En multi-hul kryohætteglas Eliminerer Frysning Artefakter når muskelvæv er direkte Nedsænket i flydende nitrogen

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskrives en procedure til at fryse muskelvæv ved at dyppe dem direkte i flydende nitrogen. Denne protokol fremhæver også en ny kryoglas, der kan undgå "tæppe effekt" af nitrogengas når flydende nitrogen i kontakt med vævsoverfladen af ​​en prøve.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Undersøgelser af skeletmuskulatur fysiologi står over for den tekniske udfordring af passende behandling af de prøver at opnå sektioner med klart synlige cytoplasmatiske rum. En anden hurdle er den stramme apposition af myofibre til de omkringliggende væv. Fordi processen med vævsfikseringen og paraffinindlejring fører til krympning af muskelfibre, frysning er en optimal middel til hærdning muskelvæv til sektionering. Men en almindeligt stødt problem, dannelsen af ​​iskrystaller, forekommer under fremstillingen af ​​frosne snit på grund af det høje indhold af muskel vand. Protokollen præsenteres her beskriver først en enkel og effektiv metode til korrekt frysning muskelvæv ved at nedsænke dem i flydende nitrogen. Problemet med anvendelse af flydende nitrogen alene er, at det forårsager dannelsen af ​​en nitrogengas barriere siden af ​​væv, der virker som en isolator og hæmmer kølingen af ​​vævene. For at undgå denne "damp tæppe" effekt, en new kryohætteglas designet til at øge hastigheden af ​​væskestrømning rundt vævsoverfladen. Dette blev opnået ved udstansning i alt 14 indløbshuller i væggen af ​​hætteglasset. Ifølge boble dynamik, til en højere væskestrømningshastigheder resulterer i mindre bobler og færre chancer danne en gasbarriere. Når flydende nitrogen strømmer ind cryovialet gennem indgangshullerne, strømningshastigheden omkring vævet er hurtig nok til at eliminere gasbarriere. Sammenlignet med fremgangsmåden ifølge frysning muskelvæv under anvendelse forkølet isopentan, denne protokol er enklere og mere effektivt og kan anvendes til at fryse muskel i et gennemløb måde. Desuden er denne metode er optimal for institutioner, der ikke har adgang til isopentan, hvilket er yderst brandfarlig ved stuetemperatur.

Introduction

Skeletmuskler er den mest værdifulde komponent i en kødproducerende dyr fra et ernæringsmæssigt og forarbejdning synspunkt. I kødindustrien, er der to særligt kritiske aspekter: effektiviteten af ​​muskelvækst og kvaliteten af ​​den resulterende kød. Som en hovedbestanddel af musklen, muskelfibre er direkte relateret til vækst og friske kødkvalitet i dyr 1. For eksempel Samlet antal fibre (TNF) og Tværsnit af fibre (CSAF) hovedsagelig bestemme muskelmasse og kødkvalitet; også, Fiber type Sammensætning (FTC) kraftigt påvirker fersk kød kvalitet 2. Derfor, manipulation af muskel fiberegenskaber i dyr er en meget effektiv metode til at øge kernen rentabilitet og konkurrenceevne gårde 1.

Til dato har flere interne og eksterne faktorer blevet identificeret til at manipulere muskelfiber characteristics 1. Denne manipulation kan opnås ved målrettet udvælgelse af dyr med specifikke gener, såsom myostatingenet hos kvæg 3, den Callipyge genet hos får 4, og RYR1 og IGF2-generne i svin 5. Også, kost kontrol og behandlinger med bestemte hormoner spiller en vigtig rolle i muskel fiberegenskaber 6. Således kan en tilgang, der kombinerer genetiske og ernæringsmæssige faktorer kunne forbedre indholdet af magert kød og kødkvalitet. Imidlertid er undersøgelser af muskelfibre begrænset i kødindustrien fordi opklaringen af ​​strukturen af ​​muskelfibre stadig er en udfordring.

Muskel fiberegenskaber identificeres ved anvendelse histokemiske metoder, såsom myosin adenosintriphosphatase (ATPase) assay. Denne metode beror på, at enzymer ligger i tynde (6-8 um) frosne sektioner afmuskelfibre kemisk kan reagere med visse produkter. Men indholdet af muskler vand er større end 75% hos grise, kaniner, mus og mennesker, uanset placeringen (dvs. ryggen, maven, eller bagben) 7. Sådan højt vandindhold i musklerne forårsager en almindeligt forekommende problem - frysning artefakter - under fremstillingen af kryosnit, som tidligere beskrevet 8, 9. I de fleste tilfælde er det næsten umuligt at passende fryse muskelvæv på et slagteri produktionslinje, ifølge vores erfaring.

Protokollen præsenteres her beskriver en enkel og effektiv metode, der anvendes i vores laboratorium til at fryse muskelvæv for Fremstilling af frysesnit i en high-throughput måde. Højdepunktet i denne metode er en ny kryoglas, der er designet til flash-frysning muskelvæv i flydende nitrogen. Den nuværende arbejdsgang kan samtidigt lette vævfrysning og forarbejdning for en fremragende muskel kryosektion, med en klart synlig compartment og den stramme apposition af myofibre til det omgivende væv. Desuden kan denne protokol anvendes til en bred vifte af muligheder for vævsanalyse fordi flydende nitrogen ikke blandes med væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nuværende metode er blevet etableret og valideret til høst og lagre mere end 1.000 muskel prøver til histologisk farvning i vores laboratorium. Alle procedurer, der involverer dyr pleje og brug fulgte de retningslinjer, som ministeriet for landbrug i Kina.

1. Udstyr til Prøvetagning

  1. Mærk prøven identitet på hver kryogene hætteglas.
    Bemærk: Den kryogene hætteglas er specielt designet til at fryse friske vævsprøver for kryosektionen procedure (figur 1A). Hætteglassene er fremstillet af polypropylen i en støbeform fabrik (figur 1C).
  2. Opnå følgende udstyr: flydende nitrogen i et passende flydende nitrogen tank, beskyttelsesbriller eller en ansigtsmaske, fryser handsker, 10 cm pincet, 25 cm pincet, en Styrofoam køler (indre dimensioner: 20 cm lang x 12 cm bred x 13,5 cm høj ; udvendige dimensioner: 24 cm lang x 16 cm bred x 15 cm høj), plastfilm (2,5 cm lange x 0,8 cm brede x 0,1 mm tyk),en skalpel, og A4 PVC bindende dæksler (21 cm x 29,5 cm) (figur 1B).

2. Fremstilling af muskelprøver

  1. Hans position Styrofoam køler med flydende nitrogen 5 min forud for prøvetagning.
    BEMÆRK: store søjle af flydende nitrogen er afgørende, fordi en del af det flydende nitrogen koger væk og bliver til gas, når friske prøver rører ved det. For at reducere hyppigheden af ​​overførsel af flydende nitrogen til at genopbygge tab, skal en passende størrelse Styrofoam køler erhverves på forhånd i overensstemmelse med antallet af prøver.
  2. Når en prøve er opnået, forsigtigt placere den på et stykke A4 PVC bindende dække og observere retningen af ​​muskelfibrene.
    BEMÆRK: Her brugte vi tværsnittet af longissimus doris musklen fra den første til den sidste lændehvirvel hos svin. Prøverne er omkring 12 cm lang, 8 cm bred og 5 cm høje.
  3. Brug en skalpel til at lave to parallelle snit gennem prøven in retningen af ​​muskelfibrene, ca. 3 cm i længden og 0,6 cm fra hinanden. Trimme indridset muskel i en firkant ca. 0,6 cm bred x 0,6 cm høje x 1,5 cm lang.
    BEMÆRK: Pålideligheden af ​​måling af tværsnitsarealet af muskelfibrene meste afhænger på fiberen orientering af indridset muskel.
  4. Anvende 10 cm pincet til forsigtigt sætte prøven på et stykke plastfilm, med den langsgående akse af indskårne muskel parallelt med den lange kant af filmen (figur 2A).
    BEMÆRK: plastfilm har to funktioner: en holdefunktion, der hjælper med fastsættelse orienteringen af ​​muskelfibrene og en vedhæftning, som forhindrer revner i prøven på grund af hurtig frysning.
  5. Med pincet placere muskelvæv i den nedre midten af et mærket kryogen hætteglas, lige mellem indgangshullerne, og derefter låget tæt på hætteglasset (figur 2B).

