Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we een Golgi-Cox protocol in uitgebreid detail. Deze betrouwbare weefselvlekmethode zorgt voor een hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus, en door de hele hersenen, met minimale probleemoplossing.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dendritische stekels zijn de uitsteeksels van de neuronale dendritische assen die excitatoire synaptes bevatten. De morfologische en vertakkingsvariaties van de neuronale dendriten binnen de hippocampus zijn betrokken bij cognitie en geheugenvorming. Er zijn verschillende benaderingen voor Golgi-kleuring, die allemaal nuttig zijn om de morfologische kenmerken van dendritische arbors te bepalen en een heldere achtergrond te geven. De huidige Golgi-Cox methode, (een lichte variatie van het protocol dat wordt geleverd met een commerciële Golgi-kleuringskit) werd ontworpen om te beoordelen hoe een relatief lage dosis van het chemotherapeutische geneesmiddel 5-flurouracil (5-Fu) de dendritische morfologie zou beïnvloeden , Het aantal stekels en de complexiteit van arborisatie binnen de hippocampus. De 5-Fu gemoduleerde de dendritische complexiteit aanzienlijk en verminderde de ruggengraat door de hippocampus op een regio-specifieke manier. Uit de getoonde gegevens blijkt dat de Golgi-kleurmethode efFectively gekleurde de volwassen neuronen in de CA1, de CA3 en de dentate gyrus (DG) van de hippocampus. Dit protocol rapporteert de details voor elke stap, zodat andere onderzoekers het weefsel in de hersenen op betrouwbare wijze kunnen vlek met hoge kwaliteit resultaten en minimale probleemoplossing.

Introduction

Dendrieten zijn het grootste deel van neuronen die presynaptische input 1 ontvangen en verwerken. Hun dendritische processen hebben een complexe geometrie, waarbij de proximale takken een grotere diameter hebben dan de distale takken. Zoals dendrieten ontwikkelen vormen ze verschillende verbindingen met andere neuronen in een proces dat wordt aangeduid als dendritische arborisatie. De omvang en het patroon van deze vertakking bepaalt de hoeveelheid synaptische ingangen die een dendriet adequaat kan verwerken 2 .

Dendritische arborisatie is een noodzakelijk proces voor activiteitafhankelijke plasticiteit en goede ontwikkeling van neuronale circuits. Extensie, terugtrekking, vertakking en synaptogenese zijn ingewikkelde processen die intrinsieke genetische programma's bevatten en invloeden van extrinsieke factoren. De morfologische en vertakkingsvariaties van de neuronale dendriten binnen de hippocampus zijn betrokken bij cognitie en geheugenvormingF "> 3 , 4. De veranderingen in dendritische complexiteit worden geassocieerd met pathofysiologische en gedragsveranderingen 5. Abnormaliteiten zijn gerelateerd aan verschillende ziektetoestanden, waaronder Fragile X Syndrome en Down Syndrome 6 .

Dendritische stekels zijn de gespecialiseerde subcellulaire compartimenten van de dendritische arbors die excitatoire input binnen het centrale zenuwstelsel ontvangen. Er zijn drie morfologische klassen dendritische stekels, met de naam van elke klas op basis van hun grootte en vorm: 1) Paddestoelenwervels, die complexe postsynaptische dichtheden hebben met meer glutamaatreceptoren dan andere stekels 7 ; 2) Stompe stekels, die geen stam hebben; En 3) dunne stekels, die bestaan ​​uit een langwerpige, smalle stam en een bolvormige kop 8 . Het dendritische wervelkolomvolume wordt gedeeltelijk gebruikt om ze te definiëren, met dunne wervelkolven over het algemeen kleiner (0,01 μm 3 3 ) 9 , 10 . De stekels stabiliseren met rijping. Bijvoorbeeld, de dunne wervels trekken zich na een paar dagen terug of ontwikkelen zich tot paddenstoelen. Als alternatief zijn de paddenstoelen relatief stabiel en kunnen ze gedurende een langere periode overleven. De sterkte van de neuronale verbindingen wordt geacht te zijn gebaseerd op het aantal stekels en / of hun volume 11 , 12 , 13 .

De klassieke Golgi-kleurmethode en zijn modernere variaties zijn allemaal handig om de dendritische ruggengraat morfologie en dichtheid te onderzoeken. Een uniek aspect van de Golgi-kleuring is dat het ongeveer 5% van de totale neuronen willekeurig vlekt, waardoor er sprake is van individuele neuronen 14 , 15 . Hoewel het exacte mechanisme waarin de Golgi methOd vlekken individuele neuronen is nog onbekend, het principe van de methode is gebaseerd op de kristallisatie van zilverchromaat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Er zijn drie hoofdsoorten van de Golgi-methode: de snelle Golgi, de Golgi-Cox en de Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle drie methoden beginnen met een eerste incubatiefase in chroomzouten gedurende meerdere dagen tot maanden, maar er zijn bepaalde belangrijke verschillen tussen hen. De snelle Golgi maakt gebruik van osmiumtetroxide in de eerste stap, terwijl de Golgi-Kopsch paraformaldehyde bevat. De vlek in zowel de snelle Golgi als de Golgi-Kopsch wordt gevolgd door een incubatie in ongeveer 1-2 dagen zilvernitraatoplossing. De methode Golgi-Cox maakt gebruik van mercuric chloride en kalium dichromaat in plaats van zilvernitraat en heeft een impregneringstijd van 2-4 weken. De weefsels worden dan gesneden en snel in een verdunde ammoniak geplaatstOplossing, gevolgd door een fotografische fixer om zouten te verwijderen. Van de drie typen wordt de Golgi-Cox methode gedacht als het beste bij het vlek van de dendritische arbors zonder veel achtergrondinterferentie, onder andere omdat de kristalartefacten niet op het oppervlak van het weefsel voorkomen (anders dan in de snelle Golgi-methode) 17 , 20 , 21 .

De huidige methode is een lichte variatie van het protocol dat wordt geleverd met een commercieel Golgi-kleurset, en is ontworpen om te beoordelen hoe een relatief lage dosis van de 5-Fu de dendritische morfologische eigenschappen en de ruggengraat zou beïnvloeden. Alle verkregen gegevens kunnen verder inzicht geven in de manier waarop chemotherapeutische behandeling de neuronale schakeling beïnvloedt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee bij UAMS.

1. Dieren en 5-Fu Injectie Paradigma

  1. Koop 6 maanden oude mannelijke C57Bl6 / J wild-type muizen en houd ze onder een constante 12 uur licht / donkere cyclus tot ze 1 jaar oud zijn.
  2. Verdun de 5-Fu in 0,9% steriele zoutoplossing. Gebruik 60 mg / kg als de vereiste dosis per muis.
  3. Geef de intraperitoneale injecties van de 5-Fu (eenmaal per week gedurende drie weken).
    1. Geef de intraperitoneale injecties ongeveer dezelfde tijd op elke dag. Bijvoorbeeld, tussen 0900-1200 uur.
  4. Euthanize de dieren en trek de hersenen 30 dagen na de laatste injectie.

2. Euthanasieprocedure en breinwinning

  1. Houd de knaagdier vast en grijp de basis van de staart vast. Plaats de duim of vinger aan de andere kant bij de handE basis van de nek van de knaagdier. Zet druk snel op de nek van de knaagdier en duw naar voren terwijl de andere hand met de staart naar achteren trekt.
  2. Houd het knaagdier met de ene hand en de grote chirurgische schaar met de andere. Plaats de nek van de knaagdier tussen de twee bladen en ontdek het hoofd snel.
  3. Neem de gesneden muishoofd en gebruik de fijne schaar om de bont boven de schedel te trimmen, tot aan de ogen. Plaats vervolgens de uiteinden van de schaar in elke oogcontact en sluit de schaar met kleine kracht.
  4. Gebruik de lente schaar om de schedel naar links en rechts van het cerebellum te snijden.
  5. Gebruik pincet om het gedeelte van de schedel omstreeks de cerebellum rechtstreeks op en uit te halen.
  6. Gebruik de lente schaar om de midsagittale lijn van de schedel te snijden.
  7. Gebruik de tang om het resterende gedeelte van de schedel uit de hersenen op te tillen.
  8. Gebruik een spatel en een sonde om de hersenen in de gewenste container uit te schuiven. Met een roestvrij sTeelblad, snijd elke hersenen langs het midsagittale vlak. Voer de volgende Golgi-Cox methode uit op de rechterhelft.

3. Golgi Staining en Weefsel Voorbereiding

  1. Dompel de vers geoogste halve hersenen in een 10 ml conische buis in 5 ml oplossing op basis van oplossing op basis van oplossing op basis van chloride (oplossing A uit de kit). De mercuric chloride oplossing is lichtgevoelig; Bedek de buis met folie. Bewaar het monster bij kamertemperatuur in het donker.
    OPMERKING: Oplossing A wordt geleverd in de kit die staat vermeld in de tabel van materialen. Voorzichtigheid! Oplossing A (ook wel mercuric chloride oplossing genoemd) bevat giftige reagentia zoals kaliumdichromaat, mercuric chloride en kaliumchromaat. Draag beschermende handschoenen en werk in een afzuigkap.
  2. Na 1 dag, verdeel de oplossing langzaam in een tijdelijke container (zoals een grote weegboot) en verwijder het in een afvalhouder voor biohazard. Dompel de hersenen (nog steeds in de originele 10 ml conische buizen) met 5 mlDe mercuric chloride oplossing, en laat het monster gedurende 13 dagen terugkeren naar het donker bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 30 g postimpregnatiebuffer toe aan 90 ml gedistilleerd of gedeïoniseerd water (dH 2 O). Vul elk putje van een 6-putjesplaat met 6,5 ml van de postimpregnatiebuffer, een put per brein
    OPMERKING: Postimpregnatiebuffer wordt geleverd in de kit die staat vermeld in de tabel van materialen.
    1. Na 14 dagen (in totaal) in de mercuric chloride oplossing, spoel het weefsel met dH 2 O af en laat ze vervolgens over in 6-putjes platen met postimpregnatiebuffer. Bedek de platen met folie en sla ze op bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Pipetteer de postimpregnatiebuffer na 1 dag onderdompeling en vernieuw met verse post-impregnatiebuffer; Bewaar gedurende 1 dag in het donker bij kamertemperatuur. Bewaar dit indien nodig bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand 22 .

4. Sectie

  1. Meld de 12-putjesplaten op hun deksels met nummers in oplopende volgorde van links naar rechts en van boven naar beneden.
  2. Bereid twee of drie 12-putjesplaten per hersen voor als u de hele hersenen snijdt.
    1. Benoem de bovenkant van elk 12-deksel deksel met het identificatienummer van de hersenen.
    2. Pipetteer 2 ml 1x PBS in elke putje van elke plaat.
  3. Stel het podium op en zet de vibratomeer aan; Zorg ervoor dat er genoeg 1x PBS in de container is om het weefsel te bedekken.
    1. Snijd twee stukken plastic parafinfolie en vouw ze twee keer over. Plaats ze over de gaten voor de specimenhouderknoppen om te voorkomen dat 1x PBS op de toonbank lekt.
    2. Zet de tape op het weefselblok van de specimenhouder en zet dan de cyanacrylaat lijm lijm (zie tabel van materialen) erop.
  4. Verwijder de hersenen uit de 6-putjesplaat en plaats deze op een plastic of glasschotel. Gebruik de roestvrijstalenStaal dubbelzijdig mes om ongeveer de helft van het cerebellum af te snijden.
    1. Snijd het cerebellum caudally. Zorg ervoor dat het gedeelte van het resterende cerebellum gelijk is.
  5. Plaats het platte oppervlak van het resterende cerebellum onmiddellijk op de lijm.
    OPMERKING: Het dorsale deel van het weefsel (de hersencortex) moet links of rechts ten opzichte van het mes worden geconfronteerd. Het rostrale uiteinde dat eerder de olfactorische bollen bevatte had, moest naar boven gericht zijn.
    1. Wacht minstens een paar minuten om ervoor te zorgen dat de lijm helemaal droogt.
  6. Terwijl de lijm die de hersenen vasthoudt, droogt, giet 1x PBS in het specimenbad. Nadat de lijm droog is, plaats de specimenhouder met het weefsel in het specimenbad.
    1. Als het weefselmonster niet volledig is bedekt, giet meer 1x PBS in het specimenbad.
  7. Bevestig het mes aan de meshouder van de vibratoom en langzaam lZet het mes in het specimenbad totdat het volledig is ondergedompeld in 1x PBS. Ga door met het verlagen van het mes tot het iets onder de bovenkant van het weefsel zit.
  8. Stel de trillingssnelheid in op 7, de amplitude tot 6, en de snijhoek tot 12 ° (zie tabel van materialen voor het vibratome-model). Start de trilling en snijd 200 μm secties 23 .
    1. Gebruik een grote pensel om de weefselsecties van het specimenbad te verplaatsen naar elke aangewezen put van de 12-putjesplaten.
  9. Ga door tot het gewenste aantal weefselsecties bereikt wordt.

5. Post-staining

  1. Voor elk van de volgende vlekstapjes en spoeltjes gebruikt u 2 ml van de aangegeven oplossing per putje. Gebruik een gemotoriseerde pipet vulmiddel (zie tabel van materialen) om de oplossingen in de putjes over te brengen. Gebruik een transferpipette (zie tabel van materialen) om oplossingen uit de putjes en in het juiste afval over te brengencontainers.
  2. Spoel de secties in een 30 minuten was van 0,01 M PBS-T (voeg 3,0 mL detergens toe (zie tabel van materialen) tot 1000 ml 0,01 M PBS).
  3. Verdun ammoniumhydroxideoplossing (voorzichtig) 3: 5 vol met dH 2 O onmiddellijk voor gebruik. Vlek de secties in de verdunde ammoniumhydroxideoplossing gedurende 19-21 minuten.
    1. Bescherm de lichtgevoelige ammoniumhydroxideoplossing met folie.
      OPMERKING: Ammoniumhydroxide binnen oplossing heeft een concentratie van ~ 10% en is geclassificeerd als 'gevaarlijk'. Ammoniumhydroxideoplossing kan brandwonden veroorzaken als het in contact komt met de huid. Het kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken bij inademing. Draag beschermende handschoenen en werk in een afzuigkap.
  4. Vlek de secties in de post-staining buffer (voeg 90 g reagent D in 500 mL dH 2 O) gedurende 19-21 min. De post-staining buffer is lichtgevoelig; Bescherm het met folie 22 .
  5. Spoel de secties in drie, 5-10 minuten wassen van 0,01 M PBS-T.

6. Montage, schoonmaken en bedekken

  1. Monteer de afdelingen op 1% gelatine-gecoate glijbanen met de grote verfborstel. Laat ze gedurende 20-30 minuten drogen bij kamertemperatuur, en plaats ze dan in een Coplin pot overnacht.
  2. Verwijder de glijbanen met handschoenen uit de Coplin pot en plaats ze in een plastic rek (zie tabel van materialen). Plaats het plastic rek in de vlekschotel (zie tabel van materialen) die 100% ethanol bevat. Ontvetten ze met drie 5 minuten wast.
  3. Was de glijbanen twee keer gedurende 5 minuten elk in 99% xyleen. Plaats de glijbanen in een glazen rek en steek het rekje in een glazen vlekschotel met xyleen met een metalen handgreep (zie tabel van materialen).
    OPMERKING: Voorzichtigheid Xylene is schadelijk bij inademing en irritatie veroorzaakt als het aan de huid raakt. Het is zeer brandbaar in vloeibare en damptoestanden. Draag beschermende handschoenen en werk in een afzuigkap.
  4. Verwijder de dia's van de xylÉén op een keer en bedek het weefsel snel met ~ 0,25 ml montagemedia (zie Materiaaltafel). Vervolgens pak de diahoes en leg ze over de media.
    1. Duw alle gevangen luchtbellen onder de schuifdoppen naar de rand met een stomp voorwerp, zoals het einde van een penseel.
  5. Plaats de glijbanen in een gebied buiten het zonlicht en laat ze 2-3 dagen drogen.
  6. Ga door met het verkrijgen van beelden met behulp van een microscoop en analyseren met de juiste software.

7. Verkrijg Beeldstack

  1. Open het afbeeldingsprogramma (zie Materialtabel ). Plaats de dia op het podium van de microscoop. Klik in het menu bovenaan het programma op 'Acquisitie' en klik vervolgens op 'Live Image'.
  2. Zet de microscoop op 10X. Identificeer de neuron van voorkeur en breng dan de cursor, die lijkt op een rode X, in het midden van de soma. Links klikken om het referentiepunt in te stellen.
  3. Zet de microscoop op 40X. Klik op 'Beweeg' in het menu boven aan het programma en klik vervolgens op 'Naar referentiepunt'.
  4. Begin met het maken van de beeldstapel door handmatig te scrollen met de fijne doelstelling boven het weefsel totdat het iets uit focus ligt.
    1. Klik op "Set Top" in de rechterbenedenhoek van het programma onder de rubriek "Image Acquisition."
    2. Blader iets onder het weefsel totdat het een beetje uit de focus ligt en klik vervolgens op "Set Bottom" onder "Image Acquisition." Klik vervolgens op 'Beeldstack ophalen'.
  5. Nadat de afbeeldingsstapel is verkregen, typt u de gewenste naam voor het afbeeldingsbestand in het venster dat verschijnt. Opslaan als "MBF Ascii-bestand."
    1. Wanneer u wordt gevraagd, selecteer het bestandstype als "MBF JPEG2000 stapelbestand" en klik vervolgens op "Opslaan".

8. Neuronale tracing

  1. In de toolbaKlik onder het menu op het vakje met de titel "Contour Name". Selecteer "Soma" in de vervolgkeuzelijst.
  2. Spoor de soma handmatig op. Klik dan met de rechtermuisknop en selecteer "Afwerking cellichaam" wanneer het traceren voltooid is.
  3. Selecteer "AutoNeuron" om een ​​ander tabblad met de titel "AutoNeuron Workflow" op te halen.
  4. Onder "Configuratietype" selecteert u "Nieuw". Stel de parameters in en klik vervolgens op "Next Step" om "Soma Detection" onderverdeling op te roepen.
    1. Selecteer "Brightfield" om de parameters in te stellen. Klik vervolgens onder "Max proces diameter", klik op "Start meten". Ga met de cursor naar de basis van de dendriet en stel de diameter handmatig in.
  5. Klik op 'Ja' in het venster dat de gebruiker vraagt ​​om de gehele afbeelding te traceren. Spoor de soma handmatig op. Klik op en klik vervolgens op "Volgende stap" om de onderkant van de zaadpositie op te halen.
  6. Klik op "Bevestigen SeedS "en klik vervolgens op" Next Step "om de subrubriek" Neuron Reconstruction "op te halen.
  7. Klik onder 'Neuron' op 'Interactief'. Doe interactieve tracing door de richting van het programma van de dendriten te volgen en met de rechtermuisknop te klikken om het gemarkeerde gebied dat door het programma wordt gevolgd af te ronden. Nadat u alle dendriten hebt opgespoord, klikt u op 'Volgende stap'.
  8. Nadat een nieuw venster verschijnt, slaat u de nieuwe configuratie op met een gewenste titel. Klik op 'Opslaan'.

9. Analyse

  1. Open het analyseprogramma (zie de tabel van materialen).
  2. Klik op "Bestand" in het bovenste menu en klik vervolgens op "Gegevensbestand openen". Selecteer het bestand van belangstelling.
  3. Selecteer onder de analyse onderverdeling "Sholl Analysis."
  4. Stel in het venster "Sholl Analyse" de startradius op 10 μm. Klik onder 'Analyse' op de vakken 'Dendrites' en 'Branch Orders'.
  5. Rechts clIck de nieuw geopende windows en klik op "Excel Export." Klik op 'Opslaan'.
  6. Klik onder de analyse op 'Vertakte structuuranalyses'. Selecteer 'Alle mogelijke analyses'.
  7. Klik met de rechtermuisknop op het nieuw geopende venster en klik op "Excel Export" 24 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De effecten van de 5-Fu behandeling op de dendritische arborisatie en complexiteit in de hippocampus van Golgi-gekleurde hersensecties werden gekwantificeerd en opgespoord onder gebruikmaking van een commercieel beschikbare beeldsoftware. Na het traceren werden de dendritische arborisatie, de ruggengraat en de ruggengraat morfologie geanalyseerd met behulp van Sholl analyse en de dendritische complexiteitsindex (DCI). Sholl analyse is een kwantitatieve analytische methode die kan worden gebruikt om de dendritische arbor morfologie 25 te bepalen. Uitgaande van de soma overlaten de cirkels 10 μm van elkaar de dendritische tracings. De lengte van de dendriten wordt bepaald door het aantal cirkels dat de dendrieten oversteken. De branchepuntanalyse, een methode om de complexiteit van een dendritische boom te bepalen, is gebaseerd op het totale aantal en de volgorde van de takpunten.

Een takpunt wordt gedefinieerd als wanneer aTak splitst in twee subtakken. De takorder is een maatstaf voor de complexiteit op basis van hoe vaak de takken verdelen. Bijvoorbeeld, een eerste-orde takpunt zou de oorspronkelijke dendriet zijn die zich uitstrekt van de soma, terwijl een tweede-orde takpunt het punt zou zijn waarop de tak in twee subtakken verdeelt. Door zowel de takpunten als de takorder te onderzoeken, is de complexiteit van de dendritische arbor (op basis van het aantal vertakkingspunten) en op welke punten de vertakkingen plaatsvinden (een kleinere takorder is dichter bij de soma, terwijl een grotere takorder is Verder van de soma) kan worden bepaald. Deze parameters werden toegepast op de DCI. De CA1 en CA3 werden verdeeld in apische en basale delen en onafhankelijk geanalyseerd 26 , 27 .

De dendrieten van de CA1- en CA3-pyramidale neuronen en granule-neuronen in het DG werden geanalyseerd. Alle neuronen geselecteerd voorR elke experimentele groep voldaan aan de volgende criteria: 1) de dendrieten hadden donkere en consistente Golgi over hun gehele lengte, 2) de dendriten waren zichtbaar intact en 3) elke neuron had voldoende ruimte tussen hen om interferentie te voorkomen tijdens de analyse 28 . Figuur 1 toont een neuron die aan bovenstaande criteria voldoet. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Om de statistische verschillen tussen de sham en de 5-Fu groepen te bepalen, werd een paired tweetailed t- test gebruikt. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van analytische software (zie tabel van materialen) en p <0,5 werd significant beschouwd. Een variatie van varianten van variaties (ANOVA) werd gebruikt om de effecten van de 5-Fu behandeling en de Sholl radius te evalueren. Fisher LSD post-hoc testen werden gebruikt bij toepassing van ANOVA, indien van toepassing 29 .

In beide CA 1 ( t = 7,68, p <0,01, Figuur 2A) en CA3 ( t = 7,54, p <0,01; Figuur 3A) apische pyramidale dendrieten, was er een significante algemene reductie in ruggengraat na de 5-Fu behandeling. Terwijl de 5-Fu behandeling geen significante invloed had op de basale ruggengraat dichtheid van CA1 ( t = 1,79, p = 0,15; Figuur 2 B ), verminderde de CA3 basale pyramidale dendritische wervelkolom ( T = 5,57, p <0,05; B ). Bovendien bleken de Fisher LSD post-hoc tests een daling van de dendritische arborisatie van de CA1 apische pyramidale dendriten bij 40-100 μm (Fisher's LSD, p <0.001, Figuur 2C) en 130-160 μm (Fisher's LSD, p < 0,05;Ig "> Figuur 2 C ) weg van de som in vergelijking met de zoutbehandelde controles. Een soortgelijk verschijnsel werd gezien in de CA1 basale apische dendriten bij 30-60 μm (Fisher's LSD, p <0.001; Figuur 2D ) en 70-110 Μm (Fisher's LSD, p <0,05; Figuur 2 D ) weg van de soma 29 .

Wat betreft de CA3-apische pyramidale dendriten was er geen significant verschil in de segmentale dendritische lengte na de 5-Fu behandeling in vergelijking met de zoutbehandelde controles ( F (28,87) = 0,91; p = 0,59; Figuur 3C ). Voor de CA3 basale pyramidale dendrieten was er echter een significant verschil tussen de 5-Fu behandeling en de zout behandelde controles in de segmentale dendritische lengte ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Figuur 3 D ). De Fisher's LSD onthulde dat de 5-Fu behandeling de dendritische arborisatie bij 90-100 μm verminderde ( p <0,01, Figuur 3 D ), 70-80 μm en 110-120 μm (Fisher's LSD, p <0,05; Figuur 3 D ) Weg van de soma 29 .

Om de dendritische complexiteit te bepalen, werd een takorderanalyse gebruikt om de 5-Fu behandelde en de zout behandelde controlegroepen te vergelijken. Binnen het DG liet de takorderanalyse een significant verschil zien tussen elke behandeling en takorder ( F (8, 36) = 25.61, p <0.001; Figuur 4 ). Dit werd verder geanalyseerd met behulp van de Fisher's LSD, wat aangaf dat er een verlaagde lengte was op de 4e en 6eVolgorde van de 5-Fu behandeling ( p <0.001; Figuur 4 ) 29 .

Figuur 1
Figuur 1 : Golgi-gebleekte neuron die de criteria voor beeldvorming en verdere analyse vertegenwoordigt. Alle drie ruggengraatjes kunnen gemakkelijk gezien worden door de Golgi-kleuring. Staining is consistent over de gehele lengte van de dendriet en de dendriet is geïsoleerd van andere neuronen. Schaalbalk, 5 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 : Golgi gebleekt n Euronen demonstreerde significante verschillen in ruggengraat dichtheid tussen de 5-Fu behandelde en de zout behandelde groepen in de apicale CA1, maar niet de basale CA1. Er was een significant verschil in de ruggengraat tussen 5-Fu behandelde en zout behandelde groepen in zowel apicale als basale CA1. (A) In de CA1-apische pyramidale dendriten verminderde 5-Fu de ruggengraat dichtheid significant. ( B ) In de basale dendriten waren er geen significante veranderingen in de totale dichtheid van wervels. ( C ) Sholl analyse bleek dat de 5-Fu behandeling dendritische arborisatie bij 40-100 μm en 130-160 μm van de soma in de CA1-apische pyramidale dendriten aanzienlijk verminderde. ( D ) In de basale dendriten verminderde de 5-Fu behandeling de dendritische arborisatie bij 30-60 μm en 70-110 μm van de soma. Gemiddeld ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 3
Figuur 3 : Golgi-gebleekte neuronen duiden significante verschillen in ruggengraat dichtheid tussen 5-Fu behandelde en zout behandelde groepen in zowel apische als basale CA3. Er was een significant verschil in ruggengraat tussen 5-Fu behandelde en zout behandelde groepen in apicale CA3, maar niet basale CA3. (A) In de CA3-apische pyramidale dendrieten verminderde 5-Fu de ruggengraat dichtheid significant. ( B ) In de basale dendrieten daalde 5-Fu de totale dichtheid van stekels significant. ( C ) Er was geen significant effect van 5-Fu behandeling in het CA 3 apicale gebied. ( D ) In de basale dendrieten, 5-Fu treaTment verminderde dendritische arborisatie 70-120 μm weg van de soma. Gemiddeld ± SEM (n = 6). *, P <0,05; **, p <0,01, ANOVA 29 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4 : Golgi-gebleekte neuronen in het DG vertoonden een verminderde lengte bij de 4e en 6de orde na 5-Fu behandeling in vergelijking met de zout behandelde groep. Lengte per takorder in pyramidale neuronen van het CA1 hippocampale gebied. Gemiddeld ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 . PleitenZie klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vergelijking met moderne technieken heeft de Golgi-Cox-methode verschillende voordelen die het de voorkeur geven aan de methode voor het onderzoeken van de ruggengraat morfologie: 1) De kleuring kan voor ieder willekeurig weefsel gebruikt worden. 2) Een basislichtmicroscoopopstelling is alles wat nodig is om Golgi-gebaseerde beelden verkrijgen, 3) De Golgi-Cox beeldvorming is sneller dan confocal beeldvorming, en 4) Golgi-gekleurde afdelingen zijn enkele maanden levensvatbaar tot jaren langer dan monsters die fluorescent gelabeld zijn. Zelfs met deze voordelen heeft de Golgi-Cox-methode nog steeds bepaalde beperkingen. Ten eerste is het hele proces erg tijdrovend, wat een paar weken langvlek vereist, gevolgd door het analyseren van de afbeeldingen. Zoals gezien bij dit protocol duurt het 14 dagen in oplossing A en 1 dag in oplossing B voordat de sectie kan beginnen. Bovendien, het uitvoeren van sectie, post-staining en montage duurt 2-3 uur per hersenen. Elke dia moet 1 dag drogen voordat u ze schoonmaakt en bedekt. Daarna, de hoeveelheid tijdHet zal naar beeld gaan en de secties analyseren zullen afhangen van het individu. Ten tweede kunnen er problemen zijn met de consistentie tussen de gegevens van analisten door verschillen in het categoriseren van wervels 30 . Om deze reden wordt aanbevolen dat één persoon het beeld- en analyse gedeelte van elk experiment uitvoert, waardoor de hoeveelheid tijd voor het afronden van het project verder wordt verlengd.

Er zijn verschillende kritieke stappen van de Golgi-Cox methode die exacte timing en aandacht vereisen. Bij het vlekken van de delen met de ammoniumhydroxideoplossing is het absoluut noodzakelijk dat de secties gedurende tenminste 19 minuten in de oplossing blijven, maar niet over 21 minuten. Als de secties niet genoeg tijd in de ammoniumhydroxideoplossing hebben, worden ze niet goed gekleurd, waardoor de neuronen minder gedetailleerd zullen worden beschouwd bij beeldvorming, waardoor het moeilijker wordt om ze te analyseren. Als de secties meer dan 21 minuten in de ammoniumhydroxideoplossing zijn, kunnen ze ov wordenEr-gekleurd, waardoor het moeilijk is om de individuele neuronen te identificeren. Daarom, bij het uitschakelen van de oplossingen, moet de onderzoeker snel verhuizen. Een andere belangrijke stap is de overdracht van de afdelingen op glijbanen. Voordat u de delen met de grote penseel verplaatst, kunt u eerst een kleine hoeveelheid van de PBS-T op de glijbaan toevoegen. Hiermee kunnen de delen gemakkelijk op de glijbaan worden geplaatst en manoeuvreren zonder dat ze eventueel kunnen uit elkaar breken. Nog een kritische stap is de droogstap nadat de secties op een dia zijn geplaatst. Als de dia's bij kamertemperatuur gedurende tenminste 20 minuten niet drogen, dan zullen bepaalde delen waarschijnlijk tijdens de uitdrogingstappen vallen. Als de dia's langer dan 30 minuten drogen, zullen ze waarschijnlijk bros worden en tijdens de uitdrogingstappen loskomen.

Bij het uitvoeren van deze procedure zijn er bepaalde stappen die lastig kunnen zijn. Bijvoorbeeld, als het hele cerebellum afgesneden wordt voordat de hersenen op de spec worden geplaatstImen houder en sectie, kan de hersenen uit elkaar breken voordat het DG volledig is gesneden, waardoor verdere secties onbruikbaar zijn. Daarom is het belangrijk om alleen caudaal door ongeveer de helft van het cerebellum te snijden. Een andere stap die de secties negatief kan beïnvloeden is de vibratome snelheid en de amplitude. Terwijl de aanbevolen instellingen voor respectievelijk 7 en 6 zijn, kunnen bij afsnijden bepaalde delen afbreken in de PBS of oneven verschijnen. Om dit te corrigeren, moet u de vibratomeersnelheid of de amplitude fijn aanpassen, één voor een keer tot de secties in tact en zelfs tussen de instellingen van 6-8 zijn.

Hoewel commerciele kits voor Golgi-kleuring beschikbaar zijn, ontbreken ze vaak exacte details voor elke individuele stap. Met dit protocol rapporteren we in detail alle stappen die werden gebruikt om andere laboratoria toe te laten om het weefsel op een betrouwbare manier te vinnen met een minimale probleemoplossing. De gebruikte materialen zijn beschikbaar voor de meeste laboratoria voor neurowetenschappen. Aberrations in dendrite morpHologologie en veranderingen in het aantal dendritische ruggengraatjes zijn gerelateerd aan een groot aantal neurologische aandoeningen 31 . Bovendien kunnen deze verstoringen van de dendritische arborisatie een significant morfologisch kenmerk van het chemotherapie veroorzaakt letsel in de hersenen 32 betekenen. In de toekomst zullen we nagaan hoe de structurele veranderingen die door 5-Fu veroorzaakt kunnen worden, betrekking hebben op de gedrags-, cellulaire en moleculaire veranderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een pilot-subsidie ​​onder NIH P20 GM109005 (ARA) en door het Center for Translational Neuroscience IDeA-programma P30 GM110702.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18, (12), 1713-1721 (2015).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 316-328 (2010).
  3. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50, (1), 10-20 (2012).
  4. Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33, (3), 121-129 (2010).
  5. von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191, (6), 518-531 (2009).
  6. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50, (6), 897-909 (2006).
  7. Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
  8. Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832, (12), 2257-2263 (2013).
  9. Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9, (3), 343-348 (1999).
  10. Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
  11. Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
  12. Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, (1432), 745-748 (2003).
  13. Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26, (7), 360-368 (2003).
  14. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  15. Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1, (3), 24 (2013).
  16. Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160, (3), 307-312 (1975).
  17. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150, (1), 90-95 (2006).
  18. Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131, (1-2), 1-7 (2003).
  19. de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55, (2), 481-489 (2007).
  20. Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11, (4), 221-230 (1984).
  21. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10, (38), (2016).
  22. superGolgi Kit. Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
  23. Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
  24. Neurolucida 11.03. MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
  25. Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87, (4), 387-406 (1953).
  26. Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7, (6), (2012).
  27. Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
  28. Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145, (1), 265-278 (2007).
  29. Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
  30. Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9, (9), (2014).
  31. Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10, (10), 981-991 (2000).
  32. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50, (1), 10-20 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics