर्भर करता है महत्वपूर्ण है। तदनुसार, ठीक से ऊतक फ्रीज करने के केवल मौजूदा तरीका मोटाई कम से कम 0.5 सेमी पूर्व ठंडा isopentane (160 डिग्री सेल्सियस) में, जैसा कि पहले 8 वर्णित के साथ मांसपेशियों के ऊतकों को विसर्जित करने के लिए है।

यह प्रोटोकॉल पहले बताता है कि कैसे ठीक से उन्हें तरल नाइट्रोजन में सीधे विसर्जित करके मांसपेशियों के ऊतकों को फ्रीज करने। अकेले तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर के साथ समस्या, ऊतक सतह पर नाइट्रोजन गैस के गठन है एक विसंवाहक के रूप में अभिनय और ऊतकों को ठंडा करने में बाधाच "> 13। इस तरह के एक वाष्प कंबल केवल फार्म कर सकते हैं जब बुलबुले के विलय इतना तीव्र है कि नाइट्रोजन गैस तरल नाइट्रोजन से ऊतक को अलग कर सकते हैं। बुलबुला गतिशीलता के अनुसार, एक तेज तरल प्रवाह छोटे बुलबुले में परिणाम होगा, यह के रूप में 14 विलय करने के लिए अवसर कम है। इसलिए, हम 14 छेद cryovial की दीवार में मुक्का मारा ऊतक के आसपास तरल प्रवाह की गति को बढ़ाने के लिए और मदद करने के लिए "वाष्प कंबल" प्रभाव से बचने जब तरल नाइट्रोजन संपर्क ऊतक।

यह देखते हुए कि एक पहलू यह है कि प्रयोगात्मक सफलता निर्धारित करता है ऊतक के आसपास तरल प्रवाह की गति है, cryovial के तीन मानकों बहुत महत्वपूर्ण हैं, स्थिति और छेद की संख्या, इनलेट छेद के व्यास, और छिद्र और के बीच की दूरी भी शामिल है नमूना। तरल गतिकी पता चलता है कि एक छिद्र के माध्यम से प्रवाह की दर छेद का व्यास द्वारा निर्धारित किया जाता है और एक रीसर्क्युलेटिंग प्रवाह तुरंत नीचे विकसित करता है किछिद्र की धारा (चित्रा 5) 15, 16। तदनुसार, छिद्र और नमूना के बीच की दूरी ज्यादातर, उच्च गति तरल प्रवाह और नमूना के बीच संपर्क क्षेत्र निर्धारित करता है के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है। नतीजतन, चित्रा 1 ए में बहु छेद cryovial चौड़ा x 0.6 सेमी x 1.5 सेमी लंबे उच्च 0.6 सेमी है कि एक मांसपेशी नमूना के लिए उपयुक्त है। बड़ा मांसपेशियों टुकड़े के लिए, यह एक बड़ा ट्यूब और अधिक छेद के साथ इस विधि की कोशिश कर रहा लायक है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल नहीं इस तरह के एक murine मॉडल में जैसे छोटे जानवरों, से पेशी के नमूने ठंड के लिए उपयुक्त है, क्योंकि इनलेट छेद छोटे नमूने के लिए बहुत बड़ा हो सकता है।

इसके अलावा, तीन महत्वपूर्ण चरणों सख्ती से प्रोटोकॉल में पालन किया जाना चाहिए। सबसे पहले, तरल नाइट्रोजन पूरे cryovial विसर्जित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, और क्रायोजेनिक शीशी पूरी तरह से तरल स्तर से नीचे होना चाहिए। दूसरा, यह एक के लिए आवश्यक हैजमे हुए मांसपेशियों और कमरे के तापमान कंटेनर या उपकरणों के बीच शून्य आकस्मिक संपर्क। उदाहरण के लिए, सावधान परिवहन के बिना, नई बर्फ क्रिस्टल फार्म सकता है जब एक cryostat के लिए तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से एक जमे हुए नमूना स्थानांतरित करने या -80 सी फ्रीजर °। तीसरा, जब नमूनों जमे हुए मांसपेशियों और अक्टूबर के बीच संपर्क क्षेत्र के आसपास बर्फ क्रिस्टल गठन के उच्च संभावना के कारण धारक पर रखा जाता है बहुत ज्यादा अक्टूबर इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।

मांस उद्योग में, एक मांसपेशी cryosection प्रक्रिया अपरिहार्य क्योंकि formalin निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग की प्रक्रिया है जो इस तरह TNF और CSAF के रूप में कुछ मांसपेशी लक्षण, के मूल्यांकन को बाधित मांसपेशी फाइबर, में संकोचन कारण बनता है। इसके अलावा, जमे हुए पेशी एफटीसी का मूल्यांकन जब मायोसिन ATPase के सक्रियण परख का उपयोग कर की आवश्यकता है। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 3E, इस प्रोटोकॉल की मांसपेशियों में दोनों रोग विश्लेषण की आवश्यकताओं और histochemical दाग मिल सकते हैं। तैय़ारीएक cryosection के नैदानिक ​​मांसपेशी विकृति प्रयोगशालाओं में एक नियमित ऑपरेशन है। मेंग एट अल द्वारा वर्णित है। 8, मांसपेशियों के ऊतकों ठंड के लिए एक मानक संचालन प्रक्रिया पूर्व ठंडा isopentane में शव परीक्षण नमूनों को विसर्जित करने के लिए है। हालांकि, isopentane नैदानिक ​​मांसपेशी विकृति प्रयोगशालाओं के बिना संस्थानों में शव परीक्षण नमूनों फ्रीज करने के लिए अनुपलब्ध है। नतीजतन, नैदानिक ​​मांसपेशी बायोप्सी अक्सर suboptimally कई चिकित्सा सुविधाओं में कार्रवाई की जाती है। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल काफी छोटे अस्पतालों या प्रयोगशालाओं के लिए क्षमता पर्याप्त गुणवत्ता का निदान मांसपेशी बायोप्सी प्रदर्शन करने के लिए बेहतर बना सकते हैं। उच्च दक्षता और इस प्रोटोकॉल के सरल ऑपरेशन को देखते हुए, यह वर्तमान isopentane आधारित ठंड विधि के लिए एक आशाजनक विकल्प हो सकता है और व्यापक रूप से भविष्य में ऊतकीय अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता।

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Disclosures

ब्याज की कोई विरोध नहीं मिले, वित्तीय या अन्यथा, लेखकों द्वारा घोषित किया गया है।

Acknowledgments

इस परियोजना चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSFC) द्वारा समर्थित किया गया: 31,301,950 और 31,671,288।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

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References

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Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

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