En Multi-hål cryovial Eliminerar Frysning Artefakter när Muscle Vävnader Direkt Nedsänkt i flytande kväve

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll beskriver ett förfarande för att frysa muskelvävnad genom att störta dem direkt i flytande kväve. Detta protokoll belyser också en ny cryovial som kan undvika "filt-effekten" av kvävgas när flytande kväve i kontakt med vävnadsytan av ett prov.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studier av skelettmuskelfysiologi möta den tekniska utmaningen att på lämpligt sätt bearbeta prover för att erhålla sektioner med tydliga cytoplasmiska fack. Ett annat hinder är den snäva apposition av myofibrer till de omgivande vävnaderna. Därför att processen med vävnadsfixering och paraffininbäddning leder till krympning av muskelfibrer, är frysning en optimal medel för härdning muskelvävnad för snittning. Men en vanligt förekommande problem, bildandet av iskristaller sker under beredningen av frysta snitt på grund av den höga vattenhalten i muskeln. Protokollet presenteras här först beskriver en enkel och effektiv metod för att korrekt frysning muskelvävnad genom nedsänkning dem i flytande kväve. Problemet med att använda flytande kväve ensamt är att den ger upphov till bildning av en kväve gasbarriär intill vävnaden, som fungerar som en isolator och hämmar kylningen av vävnaderna. För att undvika detta "ånga filt" -effekt, en new cryovial var utformad för att öka hastigheten på vätskeflödet runt vävnadsytan. Detta uppnåddes genom att stansa totalt 14 inloppshål i väggen av flaskan. Enligt bubbla dynamik, till en högre frekvens av vätskeflödesresulterar i mindre bubblor och färre chanser bilda en gasbarriär. När flytande kväve strömmar in i köldkärlet genom inloppshålen, är flödeshastigheten runt vävnaden tillräckligt snabbt för att eliminera gasbarriär. Jämfört med metoden för frysning muskelvävnad med användning pre-kyld isopentan, är detta protokoll enklare och mer effektiv och kan användas för att frysa muskel i en genomströmning sätt. Dessutom är denna metod optimalt för institutioner som inte har tillgång till isopentan, som är extremt brandfarlig vid rumstemperatur.

Introduction

Skelettmuskel är den mest värdefulla komponenten av en köttproducerande djuret från den näringsmässiga och bearbetningssynpunkt. I köttindustrin, finns det två särskilt kritiska aspekter: effektiviteten i muskeltillväxt och kvaliteten på den resulterande köttet. Som en huvudkomponent av muskeln, muskelfibrer är direkt relaterad till tillväxten och färskt köttkvalitet i djur 1. Till exempel, det totala antalet fibrer (TNF) och korset sektionsarean hos fibrer (CSAF) mestadels bestämma muskelmassa och köttkvalitet; också, Fibertyp Komposition (FTC) påverkar starkt färskt kött kvalitet 2. Därför är manipulation av muskelfiberegenskaper hos djur en mycket effektiv metod för att öka kärnan lönsamhet och konkurrenskraft av gårdar 1.

Hittills har flera inre och yttre faktorer som har identifierats för att manipulera muskelfibrer characteristics 1. Denna manipulation kan uppnås genom den riktade urvalet av djur med specifika gener, såsom den Myostatin genen hos nötkreatur 3, den Callipyge genen hos får 4, och RYR1 och IGF2-generna hos svin 5. Även kost kontroll och behandlingar med specifika hormoner spelar en viktig roll i muskelfiberegenskaper 6. Således kan en strategi som kombinerar genetiska och näringsfaktorer kunna förbättra magert kött innehåll och köttkvalitet. Men studier av muskelfibrer begränsad inom köttindustrin eftersom klarlägga struktur av muskelfibrer är fortfarande en utmaning.

Muskelfiberegenskaper identifieras med användning histokemiska metoder, såsom myosin adenosintrifosfatas (ATPas) -analys. Denna metod förlitar sig på det faktum att enzymer lokaliserade i tunna (6-8 pm) frysta sektioner avmuskelfibrer kan kemiskt reagera med vissa produkter. Emellertid är vattenhalten i musklerna större än 75% hos grisar, kaniner, möss och människor, oberoende av positionen (dvs rygg, buk, eller bakdelen) 7. Sådan hög fukthalt i muskler orsakar ett vanligt förekommande problem - frysning artefakter - under framställningen av kryosektioner, som tidigare beskrivits 8, 9. I de flesta fall är det nästan omöjligt att på lämpligt sätt frysa muskler i ett slakteri produktionslinje, enligt vår erfarenhet.

