Una multi-foro esageratamente Elimina gelati Imperfezioni muscoli sono direttamente immerso in azoto liquido

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Biology

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Summary

Questo protocollo descrive una procedura di congelamento tessuti muscolari immergendo direttamente in azoto liquido. Questo protocollo evidenzia anche un nuovo esageratamente che può evitare l'effetto "coperta" di gas azoto quando i contatti di azoto liquido la superficie del tessuto di un campione.

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Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

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Abstract

Studi sulla fisiologia del muscolo scheletrico affrontare la sfida tecnica di trattare opportunamente i campioni per ottenere sezioni con vani citoplasmatici ben visibili. Un altro ostacolo è la stretta apposizione di miofibre ai tessuti circostanti. Poiché il processo di fissaggio di tessuto e in paraffina conduce alla contrazione delle fibre muscolari, congelamento è un mezzo ottimali di indurimento tessuto muscolare per il sezionamento. Tuttavia, un problema di frequente riscontro, la formazione di cristalli di ghiaccio, si verifica durante la preparazione delle sezioni congelate a causa del alto contenuto di acqua del muscolo. Il protocollo presentato qui in primo luogo descrive un metodo semplice ed efficace per il congelamento correttamente tessuti muscolari immergendole in azoto liquido. Il problema con l'utilizzo di azoto liquido da solo è che provoca la formazione di una barriera al gas azoto accanto al tessuto, che funge da isolante e inibisce il raffreddamento dei tessuti. Per evitare questo effetto "coperta di vapore", a neesageratamente w è stato progettato per aumentare la velocità di flusso del liquido intorno alla superficie del tessuto. Questo è stato ottenuto per tranciatura di un totale di 14 fori di ingresso nella parete del flaconcino. Secondo dinamiche bolla, un più alto tasso di risultati di flusso del liquido in bolle più piccole e meno probabilità di formare una barriera al gas. Quando l'azoto liquido fluisce nella esageratamente attraverso i fori di ingresso, la velocità di flusso intorno il tessuto è abbastanza veloce per eliminare la barriera ai gas. Rispetto al metodo di congelamento tessuti muscolari utilizzando isopentano pre-raffreddato, questo protocollo è più semplice e più efficiente e può essere utilizzato per bloccare il muscolo in modo di throughput. Inoltre, questo metodo è ottimale per gli istituti che non hanno accesso a isopentano, che è estremamente infiammabile a temperatura ambiente.

Introduction

Il muscolo scheletrico è la componente più importante di un animale produttrice di carne dal punto nutrizionale e l'elaborazione di vista. Nel settore della carne, ci sono due aspetti particolarmente critici: l'efficienza della crescita muscolare e la qualità della carne risultante. Come componente principale del muscolo, le fibre muscolari sono direttamente legate alla performance di crescita e la qualità della carne fresca in animali 1. Ad esempio, il numero totale di fibre (TNF) e l'area trasversale di fibre (CSAF) in gran parte determinano la massa muscolare e la qualità della carne; Inoltre, Fibra Tipologia Composizione (FTC) influenza fortemente la qualità della carne fresca 2. Pertanto, la manipolazione delle caratteristiche della fibra muscolare negli animali è un metodo molto efficace per aumentare la redditività core e competitività delle aziende 1.

Fino ad oggi, diversi fattori intrinseci ed estrinseci sono stati identificati per manipolare fibra muscolare caratteristica atmosferaCI 1. Questa manipolazione può essere ottenuto attraverso la selezione mirata di animali con geni specifici, come il gene miostatina nei bovini 3, il gene Callipyge nelle pecore 4, e la RYR1 e geni IGF2 nei suini 5. Inoltre, controllo della dieta e trattamenti con ormoni specifici svolgono un ruolo importante nelle caratteristiche della fibra muscolare 6. Così, un approccio che combina i fattori genetici e nutrizionali potrebbe essere in grado di migliorare tenore di carne magra e la qualità della carne. Tuttavia, gli studi sulle fibre muscolari sono limitati nel settore della carne, perché la spiegazione della struttura delle fibre muscolari è ancora una sfida.

proprietà delle fibre muscolari vengono identificati mediante metodi istochimici, quali il test miosina adenosina trifosfatasi (ATPasi). Questo metodo si basa sul fatto che gli enzimi trova a sezioni sottili (6-8 micron) congelati difibre muscolari possono essere fatti reagire chimicamente con alcuni prodotti. Tuttavia, il contenuto di acqua dei muscoli è maggiore del 75% nei suini, conigli, topi, ed esseri umani, indipendentemente dalla posizione (cioè, schiena, addome, o degli arti posteriori) 7. Tale elevato contenuto di umidità nei muscoli causa un problema di frequente riscontro - artefatti congelamento - durante la preparazione di criosezioni, come precedentemente descritto 8, 9. Nella maggior parte dei casi, è quasi impossibile per congelare in modo appropriato tessuti muscolari in una linea di produzione di macellazione, secondo la nostra esperienza.

Il protocollo presentato qui descrive un metodo semplice ed efficace utilizzato nel nostro laboratorio di congelare i tessuti muscolari per criosezionamento in maniera high-throughput. Il culmine di questo metodo è un nuovo esageratamente che è progettato per i tessuti muscolari flash congelamento in azoto liquido. Il flusso di lavoro corrente può contemporaneamente facilitare tessutocongelamento e lavorazione per un'eccellente cryosection muscolare, con un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile e la stretta apposizione di miofibre al tessuto circostante. Inoltre, questo protocollo può essere applicata a una vasta gamma di opzioni per l'analisi dei tessuti perché l'azoto liquido non si mescola con i tessuti.

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Protocol

Il metodo attuale è stato stabilito e convalidato per raccogliere e memorizzare più di 1.000 campioni di muscolo per la colorazione istologica nel nostro laboratorio. Tutte le procedure che coinvolgono la cura degli animali e l'uso hanno seguito le linee guida stabilite dal Ministero dell'Agricoltura della Cina.

1. apparecchiature per la raccolta del campione

  1. Etichettare l'identità del campione su ogni fiala criogenico.
    Nota: La fiala criogenico è appositamente progettato per congelare campioni di tessuto fresco per la procedura cryosection (Figura 1A). I flaconi sono realizzati in polipropilene in una fabbrica di stampo (Figura 1C).
  2. Ottenere le seguenti attrezzature: azoto liquido in un apposito serbatoio di azoto liquido, occhiali di protezione o una visiera, guanti congelatore, 10 cm forcipe, 25 pinzette cm, un dispositivo di raffreddamento polistirolo (dimensioni interne: 20 cm x 12 cm larghezza x 13,5 cm ; dimensioni esterne: 24 cm di lunghezza x 16 cm di altezza di larghezza x 15 cm), film plastici (2,5 cm di lunghezza x 0,8 cm di spessore di larghezza x 0,1 mm),un bisturi, e copre vincolante A4 in PVC (21 cm x 29,5 centimetri) (Figura 1B).

2. Preparazione di campioni di muscolo

  1. Riempire il dispositivo di raffreddamento di polistirolo con azoto liquido 5 minuti prima del prelievo del campione.
    NOTA: La grande colonna di azoto liquido è essenziale perché parte del azoto liquido bolle di distanza e si trasforma in gas quando campioni freschi toccano. Al fine di ridurre la frequenza di trasferimento di azoto liquido per ricostituire la perdita, un dispositivo di raffreddamento polistirolo dimensioni adeguate deve essere acquisita in anticipo secondo il numero di campioni.
  2. Una volta che un campione viene ottenuta, appoggiarlo su un foglio di copertura vincolante A4 PVC e osservare la direzione delle fibre muscolari.
    NOTA: Qui, abbiamo usato la sezione del muscolo longissimus Doris dal primo all'ultimo vertebra lombare nei suini. I campioni sono lunghe circa 12 cm, 8 cm di larghezza e 5 cm di altezza.
  3. Utilizzare un bisturi per fare due incisioni parallele attraverso il I Modellon la direzione delle fibre muscolari, circa 3 cm di lunghezza e 0,6 cm di distanza. Tagliare il muscolo incisa in un rettangolo circa 0,6 centimetri di larghezza x 0.6 cm lungo alte x 1,5 cm.
    NOTA: L'affidabilità della misurazione della sezione trasversale delle fibre muscolari principalmente dipende l'orientamento delle fibre del muscolo incisa.
  4. Utilizzare 10 cm pinze per mettere delicatamente il campione su un pezzo di pellicola plastica, con l'asse longitudinale del parallelo muscolo incisa al lato lungo della pellicola (Figura 2A).
    NOTA: La pellicola plastica ha due funzioni: una funzione di tenuta che aiuta a fissare l'orientamento delle fibre muscolari e una funzione di adesione che impedisce crepe nel campione a causa di congelamento rapido.
  5. Utilizzando pinze, posizionare il tessuto muscolare in basso al centro di una fiala criogenico etichettato, proprio tra i fori di ingresso, e poi ermeticamente tappare il flacone (Figura 2B).

3. Congelare e conservare muscolare CampioneS

  1. Con 25 pinzette cm, immergere rapidamente l'intero flaconcino criogenico in azoto liquido nel refrigerante pre-raffreddato polistirolo, aspettando dell'azoto liquido non bolla (circa 10-20 s).
    NOTA: L'esageratamente galleggia quando l'azoto liquido bolle, quindi immergere attentamente la fiala in azoto liquido bollente per 10-20 s.
  2. Trasferire i campioni di muscolo di un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido o un -80 ° C per una conservazione a lungo termine.

4. Preparazione del vetrino

  1. Preraffreddare un criostato a -20 ° C e -22 ° C.
  2. Rimuovere ed eliminare la vecchia lama microtomo, pulire il portalama e la piastra anti-rollio nel criostato, installare una nuova lama microtomo criostato, e impostare lo spessore di taglio a 8 um.
  3. Trasferire il campione di muscolo nella fiala criogenico dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido o -80 ° C freezer al criostato, trasportandolo in azoto liquido o il ghiaccio secco. Attendere 30 minuti per il campione equilibrare con la temperatura del criostato.
    NOTA: Tutte le apparecchiature che potrebbero toccare il campione deve essere pre-raffreddamento, a causa di una temperatura elevata potrebbe causare la formazione di cristalli di ghiaccio presenti nel campione.
  4. Montare il campione nel portacampione sotto la formulazione ottimale temperatura di taglio di glicoli e resine idrosolubili (OCT). Tagliare sezioni 8-micron.
    NOTA: regolare l'angolo di taglio perpendicolarmente all'orientamento delle fibre muscolari, perché il CSAF è l'area della sezione trasversale delle fibre muscolari.
  5. Montare le sezioni verso il centro di un MicroSlide a temperatura ambiente. Collocare immediatamente il vetrino in una cassa scorrevole in una -80 ° C freezer. Non lasciare che il vetrino asciugare a temperatura ambiente.

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Representative Results

L'illustrazione esageratamente e l'equipaggiamento di laboratorio per il congelamento muscoli durante la preparazione di sezioni congelate sono mostrati in Figura 1. I cryovials sono realizzati in polipropilene in uno stampo di fabbrica. Ogni flaconcino ha un totale di 14 fori di ingresso: uno è sul cappuccio; un altro è nella parte inferiore; e le restanti 12 formano quattro linee parallele, ciascuna con quattro fori a 90 ° fra loro. Questi fori di ingresso possono accelerare la velocità di flusso di azoto liquido accanto al tessuto per evitare l'effetto "coperta vapore" quando i contatti azoto liquido del tessuto. Di conseguenza, pochissimi cristalli di ghiaccio si formano nei campioni congelati. Soprattutto, isopentano, il liquido estremamente volatile e infiammabile con un punto di ebollizione a 28 ° C, non è necessario in questa procedura.

Per evidenziare ulteriormente il vantaggio di questo metodo, ci si è bloccato il muscolo longissimus dorsinei suini utilizzando cinque metodi di congelamento e quindi osservata loro proprietà di colorazione e dettagli istologici utilizzando un colorante ematossilina / eosina (HE) (Figura 3). Un problema comunemente incontrati è stata la formazione di cristalli di ghiaccio durante la preparazione dei muscoli per cryosection. Quando il campione è stato collocato direttamente in un -80 ° C congelatore (figura 3A), grandi cristalli di ghiaccio formate e quindi causato un ben noto effetto "formaggio svizzero" nel cryosection muscolo. Inoltre, i cristalli di ghiaccio formano anche quando il tessuto muscolare è stato immerso direttamente in azoto liquido (Figura 3B). Anche se l'azoto liquido è un liquido molto freddo (-190 ° C), il suo calore costante è estremamente bassa. Quando tutti i contatti del provino l'azoto liquido, una coperta di vapore possono accumularsi vicino al tessuto e isolare la penetrazione di freddo nel tessuto. Inoltre, una procedura di routine per il congelamento esemplari nei laboratori di patologia non è ancora applicabile al tessuto muscolare. UNs mostrato in figura 3C, molti cristalli di ghiaccio aghiformi formate nel compartimento citoplasmatico miofibre dopo che il tessuto muscolare è stato immerso in Ottobre montante nell'orientamento corretto e poi velocemente congelata in una sospensione di isopentano (-160 ° C). In conclusione, la velocità di congelamento appropriato per i tessuti muscolari deve essere rigorosamente incontrato nel funzionamento.

Il protocollo attuale raggiunge un'eccellente integrità del campione, con un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile e la stretta apposizione di miofibre al tessuto circostante (Figura 3D). Esso permette un'eccellente visualizzazione delle proprietà metaboliche di fibre muscolari utilizzando il saggio miosina ATPasi (Figura 3E). Per questo saggio, miosina ATPasi attività è stata analizzata sulla base del fatto che le fibre muscolari fast-contraenti (tipo mammiferi 2A e 2B) idrolizzano ATP veloce di fibre lenta contraenti (mammiferi tipo 1). Quando somministrato equivavolte prestati, fibre rapida contraenti colore chiaro, con due gradi, e fibre lenta contraenti appaiono nere. È importante sottolineare che questo metodo può essere utilizzato in modo efficiente in un ambiente ad elevata capacità perché è facile da eseguire e risparmiare tempo (Figura 4). Al giorno d'oggi, un metodo di congelamento consolidata è sommergere tessuti muscolari in una sospensione di isopentano senza contatto e di ottene montante, come descritto in precedenza 8, 9 (figura 3F). In questa procedura, ci vogliono circa il 30 min per uno stato sospensione solido-liquido 240 mL di isopentano da realizzare entro il preraffreddamento del isopentano in azoto liquido e agitazione fino a piccoli precipitati bianchi appaiono in basso (Figura 4). Ci sono tre difficoltà pratiche incontrate dai ricercatori durante il tentativo di congelare i tessuti muscolari in isopentano pre-raffreddato: (1) Uno stato impasto solido-liquido di isopantane è difficile da mantenere quando iltempo di campionamento è superiore a 1 h. Nei nostri tentativi passati, manufatti congelamento di solito si sono verificati nei campioni che sono stati fatti nelle fasi metà e fine del processo, quando decine di tessuti muscolari sono stati raccolti una volta. (2) Come un liquido pericoloso, isopantane non è consentito da nessuna parte sui mezzi pubblici. (3) Isopentano non è disponibile se non in laboratorio. Molti ricercatori carne di scienze di solito congelare tessuti muscolari in un macello che è lontano da un laboratorio e che non è permesso di avere isopentano. Inoltre, biopsie muscolari diagnostiche sono spesso sub-ottimale elaborata a causa della mancanza di isopentano a strutture mediche. Così, il nostro protocollo è uno sviluppo importante per il congelamento campioni muscolari in situazioni in cui non è disponibile isopentano.

Figura 1
Figura 1: L'apparecchio per Muscle congelamento. (A) Le illustrazionidella esageratamente utilizzato in questo studio. 14 fori di ingresso vengono punzonati nella parete del tubo: uno è sul tappo; un altro è nella parte inferiore; e le restanti 12 formano quattro linee parallele, ciascuna con quattro fori a 90 ° fra loro. (B) Una fotografia dell'apparecchiatura di congelamento. Un mezzo sicuro ed efficiente di congelamento in azoto liquido muscoli implica l'uso di una pellicola plastica esageratamente, occhiali protettivi, guanti, congelatore 10 cm pinze, pinzette 25 cm, un dispositivo di raffreddamento polistirolo, un bisturi, e la copertura rilegatura A4 PVC. (C) Le illustrazioni dello stampo esageratamente fornita da un tecnico, Yonghua Wang, in fabbrica stampo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Preparazione di campioni di muscolo. (A (B) Il tessuto muscolare deve essere inserito tra i fori di ingresso nel flaconcino criogenico. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Rappresentante immagini del istologica di valutazione di muscoli Pig longissimus dorsi dopo sono congelati utilizzando cinque diversi metodi.
Cristalli di ghiaccio distruggono la leggibilità del criosezioni muscolari imaged con SE colorazione quando i muscoli sono congelati per l'analisi istologica con metodi inadeguati, come mostrato in (AC). Artefatti congelamento notevoli verificato quando campioni di muscolo sono stati posti direttamente in un 80 ° C congelatore (A) o immersi nel liquidoazoto (B). Molti cristalli di ghiaccio aghiformi formano all'interno delle cellule muscolari singole dopo che il tessuto muscolare è stato immerso in Office e poi direttamente messo in un impasto di isopentano (C). Il protocollo presentato in questo studio può eliminare la formazione di cristalli di ghiaccio quando il tessuto muscolare è semplicemente immersa in azoto liquido (D). Questo protocollo è applicabile all'analisi di attività enzimatica nel muscolo congelato sulla base del saggio di miosina ATPasi (E). Il metodo di congelamento standard per il muscolo non funzionare meglio; tessuto muscolare è immerso in una poltiglia di isopentano senza contatto diretto e di ottene mezzo di montaggio (F). Tutte le immagini sono sotto un obiettivo 10X, ad eccezione di quelli con bordi neri (20x). Barre di scala: 100 micron. La freccia nella Figura 3C indica piccoli cristalli di ghiaccio aghiformi. La freccia e il testo in Figura 3E indicano il tipo di fibre muscolari: Tipo 1 rappresenta le fibre lento miosina catena pesante, type 2A: fibre di catena pesante della miosina intermedia e digitare 2B indica fibre catena pesante della miosina veloce. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Confronto tra flussi di lavoro per le procedure di congelamento liquido a base di azoto e basati isopentano. Nel protocollo a base di azoto liquido, il tessuto muscolare nella nuova esageratamente viene immerso in azoto liquido. Nel protocollo isopentano-based, uno stato di sospensione isopentano deve essere ottenuta in anticipo preraffreddamento del isopentano in azoto liquido e agitazione fino a piccoli precipitati bianchi appaiono in basso. Poi, il tessuto muscolare viene immerso nel isopentano pre-raffreddata. Rispetto ai 35 min nella procedura isopentano-based, come descritto in Figura 3F, ci vogliono solo 5 min t o completare la procedura di congelamento presentato in questo protocollo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Liquido di flusso di azoto attraverso un orifizio a spigolo vivo. Quando immergendo l'intero fori multipli esageratamente in azoto liquido, forze di pressione atmosferica azoto liquido nel tubo attraverso i fori di ingresso 14. La presenza dei fori rende il flusso accelerare attraverso di loro, aumentando così la velocità. Un flusso di ricircolo (in blu) sviluppa immediatamente a valle dell'orifizio (arancione). D1 indica il diametro dell'orifizio sulla parete del tubo e D2 rappresenta la distanza tra il diaframma e il campione di muscolo (in rosso).= "_ Blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, descriviamo un nuovo, multiforo esageratamente per il congelamento e la conservazione tessuti muscolari per effettuare valutazioni istologiche della funzione muscolare. La fase critica modificato in questo protocollo è che il campione nella esageratamente fori multipli è direttamente immersa in azoto liquido. A nostra conoscenza, questo è il modo più semplice e rapidest di ottenere campioni congelati eccellenti per criosezionamento muscolare tra i metodi di congelamento esistenti (vedere i risultati rappresentativi).

La sfida tecnica affrontato da ricercatori muscolari è che i cristalli di ghiaccio sono più probabilità di formare quando si utilizza il congelamento come mezzo per indurire il tessuto muscolare per il sezionamento. Come notato nei risultati rappresentativi, tre fattori giocano un ruolo significativo nel determinare il corretto congelamento muscolare per gli studi patologici, tra cui la scelta di una fonte fredda adeguato, riducendo al minimo l'umidità del campione, e l'aumento della percentuale della superficie totale a contatto con la sorgente fredda. Primo,il tasso di congelamento è fondamentale per evitare danni durante la preparazione del tessuto congelato per il sezionamento. Quando il congelamento è lento, i muscoli congelati mostrano il ben noto effetto di "formaggio svizzero", perché i cristalli di ghiaccio di grandi dimensioni si formano extracellulare. Quando il congelamento è rapido, ma non sufficientemente veloce, un gran numero di piccoli cristalli di ghiaccio aghiformi si formano all'interno delle cellule muscolari individuali. Questi cristalli di ghiaccio aghiformi causano pochi danni strutturali rilevabili, ma portano i seguenti effetti: i mitocondri sono danneggiati 10, la dimensione delle fibre muscolari è aumentato artificialmente 11, e l'integrità delle strutture fibrose viene distrutto 11. Così, una sorgente fredda ad una temperatura sufficientemente fredda e una velocità di congelamento sufficiente sono essenziali per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio in criosezioni muscolari.

Idealmente, la sorgente fredda è a temperature estremamente basse ed è disposto to contattare tutte le superfici. Entrambi azoto liquido (-190 ° C) ed isopentano in uno stato misto solido-liquido (-160 ° C) soddisfano questa condizione. Tuttavia, i due mezzi di congelamento hanno i loro svantaggi. L'azoto liquido ha una costante calore specifico estremamente basso. Il risultato è che il contatto tra azoto liquido e il tessuto provoca una barriera al vapore che si accumula accanto al tessuto e notevolmente rallenta la penetrazione del freddo nel tessuto 12. Così, significativi manufatti di congelamento si verificano all'interno del muscolo congelato. Lo stato di sospensione isopentano è un mezzo di congelamento ideale che non forma barriera al vapore, ma il problema principale è che isopentano deve essere utilizzato in combinazione con azoto liquido per ottenere una temperatura del bagno liquido di 160 ° C. Inoltre, isopentano è un liquido estremamente volatile ed infiammabile a temperatura ambiente. In secondo luogo, il muscolo contiene acqua eccessivo (> 75%), in modo che qualsiasi modo per introdurre l'umidità esogeno nel campione causerebbe artefatti congelamento. Ad esempio, Ottobre mezzo di montaggio aggiunge acqua in più al muscolo, in modo da cristalli di ghiaccio sono molto più prominente in quei criosezioni muscolari rispetto a quelli senza ottobre mezzo di montaggio. Infine, lo spessore del tessuto muscolare è anche importante per congelare adeguatamente perché il tasso di congelamento in parte dipende dalla percentuale della superficie totale a contatto con la sorgente fredda (di solito, lo spessore <0,5 cm). Pertanto, l'unico modo esistente per congelare correttamente il tessuto è immergere il tessuto muscolare con uno spessore inferiore a 0,5 cm all'interno isopentano pre-raffreddato (160 ° C), come precedentemente descritto 8.

Questo protocollo prima descrive come congelare correttamente tessuti muscolari immergendo direttamente in azoto liquido. Il problema con l'utilizzo di azoto liquido solo è la formazione di gas azoto sulla superficie del tessuto, che funge da isolante e inibendo il raffreddamento del tessutof "> 13. Tale coperta vapore può formare solo quando la fusione di bolle è così rapido che il gas azoto può separare il tessuto dalla azoto liquido. Secondo dinamica bolla, un flusso veloce liquido comporterà bolle più piccole, come ha minori possibilità di unire 14. Pertanto, abbiamo perforato 14 fori nella parete del esageratamente per aumentare la velocità del flusso di liquido attorno al tessuto e per evitare l'effetto "coperta vapore" quando i contatti azoto liquido tessuto.

Considerando che il fattore che determina il successo sperimentale è la velocità di flusso di liquido attorno al tessuto, tre parametri della esageratamente sono molto importanti, tra cui la posizione e il numero di fori, il diametro dei fori di ingresso, e la distanza tra l'orifizio e il campione. dinamiche liquidi mostra che la portata attraverso un orifizio è determinata dal diametro dei fori e che un flusso di ricircolo sviluppa immediatamente giùflusso dell'orifizio (Figura 5) 15, 16. Corrispondentemente, la distanza tra il diaframma e il campione determina in gran parte l'area di contatto tra il flusso di fluido ad alta velocità e il campione, come mostrato in figura 5. Di conseguenza, l'esageratamente multiforo in Figura 1A è adatto per un campione muscolo che è 0.6 cm di altezza di larghezza x 0.6 cm x lunghezza 1,5 cm. Per frammenti muscolari più grandi, vale la pena provare questo metodo con un tubo più grande e più fori. Tuttavia, questo protocollo non è adatto per congelare campioni di muscolo di piccoli animali, come ad esempio in un modello murino, perché i fori di ingresso potrebbe essere troppo grande per i campioni più piccoli.

Inoltre, tre fasi critiche devono essere rigorosamente seguite nel protocollo. In primo luogo, l'azoto liquido deve essere sufficiente per immergere completamente esageratamente, e la fiala criogenico deve essere completamente al di sotto del livello del liquido. In secondo luogo, è necessario unvuoto contatto accidentale tra i muscoli congelati e contenitori a temperatura ambiente o strumenti. Ad esempio, senza trasporto attenta, nuovi cristalli di ghiaccio possono formare quando si trasferisce un campione congelato dal serbatoio di azoto liquido o -80 ° C congelatore un criostato. In terzo luogo, non ci dovrebbe essere troppo ottobre utilizzato quando i campioni sono montati sul supporto a causa dell'elevata probabilità di formazione di cristalli di ghiaccio intorno alla zona di contatto tra i muscoli congelati e ottobre

Nel settore della carne, una procedura cryosection muscolare è indispensabile perché il processo di formalina fissazione e paraffina provoca il restringimento nelle fibre muscolari, che altera la valutazione di alcuni tratti muscolari, come TNF e CSAF. Inoltre, il muscolo congelato è richiesto quando si valuta FTC usando il saggio miosina ATPasi. Come mostrato in figura 3E, questo protocollo può soddisfare i requisiti sia analisi patologica e macchie istochimiche nei muscoli. La preparazionedi un cryosection è un'operazione di routine nei laboratori di patologia muscolare clinici. Come descritto da Meng et al. 8, una procedura operativa standard per il congelamento tessuti muscolari è quello di immergere campioni autoptici in isopentano pre-raffreddato. Tuttavia, isopentano non è disponibile per congelare i campioni autoptici presso istituzioni senza laboratori di patologia muscolare clinici. Di conseguenza, le biopsie muscolari diagnostiche sono spesso subottimale elaborati in molte strutture mediche. Così, il nostro protocollo potrebbe migliorare sostanzialmente la possibilità per i piccoli ospedali o laboratori per eseguire biopsie muscolari diagnostiche di qualità adeguata. Considerando l'elevata efficienza e semplice operazione di questo protocollo, potrebbe essere una promettente alternativa all'attuale metodo di congelamento isopentano-based e può essere ampiamente applicata agli studi istologici in futuro.

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Disclosures

Nessun conflitto di interesse, finanziario o di altro, sono dichiarate dagli autori.

Acknowledgments

Questo progetto è stato sostenuto dalla National Science Foundation naturali della Cina (NSFC): 31.301.950 e 31.671.288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

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References

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Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

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