3. nedfrysning og opbevaring Muscle Samples

  1. Anvendelse af 25 cm pincet, hurtigt nedsænkes hele kryogene hætteglas i flydende nitrogen i forvejen afkølet Styrofoam køler, venter indtil det flydende nitrogen ikke koger (ca. 10-20 s).
    BEMÆRK: cryovialet vil flyde, når flydende nitrogen koger, så omhyggeligt nedsænke hætteglasset i den kogende væske nitrogen i 10-20 s.
  2. Overfør muskelprøver til en flydende nitrogen lagertank eller en -80 ° C fryser i langtidsopbevaring.

4. Skub Fremstilling

  1. Forkøling en kryostat til mellem -20 ° C og -22 ° C.
  2. Fjern og kassér gamle mikrotom kniv, tør ned knivholder og snitstrækkerpladen i kryostaten, installere en ny mikrotom kniv i kryostaten, og indstille den skærende tykkelse til 8 um.
  3. Overfør muskelprøve i den kryogene hætteglas fra flydende nitrogen lagertanken eller -80 ° C fryser til kryostaten, transporteres i flydende nitrogen eller på tøris. Vente 30 minutter for prøven at komme i ligevægt med temperaturen af ​​kryostaten.
    BEMÆRK: Enhver udstyr, der kan berøre skal prøven forafkølet, fordi en høj temperatur kan føre til dannelse af iskrystaller i prøven.
  4. Montere prøven i prøveholderen under den optimale skæretemperatur formulering af vandopløselige glycoler og harpikser (OLT). Skåret 8-um snit.
    BEMÆRK: Juster skærevinklen vinkelret på orienteringen af ​​muskelfibre, fordi CSAF er tværsnitsarealet af muskelfibre.
  5. Mount sektionerne mod midten af ​​et rum-temperatur mikroobjektglas. Anbring straks objektglasset i et dias kasse i en -80 ° C fryser. Lad ikke slide tørre ved stuetemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cryovialet illustration og den fælles laboratorieudstyr til frysning muskler under fremstillingen af frosne snit er vist i figur 1. De kryoglas er fremstillet af polypropylen i en støbeform fabrik. Hætteglasset har i alt 14 indløbshuller: Den ene er på hætten; en anden er i bunden; og de resterende 12 danner fire parallelle linier, hver med fire huller på 90 ° til hinanden. Disse indløbshuller kan fremskynde strømningshastigheden for flydende nitrogen ved siden af ​​vævet for at undgå "damp tæppe" virkning, når flydende nitrogen i kontakt med væv. Følgelig meget få iskrystaller dannes i de frosne prøver. Vigtigere, isopentan, den ekstremt volatile og brændbar væske med et kogepunkt ved 28 ° C, er ikke nødvendig i denne fremgangsmåde.

For yderligere at fremhæve den fordel ved denne metode, vi frøs longissimus dorsii grise under anvendelse af fem frysemetoder og derefter observeret deres farvningsegenskaber og histologiske detaljer ved hjælp af en Hematoxylin / Eosin (HE) farvning (Figur 3). Et almindeligt stødt problem var dannelsen af ​​iskrystaller under fremstillingen af ​​musklerne for kryosektion. Når prøven blev anbragt direkte i en -80 ° C fryser (figur 3A), store iskrystaller dannes og bringes derefter en velkendt "schweizerost" effekt i musklen kryosektion. Endvidere iskrystaller også dannes, når muskelvæv blev neddyppet direkte i flydende nitrogen (figur 3B). Selv om flydende nitrogen er en meget kold væske (-190 ° C), sin varme konstant er ekstremt lav. Når enhver enhed i kontakt med den flydende nitrogen, kan en damp tæppe opbygge siden af ​​vævet og isolere indtrængningen af ​​kold i vævet. Derudover en rutineprocedure til frysning prøver i patologiske laboratorier er endnu ikke gælder for muskelvæv. ENr vist i figur 3C, mange nålelignende iskrystaller dannes i det cytoplasmatiske rum af myofibre efter muskelvæv blev dyppet i oktober monteringsmedium i den korrekte orientering og derefter hurtigt nedfrosset i en opslæmning af isopentan (-160 ° C). Sammenfattende må det passende frysehastighed for muskelvæv nøje overholdes ved driften.

Den nuværende protokol opnår fremragende prøve integritet, med en klart synlig compartment og den stramme apposition af myofibre til det omgivende væv (figur 3D). Det giver mulighed for fremragende visualisering af de metaboliske egenskaber af muskelfibre ved hjælp af myosin ATPase assay (figur 3E). Til dette assay blev myosin ATPase-aktivitet analyseret baseret på det faktum, at hurtig-kontraherende muskelfibre (pattedyr-typen 2A og 2B) hydrolyserer ATP hurtigere end langsom-kontraherende fibre (mammal type 1). Når givet equivalånte gange, fast-kontraherende fibre vises lys, med to grader, og langsom-kontraherende fibre vises som sort. Vigtigt er det, kan denne fremgangsmåde anvendes effektivt i en high-throughput miljøet, fordi det er let at udføre og sparer tid (figur 4). Dag, en veletableret frysning metode er at nedsænke muskelvæv i en opslæmning isopentan uden kontakt med oktober mounting medium, som tidligere beskrevet 8, 9 (fig 3F). I denne procedure, det tager omtrentlig 30 min for en faststof-væske opslæmning tilstand på 240 ml isopentan, der skal opnås ved på forhånd at afkøle isopentan i flydende nitrogen og omrøring, indtil små hvide bundfald vises nederst (figur 4). Der er tre praktiske vanskeligheder forskere under forsøg på at fryse muskelvæv i forkølet isopentan: (1) Et fast-flydende slam tilstand isopantane er vanskeligt at opretholde, nårprøveudtagning er mere end 1 time. I vores tidligere forsøg, indefrysning artefakter normalt fandt sted i de prøver, der blev udfærdiget i midten og sene stadier af processen, når dusinvis af muskelvæv blev indsamlet én gang. (2) Som en farlig væske, isopantane er ikke tilladt nogen steder på offentlig transport. (3) Isopentan er utilgængelig undtagen i laboratorier. Mange kød naturvidenskabelige forskere normalt fryse muskelvæv i et slagteri, der er langt væk fra et laboratorium, og det er ikke tilladt at have isopentan. Hertil kommer, muskelbiopsier diagnostiske er ofte sub-optimalt behandlet på grund af manglen på isopentan på medicinske faciliteter. , Vores protokol er således en vigtig udvikling for frysning muskel prøver i situationer, hvor isopentan er ikke tilgængelig.

figur 1
Figur 1: Apparat til Muscle frysning. (A) Illustrationerneaf cryovialet anvendes i denne undersøgelse. 14 indløbshuller udstanses i rørvæggen: Den ene er på hætten; en anden er i bunden; og de resterende 12 danner fire parallelle linier, hver med fire huller på 90 ° til hinanden. (B) Et fotografi af fryseapparatet. En sikker og effektive midler til frysning muskler i flydende nitrogen involverer anvendelsen af ​​et kryohætteglas, plastfolie, beskyttelsesbriller, fryser handsker, 10 cm tang, 25 cm pincetter, en Styrofoam køler, en skalpel, og A4 PVC bindende dække. (C) Illustrationerne i cryovialet støbeform billede af en ingeniør, Yonghua Wang, i støbeformen fabrikken. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Fremstilling af Muscle prøver. (A (B) Den muskelvæv skal placeres mellem indgangshullerne i den kryogene hætteglas. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: Repræsentative Images of the Histologisk evaluering af Pig Longissimus dorsi muskler efter de er frosset bruger fem forskellige metoder.
Iskrystaller ødelægge læsbarheden af muskel kryosektioner afbildet med HE farvning, når musklerne er frosset til histologisk analyse ved hjælp af uhensigtsmæssige metoder, som vist i (AC). Betydelige frysning artefakter opstod, da muskel prøver blev anbragt direkte i et 80 ° C fryser (A) eller dyppet i flydendenitrogen (B). Mange nålelignende iskrystaller dannet inden individuelle muskelceller efter muskelvæv blev dyppet i OLT derefter direkte sat i en opslæmning af isopentan (C). Protokollen præsenteres i denne undersøgelse kan eliminere dannelsen af iskrystaller, når muskelvæv er simpelthen nedsænkes i flydende nitrogen (D). Denne protokol er anvendelig til analyse af enzymaktivitet i frossen muskel baseret på myosin ATPase assay (E). Standard frysemetode for muskel udfører ikke bedre; muskelvæv dyppes i en opslæmning af isopentan uden direkte kontakt med oktober montering medium (F). Alle billeder er under et 10X objektiv, bortset fra dem med sorte kanter (20X). Målestok: 100 um. Pilespidsen i figur 3C viser små, nålelignende iskrystaller. Pilespidsen og tekst i figur 3E indikerer typen af ​​muskelfibre: type 1 repræsenterer de langsomme myosin tung kæde fibre, type betyder 2A mellemliggende myosin tung kæde fibre, og skriv 2B indikerer hurtig myosin tung kæde fibre. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4: Sammenligning af arbejdsgange for flydende nitrogen-baserede og Isopentan-baserede Freezing procedurer. I flydende nitrogen-baseret protokol, er muskelvæv i den nye cryovialet neddyppet i flydende nitrogen. I isopentan-baseret protokol, skal opnås en opslæmning tilstand isopentan på forhånd ved at forafkøle isopentan i flydende nitrogen og omrøring, indtil små, hvide præcipitater vises nederst. Derefter muskelvæv dyppet i forkølede isopentan. Mod 35 min i isopentan-baserede fremgangsmåde, som beskrevet i figur 3F, det tager kun 5 min t o fuldføre indefrysning procedure præsenteres i denne protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 5
Figur 5: Flydende Nitrogen Flow gennem en Skarpe Orifice. Når nedsænkning af hele multi-hul cryovialet i flydende nitrogen, atmosfæriske trykkræfter flydende nitrogen ind i røret gennem de 14 indgangshullerne. Tilstedeværelsen af ​​hullerne gør strømmen accelerere igennem dem, hvilket øger hastigheden. En recirkulerende strøm (med blåt) udvikler umiddelbart nedstrøms for åbningen (orange). D1 angiver diameteren af ​​åbningen på væggen af ​​røret og D2 repræsenterer afstanden mellem åbningen og musklen prøven (i rødt).= "_ Blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en ny, multi-hul kryoglas til nedfrysning og opbevaring muskelvæv til at udføre histologiske vurderinger af muskelfunktion. Den kritiske modificerede trin i denne protokol er, at prøven i flerhuls kryohætteglas er direkte nedsænket i flydende nitrogen. Så vidt vi ved, er dette den enkleste og rapidest måde at opnå gode frosne prøver for muskel Fremstilling af frysesnit blandt de eksisterende indefrysning metoder (se de repræsentative resultater).

Den tekniske udfordring ved muskel forskere står er, at iskrystaller er mest sandsynlig, når ved frysning som middel til at hærde muskelvæv til sektionering. Som bemærket i de repræsentative resultater, tre faktorer spiller nogen væsentlig rolle for ordentlig muskel frysning til patologiske undersøgelser, herunder valg af en passende kold kilde, minimere fugten af ​​prøven, og at øge andelen af ​​den samlede overflade i kontakt med den kolde kilde. Først,frysehastigheden er kritisk for at undgå beskadigelse under fremstillingen af ​​det frosne væv til sektionering. Når frysningen er langsom, frosne muskler viser den velkendte "schweizerost" effekt, fordi store iskrystaller dannes ekstracellulært. Når frysningen er hurtig men ikke tilstrækkeligt hurtig, er mange små, nålelignende iskrystaller dannet inden individuelle muskelceller. Disse nålelignende iskrystaller forårsage lidt påviselig strukturel skade, men de bringer følgende virkninger: mitokondrier beskadiges 10, er størrelsen af muskelfibrene kunstigt forøget 11, og integriteten af fibrøse strukturer er ødelagt 11. Således er en kold kilde ved en tilstrækkelig lav temperatur og en tilstrækkelig frysning hastighed er afgørende for at undgå dannelsen af ​​iskrystaller i muskel kryosektioner.

Ideelt set den kolde kilde er ved ekstremt kolde temperaturer og er anbragt to kontakte alle overflader. Både flydende nitrogen (-190 ° C) og isopentan i en faststof-væske blandet tilstand (-160 ° C) opfylder denne betingelse. Men de to indefrysning medier har deres egne ulemper. Flydende nitrogen har en ekstremt lav specifik varme konstant. Resultatet er, at kontakten mellem flydende nitrogen, og vævet forårsager en dampspærre, der opbygger siden af væv og i høj grad forsinker indtrængningen af kold i vævet 12. Således sker væsentlige frysning artefakter inde i frosne muskel. Opslæmningen tilstand isopentan er et ideelt frysning medium, som ikke danner dampspærrer, men det største problem er, at isopentan skal anvendes sammen med flydende nitrogen for at opnå et væskebad temperatur på 160 ° C. Desuden isopentan er et meget flygtigt og brændbart flydende ved stuetemperatur. For det andet indeholder musklen overdreven vand (> 75%), så enhver måde at introducere exogent fugt i prøven ville forårsage frysning artefakter. For eksempel, OCT montering medium tilføjer ekstra vand til musklen, så iskrystaller er langt mere fremtrædende i disse muskler kryosektioner sammenlignet med dem uden oktober montering medium. Endelig tykkelsen af ​​muskelvæv er også vigtigt at passende fryse det, fordi hastigheden af ​​frysning afhænger til dels den procentdel af det samlede overfladeareal i kontakt med den kolde kilde (normalt tykkelsen <0,5 cm). Følgelig er den eneste eksisterende måde til korrekt fryse vævet er at nedsænke muskelvæv med en tykkelse på mindre end 0,5 cm ind forafkølet isopentan (160 ° C), som tidligere beskrevet 8.

Denne protokol først beskriver, hvordan man korrekt fryse muskelvæv ved at nedsænke dem direkte i flydende nitrogen. Problemet med anvendelse af flydende nitrogen alene er dannelsen af ​​nitrogengas over vævsoverfladen, der virker som en isolator og inhibere afkølingen af ​​vævetf "> 13. En sådan damp tæppe kan kun dannes, når sammensmeltning af bobler er så hurtig, at nitrogengassen kan adskille væv fra flydende nitrogen. Ifølge boble dynamik, vil en hurtigere væskestrøm resultere i mindre bobler, som det har færre chancer for at fusionere 14. Derfor er vi udstanset 14 huller i væggen af cryovialet at øge hastigheden af væskestrømning omkring vævet og for at undgå den "damp tæppe" virkning, når flydende nitrogen i kontakt med vævet.