Det protokoll som presenteras här beskriver en enkel och effektiv metod som används i vårt laboratorium för att frysa muskelvävnad för cryosectioning i en hög genomströmning sätt. Höjdpunkten i denna metod är en ny cryovial som är avsedd för flash-frysning muskelvävnad i flytande kväve. Den aktuella arbetsflödet kan samtidigt underlätta vävnadfrysning och bearbetning för en utmärkt muskel kryosnitt, med en klart synlig cytoplasmisk avdelning och den snäva apposition av myofibrer till den omgivande vävnaden. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på ett brett spektrum av alternativ för vävnadsanalys eftersom flytande kväve inte blandar med vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nuvarande metoden har upprättats och godkänts för att skörda och lagra mer än 1.000 muskelprover för histologisk färgning i vårt laboratorium. Alla procedurer som involverar djurvård och användning följt de riktlinjer som fastställts av jordbruksministeriet i Kina.

1. Utrustning för Provtagning

  1. Märk prov identitet på varje kryogen flaska.
    Obs: Den kryogena flaskan är speciellt utformad för att frysa färska vävnadsprover för kryosnitt förfarande (Figur 1A). Flaskorna är gjorda av polypropen i ett formverktyg fabrik (Figur 1C).
  2. Erhålla följande utrustning: flytande kväve i en lämplig flytande kväve tank, skyddsglasögon eller en ansiktsmask, frys handskar, 10 cm pincett, 25 cm pincett, en Styrofoam kylare (inre dimensioner: 20 cm lång x 12 cm bred x 13,5 cm hög ; yttre dimensioner: 24 cm lång x 16 cm bred x 15 cm hög), plastfilm (2,5 cm lång x 0,8 cm bredd x 0,1 mm tjocklek),en skalpell, och A4 PVC bindande omslag (21 cm x 29,5 cm) (Figur 1B).

2. Framställning av muskelprover

  1. Fylla Styrofoam kylare med flytande kväve 5 minuter före provtagning.
    OBS: Den stora kolumnen i flytande kväve är viktigt eftersom en del av det flytande kvävet kokar bort och förvandlas till gas när färska prover röra vid den. I syfte att minska frekvensen av överföring av flytande kväve för att fylla på förlust, måste en lämpligt dimensionerad Styrofoam svalare förvärvas i förväg i enlighet med antalet prov.
  2. När ett prov erhålls, försiktigt placera den på en bit A4 PVC bindande omslag och observera riktningen av muskelfibrer.
    OBS: Här använde vi tvärsnittet av rygg doris muskler från den första till den sista ländkotan hos grisar. Exemplaren är ca 12 cm långa, 8 cm bred, och 5 cm höga.
  3. Använda en skalpell för att göra två parallella snitt genom provet in riktningen av muskelfibrer, ca 3 cm i längd och 0,6 cm från varandra. Trimma snittade muskeln till en rektangel ca 0,6 cm bred x 0,6 cm hög x 1,5 cm lång.
    OBS: tillförlitlighet mäta tvärsnittsarean av de muskelfibrer beror mest på fiberorienteringen i Incised muskeln.
  4. Använda 10 cm pincett för att försiktigt sätta provet på en bit plastfilm, med den längsgående axeln hos den snittade muskeln parallellt med långsidan av filmen (Figur 2A).
    OBS: Plastfilmen har två funktioner: en hållfunktion som hjälper till att fixera orienteringen av muskelfibrer och en vidhäftningsfunktion som förhindrar sprickor i provet på grund av snabb frysning.
  5. Med hjälp av pincett, placera muskelvävnad in i den nedre mitten av en märkt kryogen ampull, bara mellan inloppshålen, och sedan tätt kapsyl på flaskan (Figur 2B).

3. Frysning och lagra Muskel Provs

  1. Med användning av 25 cm pincett, snabbt dränka hela kryogen flaskan i flytande kväve i den förkylda Styrofoam kylare, och väntade tills det flytande kvävet inte kokar (approximativt 10-20 s).
    OBS: cryovial kommer att flyta när det flytande kvävet kokar, så försiktigt sänka ned flaskan i kokande flytande kväve under 10-20 s.
  2. Överföra muskelprover till en vätsketank kväve lagring eller en -80 ° C frys under långtidslagring.

4. Skjut Framställning

  1. Förkyla en kryostat till mellan -20 ° C och -22 ° C.
  2. Ta bort och kassera den gamla mikrotom blad, torka av knivhållare och antirullningsplattan i kryostaten, installera en ny mikrotom blad i kryostaten och ställ in skärtjockleken till 8 um.
  3. Överföra muskelprov i den kryogena injektionsflaskan från flytande kväve lagringstank eller -80 ° C frys till kryostaten, transportera den i flytande kväve eller på torr is. Vänta 30 min för provet att komma i jämvikt med temperaturen hos kryostaten.
    OBS: All utrustning som kan röra provet måste i förväg kyld, eftersom en hög temperatur kan orsaka bildandet av iskristaller i provet.
  4. Montera provet i provhållaren under optimala formuleringen av vattenlösliga glykoler och hartser (ULT) skärtemperatur. Skär 8-um sektioner.
    OBS: Justera skärvinkeln vinkelrätt mot orienteringen av muskelfibrer, eftersom CSAF är tvärsektionsarean av muskelfibrer.
  5. Montera sektionerna mot centrum av ett rum-temperatur mikros. Placera omedelbart objektglaset i en glidlåda i en -80 ° C frys. Låt inte bilden för att torka vid rumstemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Köldkärlet illustration och vanlig laboratorieutrustning för frysning muskler under framställningen av frysta sektioner visas i Figur 1. De cryovials är tillverkade av polypropen i ett formverktyg fabrik. Varje flaska har totalt 14 inloppshål: en är på locket; en annan är vid botten; och de återstående 12 bildar fyra parallella linjer, vardera med fyra hål vid 90 ° mot varandra. Dessa inloppshål kan påskynda flödeshastigheten hos flytande kväve intill vävnaden för att undvika "ånga filt" effekt när flytande kväve i kontakt med vävnad. Följaktligen mycket få iskristaller bildas i de frysta proverna. Viktigare, isopentan, den extremt flyktig och lättantändlig vätska med en kokpunkt vid 28 ° C, är inte nödvändigt i detta förfarande.

För att ytterligare belysa fördelen med denna metod, frös vi longissimus dorsii grisar med hjälp av fem frysmetoder och observerades sedan sina färgningsegenskaper och histologiska detaljer med användning av en Hematoxylin / eosin (HE) färgning (figur 3). En vanligt förekommande fråga var bildandet av iskristaller under utarbetandet av musklerna för kryosnitt. När provet placeras direkt i en -80 ° C frys (figur 3A), stora iskristaller bildas och sedan orsakade en välkänd "schweizerost" effekt i muskeln kryosnitt. Vidare iskristaller bildas också när muskelvävnaden nedsänktes direkt i flytande kväve (figur 3B). Även om flytande kväve är en mycket kall vätska (-190 ° C), är dess värme konstant extremt låg. När några prov kontakt med flytande kväve, kan en ånga filt bygga upp bredvid vävnaden och isolera penetration av kallt in i vävnaden. Dessutom är ett rutinförfarande för frysning exemplar i patologi laboratorier ännu inte är tillämplig på muskelvävnad. ens visas i figur 3C, många nålliknande iskristaller som bildas i den cytoplasmatiska utrymme myofibrer efter muskelvävnaden doppades i oktober monteringsmedium i rätt orientering och sedan snabbt fryses i en uppslamning av isopentan (-160 ° C). Sammanfattningsvis måste lämplig fryshastigheten för muskelvävnad strikt uppfyllas i verksamheten.

Det nuvarande protokollet uppnår utmärkt prov integritet, med en klart synlig cytoplasmisk avdelning och den snäva apposition av myofibrer till den omgivande vävnaden (figur 3D). Den möjliggör utmärkt visualisering av de metaboliska egenskaperna hos muskelfibrerna med användning av myosin ATPase-analys (figur 3E). För denna analys var myosin ATPas-aktivitet analyserades baserat på det faktum att snabb-avtals muskelfibrer (däggdjurstyp 2A och 2B) hydrolysera ATP snabbare än långsam-avtalsfibrer (däggdjurs typ 1). När det ges motsvalånade gånger, snabb-avtalsfibrer visas ljus, med två grader, och långsam-avtals fibrer visas svart. Viktigare, kan denna metod användas effektivt i en hög genomströmning miljö eftersom det är lätt att utföra och sparar tid (Figur 4). Numera är en väletablerad frysning metod att dränka muskelvävnad i en uppslamning av isopentan utan kontakt med oktober monteringsmedium, såsom tidigare beskrivits 8, 9 (fig 3F). I detta förfarande, det tar ungefär 30 min för ett tillstånd fast-flytande uppslamning av 240 ml isopentan som skall uppnås genom för-kylning av isopentan i flytande kväve och omrörning tills små vita fällningarna visas längst ned (figur 4). Det finns tre praktiska svårigheter av forskare vid försök att frysa muskelvävnad i pre-kyld isopentan: (1) En fast-flytande slam tillstånd isopantane är svårt att upprätthålla när denprovtagningstid är mer än en timme. I våra tidigare försök, frysning artefakter inträffade vanligtvis i prover som gjordes vid mitten och sena stadier av processen, när dussintals muskelvävnad samlades en gång. (2) Som en farlig vätska, isopantane är inte tillåtet någonstans på kollektivtrafik. (3) Isopentan är inte tillgänglig utom i laboratorier. Många Meat Science forskare brukar frysa muskler i ett slakteri som är långt borta från ett laboratorium och det är inte tillåtet att ha isopentan. Dessutom diagnostiska muskelbiopsier är ofta suboptimalt bearbetas på grund av bristen på isopentan vid medicinska faciliteter. Således är våra protokoll en viktig utveckling för frysning muskelprover i situationer där isopentan är tillgänglig.

Figur 1
Figur 1: Den Anordning för Muscle Frysning. (A) Illustrationernaav cryovial som används i denna studie. 14 inloppshål stansas i rörväggen: en är på locket; en annan är vid botten; och de återstående 12 bildar fyra parallella linjer, vardera med fyra hål vid 90 ° mot varandra. (B) Ett fotografi av frysapparaten. Ett säkert och effektivt medel för frysning muskler i flytande kväve innebär användning av en cryovial, plastfilm, skyddsglasögon, frys handskar, 10 cm tänger, 25 cm pincett, en Styrofoam kylare, en skalpell, och A4 PVC bindande täcka. (C) De illustrationer av köldkärlet formen tillhandahålls av en ingenjör, Yonghua Wang, i form fabriken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Framställning av muskelprover. (A (B) Den muskelvävnad bör placeras mellan inloppshålen i den kryogena flaskan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
Figur 3: representativa bilder av den histologiska utvärderingen av Pig longissimus dorsi muskler efter de är frysta med hjälp av fem olika metoder.
Iskristaller förstöra läsbarhet muskel kryosnitt avbildade med HE-färgning när musklerna är frysta för histologisk analys med användning av olämpliga metoder, som visas i (AC). Avsevärda frysnings artefakter inträffade när muskelprover direkt placerades i en 80 ° C-frys (A) eller doppas i flytandekväve (B). Många nålliknande iskristaller bildas inom individuella muskelceller efter muskelvävnaden doppades i ULT och sedan direkt in i en uppslamning av isopentan (C). Protokollet presenteras i denna studie kan eliminera bildningen av iskristaller, när muskelvävnaden är helt enkelt nedsänkta i flytande kväve (D). Detta protokoll är tillämpligt på analys av enzymaktiviteten i frusen muskel baserad på myosin ATPase-analys (E). Standardfrysmetod för muskel inte presterar bättre; muskelvävnad doppas i en uppslamning av isopentan utan direkt kontakt med oktober monteringsmedium (F). Alla bilder är under en 10X objektiv, med undantag för dem med svarta kanter (20X). Scale bars: 100 | j, m. Pilspetsen i figur 3C indikerar små, nålliknande iskristaller. Pilspetsen och text i Figur 3E visar vilken typ av muskelfibrer: typ 1 representerar långsam myosin tunga kedjan fibrer, typ 2A innebär mellanliggande tunga kedjan från myosin fibrer, och typ 2B indikerar snabb myosin tunga kedjan fibrer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Jämförelse av arbetsflöden för flytande kväve-baserade och Isopentan-baserade Frys Förfaranden. I flytande kväve-baserat protokoll, är muskelvävnaden i den nya köldkärlet nedsänkt i flytande kväve. I isopentan-baserat protokoll, måste en uppslamning tillstånd av isopentan uppnås i förväg genom att förkyla den isopentan i flytande kväve och omrörning tills små vita fällningarna visas längst ned. Därefter muskelvävnad doppas i förkylda isopentan. Jämfört med 35 minuter i isopentan baserade förfarandet, såsom beskrivs i figur 3F, tar det endast 5 minuter t o avsluta förfarandet frysning som presenteras i detta protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Vätska kväveflöde genom en skarpkantad Orifice. När nedsänkning av hela multi-hål cryovial i flytande kväve, atmosfäriska tryckkrafter flytande kväve in i röret genom de 14 inloppshålen. Närvaron av hålen gör att flödet accelererar genom dem, vilket således ökar hastigheten. En recirkulerande flöde (i blått) utvecklar omedelbart nedströms om öppningen (orange). D1 indikerar diametern på öppningen på väggen av röret och D2 representerar avståndet mellan öppningen och provet muskeln (i rött).= "_ Blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi en ny multi hål cryovial för frysning och lagring muskelvävnad att utföra histologiska bedömningar av muskelfunktion. Det kritiska modifierade steget i detta protokoll är att provet i det med flera hål cryovial är direkt nedsänkt i flytande kväve. Såvitt vi vet är detta det enklaste och rapidest sätt att få utmärkta frysta prover för muskel cryosectioning bland de befintliga frysmetoder (se representativa resultat).

Den tekniska utmaningen genom muskelforskare står inför är att iskristaller är mest sannolikt att bilda vid användning av frysning som medel att härda muskelvävnad för sektionering. Såsom noteras i de representativa resultat, tre faktorer spelar viktiga roller vid bestämning korrekt muskel frysning för patologiska studier, inklusive att välja en lämplig kall källa, vilket minimerar fukt av provet, och öka den procentuella andelen av den totala ytan är i kontakt med den kalla källan. Först,graden av frysning är avgörande för att undvika skador under utarbetandet av den frusna vävnad för sektionering. När frysningen är långsam, frysta musklerna visar det välkända "schweizerost" effekt eftersom stora iskristaller bildas extracellulärt. När frysning är snabb, men inte tillräckligt snabbt, finns ett stort antal små nål-liknande iskristaller bildas inom enskilda muskelceller. Dessa nålliknande iskristaller orsaka lite detekterbar strukturella skador, men de få följande effekter: mitokondrier är skadade 10, är storleken på muskelfibrer artificiellt ökade 11, och integriteten hos fibrösa strukturer förstörs 11. Sålunda, en kall källa vid en tillräckligt kall temperatur och en tillräcklig fryshastighet är väsentliga för att undvika bildning av iskristaller i muskel kryosnitt.

Idealt är den kalla källan vid extremt kalla temperaturer och är anordnad to kontakt med alla ytor. Både flytande kväve (-190 ° C) och isopentan i en fast-vätska-blandade tillstånd (-160 ° C) uppfyller detta villkor. Men de två frys media har sina egna nackdelar. Flytande kväve har en extremt låg specifik värme konstant. Resultatet är att kontakten mellan flytande kväve och vävnaden orsakar en ångspärr som bygger upp intill vävnaden och kraftigt fördröjer inträngning av kall in i vävnaden 12. Således betydande frysning artefakter uppstå i frysta muskeln. Uppslamningen tillstånd isopentan är ett idealiskt frysmedium som inte bildar ångspärrar, men det största problemet är att isopentan måste användas i förening med flytande kväve för att uppnå en vätske badtemperatur av 160 ° C. Dessutom är isopentan en extremt flyktig och lättantändlig vätska vid rumstemperatur. För det andra innehåller muskeln överdriven vatten (> 75%), så något sätt att införa exogen fukt i provet skulle orsaka frysning artefakter. Till exempel, tillägger oktober monteringsmedium extra vatten till muskeln, så iskristaller är mycket mer framträdande i dessa muskel kryosnitt jämfört med dem utan oktober monteringsmedium. Slutligen, är tjockleken hos muskelvävnaden också viktigt att på lämpligt sätt frysa det eftersom hastigheten för frysning delvis beror på den procentuella andelen av den totala ytan är i kontakt med den kalla källan (vanligtvis, tjockleken <0,5 cm). Följaktligen är den enda existerande sätt att korrekt frysa vävnaden att fördjupa muskelvävnad med en tjocklek mindre än 0,5 cm in i för-kyld isopentan (160 ° C), såsom tidigare beskrivits 8.

Detta protokoll beskriver först hur korrekt att frysa muskelvävnad genom nedsänkning dem direkt i flytande kväve. Problemet med att använda flytande kväve ensamt är bildningen av kvävgas över vävnadsytan, i egenskap av en isolator och inhibera kylningen av vävnadenf "> 13. En sådan ånga filt kan bilda endast när en sammanslagning av bubblorna är så snabb att kvävgasen kan separera vävnaden från det flytande kvävet. Enligt bubbeldynamik kommer en snabbare vätskeflöde att resultera i mindre bubblor, som det har färre chanser att slå samman 14. Därför stansas vi 14 hål i väggen av köldkärlet för att öka hastigheten på vätskeflödet runt vävnaden och bidra till att undvika "ånga filt" effekt när flytande kväve i kontakt med vävnaden.

Med tanke på att en faktor som avgör experimentell framgång är hastigheten på vätskeflödet runt vävnaden, tre parametrar hos köldkärlet är mycket viktiga, inklusive positionen och antalet hål, varvid diametern hos inloppshålen, och avståndet mellan öppningen och provexemplaret. Vätskedynamiken visar att flödeshastigheten genom en öppning bestäms av diametern hos hålen och att en återcirkulerande flöde utvecklar omedelbart nedström av öppningen (figur 5) 15, 16. På motsvarande sätt är avståndet mellan öppningen och provet bestämmer mestadels kontaktytan mellan den höghastighetsfluidflöde och provet, såsom visas i figur 5. Följaktligen är det med flera hål cryovial i figur 1A lämplig för en muskel prov som är 0,6 cm bred x 0,6 cm hög x 1,5 cm lång. För större muskelfragment, är det värt att försöka denna metod med ett större rör och fler hål. Emellertid är detta protokoll inte är lämpliga för frysning muskelprover från små djur, såsom i en murin modell, eftersom inloppshålen kan vara för stor för mindre prover.

Dessutom måste tre kritiska steg följas strikt i protokollet. För det första bör det flytande kvävet vara tillräcklig för att doppa hela cryovial och kryogen flaskan måste vara helt under vätskenivån. För det andra är det nödvändigt att envoid oavsiktlig kontakt mellan frysta musklerna och behållare för rumstemperatur eller instrument. Till exempel, utan noggrann transport, kan nya iskristaller bildas när överföring av ett fryst prov från flytande kväve lagringstank eller -80 ° C frys till en kryostat. För det tredje bör det inte vara för mycket oktober används när proverna monteras på hållaren på grund av den höga sannolikheten av iskristall bildning runt kontaktytan mellan frysta muskler och oktober

Inom köttindustrin, är en muskel kryosnitt förfarande oundgängligt eftersom processen för formalinfixering och paraffininbäddning orsakar krympning i muskelfibrer, vilket försämrar utvärderingen av vissa muskeldrag, såsom TNF och CSAF. Dessutom är frusen muskel krävs vid utvärdering FTC användning myosin ATPase-analys. Såsom visas i fig 3E, kan detta protokoll uppfylla kraven i både patologisk analys och histokemiska fläckar i muskler. Förberedelsenav kryosnitt är en rutinoperation i kliniska muskel patologi laboratorier. Såsom beskrivits av Meng et al. 8, är ett standardförfarande för frysning muskelvävnad att fördjupa obduktionsprover i förväg kyld isopentan. Dock är isopentan otillgänglig att frysa obduktionsprover vid institutioner utan kliniska muskel patologi laboratorier. Följaktligen diagnostiska muskelbiopsier ofta suboptimalt behandlas vid många sjukvårdsinrättningar. Således kan våra protokoll avsevärt förbättra möjligheten för små sjukhus eller laboratorier för att utföra diagnostiska muskelbiopsier av tillräcklig kvalitet. Med tanke på den höga effektiviteten och enkel drift av detta protokoll, kan det vara ett lovande alternativ till det nuvarande isopentan baserade frysningsmetod och kan i stor utsträckning för histologiska studier i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter, finansiell eller på annat sätt, deklareras av författarna.

Acknowledgments

Projektet stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC): 31.301.950 och 31.671.288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95, (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84, (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2, (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38, (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57, (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69, (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8, (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12, (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53, (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71, (9), 300-309 (2012).

Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics