Een multi-hole Cryovial Voorkomt bevriezen Artefacten als spierweefsel direct worden ondergedompeld in vloeibare stikstof

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol beschrijft een procedure voor spierweefsel bevriezen door ze rechtstreeks dompelen in vloeibare stikstof. Dit protocol wijst een nieuwe cryovial dat de "blanket effect" stikstofgas kan voorkomen bij vloeibare stikstof contact maakt met het weefseloppervlak van een monster.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studies over skeletspier fysiologie staan ​​voor de technische uitdaging van geschikte verwerking van de monsters met secties met duidelijk zichtbare cytoplasmatische compartimenten verkrijgen. Een andere hindernis is de strakke aanbrenging van spiervezels naar de omliggende weefsels. Omdat het proces van weefsel fixatie en inbedding in paraffine leidt tot het krimpen van spiervezels, invriezen optimale middel verharding spierweefsel te snijden. Echter, een algemeen voorkomende probleem de vorming van ijskristallen optreedt tijdens de bereiding van ingevroren secties vanwege het hoge watergehalte van de spier. De hier gepresenteerde protocol beschrijft eerst een eenvoudige en efficiënte werkwijze voor het invriezen goed spierweefsel door onderdompeling in vloeibare stikstof. Het probleem met vloeibare stikstof alleen dat het veroorzaakt de vorming van een stikstof gasbarrière naast het weefsel, die fungeert als een isolator en remt de koeling van de weefsels. Om deze "damp deken" effect te vermijden, een new cryovial is ontworpen om de snelheid van de vloeistofstroming rond het weefseloppervlak te verhogen. Dit werd bereikt door ponsen in totaal 14 inlaatopeningen in de wand van het flesje. Volgens beldynamica, een hogere vloeistofstroom leidt tot kleinere bellen en minder kansen om een ​​gasbarrière te vormen. Wanneer vloeibare stikstof in de cryovial door de inlaat openingen stroomt, de stroomsnelheid rond het weefsel snel genoeg om de gasbarrière te elimineren. Vergeleken met de werkwijze voor het invriezen spierweefsel met behulp van vooraf gekoelde isopentaan, dit protocol is eenvoudiger en efficiënter en kunnen worden gebruikt om spieren bevriezen in een debiet wijze. Bovendien is deze methode is optimaal voor instellingen die geen toegang hebben tot isopentaan, dat is zeer licht ontvlambaar bij kamertemperatuur hebben.

Introduction

Skeletspier de meest waardevolle component van een vleesproducerende dier uit de voeding en het oogpunt van verwerking. In de vleesindustrie, zijn twee bijzonder belangrijke aspecten: de efficiëntie van spiergroei en de kwaliteit van het vlees verkregen. Als hoofdbestanddeel van de spier, spiervezels rechtstreeks verband met groei en vers vleeskwaliteit bij dieren 1. Bijvoorbeeld, het totaal aantal vezels (TNF) en de Doorsnede van vezels (CSAF) bepalen grotendeels spiermassa en vleeskwaliteit; ook, Fiber Type Composition (FTC) heeft een sterke invloed vers vlees kwaliteit 2. Daarom is de manipulatie van spiervezel eigenschappen bij dieren is een zeer effectieve methode om de kern rentabiliteit en het concurrentievermogen van boerderijen 1 te verhogen.

Tot op heden zijn verschillende intrinsieke en extrinsieke factoren geïdentificeerd aan spiervezels characterist manipulerenics 1. Deze bewerking kan worden bereikt door gerichte selectie van dieren met specifieke genen, zoals het myostatine-gen bij runderen 3, de Callipyge gen bij schapen 4 en de RYR1 en IGF2 genen in varkens 5. Ook, dieet controle en behandelingen met specifieke hormonen spelen een belangrijke rol in de spiervezels elementen 6. Zo zou een benadering die genetische en voedingsfactoren combineert in staat zijn om mager vlees inhoud en kwaliteit van het vlees te verbeteren. Studies on spiervezels zijn beperkt in de vleesindustrie omdat de opheldering van de structuur van de spiervezels nog steeds een uitdaging.

Spiervezel eigenschappen worden geïdentificeerd door histochemische werkwijzen, zoals myosine adenosinetrifosfatase (ATPase) test. Deze werkwijze berust op het feit dat enzymen in dunne (6-8 pm) ingevroren sectiesspiervezels kan chemisch reageren met bepaalde producten. Echter, het watergehalte van spieren is dan 75% bij varkens, konijnen, muizen en mensen, onafhankelijk van de positie (dat wil zeggen, rug, buik of achterbeen) 7. Dergelijke hoge vochtgehalte in de spieren veroorzaakt voorkomende probleem - bevriezing artefacten - tijdens de bereiding van vriescoupes, zoals eerder beschreven 8, 9. In de meeste gevallen is het bijna onmogelijk om adequaat te bevriezen spierweefsel in een slachthuis productielijn, volgens onze ervaring.

De hier gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte werkwijze die in ons laboratorium spierweefsel bevriezen cryosectioning in een high-throughput manier. Het hoogtepunt van deze werkwijze is een nieuwe cryovial die is ontworpen voor flash-bevriezen spierweefsel in vloeibare stikstof. De huidige werkstroom kan gelijktijdig weefsel vergemakkelijktinvriezen en verwerking voor een uitstekende spier cryosectie, met een duidelijk zichtbare cytoplasmische compartiment en de dichte appositie van myovezels aan het omringende weefsel. Bovendien kan dit protocol worden toegepast op een breed scala van mogelijkheden voor weefselanalyse omdat vloeibare stikstof niet mengen met weefsels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De huidige methode is vastgesteld en gevalideerd te oogsten en opslaan van meer dan 1000 spiermonsters voor histologische kleuring in ons laboratorium. Alle procedures met betrekking tot de verzorging van dieren en het gebruik gevolgd de door het ministerie van Landbouw van China richtlijnen.

1. apparatuur voor Sample Collection

  1. Label het monster identiteit op elk cryogene flacon.
    Opmerking: De cryogene flacon is speciaal ontworpen om weefselmonsters verse bevriezen de cryosectie procedure (figuur 1A). De flesjes zijn gemaakt van polypropyleen in een vormfabriek (figuur 1C).
  2. Haal de volgende apparatuur: vloeibare stikstof in een geschikte stikstof tank vloeibare, veiligheidsbril of gezichtsscherm, diepvries handschoenen, 10 cm forceps, 25 cm pincet, piepschuim koeler (binnenafmetingen: 20 cm lang x 12 cm breed x 13,5 cm hoog ; buitenafmetingen: 24 cm lang x 16 cm breed x 15 cm hoog), kunststoffolie (2,5 cm lang x 0,8 cm breed x 0,1 mm dik),een scalpel, en A4 PVC bindende covers (21 cm x 29,5 cm) (Figuur 1B).

2. Bereiding van spiermonsters

  1. Vul het piepschuim koeler met vloeibare stikstof 5 min vóór monstername.
    Opmerking: Het grote vloeistofkolom stikstof is essentieel omdat een deel van de vloeibare stikstof kookt verwijderd en verandert in gas Wanneer monsters aanraken. Om de frequentie van overdracht van vloeibare stikstof te reduceren tot het verlies vullen, moet een geschikte afmetingen piepschuim koeler vooraf verkregen volgens het aantal monsters.
  2. Zodra een monster wordt verkregen, plaats voorzichtig het op een A4 PVC bindende deksel en let op de richting van de spiervezels.
    LET OP: Hier gebruikten we de doorsnede van de longissimus doris spier van de eerste tot de laatste lendenwervel in varkens. De monsters zijn ongeveer 12 cm, 8 cm breed en 5 cm hoog.
  3. Met een scalpel twee parallelle insnijdingen door het monster in de richting van de spiervezels ongeveer 3 cm lang en 0,6 cm. Trim de spier ingesneden tot een rechthoek van ongeveer 0,6 cm breed x 0,6 cm x 1,5 cm lang.
    OPMERKING: De betrouwbaarheid van de meting van de dwarsdoorsnede van de spiervezels hangt meestal af van de vezeloriëntatie van de ingesneden spier.
  4. Met 10 cm tang om zachtjes het monster op een stuk plastic folie, met de lengteas van de ingesneden spier parallel aan de lange zijde van de folie (figuur 2A).
    Opmerking: De kunststof folie heeft twee functies: een vasthoudfunctie die helpt bij het vaststellen van de oriëntatie van de spiervezels en een adhesie functie die scheuren in het monster voorkomt als gevolg van snelle bevriezing.
  5. Behulp van een tang, plaats het spierweefsel in het onderste midden van een gemerkt cryogeen flesje, tussen de inlaat openingen, en vervolgens strak deksel op het vat (figuur 2B).

3. Het invriezen en opslaan spiermonsters

  1. Toepassing van 25 cm pincet snel onderdompelen gehele cryogene flacon in vloeibare stikstof in de voorgekoelde piepschuim koeler, wachten totdat de vloeibare stikstof niet kookt (circa 10-20 s).
    OPMERKING: De cryovial drijven wanneer de vloeibare stikstof kookt, zo zorgvuldig dompel de flacon in de kokende vloeibare stikstof gedurende 10-20 s.
  2. Breng de spiermonsters een vloeibare stikstof opslagtank of een -80 ° C vriezer voor langetermijnopslag.

4. prepareren

  1. Voorkoelen een cryostaat tot tussen -20 ° C en -22 ° C.
  2. Verwijder de oude microtoom mes vegen van de meshouder en anti-rolplaat in de cryostaat Plaats een nieuwe microtoom mes in de cryostaat en stel de snijbreedte tot 8 urn.
  3. Breng het monster in de spier cryogene flacon het stikstofatoom vloeistof opslagtank of -80 ° C vriezer om de cryostaat, transporteren in vloeibare stikstof of droogijs. Wacht 30 minuten voor het monster in evenwicht met de temperatuur van de cryostaat.
    LET OP: Elk apparaat dat het monster zou aanraken moet vooraf worden gekoeld, omdat een hoge temperatuur de vorming van ijskristallen in het monster zou kunnen veroorzaken.
  4. Monteer het monster in de monsterhouder onder optimale snijtemperatuur formulering van in water oplosbare glycolen en hars (oktober). Cut 8-um secties.
    OPMERKING: Stel de snijhoek loodrecht op de oriëntatie van de spiervezels, omdat de CSAF is de dwarsdoorsnede van spiervezels.
  5. Monteer de delen naar het midden van een bij kamertemperatuur microplaat. Onmiddellijk in zijn dia in een schuifkast in een -80 ° C vriezer. Sta niet toe dat de dia drogen bij kamertemperatuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cryovial de illustratie en de gemeenschappelijke laboratoriummateriaal bevriezen spieren tijdens de bereiding van bevroren secties worden getoond in Figuur 1. De cryovials zijn gemaakt van polypropyleen in een vormfabriek. Elke flacon heeft in totaal 14 inlaatopeningen: men op de dop; een ander is aan de onderzijde; en de resterende 12 vormen vier parallelle lijnen, elk met vier gaten 90 ° ten opzichte van elkaar. Deze inlaatopeningen kunnen versnellen van de stromingssnelheid van vloeibare stikstof naast het weefsel aan de "dampdeken" effect wanneer vloeibare stikstof contact maakt met het weefsel te voorkomen. Bijgevolg weinig ijskristallen in de bevroren monsters. Belangrijker, isopentaan, de zeer vluchtige en brandbare vloeistof met een kookpunt bij 28 ° C, niet noodzakelijk in deze procedure.

Om verder te wijzen op de voordelen van deze methode, we bevroor de longissimus dorsibij varkens gebruikmaking van vijf koudebehandelingsmethoden en wordt vervolgens de kleuring eigenschappen en histologische gegevens via een hematoxyline / eosine (HE) kleuring (figuur 3). Een veel voorkomende probleem was de vorming van ijskristallen tijdens de voorbereiding van de spieren voor cryosectie. Wanneer het monster direct in een -80 ° C vriezer (figuur 3A) werd geplaatst, grote ijskristallen en veroorzaakte een bekende "Emmentaler" effect in de spier cryosectie. Verder ijskristallen eveneens gevormd wanneer het spierweefsel direct in vloeibare stikstof (figuur 3B) werd gedompeld. Hoewel vloeibare stikstof een zeer koude vloeistof (-190 ° C), de warmte constant is extreem laag. Wanneer een specimen contact komt met de vloeibare stikstof, kan een dampdeken opgebouwd naast het weefsel en isoleren van de penetratie van koude in het weefsel. Bovendien kan een routinematige procedure voor het invriezen specimens pathologielaboratoria nog niet van toepassing op spierweefsel. EENTussen getoond in figuur 3C, vele naaldachtige ijskristallen gevormd in het cytoplasmatische compartiment van spiervezels na het spierweefsel in de juiste oriëntatie in oktober fixeermiddel werd gedompeld en vervolgens snel ingevroren in isopentaan suspensie (-160 ° C). Bijgevolg moet de juiste invriessnelheid van spierweefsel streng worden gehouden bij het exploiteren.

Het huidige protocol bereikt uitstekende specimen integriteit, met een duidelijk zichtbare cytoplasmische compartiment en de dichte appositie van myovezels aan het omringende weefsel (Figuur 3D). Het zorgt voor uitstekende visualisatie van de metabolische eigenschappen van spiervezels met de myosine ATPase assay (figuur 3E). Voor deze test werd myosine ATPase-activiteit geanalyseerd op basis van het feit dat snel verdragsluitende spiervezels (type zoogdier 2A en 2B) hydrolyseren ATP sneller dan slow-verdragsluitende vezels (zoogdierlijke type 1). Wanneer gegeven equivauitgeleend tijden, snel aanbestedende vezels verschijnen licht, met twee graden, en slow-verdragsluitende vezels zwart weergegeven. Belangrijker is dat deze werkwijze efficiënt worden gebruikt in een high-throughput omgeving omdat deze gemakkelijk uit te voeren en spaart tijd (figuur 4). Tegenwoordig een gevestigde methode invriezen moet spierweefsel dompelen in een suspensie isopentaan zonder contact met oktober fixeermiddel, zoals eerder beschreven 8, 9 (Figuur 3F). In deze procedure duurt bij benadering 30 min bij een vast-vloeibare suspensie stand van 240 ml isopentaan te bereiken door vooraf koelen van de isopentaan in vloeibare stikstof en roeren tot kleine witte neerslagen worden onder (Figuur 4). Er zijn drie praktische problemen waarmee onderzoekers tijdens een poging om spierweefsel in de pre-gekoelde isopentaan bevriezen: (1) Een vast-vloeibare brij toestand van isopantane is moeilijk vol te houden wanneer debemonsteringstijd is meer dan 1 uur. In het verleden pogingen bevriezing artefacten treden gewoonlijk op in de monsters die in het midden en late stadia van het proces, toen tientallen spierweefsels eenmaal verzameld werden uitgevoerd. (2) Als gevaarlijke vloeistoffen, isopantane nergens toegestaan ​​op OV. (3) Isopentane niet beschikbaar behalve in laboratoria. Veel vlees wetenschap onderzoekers bevriezen meestal spierweefsel in een slachthuis dat is ver weg van een laboratorium en dat is niet toegestaan ​​om isopentaan hebben. Daarnaast diagnostische spierbiopten zijn vaak sub-optimaal verwerkt te wijten aan het gebrek aan isopentaan bij medische voorzieningen. Zo is ons protocol is een belangrijke ontwikkeling voor het invriezen van spier specimens in situaties waarin isopentaan is niet beschikbaar.

Figuur 1
Figuur 1: Inrichting voor Muscle invriezen. (A) De afbeeldingenvan de cryovial gebruikt in deze studie. 14 inlaatopeningen geponst in de buiswand: men op de dop; een ander is aan de onderzijde; en de resterende 12 vormen vier parallelle lijnen, elk met vier gaten 90 ° ten opzichte van elkaar. (B) een foto van de invriesapparaat. Een veilige en efficiënte manier van invriezen spieren in vloeibare stikstof omvat het gebruik van een cryovial, kunststoffolie, veiligheidsbril, diepvries handschoenen, 10 cm forceps, pincet 25 cm, piepschuim koeler, een scalpel en A4 PVC bindende dekken. (C) De afbeeldingen van de cryovial matrijs door een ingenieur, Wang Yonghua, in het vormfabriek. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Bereiding van spiermonsters. (A (B) het spierweefsel worden geplaatst tussen de inlaat gaten in de cryogene flacon. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Vertegenwoordiger Beelden van het histologisch onderzoek van Pig Longissimus Dorsi spieren na Ze zijn bevroren met behulp van vijf verschillende methoden.
Ijskristallen vernietigen van de leesbaarheid van de spier vriescoupes afgebeeld met HE kleuring wanneer de spieren worden ingevroren voor histologische analyse met behulp van ongeschikte methoden, zoals getoond in (AC). Aanzienlijke bevriezing artefacten opgetreden bij spiermonsters direct in een 80 ° C vriezer (A) werden gedompeld in vloeibare ofstikstof (B). Veel naaldachtige ijskristallen gevormd binnen individuele spiercellen na het spierweefsel werd ondergedompeld in oktober en vervolgens direct in een suspensie isopentaan (C) gezet. Het protocol in dit onderzoek kan de vorming van ijskristallen elimineren wanneer het spierweefsel eenvoudig wordt ondergedompeld in vloeibare stikstof (D). Dit protocol is van toepassing op de analyse van enzymactiviteit in bevroren spier gebaseerd op de myosine ATPase assay (E). De standaard bevriezing methode voor spier niet beter presteren; spierweefsel wordt ondergedompeld in een suspensie isopentaan zonder direct contact met oktober montage medium (F). Alle afbeeldingen zijn onder een 10X objectief, met uitzondering van die met zwarte randen (20X). Schaalbalken: 100 urn. De pijlpunt in Figuur 3C toont kleine, naaldachtige ijskristallen. De pijlpunt en tekst in figuur 3E geven het type spiervezels: Type 1 de langzame myosine zware keten vezels, type 2A tussenfrequente zware keten van myosine vezels, en type 2B geeft snelle myosine zware keten vezels. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Vergelijking van werkstromen voor vloeibare stikstof-gebaseerde en isopentaan invriezen-gebaseerde procedures. In de vloeibare stikstof gebaseerd protocol, is het spierweefsel van de nieuwe cryovial ondergedompeld in vloeibare stikstof. In het isopentaan gebaseerd protocol moet een suspensietoestand isopentaan vooraf worden bereikt door het voorkoelen isopentaan in vloeibare stikstof en roeren tot kleine, witte neerslagen worden onder. Vervolgens wordt het spierweefsel ondergedompeld in de voorgekoelde isopentaan. Tegenover 35 min in isopentaan-gebaseerde procedure, zoals beschreven in figuur 3F, het is slechts 5 minuten t o voltooi de invriezen in dit protocol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: vloeibare stikstof stroom door een Scherpe Orifice. Wanneer het onderdompelen van het gehele aantal gaatjes cryovial in vloeibare stikstof atmosferische drukkrachten vloeibare stikstof in de buis door de 14 inlaat gaten. De aanwezigheid van de gaten maakt de stroming te versnellen doorheen, waardoor de snelheid toeneemt. Een recirculatiestroom (blauw) ontwikkelt onmiddellijk stroomafwaarts van de opening (oranje). D1 geeft de diameter van de opening aan de wand van de buis en D2 representeert de afstand tussen de opening en de spiermonster (rood).= "_ Blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we een nieuwe, multi-hole cryovial voor het invriezen en bewaren van spierweefsel aan histologische evaluaties van de spier functie uit te voeren. De kritische stap in deze gewijzigde protocol is dat het monster in de multi-hole cryovial direct ondergedompeld in vloeibare stikstof. Voor zover wij weten, is dit de eenvoudigste en rapidest manier om uitstekende ingevroren monsters voor spier cryosectioning tussen de bestaande bevriezing methoden (zie de representatieve resultaten) te verkrijgen.

De technische uitdaging spier onderzoekers is dat ijskristallen de meeste kans om te vormen bij het gebruik van het invriezen als het middel om spierweefsel te harden voor het snijden. Zoals in de representatieve resultaten, drie factoren spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de juiste spieren koud voor pathologische studies, waaronder het kiezen van een geschikte koudebron, minimaliseert de vochtigheid van het monster, en het verhogen van het percentage van het totale oppervlak in contact met de koudebron. Eerste,de snelheid van invriezen is essentieel voor beschadiging tijdens het bereiden van het bevroren weefsel te snijden voorkomen. Wanneer het invriezen langzaam, bevroren spieren vertonen de bekende "Emmentaler" effect omdat grote ijskristallen extracellulair worden gevormd. Wanneer het invriezen is snel maar niet voldoende snel worden grote aantallen kleine, naaldachtige ijskristallen gevormd binnen individuele spiercellen. Deze naaldachtige ijskristallen veroorzaken weinig detecteerbare structurele schade, maar zij brengen de volgende effecten: mitochondria beschadigd 10 worden de omvang van de spiervezels kunstmatig verhoogde 11 en de integriteit van vezelachtige structuren 11 vernietigd. Dus een koudebron bij een voldoende lage temperatuur en een voldoende vriessnelheid zijn essentieel voor de vorming van ijskristallen in de spieren cryosecties voorkomen.

In het ideale geval de koudebron is bij extreem lage temperaturen en is aangebracht to contact alle oppervlakken. Zowel vloeibare stikstof (-190 ° C) en isopentaan in een vaste stof-vloeistof gemengde toestand (-160 ° C) aan deze voorwaarde. Echter, de twee bevriezing media hebben hun eigen nadelen. Vloeibare stikstof heeft een zeer lage soortelijke warmte constant. Het resultaat is dat het contact tussen vloeibare stikstof en het weefsel veroorzaakt een dampbarrière die opbouwt naast het weefsel en sterk vertraagt de penetratie van koude in het weefsel 12. Zo significante bevriezing artefacten optreden in de bevroren spier. De suspensietoestand isopentaan ideaal bevriezing medium dat vochtafsluiters niet vormt, maar het belangrijkste probleem is dat isopentaan moet tezamen met vloeibaar stikstof worden gebruikt om een ​​vloeibare badtemperatuur van 160 ° C bereiken. Bovendien, isopentaan een zeer vluchtige en brandbare vloeistof bij kamertemperatuur. Ten tweede, de spier bevat teveel aan water (> 75%), zodat enigerlei wijze exogeen vocht introduceren in het monster zou leiden tot bevriezing artefacten. Bijvoorbeeld, oktober montage medium voegt extra water naar de spier, dus ijskristallen zijn veel meer prominent in de spier vriescoupes vergelijking met degenen zonder oktober montage medium. Tenslotte de dikte van het spierweefsel is ook belangrijk om op geschikte bevriezen omdat de snelheid van bevriezing mede afhankelijk van het percentage van het totale oppervlak in contact met de koudebron (meestal de dikte <0,5 cm). Dienovereenkomstig is de enige bestaande manier om het weefsel goed te bevriezen is spierweefsel dompelen met een dikte van minder dan 0,5 cm in vooraf gekoelde isopentaan (160 ° C), zoals eerder beschreven 8.

Dit protocol beschrijft eerst hoe spierweefsel goed bevriezen door onderdompeling direct in vloeibare stikstof. Het probleem met vloeibare stikstof alleen de vorming van stikstofgas via weefseloppervlak, als een isolator en het remmen van de koeling van het weefself "> 13. Een dergelijke dampdeken alleen vormen wanneer de samenvoeging van bellen zo snel dat het stikstofgas het weefsel van de vloeibare stikstof kan scheiden. Volgens beldynamica, zal een snellere vloeistofstroom leiden tot kleinere bellen, zoals heeft minder kans samenvoegen 14. Daarom hebben we geponste gaten 14 in de wand van de cryovial om de snelheid van de vloeistofstroming rond het weefsel vergroten en om te voorkomen dat de "dampdeken" effect wanneer vloeibare stikstof contact maakt met het weefsel.

Aangezien de ene factor die experimentele succes bepaalt de snelheid van de vloeistofstroming rond het weefsel, drie parameters van de cryovial groot belang, zoals de positie en het aantal openingen, de diameter van de inlaat gaten en de afstand tussen de opening en het voorbeeld. Vloeistofdynamica blijkt dat de stroomsnelheid door een opening wordt bepaald door de diameter van de gaten en die een hercirculerende stroming ontstaat onmiddellijk benedenstroom van de opening (figuur 5) 15 16. Dienovereenkomstig de afstand tussen de opening en het monster bepaalt grotendeels het contactoppervlak tussen de snelle fluïdumstroming en het monster, zie figuur 5. Bijgevolg het aantal gaatjes cryovial in figuur 1A is geschikt voor spiermonster die 0,6 cm breed x 0,6 cm x 1,5 cm lang. Voor grotere spierfragmenten is de moeite waard om deze werkwijze met een grotere buis en gaten. Echter, dit protocol is niet geschikt voor het invriezen van monsters van kleine dieren, zoals in een muizenmodel omdat de inlaatgaten te groot voor kleinere monsters kunnen zijn.

Bovendien moet drie cruciale stappen strikt worden gevolgd protocol. Ten eerste moet de vloeibare stikstof voldoende om de gehele cryovial dompelen, en de cryogene flacon moeten volledig onder het vloeistofniveau zijn. Ten tweede, is het noodzakelijk om eenleegte toevallig contact tussen bevroren spieren en kamertemperatuur containers of instrumenten. Bijvoorbeeld, zonder zorgvuldige transport, nieuwe ijskristallen kunnen vormen bij overdracht van een ingevroren monster van de stikstof opslagtank vloeibare of -80 ° C vriezer een cryostaat. Ten derde, er moet niet teveel oktober gebruikt wanneer de monsters op de houder worden aangebracht vanwege de hoge kans op ijs kristalvorming rondom het contactgebied tussen ingevroren spieren en oktober

In de vleesindustrie, een spier cryosectie procedure is noodzakelijk omdat de werkwijze formaline fixatie en inbedding in paraffine krimp veroorzaakt in spiervezels, die de evaluatie van wat spieren eigenschappen, zoals TNF en CSAF schaadt. Bovendien is ingevroren spier vereist bij de beoordeling FTC met de myosine ATPase assay. Zoals getoond in figuur 3E, kan dit protocol voldoen aan de eisen van zowel pathologische analyse en histochemische vlekken in de spieren. De voorbereidingvan een cryosection is een routine-operatie in de klinische spier pathologie laboratoria. Zoals beschreven door Meng et al. 8, een standaard procedure voor het bevriezen van spierweefsel is autopsiemonsters dompelen in vooraf gekoelde isopentaan. Echter, isopentaan niet beschikbaar is voor autopsie monsters bij instellingen te bevriezen zonder klinische spier pathologie laboratoria. Bijgevolg worden diagnostische spierbiopten vaak suboptimaal verwerkt op vele medische voorzieningen. Zo zou ons protocol aanzienlijk verbeteren van de mogelijkheid voor kleine ziekenhuizen of laboratoria om diagnostische spierbiopten van voldoende kwaliteit uit te voeren. Gezien de hoge efficiëntie en eenvoudige werking van dit protocol, kan het een veelbelovend alternatief voor de huidige isopentaan invriezen gebaseerde methode en kan wijd op histologisch onderzoek in de toekomst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten, financieel of anderszins, worden verklaard door de auteurs.

Acknowledgments

Dit project werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC): 31.301.950 en 31.671.288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95, (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84, (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2, (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38, (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57, (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69, (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8, (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12, (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53, (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71, (9), 300-309 (2012).

Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics