Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Neuroscience

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Summary

Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.

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Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

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Abstract

As espinhas dendríticas são as protuberâncias dos eixos dendríticos neuronais que contêm sinapses excitatórias. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória. Existem várias abordagens para a coloração de Golgi, todas as quais foram úteis para determinar as características morfológicas dos corredores dendríticos e produzir um fundo claro. O presente método de Golgi-Cox, (uma pequena variação do protocolo que é fornecido com um kit de coloração Golgi comercial) foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa do medicamento quimioterápico 5-flurouracil (5-Fu) afetaria a morfologia dendrítica , O número de espinhas e a complexidade da arborização dentro do hipocampo. O 5-Fu modificou significativamente a complexidade dendrítica e diminuiu a densidade da coluna em todo o hipocampo de uma maneira específica da região. Os dados apresentados mostram que o método de coloração de Golgi efManchou os neurônios maduros no CA1, o CA3 e o giro dentado (DG) do hipocampo. Este protocolo relata os detalhes de cada passo para que outros pesquisadores possam manchar de forma confiável tecido em todo o cérebro com resultados de alta qualidade e solução de problemas mínima.

Introduction

Os dendritos são a maior parte dos neurônios que recebem e processam a entrada pré-sináptica 1 . Seus processos dendríticos têm uma geometria complexa, onde os ramos proximais têm um diâmetro maior do que os ramos distal. À medida que os dendritos se desenvolvem, eles formam várias conexões com outros neurônios em um processo conhecido como arborização dendrítica. A extensão eo padrão dessa ramificação determinam a quantidade de entradas sinápticas que um dendrite pode processar adequadamente 2 .

A arborização dendrítica é um processo necessário para a plasticidade dependente da atividade e o desenvolvimento adequado dos circuitos neuronais. Extensão, retração, ramificação e sinaptogênese são processos intrincados que incluem programas genéticos intrínsecos e influências de fatores extrínsecos. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória.As alterações na complexidade dendrítica estão associadas a alterações fisiopatológicas e comportamentais 5. As anormalidades estão relacionadas a vários estados patológicos, incluindo síndrome de X frágil e síndrome de Down 6 .

As espinhas dendríticas são os compartimentos subcelulares especializados dos corredores dendríticos que recebem entrada excitatória no sistema nervoso central. Existem três classes morfológicas de espinhas dendríticas, com o nome de cada classe com base no tamanho e na forma: 1) espinhas de cogumelo, que apresentam densidades pós-sinápticas complexas com mais receptores de glutamato do que outras espinhas 7 ; 2) espinhos espinhosos, que não possuem tronco; E 3) espinhas finas, que consistem em uma haste prolongada e estreita e uma cabeça globular 8 . O volume da coluna dendrítica é usado em parte para defini-los, com espinhas finas geralmente menores (0,01 μm 3 3 ) 9 , 10 . As espinhas se estabilizam com a maturação. Por exemplo, as espinhas finas se retraem após alguns dias ou se desenvolvem em espinhos de cogumelo. Alternativamente, as espinhas dos cogumelos são relativamente estáveis ​​e podem sobreviver durante um período prolongado. A força das conexões neuronais é pensada para ser baseada no número de espinhas e / ou seu volume 11 , 12 , 13 .

O método clássico de coloração de Golgi e suas variações mais modernas têm sido úteis para examinar a morfologia e a densidade da coluna dendrítica. Um aspecto único da coloração de Golgi é que ele mancha aleatoriamente cerca de 5% dos neurônios totais, o que permite o rastreamento de neurônios individuais 14 , 15 . Embora o mecanismo exato em que a metanfeta de GolgiNão há ainda desconhecidos os neurônios individuais, o princípio do método é baseado na cristalização do cromato de prata (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Existem três tipos principais do método de Golgi: o Golgi rápido, o Golgi-Cox e o Golgi-Kopsch 18 , 19 . Todos os três métodos começam com uma fase inicial de incubação em sais de cromo durante vários dias a meses, mas existem certas diferenças fundamentais entre eles. O Golgi rápido usa o tetróxido de ósmio no primeiro passo, enquanto o Golgi-Kopsch inclui paraformaldeído. A coloração tanto no Golgi quanto no Golgi-Kopsch é seguida por uma incubação em uma solução de nitrato de prata a 1% a 2% durante cerca de 7 dias. O método de Golgi-Cox usa cloreto de mercúrio e dicromato de potássio em vez de nitrato de prata e tem um tempo de impregnação de 2-4 semanas. Os tecidos são então seccionados e colocados rapidamente em amônia diluídaSolução, seguida por um fixador fotográfico para remover os sais. Dos três tipos, pensa-se que o método de Golgi-Cox é o melhor na coloração dos corredores dendríticos sem muita interferência de fundo, em parte, porque os artefatos de cristal não ocorrem na superfície do tecido (ao contrário do método rápido de Golgi) 17 , 20 , 21 .

O presente método é uma pequena variação do protocolo fornecido com um kit comercial de coloração de Golgi e foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa de 5-Fu afetaria as características morfológicas dendríticas e a densidade da coluna vertebral. Qualquer informação adquirida pode fornecer informações adicionais sobre como o tratamento quimioterapêutico afeta os circuitos neuronais.

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Protocol

As experiências foram realizadas de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na UAMS.

1. Paradigma de animais e 5-Fu Injection

  1. Compre ratinhos de tipo selvagem C57Bl6 / J de 6 meses de idade e abrigue-os sob um ciclo constante de 12 h luz / escuridão até atingir o 1 ano de idade.
  2. Diluir o 5-Fu em solução salina estéril a 0,9%. Use 60 mg / kg como a dose necessária por mouse.
  3. Dê as injeções intraperitoneais do 5-Fu (uma vez por semana durante três semanas).
    1. Dê as injeções intraperitoneais ao mesmo tempo em cada dia. Por exemplo, entre 0900-1200 h.
  4. Eutanizar os animais e extrair os cérebros 30 dias após a injeção final.

2. Procedimento de Eutanásia e Extração de Cérebro

  1. Conduza o roedor e agarre a base da cauda. Por outro lado, coloque o polegar ou o primeiro dedo no thE base do pescoço do roedor. Pressione rapidamente o pescoço do roedor e empurre para a frente enquanto a outra mão segurando a cauda puxa para trás.
  2. Segure o roedor com uma mão e a grande tesoura cirúrgica com a outra. Coloque o pescoço do roedor entre as duas lâminas e rapidamente decapite a cabeça.
  3. Pegue a cabeça do mouse cortada e use a tesoura fina para cortar a pele acima do crânio, até os olhos. Em seguida, coloque as pontas das tesouras em cada soquete do olho e feche a tesoura com pouca força.
  4. Use a tesoura de mola para cortar o crânio para a esquerda e para a direita do cerebelo.
  5. Use fórceps para levantar a parte do crânio em torno do cerebelo diretamente para cima e para fora.
  6. Use a tesoura de mola para cortar a linha midsagittal do crânio.
  7. Use a pinça para levantar a parte restante do crânio do cérebro.
  8. Use uma espátula e uma sonda para colher o cérebro no recipiente desejado. Usando um aço inoxidávelLâmina de corte, corte cada cérebro ao longo do plano midsagital. Execute o seguinte método de Golgi-Cox nos hemisférios direitos.

3. Mancha de Golgi e Preparação de Tecidos

  1. Mergulhe os meia-cérebros recém-colhidos em 5 mL de solução à base de cloreto de mercúrio (solução A do kit) em um tubo cônico de 10 mL. A solução de cloreto de mercúrio é sensível à luz; Cubra o tubo com papel alumínio. Armazene a amostra no escuro à temperatura ambiente.
    NOTA: A solução A é fornecida no kit que está listado na tabela de materiais. Cuidado! A solução A (também chamada de solução de cloreto de mercúrio) contém reagentes tóxicos, como dicromato de potássio, cloreto de mercúrio e cromato de potássio. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora.
  2. Após 1 dia, decanta lentamente a solução em um recipiente temporário (como um barco de pesagem grande) e descarte-o em um recipiente de resíduos de risco biológico. Mergulhe os cérebros (ainda nos tubos cônicos originais de 10 mL) com 5 mL deA solução de cloreto de mercúrio e devolver a amostra ao escuro a temperatura ambiente por mais 13 dias.
  3. Adicione 30 g de tampão pós-impregnação a 90 mL de água destilada ou desionizada (dH2O). Preencha cada poço de uma placa de 6 poços com 6,5 mL do tampão pós-impregnação, um poço por cérebro
    NOTA: O buffer pós-impregnação é fornecido no kit que está listado na tabela de materiais.
    1. Após 14 dias (no total) na solução de cloreto de mercúrio, enxágue o tecido com dH 2 O e, em seguida, transfira-os para placas de 6 poços com tampão pós-impregnação. Cubra os pratos com papel alumínio e guarde-os à temperatura ambiente no escuro.
  4. Pipetar o buffer de pós-impregnação após 1 dia de imersão e renovar com tampão pós-impregnação fresco; Armazene por 1 dia no escuro à temperatura ambiente. Se necessário, armazene isto a 4 ° C por até 1 mês 22 .

4. Seção

  1. Rotule as placas de 12 poços em suas tampas com números em ordem crescente da esquerda para a direita e para cima para baixo.
  2. Prepare duas ou três placas de 12 poços por cérebro, se estacionar todo o cérebro.
    1. Rotule a parte superior de cada tampa da placa de 12 poços com o número de identificação do cérebro seccionado.
    2. Pipetar 2 mL de 1x PBS em cada poço de cada placa.
  3. Configure o palco e ative o vibratome; Certifique-se de que haja 1x PBS no recipiente para cobrir o tecido.
    1. Corte dois pedaços de película de parafina de plástico e dobre-os duas vezes. Coloque-os sobre os orifícios para os botões do suporte do espécime para evitar que 1x PBS vaze no contador.
    2. Coloque a fita no bloco de tecido do suporte do espécime e coloque em seguida cola adesiva de cianoacrilato (ver tabela de materiais).
  4. Retire o cérebro da placa de 6 poços e coloque-o sobre um prato de plástico ou de vidro. Use o aço inoxidávelLâmina de aço de dois gumes para cortar cerca de metade do cerebelo.
    1. Corte o cerebelo caudalmente. Certifique-se de que a porção do cerebelo restante é uniforme.
  5. Coloque imediatamente a superfície plana do cerebelo restante na cola.
    NOTA: A parte dorsal do tecido (o córtex cerebral) deve estar voltada para a esquerda ou para a direita em relação à lâmina. A extremidade rostral que anteriormente continha a lâmpada olfativa em anexo deve virar para cima.
    1. Espere pelo menos alguns minutos para se certificar de que a cola seca completamente.
  6. Enquanto a cola que segura o cérebro no lugar é a secagem, despeje 1x PBS no banho do espécime. Após a cola estar seca, coloque o suporte do espécime com o tecido no banho da amostra.
    1. Se a amostra de tecido não estiver totalmente coberta, despeje mais 1x PBS no banho da amostra.
  7. Anexe a lâmina ao suporte da lâmina do vibratome e lentamente lColoque a lâmina no banho do espécime até ficar completamente submersa em 1x PBS. Continue abaixando a lâmina até ficar ligeiramente abaixo da parte superior do tecido.
  8. Ajuste a velocidade do vibratoma para 7, a amplitude para 6 e o ​​ângulo de corte para 12 ° (ver tabela de materiais para o modelo vibratome). Comece a vibração e corte as seções de 200 μm 23 .
    1. Use um grande pincel para mover as seções de tecido do banho da amostra em cada poço designado das placas de 12 poços.
  9. Continue a cortar o tecido até atingir o número desejado de seções de tecido.

5. Pós-coloração

  1. Para cada uma das seguintes etapas de coloração e enxaguamentos, use 2 mL da solução indicada por poço. Use um enchimento de pipeta motorizado (veja tabela de materiais) para transferir as soluções para os poços. Use uma pipeta de transferência (veja tabela de materiais) para transferir soluções para fora dos poços e para dentro dos resíduos adequadoscontainers.
  2. Enxaguar as secções em uma lavagem de 30 min de PBS-T 0,01 M (adicionar 3,0 mL de detergente (ver tabela de materiais) a 1.000 mL de PBS 0,01 M).
  3. Diluir a solução de hidróxido de amônio (precaução) 3: 5 em volume com dH 2 O imediatamente antes da utilização. Manchar as secções na solução diluída de hidróxido de amónio durante 19-21 min.
    1. Proteja a solução de hidróxido de amônio sensível à luz com papel alumínio.
      NOTA: O hidróxido de amônio na solução tem uma concentração de ~ 10% e é classificado como "perigoso". A solução de hidróxido de amônio pode produzir queimaduras se entrar em contato com a pele. Pode causar irritação das vias respiratórias se inalado. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora.
  4. Manchar as secções no tampão pós-coloração (adicionar 90 g de reagente D em 500 mL de dH2O) durante 19-21 min. O buffer de pós-coloração é sensível à luz; Proteja-o com papel alumínio 22 .
  5. Enxaguar as secções em três, 5-10 min lavagens de 0,01 M de PBS-T.

6. Montagem, limpeza e cobertura

  1. Monte as seções em 1% de lâminas revestidas de gelatina com o grande pincel. Deixe secar durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, coloque-os em um frasco de Coplin durante a noite.
  2. Remova as lâminas com as mãos enluvadas da jarra Coplin e coloque-as em uma prateleira de plástico (ver tabela de materiais). Coloque a prateleira de plástico no prato de coloração (ver tabela de materiais) contendo 100% de etanol. Desidratá-los com três lavagens de 5 min.
  3. Lave as lâminas duas vezes por 5 min cada em 99% de xileno. Coloque os slides em uma prateleira de vidro e abaixe a cremalheira em um prato de coloração de vidro contendo xileno com uma alça metálica (ver tabela de materiais).
    NOTA: Cuidado, o xileno é prejudicial se inalado e causa irritação se ele tocar a pele. É altamente inflamável em estados de líquido e vapor. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora.
  4. Remova as lâminas do xilEne uma por vez e cobrir rapidamente o tecido com ~ 0,25 mL de mídia de montagem (ver Tabela de materiais). Em seguida, pegue as capas deslizantes e coloque-as sobre a mídia.
    1. Empurre as bolhas de ar presas debaixo das tampas deslizantes para a borda com um objeto contundente, como o fim de um pincel.
  5. Coloque os slides em uma área longe da luz solar e deixe secar por 2-3 dias.
  6. Proceda à aquisição de imagens usando um microscópio e analise com o software apropriado.

7. Adquira pilha de imagens

  1. Abra o programa de imagem (consulte a Tabela de materiais ). Coloque o slide no palco do microscópio. No menu no topo do programa, clique em "Aquisição" e, em seguida, clique em "Imagem ao vivo".
  2. Coloque o microscópio em 10X. Identifique o neurônio de preferência e depois traga o cursor, que aparece como um X vermelho, no centro do soma. Clique com o botão esquerdo para definir o ponto de referência.
  3. Coloque o microscópio em 40X. Clique em "Mover" no menu na parte superior do programa e depois clique em "Para Ponto de Referência".
  4. Comece a criar a pilha de imagens, deslocando manualmente com o objetivo fino acima do tecido até ficar um pouco fora de foco.
    1. Clique em "Set Top" no canto inferior direito do programa sob o título "Aquisição de imagens".
    2. Desloque-se ligeiramente sob o tecido até ficar ligeiramente fora de foco e depois clique em "Definir fundo" em "Aquisição de imagens". Em seguida, clique em "Adquirir pilha de imagens".
  5. Após a aquisição da pilha de imagens, digite o nome desejado para o arquivo de imagem na janela que aparece. Salve como "arquivo MBF Ascii".
    1. Quando solicitado, selecione o tipo de arquivo como "arquivo de pilha JPEG 2000 MBF" e clique em "Salvar".

8. Rastreamento neuronal

  1. Na ferramentaSob o menu, clique na caixa intitulada "Nome do contorno". Selecione "Soma" no menu suspenso.
  2. Trace manualmente o soma. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione "Finalizar o corpo da célula" quando o rastreamento estiver completo.
  3. Selecione "AutoNeuron" para exibir outra guia intitulada "AutoNeuron Workflow".
  4. Em "Tipo de configuração", selecione "Novo". Defina os parâmetros e, em seguida, clique em "Próximo passo" para exibir a subposição "Soma Detection".
    1. Para definir os parâmetros, selecione "Brightfield". Em seguida, em "Diâmetro máximo do processo", clique em "Iniciar medição". Usando o cursor, vá para a base do dendrite e ajuste manualmente o diâmetro.
  5. Clique em "Sim" na janela que pede ao usuário que rastreie toda a imagem. Trace manualmente o soma. Desmarque e clique em "Próximo passo" para exibir a subposição "Colocação de sementeira".
  6. Clique em "Validar semente"S "e, em seguida, clique em" Próximo passo "para exibir a subposição" Neuron Reconstruction ".
  7. Em "Neuron", clique em "Interactive". Execute o rastreamento interativo seguindo a direção do programa dos dendritos e clique com o botão direito do mouse para completar a área destacada rastreada pelo programa. Depois de rastrear todos os dendritos, clique em "Próximo passo".
  8. Depois que uma nova janela aparecer, salve a nova configuração com o título desejado. Clique em "Salvar".

9. Análise

  1. Abra o programa de análise (veja a tabela de materiais).
  2. Clique em "Arquivo" no menu superior e depois clique em "Abrir arquivo de dados". Selecione o arquivo de interesse.
  3. Sob a subposição de análise, selecione "Análise Sholl".
  4. Na janela "Análise Sholl", ajuste o raio de partida para 10 μm. Em "Análise", clique nas caixas "Dendritas" e "Ordens de Ramificação".
  5. Direito clIck na janela recém-inaugurada e clique em "Exportar Excel". Clique em "Salvar".
  6. Sob a análise, clique em "Análise de Estrutura Ramificada". Selecione "Todas as análises possíveis".
  7. Clique com o botão direito na janela recém-inaugurada e clique em "Excel Export" 24 .

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Representative Results

Os efeitos do tratamento com 5-Fu sobre a arborização dendrítica e a complexidade no hipocampo das seções cerebrais manchadas de Golgi foram quantificados e rastreados usando um software de imagem comercialmente disponível. Após o rastreamento, a arborização dendrítica, a densidade da coluna vertebral e a morfologia da coluna vertebral foram analisadas através da análise de Sholl e do índice de complexidade dendrítica (DCI). A análise de Sholl é um método analítico quantitativo que pode ser usado para determinar a morfologia do mandril dendrítico 25 . Partindo do soma, círculos de 10 μm um do outro sobrepõem os traçados dendríticos. O comprimento das dendritas é determinado pelo número de círculos que os dendritos atravessam. A análise do ponto de derivação, um método para verificar a complexidade de um mandril dendrítico, é baseada no número total e na ordem dos pontos de derivação.

Um ponto de ramificação é definido como quando umO ramo se divide em dois sub-ramos. A ordem do ramo é uma medida da complexidade baseada em quantas vezes os ramos se dividem. Por exemplo, um ponto de ramificação de primeiro plano seria o dendrite original que se estende do soma, enquanto um ponto de ramificação de segundo plano seria o ponto em que o ramo se divide em dois sub-ramos. Examinando os pontos de ramificação e a ordem de derivação, a complexidade do arrai dendrítico (com base no número de pontos de ramificação) e em que pontos ocorre a ramificação (uma ordem de derivação menor está mais próxima do soma, enquanto uma ordem de derivação maior é Mais longe do soma) pode ser determinado. Esses parâmetros foram aplicados ao DCI. O CA1 e o CA3 foram divididos em porções basais e apical e analisados ​​independentemente 26 , 27 .

Os dendritos dos neurônios piramidais CA1 e CA3 e os neurônios dos grânulos na DG foram analisados. Todos os neurônios selecionados paraCada grupo experimental preenchia os seguintes critérios: 1) os dendritos apresentavam manchas de Golgi escuras e consistentes em todo o seu comprimento, 2) os dendritos estavam visivelmente intactos e 3) cada neurônio tinha espaço suficiente entre eles para evitar interferências durante a análise 28 . A Figura 1 demonstra um neurônio que cumpre os critérios acima. Os dados foram expressos como média ± SEM. Para determinar as diferenças estatísticas entre a farsa e os grupos 5-Fu, utilizou-se um teste t pareado de duas colunas. Todas as análises estatísticas foram conduzidas usando software analítico (ver tabela de materiais) e p <0,5 foi considerado significativo. Uma análise de variância de fatores variados (ANOVA) foi utilizada para avaliar os efeitos do tratamento com 5-Fu e do raio de Sholl. Foram utilizados testes Fisher-LSD pós-hoc seguindo ANOVA quando apropriado 29 .

Em ambas as CA 1 ( t = 7,68, p <0,01; Figura 2 A ) e CA3 ( t = 7,54, p <0,01; Figura 3 A ) dendritas apicais piramidais, houve uma redução global significativa nas espinhas após o tratamento com 5-Fu. Embora o tratamento com 5-Fu não afetou significativamente a densidade da coluna vertebral basal de CA1 ( t = 1,79, p = 0,15; Figura 2 B ), diminuiu significativamente as espinhas dendríticas piramidais basais CA3 ( t = 5,57, p <0,05; Figura 3 B ). Além disso, os testes pós-hoc Fisher LSD revelaram uma diminuição da arborização dendrítica dos dendritos piramidais apical CA1 a 40-100 μm (LSD de Fisher, p <0,001; Figura 2 C ) e 130-160 μm (Fisher's LSD, p < 0,05;Figura 2 C ) longe do soma em comparação com os controles tratados com solução salina. Um fenômeno semelhante foi observado nos dendritos apical basais CA1 a 30-60 μm (LSD de Fisher, p <0,001, Figura 2 D ) e 70-110 Μm (LSD de Fisher, p <0,05; Figura 2 D ) longe do soma 29 .

Em relação aos dendritos piramidais apical CA3, não houve diferença significativa no comprimento dendrítico segmentar após o tratamento com 5-Fu comparado aos controles tratados com solução salina ( F (28,87) = 0,91; p = 0,59; Figura 3 C ). No entanto, para os dendritos piramidais basais CA3, houve diferença significativa entre o tratamento com 5-Fu e os controles tratados com solução salina no comprimento dendrítico segmentado ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Figura 3 D ). O LSD de Fisher revelou que o tratamento com 5-Fu diminuiu a arborização dendrítica a 90-100 μm ( p <0,01; Figura 3 D ), 70-80 μm e 110-120 μm (LSD de Fisher, p <0,05; Figura 3 D ) Longe do soma 29 .

Para determinar a complexidade dendrítica, foi utilizada uma análise de ordem de derivação para comparar os grupos de controle tratado com 5-Fu e com solução salina. Dentro da DG, a análise da ordem de derivação mostrou uma diferença significativa entre cada tratamento e ordem de derivação ( F (8, 36) = 25,61, p <0,001; Figura 4 ). Isto foi analisado adicionalmente usando o LSD de Fisher, o que indicava que havia um comprimento reduzido no e Ordem após o tratamento com 5-Fu ( p <0,001; Figura 4 ) 29 .

figura 1
Figura 1 : neurônio corado de Golgi que representa os critérios de imagem e análise posterior. Todos os três tipos de espinha podem ser facilmente vistos após a coloração de Golgi. A coloração é consistente em todo o comprimento da dendrite e a dendrite é isolada de outros neurônios. Barra de escala, 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 : Golgi manchado n Eurons demonstraram diferenças significativas na densidade da coluna vertebral entre os grupos tratados com 5-Fu e com solução salina no CA1 apical, mas não com o CA1 basal. Houve uma diferença significativa no comprimento da coluna vertebral entre os grupos tratados com 5-Fu e tratados com solução salina em CA1 apical e basal. (A) Nas dendritas piramidais apical CA1, 5-Fu diminuiu significativamente a densidade da coluna vertebral. ( B ) Nas dendritas basais, não houve mudanças significativas na densidade geral das espinhas. ( C ) A análise de Sholl revelou que o tratamento com 5-Fu diminuiu significativamente a arborização dendrítica a 40-100 μm e 130-160 μm de distância do soma nos dendritos piramidais apical CA1. ( D ) Nas dendritas basais, o tratamento com 5-Fu diminuiu a arborização dendrítica a 30-60 μm e 70-110 μm de distância do soma. Média ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3 : Os neurônios coloridos com Golgi demonstraram diferenças significativas na densidade da coluna vertebral entre grupos tratados com 5-Fu e tratados com solução salina em CA3 apical e basal. Houve uma diferença significativa no comprimento da coluna entre os grupos tratados com 5-Fu e tratados com solução salina em CA3 apical, mas não CA3 basal. (A) Nos dendritos piramidais apical CA3, 5-Fu diminuiu significativamente a densidade da coluna vertebral. ( B ) Nas dendritas basais, 5-Fu diminuiu significativamente a densidade geral das espinhas. ( C ) Não houve efeito significativo do tratamento com 5-Fu na área apical CA 3. ( D ) Nas dendritas basais, 5-Fu treaDiminuiu a arborização dendrítica 70-120 μm de distância do soma. Média ± SEM (n = 6). *, P <0,05; **, p <0,01, ANOVA 29 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 : Os neurônios coloridos com Golgi no DG apresentaram diminuição do comprimento na e 6ª ordem após o tratamento com 5-Fu em comparação com o grupo tratado com solução salina. Comprimento por ramificação em neurônios piramidais da região do hipocampo CA1. Média ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 . SentidoClique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Comparado com técnicas mais modernas, o método de Golgi-Cox tem várias vantagens que o tornam o método preferido para examinar a morfologia da coluna: 1) A coloração pode ser usada para essencialmente qualquer tecido, 2) Uma configuração básica de microscópio de luz é tudo o que é necessário para Adquirir imagens baseadas em Golgi, 3) A imagem de Golgi-Cox é mais rápida do que a imagem confocal, e 4) As secções coradas de Golgi são viáveis ​​por vários meses a anos mais do que as amostras que são marcadas de forma fluorescente. Mesmo com essas vantagens, o método Golgi-Cox ainda possui certas limitações. Primeiro, todo o processo é muito demorado, exigindo várias semanas de coloração seguido de análise das imagens. Como visto com este protocolo, leva 14 dias na solução A e 1 dia na solução B antes que o corte possa começar. Além disso, realizar secções, pós-tintas e montagem levará 2-3 horas por cérebro. Cada lâmina deve secar por 1 dia antes de limpar e cobri-los. Depois disso, a quantidade de tempoIsso levará a imagem e análise, as seções dependerão do indivíduo. Em segundo lugar, pode haver problemas de consistência entre os dados dos analistas devido a diferenças na categorização das espinhas 30 . Por esse motivo, recomenda-se que uma pessoa realize a parcela de análise e análise de cada experiência, o que amplia a quantidade de tempo para a conclusão do projeto.

Existem vários passos críticos do método de Golgi-Cox que exigem tempo e atenção exatos. Ao colher as secções com a solução de hidróxido de amônio, é imperativo que as secções permaneçam na solução durante pelo menos 19 minutos, mas não durante 21 min. Se as seções não estiverem na solução de hidróxido de amônio por tempo suficiente, elas não serão coradas adequadamente, o que significa que os neurônios ficarão menos definidos quando se formam imagens, tornando mais difícil analisá-las. Se as secções estiverem na solução de hidróxido de amónio durante mais de 21 min, elas podem se tornar ovEr-manchado, tornando assim difícil identificar os neurônios individuais. Portanto, ao mudar as soluções, o pesquisador deve se mover rapidamente. Outro passo importante é a transferência das seções para slides. Antes de mover as seções com o grande pincel, é melhor primeiro adicionar uma pequena quantidade do PBS-T no slide. Isso permite que as seções sejam facilmente colocadas no slide e manobradas sem potencialmente quebrar. Mais um passo crítico é o passo de secagem após as seções serem colocadas em um slide. Se as lâminas não se secarem durante pelo menos 20 minutos à temperatura ambiente, então certas seções serão provavelmente caídas durante as etapas de desidratação. Se as lâminas secarem por mais de 30 min, elas provavelmente se tornarão quebradiças e se separarão durante as etapas de desidratação.

Ao executar este procedimento, existem certas etapas que podem ser problemáticas. Por exemplo, se o cerebelo inteiro for cortado antes de colocar o cérebro na especificaçãoSuporte e corte, o cérebro pode se separar antes que a DG seja completamente seccionada, tornando inutilizáveis ​​outras seções. Portanto, é importante cortar apenas caudalmente cerca de metade do cerebelo. Outro passo que pode afetar negativamente as seções é a velocidade do vibratoma e a amplitude. Enquanto as configurações recomendadas são para 7 e 6, respectivamente, após o corte, certas seções podem desintegrar-se no PBS ou aparecer desigual. Para corrigir isso, ajuste finamente a velocidade vibratométrica ou a amplitude, uma de cada vez até as seções serem intactas e até mesmo, entre as configurações de 6-8.

Mesmo que os kits comerciais para a coloração de Golgi estejam disponíveis, muitas vezes eles não possuem detalhes exatos para cada passo individual. Com este protocolo, relatamos detalhadamente todas as etapas que foram usadas para permitir que outros laboratórios manchassem de forma confiável tecido em alta qualidade com solução de problemas mínima. Os materiais utilizados estão disponíveis para a maioria dos laboratórios de neurociência. Aberrações em dendrite morpA hologia e as alterações no número de espinhas dendríticas estão relacionadas a uma infinidade de distúrbios neurológicos 31 . Além disso, essas perturbações da arborização dendrítica podem representar uma marca morfológica significativa da lesão induzida por quimioterapia no cérebro 32 . No futuro, examinaremos como as alterações estruturais induzidas pelo 5-Fu podem estar relacionadas às mudanças comportamentais, celulares e moleculares.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma concessão piloto sob o NIH P20 GM109005 (ARA) e pelo prêmio do Centro de Tradução de Neurociências IDEA P30 GM110702.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

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References

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