Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend

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Biology

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigen Stickstoff tauchen. Dieses Protokoll zeigt auch eine neue Cryovial, die den „Decke-Effekt“ von Stickstoffgas, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit der Gewebeoberfläche einer Probe zu vermeiden.

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Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

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Abstract

Studien über die Skelettmuskelphysiologie stehen vor der technischen Herausforderung, in geeigneter Weise die Proben Verarbeitungsabschnitte mit deutlich sichtbaren cytoplasmatischen Kompartimenten zu erhalten. Eine weitere Hürde ist die enge Apposition von Muskelfasern zu den umliegenden Geweben. Da der Prozess der Gewebefixierung und Paraffineinbettung der Schrumpfung von Muskelfasern führt, Gefrieren ist ein optimales Mittel zum Härten Muskelgewebe zur Sektionierung. Allerdings ist ein häufig auftretendes Problem, die Bildung von Eiskristallen, tritt während der Herstellung von Gefrierschnitten aufgrund des hohen Wassergehalt des Muskels. Das Protokoll hier vorgestellte erste beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Muskelgewebe richtig Einfrieren, indem sie in flüssigem Stickstoff eingetaucht wird. Das Problem bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff allein ist, dass es die Bildung einer Stickstoffgasbarriere bewirkt neben das Gewebe, das als Isolator wirkt und hemmt die Kühlung der Gewebe. Um dies zu vermeiden „Dampfdecke“ -Effekt, ein new Kryoröhrchen wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung um die Gewebeoberfläche zu erhöhen. Dies wurde durch Stanzen eines insgesamt 14 Einlassöffnungen in der Wand des Fläschchens erreicht. Nach Blasendynamik, eine höhere Rate des Flüssigkeitsstrom führt zu kleineren Blasen und weniger Chancen eine Gasbarriere zu bilden. Wenn flüssiger Stickstoff die Kryoröhrchen durch die Einlasslöcher strömt, ist die Strömungsgeschwindigkeit um das Gewebe schnell genug, um die Gasbarriere zu beseitigen. Im Vergleich zu dem Verfahren von Muskelgewebe Einfrieren unter Verwendung von vorgekühltes Isopentan, ist dieses Protokoll einfacher und effizienter und kann verwendet werden, Muskel in einem Durchsatz Weise einzufrieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren optimal für Institutionen, die keinen Zugang zu Isopentan haben, die bei Raumtemperatur extrem leicht entflammbar ist.

Introduction

Der Skelettmuskel ist das wertvollste Komponente eines fleischproduzierenden Tieres aus der Ernährungs- und verarbeitungstechnischer Sicht. In der Fleischindustrie gibt es zwei besonders kritische Aspekte: die Effizienz des Muskelwachstums und der Qualität des resultierenden Fleisch. Als Hauptbestandteil des Muskels, sind Muskelfasern zu Wachstum und frische Fleischqualität 1 bei Tieren direkt in Zusammenhang steht. Zum Beispiel ist die Gesamtanzahl von Fasern (TNF) und die Querschnittsfläche der Fasern (CSAF) meist Muskelmasse und Fleischqualität bestimmen; auch, Fasertyp Zusammensetzung (FTC) wirkt sich stark auf frische Fleischqualität 2. Daher ist die Manipulation von Muskelfasereigenschaften bei Tieren eine sehr wirksame Methode 1 den Kern der Rentabilität und die Wettbewerbsfähigkeit der Betriebe zu erhöhen.

Bis heute wurden mehrere intrinsische und extrinsische Faktoren identifiziert worden, Muskelfaser characterist zu manipulierenics 1. Diese Manipulation kann durch die gezielte Auswahl von Tieren mit spezifischen Genen, wie die Myostatin - Gene in cattle 3, das Callipyge Gen in sheep 4 und die RYR1 und IGF2 Gene in pigs 5 erreicht werden. Auch Ernährung Kontrolle und Behandlungen mit spezifischen Hormone spielen eine wichtige Rolle bei der Muskelfasereigenschaften 6. So ein Ansatz, die genetischen und Ernährungsfaktoren kombiniert könnte Muskelfleischanteil und Fleischqualität verbessern kann. Allerdings Studien über Muskelfasern sind in der Fleischindustrie, weil die Aufklärung der Struktur von Muskelfasern begrenzt noch eine Herausforderung.

Muskelfasereigenschaften werden unter Verwendung histochemischer Methoden, wie beispielsweise die Myosin Adenosintriphosphatase (ATPase) -Assay identifiziert. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass die in dünnen (6-8 um) gefroren Abschnitte angeordnet EnzymeMuskelfasern chemisch reagiert mit bestimmten Produkten werden kann. Jedoch ist der Wassergehalt der Muskeln mehr als 75% bei Schweinen, Kaninchen, Mäusen und Menschen, unabhängig von der Position ( das heißt, Rücken, Bauch oder hinteren Gliedmaßen) 7. Solche hohen Feuchtigkeitsgehalt in Muskeln verursacht eine häufig auftretende Problem - Einfrieren Artefakte - bei der Herstellung von Gefrierschnitten, wie zuvor beschrieben , 8, 9. In den meisten Fällen ist es fast unmöglich, in geeigneter Weise zu Muskelgewebe in einem Schlachthof Produktionslinie, nach unserer Erfahrung einzufrieren.

Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt ein einfaches und effizientes Verfahren in unserem Labor verwendete Muskelgewebe einzufrieren für in einer Hochdurchsatz-Art und Weise Kryoschneiden. Der Höhepunkt dieses Verfahrens ist ein neues, die für Flash-Kryoröhrchen Frieren Muskelgewebe in flüssigem Stickstoff ausgelegt ist. Der aktuelle Workflow kann gleichzeitig Gewebe erleichternEinfrieren und die Verarbeitung für einen ausgezeichneten Muskel Kryoschnitt, mit einem deutlich sichtbar cytoplasmatischen Kompartiment und der engen Apposition von Muskelfasern an das umgebenden Gewebe. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf eine breite Palette von Möglichkeiten für Gewebeanalyse angewendet werden, da flüssiger Stickstoff mit Gewebe nicht mischen.

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Protocol

Die aktuelle Methode wurde entwickelt und validiert zu ernten und lagert mehr als 1.000 Muskelproben zur histologischen Färbung in unserem Labor. Alle Verfahren beteiligen Tierpflege und Verwendung folgten die vom Ministerium für Landwirtschaft von China festgelegten Richtlinien.

1. Ausrüstung für die Probenentnahme

  1. Beschriften Sie die Probe Identität auf jeder kryogenen Fläschchen.
    Hinweis: Die Kryo - Fläschchen speziell frische Gewebeproben für das Kryoschnittes Verfahren (Abbildung 1A) einzufrieren ausgelegt ist. Die Fläschchen werden aus Polypropylen in einer Form Fabrik (1C) gebildet.
  2. Erhalten, die folgende Ausrüstung: flüssigen Stickstoff in einem geeigneten Flüssigstickstofftank, eine Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz, Gefriertruhe Handschuhe, 10 cm Zange 25 cm Pinzette, eine Styropor-Kühler (innere Abmessungen: 20 cm lang x 12 cm breit x 13,5 cm hoch Außenabmessungen;: 24 cm lang x 16 cm breit x 15 cm hoch), Kunststofffolien (2,5 cm lang x 0,8 cm breit x 0,1 mm dick),ein Skalpell, und A4 PVC Bindungsabdeckungen (21 cm x 29,5 cm) (1B).

2. Herstellung von Muskelproben

  1. Füllen Sie das Styropor-Kühler mit flüssigen Stickstoff 5 min vor der Probenentnahme.
    HINWEIS: Die große Säule von flüssigem Stickstoff ist wichtig, weil ein Teil des flüssigen Stickstoffs verkocht und verwandelt sich in Gas, wenn frische Proben berühren. Um die Häufigkeit der Übertragung von flüssigem Stickstoff zu reduzieren, um den Verlust, ein entsprechend dimensioniertes Styropor-Kühler aufzufüllen muss entsprechend der Anzahl von Abtastwerten im Voraus erfasst werden.
  2. Sobald eine Probe erhalten wird, ist es leicht Platz auf einem Stück PVC-Bindungs ​​A4 Abdeckung und die Richtung der Muskelfasern beobachten.
    HINWEIS: Hier haben wir den Querschnitt des longissimus doris Muskel von der ersten bis zur letzten Lendenwirbel bei Schweinen. Die Proben sind etwa 12 cm lang, 8 cm breit und 5 cm hoch.
  3. Verwenden eines Skalpells zwei parallele Schnitte durch die Probe i zu machenn die Richtung der Muskelfasern, etwa 3 cm lang und 0,6 cm auseinander liegen. Schneiden Sie den eingeschnittene Muskel in ein Rechteck ungefähr 0,6 cm breit x 0,6 cm x 1,5 cm lang.
    HINWEIS: Die Zuverlässigkeit der Messung der Querschnittsfläche der Muskelfasern hängt vor allem von der Faserorientierung des eingeschnittenen Muskel.
  4. 10 cm verwenden Pinzette vorsichtig auf die Probe stellen auf einem Stück Kunststofffolie, die mit der Längsachse des eingeschnittenen Muskel parallel zur langen Kante des Films (2A).
    HINWEIS: Der Kunststofffilm hat zwei Funktionen: eine Haltefunktion, die bei der Festlegung der Ausrichtung der Muskelfasern und eine Haftfunktion hilft, dass Risse in der Probe aufgrund des schnellen Einfrierens verhindert.
  5. Mit einer Pinzette, legt das Muskelgewebe in die untere Mitte eines Kryoröhrchen gekennzeichnet, genau zwischen den Einlasslöchern und dann fest verschließen die Phiole (2B).

3. Einfrieren und Speichern von Muskelprobes

  1. Unter Verwendung von 25 cm Pinzette, unterzutauchen schnell das gesamte Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff in dem vorgekühlten Styroporkühler, zu warten, bis der flüssige Stickstoff nicht siedet (ungefähr 10-20 s).
    HINWEIS: Die Cryovial schwimmt, wenn der flüssige Stickstoff kocht, so sorgfältig das Fläschchen in dem siedenden Flüssigkeit Stickstoff taucht für 10-20 s.
  2. Übertragen der Muskelproben zu einer Flüssigstickstofflagertank oder ein -80 ° C-Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.

4. Schieben Vorbereitung

  1. Vorkühlen eines Kryostaten auf zwischen -20 ° C und -22 ° C.
  2. Entfernen und entsorgen Sie die alte Mikrotom-Klinge, wischen Sie den Messerhalter und Treckerplatte im Kryostaten, ein neues Mikrotomklinge im Kryostaten installieren, und stellen Sie die Schnittstärke bis 8 um.
  3. Übertragen der Muskelprobe in der Kryoröhrchen aus dem Flüssigstickstofflagertank oder -80 ° C Gefrierschrank zu dem Kryostaten, es in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis transportiert. Warte 30 min für die Probe mit der Temperatur des Kryostaten äquilibrieren.
    HINWEIS: Alle Geräte, die die Probe berühren könnten, muß vorgekühlt werden, da eine hohe Temperatur könnte die Bildung von Eiskristallen in der Probe führen.
  4. Montieren der Probe in der Probenhalter unter der optimale Schnitttemperatur Formulierung von wasserlöslichen Glykolen und Harze (OCT). Geschnitten 8-um-Schnitte.
    HINWEIS: Einstellen der Schnittwinkel senkrecht zur Ausrichtung der Muskelfasern, weil die CSAF die Querschnittsfläche der Muskelfasern ist.
  5. Montieren Sie die Abschnitte in Richtung der Mitte einer Raumtemperatur Mikrodia. unmittelbar die Folie in eine Folie Box in einem -80 ° C-Gefrierschrank. Halten Sie das Dia bei RT trocknen.

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Representative Results

Die Kryoröhrchen Illustration und die gemeinsamen für Laborgeräte Muskeln während der Herstellung von Gefrierschnitten Einfrieren sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Kryoröhrchen sind aus Polypropylen in einer Form Fabrik. Jedes Fläschchen hat insgesamt 14 Einlasslöcher: Ein an der Kappe ist; eine andere ist an der Unterseite; und die verbleibenden 12 bilden vier parallele Leitungen, die jeweils mit vier Bohrungen um 90 ° zueinander. Diese Einlasslöcher können die Strömungsgeschwindigkeit des flüssigen Stickstoffs neben das Gewebe beschleunigen, um das „Dampfdecke“ -Effekt, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit dem Gewebe zu vermeiden. Folglich sehr wenige Eiskristalle in den gefrorenen Proben bilden. Wichtig ist, Isopentan, das äußerst flüchtige und entflammbare Flüssigkeit mit einem Siedepunkt bei 28 ° C, ist in diesem Verfahren nicht notwendig.

Um den Vorteil dieses Verfahrens hervorzuheben, fror wir den longissimus dorsibei Schweinen mit fünf Gefrierverfahren und beobachtet dann ihre Färbeeigenschaften und histologische Angaben Hematoxylin / Eosin (HE) Färbung (Abbildung 3) verwendet wird . Ein häufig auftretendes Problem war die Bildung von Eiskristallen während der Vorbereitung der Muskeln für Kryoschnittes. Wenn die Probe direkt in einem -80 ° C - Gefrierschrank (3A) platziert wurde, große Eiskristalle gebildet und verursacht dann eine bekannte „Schweizer Käse“ -Effekt in den Muskel Kryoschnitt. Weiterhin Eiskristalle auch gebildet , wenn das Muskelgewebe direkt in flüssigem Stickstoff (3B) eingetaucht wurde. Obwohl flüssiger Stickstoff eine sehr kalte Flüssigkeit (-190 ° C), ist seine Wärme konstant extrem niedrig. Wenn irgendwelche Proben in Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff, kann eine Dampfdecke neben dem Gewebe aufzubauen und das Eindringen von Kälte in das Gewebe zu isolieren. Darüber hinaus ist ein Routineverfahren für das Einfrieren von Proben in Pathologie-Laboratorien noch nicht für Muskelgewebe. EINs in 3C, viele nadelartige Eiskristalle gebildet im cytoplasmatischen Kompartiment von Muskelfasern , nachdem das Muskelgewebe in Oktober Eindeckmediums in der richtigen Orientierung eingefroren und dann schnell in einer Aufschlämmung von Isopentan (-160 ° C) eingetaucht wurde , gezeigt. Abschließend muss die entsprechende Gefrierrate für Muskelgewebe streng im Betrieb erfüllt werden.

Das aktuelle Protokoll erzielt ausgezeichnete Probenintegrität, mit einem deutlich sichtbar cytoplasmatischen Kompartiment und der engen Apposition von Muskelfasern des umgebenden Gewebe (Abbildung 3D). Es ermöglicht eine hervorragende Visualisierung der metabolischen Eigenschaften der Muskelfasern der Myosin - ATPase - Assay (Figur 3E) verwendet wird . Für diesen Test wurde Myosin-ATPase-Aktivität beruht auf der Tatsache analysiert, dass schnell kontrahier Muskelfasern (Mammalian Typ 2A und 2B) hydrolysieren ATP schneller als langsam kontrahier Fasern (Mammalian Typ 1). Wenn gegeben EQUIVAliehen Zeiten, erscheinen schnell kontrahier Faser Licht, mit zwei Grad, und langsam kontrahier Faser schwarz erscheinen. Wichtig ist , kann dieses Verfahren effizient in einer Hochdurchsatz - Umgebung verwendet werden , weil es leicht durchzuführen ist und spart Zeit (Abbildung 4). Heutzutage ist ein gut etabliertes Verfahren Einfrieren Muskelgewebe in einer Aufschlämmung von Isopentan kontaktlos OCT Eindeckmediums unterzutauchen, wie zuvor beschrieben , 8, 9 (Figur 3F). In diesem Verfahren dauert es ca. 30 min für einen Fest-Flüssig - Aufschlämmung Zustand 240 ml Isopentan durch Vorkühlen den Isopentan in flüssigem Stickstoff und Rühren , bis kleine weißen Niederschläge am Boden (Figur 4) erscheinen erreicht werden. Es gibt drei praktische Schwierigkeiten von den Forschern auf beim Versuch, Muskelgewebe in vorgekühltem Isopentan einzufrieren: (1) ein Fest-Flüssig-Aufschlämmung Zustand isopantane ist schwierig aufrecht zu erhalten, wenn dieZeit Abtasten mehr als 1 h. In unseren bisherigen Versuchen trat Einfrieren Artefakte in der Regel in den Proben, die bei den mittleren und späten Stadien des Prozesses gemacht wurden, wenn Dutzende von Muskelgewebe einmal gesammelt wurden. (2) Als gefährliche Flüssigkeit wird isopantane nicht überall auf dem öffentlichen Verkehr erlaubt. (3) ist Isopentan nicht verfügbar, außer in Laboratorien. Viele Fleisch Wissenschaft Forscher in der Regel Muskelgewebe in einem Schlachthof einzufrieren, die weit entfernt von einem Labor ist und dass ist nicht erlaubt Isopentan zu haben. Darüber hinaus sind diagnostische Muskelbiopsien oft suboptimal aufgrund des Fehlens von Isopentan in medizinischen Einrichtungen verarbeitet. Somit ist unser Protokoll eine wichtige Entwicklung für das Einfrieren von Muskelproben in Situationen, in denen Isopentan nicht verfügbar ist.

Abbildung 1
Abbildung 1: Die Vorrichtung zur Muskel - Freezing. (A) Die Abbildungendie Cryovial in dieser Studie verwendet. 14 Einlassöffnungen in der Rohrwand gestanzt: ein auf der Kappe ist; eine andere ist an der Unterseite; und die verbleibenden 12 bilden vier parallele Leitungen, die jeweils mit vier Bohrungen um 90 ° zueinander. (B) eine Photographie der Gefriervorrichtung. Ein sicheres und effizientes Mittel der Muskeln in flüssigem Stickstoff beinhaltet die Verwendung eines Kryoröhrchen, Kunststofffolie, Schutzbrille, Gefriertruhe Handschuhe, 10 cm Zange, Pinzette 25 cm, ein Styropor-Kühler, ein Skalpell und A4 PVC Bindung Abdeckung einfriert. (C) Die Abbildungen der Kryoröhrchen Form von einem Ingenieur bereitgestellt, Yonghua Wang, in der Form Fabrik. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Herstellung von Muskelproben. (A (B) sollte das Muskelgewebe zwischen den Einlasslöchern in dem kryogenen Phiole platziert werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Repräsentative Bilder der histologischen Beurteilung von Pig longissimus dorsi , nachdem sie gefroren sind fünf verschiedene Methoden verwenden.
Eiskristalle zerstört die Lesbarkeit von Muskel Cryoschnitten abgebildet mit HE - Färbung , wenn die Muskeln sind für die histologische Analyse eingefroren unangemessene Methoden, wie in (AC) gezeigt. Beträchtliche Einfrieren Artefakte auftraten , wenn Muskelproben direkt in einem 80 ° C - Gefrierschrank (A) gesetzt wurden oder in Flüssigkeit eingetauchtStickstoff (B). Viele nadelartige Eiskristalle innerhalb einzelner Muskelzellen gebildet , nachdem das Muskelgewebe in Oktober getaucht wurde und dann in eine Aufschlämmung von Isopentan direkt gestellt (C). Das Protokoll , das in dieser Studie präsentierte die Bildung von Eiskristallen beseitigen , wenn das Muskelgewebe einfach in flüssigem Stickstoff (D) eingetaucht ist. Dieses Protokoll ist auf die Analyse der Enzymaktivität in gefrorenem Muskel basierend auf der Myosin - ATPase - Assay (E) anwendbar. Die Standard-Gefriermethode für Muskel nicht mehr leisten; Muskelgewebe wird in einer Aufschlämmung von Isopentan ohne direkten Kontakt OCT Befestigungsmedium (F) eingetaucht. Alle Bilder sind unter einem 10X-Objektiv, mit Ausnahme derjenigen mit schwarzen Rändern (20X). Maßstabsbalken: 100 & mgr; m. Die Pfeilspitze in Figur 3C zeigt kleine, nadelartige Eiskristalle. Die Pfeilspitze und Text in Figur 3E zeigen die Art von Muskelfasern: Typ 1, die langsamen Myosin schweren Kette-Fasern darstellt, typ 2A bedeutet Zwischen Myosin schweren Kette-Fasern und Typ 2B schnellen Myosin schweren Kette-Fasern zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Vergleich von Workflows für Flüssigstickstoffbasis und Isopentan basierenden Gefrierverfahren. In dem flüssigen Stickstoff-basiertes Protokoll ist das Muskelgewebe in dem neuen Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff eingetaucht. In dem Isopentan-basierten Protokoll, ein Aufschlämmungszustand Isopentan muss durch Vorkühlung des Isopentan in flüssigem Stickstoff und Rühren, bis kleine, weiße Präzipitate werden unten im Voraus erreicht werden. Dann wird das Muskelgewebe in die vorgekühlten Isopentan getaucht. Im Vergleich zu 35 min in dem Isopentan basierendes Verfahren, wie in Abbildung 3F beschrieben ist, dauert es nur 5 min t o rundet das Einfrieren Verfahren in diesem Protokoll vorgestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Flüssiger Stickstoff - Flow durch eine scharfkantige Orifice. Beim Eintauchen des gesamte Mehrloch-Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff, atmosphärische Druckkräfte von flüssigem Stickstoff in das Rohr 14 durch die Einlasslöcher. Das Vorhandensein der Löcher macht die Strömung durch sie beschleunigt, wodurch die Geschwindigkeit erhöht wird. Ein Umlaufstrom (in blau) entwickelt sich sofort stromabwärts der Öffnung (in orange). D1 gibt den Durchmesser der Öffnung an der Wand des Rohres und D2 stellt den Abstand zwischen der Öffnung und der Muskelprobe (in rot).= „_ Blank“> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Hier beschreiben wir ein neues, Mehrloch Kryoröhrchen zum Einfrieren und Speicher von Muskelgewebe zu histologischer Beurteilung der Muskelfunktion führen. Der kritische Schritt in diesem modifizierten Protokoll ist, dass die Probe in den Mehrloch-Kryoröhrchen direkt in flüssigem Stickstoff eingetaucht ist. Unser Wissen ist dies die einfachste und rapidest Art und Weise ausgezeichnete gefrorene Proben für Muskel Kryoschneiden unter den bestehenden Gefrierverfahren zu erhalten (siehe die repräsentativen Ergebnisse).

Die technische Herausforderung durch Muskel Forscher konfrontiert ist, dass Eiskristalle am ehesten zu bilden ist, wenn sie als Mittel mit Einfrieren Muskelgewebe zu härten für das Schneiden. Wie in den repräsentativen Ergebnissen angegeben, spielen drei Faktoren eine bedeutende Rolle in der richtigen Muskel Einfrieren für pathologische Untersuchungen bestimmen, einschließlich eines geeigneten Kältequelle der Wahl, um die Feuchtigkeit der Probe minimiert wird, und mit der Kältequelle den Prozentsatz der gesamten Oberfläche in Kontakt zu erhöhen. Zuerst,die Geschwindigkeit des Einfrierens kritische Schaden bei der Herstellung des gefrorenen Gewebes zu vermeiden für das Schneiden. Wenn das Einfrieren langsam ist, zeigen gefrorenen Muskeln die bekannte „Schweizer Käse“ -Effekt, weil große Eiskristalle extrazellulär gebildet werden. Wenn das Einfrieren schnell ist, aber nicht ausreichend schnell, eine große Anzahl von kleinen, nadelartige Eiskristalle innerhalb der einzelnen Muskelzellen gebildet. Diese nadelförmigen Eiskristallen wenig nachweisbaren strukturellen Schäden verursachen, aber sie bringen die folgenden Effekte: Mitochondrien 10 beschädigt sind, die Größe der Muskelfasern erhöht künstlich 11 und die Integrität der Faserstrukturen 11 zerstört. Somit wird eine Kältequelle bei einer ausreichend kalten Temperatur und eine ausreichende Gefriergeschwindigkeit ist unerlässlich, um die Bildung von Eiskristallen in Muskel Cryoschnitten zu vermeiden.

Idealerweise ist die Kältequelle bei extrem kalten Temperaturen und t angeordneto kontaktieren alle Oberflächen. Sowohl flüssiger Stickstoff (-190 ° C) und Isopentan in einem Fest-Flüssig-Mischzustand (-160 ° C), um diese Bedingung erfüllen. Allerdings haben die beiden Einfrieren Medien ihre eigenen Nachteile. Flüssiger Stickstoff hat eine extrem niedrige spezifische Wärme konstant. Das Ergebnis ist , dass der Kontakt zwischen flüssigem Stickstoff und dem Gewebe einer Dampfsperre bewirkt, der neben das Gewebe aufbaut und stark verlangsamt das Eindringen von Kälte in das Gewebe 12. Somit treten signifikante Einfrieren Artefakte innerhalb des gefrorenen Muskel. Aufschlämmungszustand Isopentan ist ein ideales Einfriermedium, das nicht Dampfsperren bildet, aber das Hauptproblem ist, dass Isopentan in Verbindung mit flüssigem Stickstoff verwendet werden, um eine Flüssigkeit muss Badtemperatur von 160 ° C zu erreichen. Darüber hinaus ist eine extrem Isopentan flüchtige und brennbare Flüssigkeit bei Raumtemperatur. Zweitens enthält der Muskel überschüssiges Wasser (> 75%), so dass jede Art und Weise exogene Feuchtigkeit in die Probe einzuführen, verursachen würde Artefakte Einfrieren. Beispielsweise fügt Oktober Eindeckmediums extra Wasser auf den Muskel, so Eiskristalle viel mehr im Vordergrund in diesem Muskel Cryoschnitten im Vergleich zu denen ohne Oktober Eindeckmediums ist. Schließlich ist der Dicke des Muskelgewebes auch wichtig, in geeigneter Weise um es zu gefrieren, da die Geschwindigkeit des Einfrierens zum Teil auf dem Prozentsatz der Gesamtoberfläche hängt in Kontakt mit der Kältequelle (in der Regel ist die Dicke <0,5 cm). Dementsprechend ist der einzige Weg , um richtig in das Gewebe einzuzufrieren Muskelgewebes mit einer Dicke von weniger als 0,5 cm in vorgekühltem Isopentan (160 ° C), zu versenken , wie zuvor 8 beschrieben.

Dieses Protokoll beschreibt zuerst, wie man richtig Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigem Stickstoff eingetaucht wird. Das Problem bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff allein ist die Bildung von Stickstoffgas über die Gewebeoberfläche, als Isolator wirkt, und die Hemmung die Abkühlung des Gewebesf "> 13. Ein solcher Dampfdecke kann nur bilden , wenn die Zusammenführung von Blasen so schnell ist , dass das Stickstoffgas in das Gewebe aus dem flüssigen Stickstoff trennen kann. Nach Blasendynamik, eine schnellere Flüssigkeitsstrom wird in kleinere Blasen, da sie zur Folge haben weniger Chancen auf 14 übergehen. Daher wir gestanzten Löcher 14 in die Wand des Kryoröhrchen um das Gewebe um die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung zu erhöhen und um das „Dampfdecke“ -Effekt , wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit dem Gewebe zu vermeiden.

Bedenkt man, dass die ein Faktor, der experimentellen Erfolg bestimmt, ist die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung um das Gewebe, drei Parameter der Kryoröhrchen sind sehr wichtig, einschließlich der Position und der Anzahl der Löcher, der Durchmesser der Einlassöffnungen und der Abstand zwischen der Öffnung und die Probe. Flüssigkeitsdynamik zeigt, dass die Durchflussrate durch eine Öffnung durch den Durchmesser der Löcher bestimmt wird, und daß eine Umlaufströmung entwickelt sich sofort nach untenStrom von der Öffnung (5) , 15, 16. Entsprechend bestimmt der Abstand zwischen der Öffnung und der Probe hauptsächlich die Kontaktfläche zwischen dem Hochgeschwindigkeits - Fluidstrom und der Probe, wie in Abbildung 5 gezeigt. Folglich sind die Mehrloch - Kryoröhrchen in 1A geeignet für eine Muskelprobe , die 0,6 cm breit x 0,6 cm x 1,5 cm lang ist. Für größere Muskelfragmente, ist es wert, diese Methode mit einem größeren Rohr und mehr Löchern versuchen. Jedoch ist dieses Protokoll für das Einfrieren von Muskelproben von Kleintieren nicht geeignet, wie in einem Mausmodell, weil die Einlasslöcher sein könnten für kleinere Proben groß.

Darüber hinaus müssen drei wichtige Schritte strikt in dem Protokoll folgen. Zunächst sollte der flüssige Stickstoff ausreichend sein, um die ganze Cryovial einzutauchen, und das kryogene Fläschchen vollständig unterhalb des Flüssigkeitsspiegels liegen. Zweitens ist es notwendig, eineLeerer versehentlicher Kontakt zwischen gefrorenen Muskeln und bei Raumtemperatur Behältern oder Instrumenten. Zum Beispiel, ohne sorgfältigen Transport, neue Eiskristalle bilden könnten, wenn eine gefrorene Probe aus dem Flüssigstickstoffspeicherbehälter oder -80 ° C Gefrierschrank zu einem Kryostaten übertragen. Drittens sollte es nicht zu viel Oktober verwendet, wenn die Proben auf dem Halter montiert sind, aufgrund der hohen Wahrscheinlichkeit einer Bildung von Eiskristallen um die Kontaktfläche zwischen gefrorenen Muskeln und Oktober

In der Fleischindustrie, ist ein Muskel Kryoschnitt Verfahren unverzichtbar, weil der Prozess der Formalin-Fixierung und Paraffineinbettung Schrumpfung in Muskelfasern verursacht, die die Bewertung einiger Muskelzüge, wie TNF und CSAF beeinträchtigt. Darüber hinaus ist gefrorener Muskel erforderlich, wenn FTC mit dem Myosin-ATPase-Test auswertet. Wie in 3E gezeigt, kann dieses Protokoll , um die Anforderungen sowohl pathologischen Analyse und histochemische Flecken in Muskeln erfüllen. Die Vorbereitungein Kryoschnittes ist eine Routineoperation in Laboratorien Pathologie klinischer Muskels. Wie von Meng et al. 8 ist ein Standardverfahren für das Einfrieren Muskelgewebe ist Autopsieproben in vorgekühltem Isopentan einzutauchen. Allerdings ist Isopentan Autopsieproben an Institutionen ohne klinische Muskel Pathologie-Laboratorien einzufrieren nicht verfügbar. Folglich werden oft diagnostische Muskelbiopsien bei vielen medizinischen Einrichtungen suboptimal verarbeitet. So könnte unser Protokoll im Wesentlichen die Fähigkeit, für kleine Krankenhäuser oder Labore verbessern, um diagnostische Muskelbiopsien von ausreichender Qualität durchzuführen. In Anbetracht der hohen Effizienz und einfache Bedienung dieses Protokolls, könnte es eine vielversprechende Alternative zu den aktuellen Isopentan basierenden Gefriermethode sein und histologische Untersuchungen in der Zukunft weit angewendet werden kann.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte, finanzielle oder sonstige, werden von den Autoren erklärt.

Acknowledgments

31301950 und 31671288: Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

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Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

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