I betragtning af at den ene faktor, der afgør eksperimentel succes er hastigheden af ​​væskestrømning omkring vævet, tre parametre cryovialet er meget vigtige, herunder placeringen og antallet af huller, diameteren af ​​indgangshullerne, og afstanden mellem åbningen og prøven. Flydende dynamik viser, at strømningshastigheden gennem en åbning bestemmes af diameteren af ​​hullerne, og at en recirkulerende strøm udvikler straks nedstrøm af åbningen (figur 5) 15, 16. Tilsvarende er afstanden mellem åbningen og prøven hovedsagelig bestemmer kontaktområdet mellem højhastighedstog fluidstrømning og prøven, som vist i figur 5. Følgelig flerhuls kryoglas i Figur 1A er egnet til en muskel prøve, som er 0,6 cm bred x 0,6 cm højde x 1,5 cm lang. For større muskler fragmenter, det er værd at prøve denne metode med et større rør og flere huller. Men denne protokol ikke er egnet til frysning muskelprøver fra små dyr, såsom i en murin model, fordi indgangshullerne kan være for stor til mindre prøver.

Desuden skal tre kritiske trin følges nøje i protokollen. Først fører det flydende nitrogen være tilstrækkelig til at nedsænke hele kryoglas, og den kryogene hætteglas skal være helt under væskeniveauet. For det andet er det nødvendigt at envoid utilsigtet kontakt mellem frosne muskler og rum-temperatur beholdere eller instrumenter. For eksempel uden omhyggelig transport, kan nye iskrystaller dannes, når der overføres en frossen prøve fra flydende nitrogen lagertanken eller -80 ° C fryser til en kryostat. For det tredje bør der ikke være for meget OLT anvendes, når enhederne er monteret på holderen grund af den høje sandsynlighed for iskrystaldannelse omkring kontaktområdet mellem frosne muskler og OLT.

I kødindustrien, en muskel kryosektion procedure er påkrævet, da processen med formalinfiksering og paraffinindlejring forårsager krympning i muskelfibre, som svækker evaluering af muskelafslappende egenskaber, såsom TNF og CSAF. Desuden er frosset muskel nødvendig ved evaluering FTC hjælp af myosin ATPase assay. Som vist i figur 3E, kan denne protokol opfylde kravene i både patologisk analyse og histokemiske pletter i muskler. forberedelsenaf en kryosektion er en rutinemæssig operation i kliniske muskel patologi laboratorier. Som beskrevet af Meng et al. 8, en standardprocedure til frysning muskelvæv er at nedsænke autopsiprøver i forafkølet isopentan. Men isopentan er utilgængelig for fryse autopsiprøver på institutioner uden kliniske muskel patologi laboratorier. Derfor er muskelbiopsier diagnostiske ofte suboptimalt bearbejdes på mange medicinske faciliteter. Således kunne vores protokol væsentligt forbedrer evnen til små hospitaler eller laboratorier for at udføre diagnostiske muskelbiopsier af tilstrækkelig kvalitet. Betragtning af den høje effektivitet og enkel betjening af denne protokol, kan det være et lovende alternativ til den nuværende isopentan-baserede frysning fremgangsmåde og kan i vid udstrækning anvendes til histologiske undersøgelser i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter, økonomisk eller på anden måde, er erklæret af forfatterne.

Acknowledgments

Dette projekt blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC): 31.301.950 og 31.671.288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95, (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84, (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2, (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38, (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57, (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69, (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8, (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12, (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53, (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71, (9), 300-309 (2012).

Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics