Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Neuroscience

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Summary

ここでは、Golgi-Coxプロトコルを詳細に紹介します。この信頼性の高い組織染色法は、最小のトラブルシューティングで、海馬の脳構造の全面的な評価を可能にします。

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Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

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Abstract

樹状突起棘は、興奮性シナプスを含むニューロンの樹状突起軸からの隆起である。海馬内のニューロン樹状突起の形態学的および分枝的な変化は、認知および記憶形成に関係している。ゴルジ染色にはいくつかのアプローチがあり、これらのすべてが樹状突起の形態学的特徴を決定し、明確なバックグラウンドを生成するのに有用であった。現在のゴルジ - コックス法(市販のゴルジ染色キットで提供されるプロトコルのわずかな変形)は、化学療法薬5-フルオロウラシル(5-Fu)の比較的低用量が樹状形態にどのように影響するかを評価するために設計された、脊髄の数、および海馬内での血管収縮の複雑さが含まれる。 5-Fuは、樹状突起の複雑さを有意に調節し、領域特異的様式で海馬全体の背骨密度を減少させた。示されたデータは、ゴルジ体染色法ef海馬のCA1、CA3、および歯状回(Dentate gyrus、Dentate gyrus)における成熟ニューロンを強く染色した。このプロトコルは、各ステップの詳細を報告し、他の研究者が高品質の結果と最小のトラブルシューティングで脳全体の組織を確実に染色できるようにします。

Introduction

デンドライトは、シナプス入力1を受け取り、処理するニューロンの中で最大の部分です。それらの樹状突起は複雑な幾何学的形状を有し、近位枝は遠位枝よりも大きな直径を有する。樹状突起が発達すると、それらは樹状突起形成と呼ばれる過程で他のニューロンといくつかのつながりを形成する。この分枝の程度とパターンは、樹状突起が適切に処理できるシナプス入力の量を決定する2

樹状突起形成は、活性依存性可塑性およびニューロン回路の適切な発達のために必要なプロセスである。伸長、収縮、分枝およびシナプス形成は、固有の遺伝的プログラムおよび外因性因子からの影響を含む複雑なプロセスである。海馬内のニューロン樹状突起の形態学的および分枝的な変化は、認知および記憶形成に関与している樹状突起の複雑さの変化は、病態生理学的および行動的変化に関連する5.異常は、脆弱X症候群およびダウン症候群6を含むいくつかの疾患状態に関連する。

樹状突起突起は、中枢神経系内に興奮性の入力を受ける樹状突起の特殊な細胞内区画である。樹状突起の3つの形態学的クラスがあり、その大きさと形状に基づいてそれぞれのクラスの名前があります:1)キノコの背骨は複雑なシナプス後の密度を持ち、他の突起よりもグルタミン酸受容体が多い7 。 2)茎が欠けているぼんやりした棘。 3)細長い棘は、伸長した細い幹と球状頭部からなる8 。樹状突起棘の容積は、それらを規定するために部分的に使用され、薄い棘は一般的により小さい(0.01μm3 9,10 。背骨は成熟とともに安定する。例えば、細い棘は数日後に収縮するか、キノコの棘に成長する。あるいは、マッシュルームの棘は比較的安定であり、長期間生存することができる。ニューロンの結合の強さは、棘の数および/またはその体積に基づいていると考えられる11,12,13

古典的なゴルジ染色方法およびそのより現代的なバリエーションはすべて、樹状突起の形態および密度を調べるために有用であった。ゴルジ染色の1つの独特な局面は、全ニューロンの約5%を無作為に染色することであり、個々のニューロンの追跡を可能にする14,15 。ゴルジ体の正確なメカニズム個々のニューロン染色は未知であるが、この方法の原理はクロム酸銀(Ag 2 CrO 416,17の結晶化に基づく。ゴルジ法の主な3つのタイプがあります:急速ゴルジ、ゴルジ - コックス、ゴルジ - コプシュ18 。 3つの方法はすべてクロム塩の初期インキュベーション段階から数日から数ヶ月間に始まりますが、それらの間にはいくつかの重要な違いがあります。急速ゴルジ体は第一段階で四酸化オスミウムを使用し、ゴルジ - コプシュはパラホルムアルデヒドを含む。迅速ゴルジおよびゴルジ - コプシュの両方の染色の後に、約7日間、1〜2%硝酸銀溶液中でのインキュベーションを行う。 Golgi-Cox法は、硝酸銀の代わりに塩化第二水銀および重クロム酸カリウムを使用し、2〜4週間の含浸時間を有する。次いで、組織を切片化し、希釈したアンモニアその後、塩を除去するための写真定着液を使用した。 3つのタイプのうち、ゴルジ - コックス(Golgi-Cox)法は、部分的には干渉を伴わずに樹状突起を染色するのに最も良いと考えられているが、その理由は、結晶アーチファクトが組織の表面上に起こらないからである17,20,21

本方法は、市販のゴルジ染色キットを備えたプロトコルのわずかな変形であり、5-Fuの比較的低い用量が樹状の形態学的特徴および背骨密度にどのように影響するかを評価するために設計された。取得されたデータは、化学療法による治療がニューロン回路にどのように影響するかについてのさらなる洞察を提供することができる。

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Protocol

実験は、UAMSの機関動物管理および使用委員会によって承認された倫理基準に従って行われた。

1.動物および5-Fu注射パラダイム

  1. 6ヵ月齢のオスのC57Bl6 / J野生型マウスを購入し、それらが1歳に達するまで一定の12時間の明/暗サイクル下にそれらを収容する。
  2. 5%Fuを0.9%滅菌生理食塩水で希釈する。マウス1匹あたり必要な用量として60 mg / kgを使用する。
  3. 5-Fuの腹腔内注射を行う(週に3回、3週間)。
    1. 毎日同じ時間に腹腔内注射を行う。例えば、0900-1200時間の間。
  4. 動物を安楽死させ、最終注射の30日後に脳を抽出する。

2.安楽死処置および脳抽出

  1. 齧歯類を拘束し、尾の基部をつかむ。一方、親指または第1の指をthげっ歯類の首の根元。齧歯類の首にすばやく圧力を加え、尾をつかんでいるもう一方の手が後ろに引っ張っている間、前に押します。
  2. 一方の手でげっ歯類を、他方の手で大きな手術用はさみを持ちます。齧歯類の首を2枚の刃の間に置き、頭をすばやく断頭します。
  3. 切断されたマウスの頭部を取って、細かいはさみを使って、目の上まで頭骨の上の毛皮を整える。次に、はさみの先端を各アイソケットに置き、わずかな力でハサミを閉じます。
  4. 春のはさみを使用して、頭蓋骨を小脳の左右に切断します。
  5. 小脳の周りの頭蓋骨の部分を直接持ち上げて持ち上げるために鉗子を使用してください。
  6. 春のハサミを使用して、頭蓋骨の中心窩に沿って切断します。
  7. 鉗子を使用して頭蓋骨の残りの部分を脳から持ち上げます。
  8. スパチュラとプローブを使用して、脳を目的の容器にすくい取ってください。ステンレスを使用してティエルブレードは、各脳を正中面に沿って切断します。右半球について以下のゴルジ - コックス法を実行する。

Golgi染色および組織の調製

  1. 新しく採取した半分の脳を、10mLコニカルチューブ内の5mLの塩化水銀ベースの溶液(キットの溶液A)に浸します。塩化第二水銀溶液は感光性である。ホイルでチューブを覆う。サンプルを室温で暗所に保管してください。
    注:キットには、材料表に記載されているソリューションAが提供されています。あぶない!溶液A(塩化水銀溶液とも呼ばれる)には、重クロム酸カリウム、塩化水銀、クロム酸カリウムなどの有毒な試薬が含まれています。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。
  2. 1日後、溶液をゆっくりと一時的な容器(大型の計量ボートなど)に落として、バイオハザードの廃棄容器に処分する。脳(元の10 mLコニカルチューブに依然として)を5 mLの塩化水銀溶液を添加し、サンプルを暗室に室温でさらに13日間戻す。
  3. 90gの蒸留水または脱イオン水(dH 2 O)に30gの含浸後緩衝液を加える。 6ウェルプレートの各ウェルに、6.5mLの含浸後緩衝液(1頭あたり1ウェル)を充填する
    注記:ポスト含浸緩衝液は、材料表に記載されているキットに含まれています。
    1. 塩化水銀溶液中で(合計で)14日後、組織をdH 2 Oですすぎ、その後、含浸緩衝液を入れた6ウェルプレートに移す。箔でプレートを覆い、暗所で室温で保管します。
  4. 浸漬1日後に含浸後緩衝液をピペットで取り出し、新鮮な含浸後含浸緩衝液で更新する;室温で暗所に1日間保存する。必要に応じて、4℃で1ヶ月まで保存してください。22

4.セクショニング

  1. 蓋の12ウェルプレートに左から右、上から下へ昇順に番号を付けます。
  2. 脳全体を切断する場合は、1つの脳につき2つまたは3つの12ウェルプレートを準備する。
    1. 各12ウェルプレートの蓋の上部に、切断された脳の識別番号をラベルする。
    2. 各プレートの各ウェルに1×PBS 2mLをピペットで入れる。
  3. ステージを設定し、ビブラトームをオンにします。組織を覆う十分な1x PBSが容器に入っていることを確認してください。
    1. プラスチックパラフィンフィルムを2枚切り、2回折り重ねます。 1x PBSがカウンターに漏れるのを防ぐために、検体ホルダーノブの穴の上にそれらを置きます。
    2. 試験片ホルダーのティッシュブロックにテープを貼り、シアノアクリレート粘着剤(材料表参照)を貼ります。
  4. 6ウェルプレートから脳を取り出し、それをプラスチックまたはガラス皿に置きます。ステンレスを使用小脳の約半分を切断するためにスチールの両刃ブレード。
    1. 小脳を尾を切る。残っている小脳の部分が均一であることを確認してください。
  5. 直ちに残りの小脳の平らな表面を接着剤の上に置きます。
    注:組織の背部(大脳皮質)は、ブレードに対して左右に向いている必要があります。以前に嗅球が付着していた吻側は、上向きになるはずです。
    1. 接着剤が完全に乾燥していることを確認するために、少なくとも数分間待ちます。
  6. 脳を所定の位置に保持している接着剤が乾燥している間に、1×PBSを検体浴に注ぎます。接着剤が乾燥した後、組織が入った標本ホルダーを標本浴に置きます。
    1. 組織サンプルが完全に覆われていない場合は、1倍のPBSを検体浴に注ぎます。
  7. ビブラトームのブレードホルダーにブレードを取り付け、ゆっくりとl1×PBSに完全に浸すまで、ブレードを試料バスに入れます。それが組織の上部のわずかに下になるまでブレードを下げ続けます。
  8. ビブラトームの速度を7、振幅を6、切断角度を12°に設定します(ビブラトームモデルの材料表を参照)。振動を開始し、200μmの部分を切断する23
    1. 大きなペイントブラシを使用して、組織切片を検体浴から12ウェルプレートの指定されたウェルのそれぞれに移動させます。
  9. 所望の数の組織切片に達するまで、組織を切断し続ける。

5.後染色

  1. 以下の染色工程およびリンスのそれぞれについて、1ウェルにつき示された溶液2 mLを使用する。溶液をウェルに移すには電動ピペットフィラー(材料表を参照)を使用してください。溶液を適切な廃棄物に移すために移送ピペット(材料表を参照)を使用するコンテナ。
  2. 切片を0.01M PBS-Tの1回30分洗浄で洗浄する(3.0mLの界面活性剤(材料の表参照)を0.01MのPBS1000mLに加える)。
  3. 使用直前にdH 2 Oで3:5の容量の水酸化アンモニウム溶液(注意)を希釈する。希釈した水酸化アンモニウム溶液中の切片を19〜21分間染色する。
    1. 光感受性水酸化アンモニウム溶液をホイルで保護する。
      注:溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は約10%であり、それは「有害」と分類される。水酸化アンモニウム溶液は、皮膚に接触すると火傷を起こすことがあります。吸入すると呼吸器の刺激を引き起こすことがある。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。
  4. ポスト染色バッファー(500mLのdH 2 O中に90gの試薬Dを加える)中の切片を19〜21分間染色する。ポスト染色バッファーは感光性です。フォイル22で保護してください。
  5. 3つのセクションをすすいでください0.01M PBS-Tを5〜10分間洗浄した。

6.取り付け、クリーニング、およびカバー

  1. 大きなペイントブラシで1%ゼラチンコートスライドのセクションをマウントします。それらを室温で20〜30分間乾燥させ、その後Coplinジャーに一晩置いてください。
  2. コプリンジャーから手袋をしたスライドをスライドから取り出し、プラスチックラックに置きます(材料の表を参照)。 100%エタノールを含有する染色皿(材料表参照)にプラスチックラックを置きます。 5分間3回洗浄して脱水する。
  3. スライドを99%キシレンで5分間ずつ2回洗浄する。スライドをガラスラックに置き、金属ハンドル付きのキシレンを含むガラス染色皿にラックを下ろします(材料の表を参照)。
    注:キシレンは吸入すると有害であり、皮膚に触れると刺激を引き起こすことがあります。それは液体および蒸気状態で非常に可燃性である。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。
  4. キシルからスライドを除去する一度に1つずつ取り出し、組織を約0.25 mLのマウントメディアですばやくカバーします(材料表を参照)。次に、スライドカバーを取り、メディアの上に置きます。
    1. スライドカバーの下に閉じ込められた気泡を、ペイントブラシの端などの鈍いオブジェクトで端まで押します。
  5. 太陽光から離れた場所にスライドを置き、2〜3日間乾燥させる。
  6. 顕微鏡を使用して画像を取得し、適切なソフトウェアで分析することに進みます。

7.イメージスタックを取得する

  1. イメージングプログラムを開きます( 材料表を参照)。スライドを顕微鏡のステージに置きます。プログラムの上部にあるメニューで、[取得]をクリックし、[ライブ画像]をクリックします。
  2. 顕微鏡を10倍に設定します。好みのニューロンを特定してから、赤いXのように見えるカーソルをソーマの中心に持って行きます。左クリックして基準点を設定します。
  3. 顕微鏡を40倍に設定します。プログラムの上部にあるメニューから「移動」をクリックし、「参照先に」をクリックします。
  4. 組織の上の細かい対物レンズを手動でスクロールして、わずかに焦点が外れるまで、画像スタックの作成を開始します。
    1. プログラムの右下にある[画像の取得]という見出しの下にある[Set Top]をクリックします。
    2. 組織の下をわずかにスクロールして、焦点がわずかに外れるようにしてから、「Image Acquisition」の下の「Set Bottom」をクリックします。次に、「画像スタックの取得」をクリックします。
  5. イメージスタックを取得した後、表示されるウィンドウにイメージファイルの名前を入力します。 「MBF Asciiファイル」として保存します。
    1. メッセージが表示されたら、ファイル形式を「MBF JPEG2000スタックファイル」として選択し、「保存」をクリックします。

8.ニューロンのトレース

  1. ツールバでrメニューの下にある「Contour Name」という名前のボックスをクリックします。ドロップダウンメニューから「Soma」を選択します。
  2. 手動で体細胞を追跡します。トレースが完了したら、右クリックして[セルボディの終了]を選択します。
  3. 「AutoNeuron」を選択すると、「AutoNeuron Workflow」という別のタブが表示されます。
  4. [設定タイプ]で[新規]を選択します。パラメータを設定し、 "次のステップ"をクリックして "Soma Detection"小見出しを表示します。
    1. パラメータを設定するには、「Brightfield」を選択します。次に、 "Max Process Diameter"で "Start Measuring"をクリックします。カーソルを使用して、デンドライトの底に移動し、手動で直径を設定します。
  5. ユーザーに画像全体をトレースするよう要求するウィンドウで[はい]をクリックします。手動で体細胞を追跡します。 「次のステップ」をクリックして、「シードプレースメント」小見出しを表示させます。
  6. [Validate Seed]をクリックします。"次のステップ"をクリックして "Neuron Reconstruction"小見出しを表示させます。
  7. "Neuron"で、 "Interactive"をクリックします。樹状突起のプログラムからの指示に従い、プログラムでトレースされた強調表示された領域を完成させるために右クリックして、インタラクティブなトレースを実行します。すべての樹状突起をトレースした後、「次のステップ」をクリックします。
  8. 新しいウィンドウが表示されたら、希望のタイトルで新しい構成を保存します。 [保存]をクリックします。

9.分析

  1. 分析プログラムを開きます(材料の表を参照)。
  2. トップメニューから「ファイル」をクリックし、「データファイルを開く」をクリックします。対象のファイルを選択します。
  3. 分析小見出しの下で、「Sholl Analysis」を選択します。
  4. 「Sholl Analysis」ウィンドウで、開始半径を10μmに設定します。 [分析]の下にある[Dendrites]と[Branch Orders]のボックスをクリックします。
  5. 右のcl新しく開いたウィンドウをクリックし、「Excelエクスポート」をクリックします。 [保存]をクリックします。
  6. 分析の下で、「分枝構造分析」をクリックします。 「すべての可能な分析」を選択します。
  7. 新しく開いたウィンドウを右クリックし、「Excelエクスポート」をクリックします。

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Representative Results

市販のイメージングソフトウェアを使用して、ゴルジ染色された脳切片の樹状突起形成および海馬の複雑さに対する5-Fu処置の効果を定量し、追跡した。追跡後、Sholl分析および樹状複雑性指数(DCI)を用いて、樹状突起形成、背骨密度、および脊椎形態を分析した。ショール分析は、樹状突起の形態を決定するために使用できる定量的分析方法である25 。体細胞から出発して、互いに10μm離れた円は、樹状突起の上に重なっている。樹状突起の長さは、樹状突起が交差する円の数によって決定される。樹状突起の複雑さを確認する方法である分岐点解析は、分岐点の総数と順序に基づいています。

分岐点は、ブランチは2つのサブブランチに分割されます。分岐順序は、分岐が分割される回数に基づいて複雑さの尺度です。例えば、1次分岐点は元の樹状突起であり、2次分岐点は2つのサブ分岐に分かれる点である。分岐点と分岐順序の両方を調べることで、樹状突起の複雑さ(分岐点の数に基づいて)と分岐がどの点で起こるか(小規模な分岐順序は細胞に近い。さらに体細胞から)を決定することができる。これらのパラメータはDCIに適用されました。 CA1およびCA3を頂端および基底部分に分割し独立して分析した( 26,27

DG中のCA1およびCA3ピラミッドニューロンおよび顆粒ニューロンの樹状突起を分析した。すべてのニューロンがfoそれぞれの実験群は以下の基準を満たした:1)樹状突起は、その全長にわたって暗くて一貫したゴルジ染色を有し、2)樹状突起は目に見えて触れており、3)各ニューロンは、 28図1は、上記の基準を満たすニューロンを示す。データは平均±SEMとして表した。偽群と5-Fu群との間の統計的相違を決定するために、対になった両側t検定を用いた。すべての統計的分析は、分析ソフトウェア(材料の表を参照)を用いて実施し、 p <0.5を有意であるとみなした。 5-Fu治療およびショール半径の効果を評価するために、混合因子分析分散(ANOVA)を使用した。フィッシャーLSDポストホック試験は、適切な場合にANOVA 29の後に使用した。

両方のCA 5-Fu処理後の棘の有意な全体的な減少があった( 7At = 7.68、 p <0.01; 2A )およびCA3( t = 7.54、 p <0.01; 図3A )。 5-Fu治療はCA1の基底背骨密度に有意に影響しなかったが( t = 1.79、 p = 0.15; 2B )、CA3基底錐体突起棘を有意に減少させた( t = 5.57、 p <0.05; 図3 B )。さらに、Fisher LSD post-hoc試験は、40-100μm(フィッシャーのLSD、 p <0.001; 2C )および130-160μm(フィッシャーのLSD、 p <0.05)におけるCA1頂端ピラミッド樹状突起の樹状突起樹状化の減少を明らかにした0.05;(フィッシャーのLSD、 p <0.001; 2D )および70-110(図2C )のCA1基底頂端樹状突起においても同様の現象が見られたμm2(フィッシャーのLSD、 p <0.05; 2D )。

CA3頂端ピラミッド樹状突起に関して、5-Fu処理後のセグメント樹状突起長の有意差は、生理食塩水処置対照( F (28,87)= 0.91; p = 0.59; 3C )と比較して有意差はなかった。しかし、CA3基底ピラミッド型樹状突起では、5-Fu処理と食塩水処理対照との間に有意差があった( F (25,78)=1.85; p <0.05; 図3( D ))。フィッシャーのLSDは、5-Fu処置が、90-100μm( p <0.01; 3D )、70-80μmおよび110-120μm(フィッシャーのLSD、 p <0.05; 3D )の樹状突起形成を減少させ、ソーマ29から離れている。

樹状突起の複雑さを決定するために、分枝順序分析を使用して、5-Fu処理対照および生理食塩水処理対照群を比較した。 DG内で、支流順序分析は、各処理と分岐順序の間に有意差を示した( F (8,36)= 25.61、 p <0.001; 図4 )。これをフィッシャーのLSDを用いてさらに分析したところ、 4および 6の時点で長さが減少していることが示された5-Fu治療( p <0.001; 図429に続くオーダー。

図1
図1 :イメージングとさらなる分析の基準を表すゴルジ染色されたニューロン。ゴルジ染色の後、3つの背骨型はすべて簡単に見ることができます。染色は樹状突起の全長にわたって一貫しており、樹状突起は他のニューロンから隔離されている。スケールバー、5μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2 :ゴルジ染色したnエウロンは、頂部CA1の5-Fu処置群と生理食塩水処置群との間の背骨密度の有意差を示したが、基礎CA1では有意差を示さなかった。頂端および基底CA1の両方における5-Fu処置群と生理食塩水処置群との間の背骨の長さに有意差があった。 ( a )CA1頂端ピラミッド型樹状突起において、5-Fuは背骨密度を有意に減少させた。 ( b )基底樹状突起において、背骨全体の密度に有意な変化はなかった。 ( c )ショール分析は、5-Fu処置が、CA1頂角錐形樹状突起における体細胞から40-100μmおよび130-160μmの樹状突起樹状化を有意に減少させることを明らかにした。 ( d )基底樹状突起において、5-Fu処理は、30〜60μmおよび樹状細胞樹状細胞から70〜110μm離れた樹状突起形成を減少させた。平均±SEM(n = 6)。 * p <0.05; ** p <0.01、ANOVA 29 。= "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3
図3 :ゴルジ染色されたニューロンは、先端CA3および基底CA3の両方における5-Fu処置群と生理食塩水処置群との間の背骨密度の有意差を示した。頂端CA3では5-Fu処置群と生理食塩水処置群との間に背骨長さに有意差があったが、基底CA3では有意差はなかった。 ( a )CA3頂端ピラミッド樹状突起において、5-Fuは背骨密度を有意に減少させた。 ( b )基底樹状突起において、5-Fuは棘の全体密度を有意に減少させた。 ( c )CA3先端領域における5-Fu治療の有意な効果はなかった。 ( d )基底樹状突起において、5-Fu treaソーマから70-120μm離れた樹状突起形成を減少させた。平均±SEM(n = 6)。 *、 p <0.05; **、 p <0.01、ANOVA 29この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4
図4 :DG内のゴルジ染色されたニューロンは、生理食塩水処置群と比較して、5-Fu処置後の4および6 次の長さの減少を示した。 CA1海馬領域のピラミッドニューロンにおける分枝順の長さ。平均±SEM(n = 6)。 * p <0.05; ** p <0.01、ANOVA 29歓喜この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

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Discussion

より現代的な技術と比較して、Golgi-Cox法は、スパイン形態を検査するための好ましい方法であるいくつかの利点を有する:1)本質的に任意の組織に染色を用いることができ、2)基本的な光学顕微鏡のセットアップは、 3)Golgi-Coxイメージングは​​、共焦点イメージングよりも速く、4)ゴルジ染色された切片は、蛍光標識されたサンプルより数ヶ月から数年長い間生存可能である。これらの利点があるとしても、Golgi-Cox法には依然として一定の限界がある。第1に、プロセス全体が非常に時間がかかり、数週間の染色が必要であり、続いて画像を分析する必要がある。このプロトコルで見られるように、セクションAが開始される前に、溶液Aでは14日、溶液Bでは1日かかる。さらに、セクショニング、ポスト染色、およびマウントの実行には、1脳あたり2〜3時間かかります。それぞれのスライドは、清掃してカバーする前に1日乾燥させる必要があります。その後、時間の量セクションをイメージし分析するのは個人によって異なります。第2に、背骨の分類の違いによるアナリストのデータ間に一貫性の問題がある可能性があります。このため、各実験の画像解析部分を1人で行うことをお勧めします。これにより、プロジェクト完了までの時間がさらに延長されます。

正確なタイミングと注意を必要とするGolgi-Cox法のいくつかの重要なステップがあります。切片を水酸化アンモニウム溶液で染色する場合、切片が溶液中に少なくとも19分間、ただし21分を超えてはならないことが不可欠である。セクションが十分な時間水酸化アンモニウム溶液に入っていない場合、それらは適切に染色されない。すなわち、画像化の際にニューロンがあまり定義されないように見えるので、分析がより困難になる。切片が水酸化アンモニウム溶液中に21分を超えて存在する場合、これらの切片は、er染色され、個々のニューロンを同定することが困難になる。したがって、ソリューションを切り替えるときは、研究者はすばやく移動する必要があります。もう一つの重要なステップは、セクションをスライドに移すことです。大きなペイントブラシでセクションを移動する前に、最初に少量のPBS-Tをスライドに追加することをお勧めします。これにより、セクションを簡単にスライド上に置くことができ、破壊することなく容易に操作することができます。もう1つの重要なステップは、セクションがスライド上に置かれた後の乾燥ステップである。スライドが室温で少なくとも20分間乾燥しない場合、脱水工程中に特定のセクションが脱落する可能性が最も高い。スライドが30分以上乾燥すると、脱水工程中に脆くなり破損する可能性が高くなります。

この手順を実行する際には、面倒な手順があります。例えば、脳をスペックに置く前に小脳全体が切断されている場合DGが完全に切断される前に脳が裂けて、それ以上の部分を使用できなくなる可能性があります。したがって、小脳の約半分だけを尾状に切ることが重要です。セクションに悪影響を及ぼし得る別のステップは、ビブラトームの速度および振幅である。推奨設定はそれぞれ7と6ですが、切断すると特定のセクションがPBSで崩壊するか不均一に見えることがあります。これを補正するには、ビブラトームのスピードまたは振幅を、セクションがタクトで偶数になるまで1回ずつ、6-8の間で細かく調整します。

ゴルジ染色用の市販キットが入手可能であるにもかかわらず、個々のステップごとに正確な詳細が不足することがよくあります。このプロトコルでは、他のラボが最小限のトラブルシューティングで高品質で組織を確実に染色できるようにするために使用されたすべてのステップを詳細に報告します。使用される材料は、ほとんどの神経科学ラボで利用可能です。樹状突起群の異常樹状突起棘の数の変化と変化は、数多くの神経障害に関連している31 。さらに、樹状突起形成のこれらの摂動は、脳における化学療法誘発損傷の重要な形態学的特徴を表している可能性がある32 。将来、我々は、5-Fuによって誘導される構造的変化が、行動、細胞、および分子の変化とどのように関連しているかを調べる。

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Disclosures

著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

Acknowledgments

この研究は、NIH P20 GM109005(ARA)およびTranslational Neuroscience IDeAプログラム賞P30 GM110702のセンターのパイロット助成金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

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References

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