Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

Genetics
 

Summary

Hier beschreiben wir die Lieferung von MicroRNA verwenden ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 in einem Mausmodell der neuromuskulären Erkrankungen. Eine einzelne periphere Verabreichung bei Mäusen führte zu nachhaltigen MiRNA Überexpression in Muskel und motorischen Neuronen, bietet eine Möglichkeit, MiRNA Lernfunktion und therapeutische Potenzial in Vivo.

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Pourshafie, N., Lee, P. R., Chen, K. l., Harmison, G. G., Bott, L. C., Fischbeck, K. H., Rinaldi, C. Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (138), e55724, doi:10.3791/55724 (2018).

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Abstract

RNA-Interferenz über den endogenen MiRNA Weg regelt Genexpression durch die Kontrolle der Proteinsynthese durch posttranskriptionelle gen-silencing. In den letzten Jahren hat die MiRNA-vermittelten Genregulation Potenzial für die Behandlung von neurologischen Störungen, verursacht durch einen giftigen Gewinn der Funktion Mechanismus gezeigt. Effiziente Bereitstellung zum Zielgewebe sind jedoch seine Anwendung begrenzt. Hier haben wir einem transgenen Mausmodell für bulbärer und Spinale Muskelatrophie (SBMA) verwendet, eine Neuromuskuläre Krankheit verursacht durch Trinukleotiderkrankungen Expansion in den Androgenrezeptor (AR), testen Sie gen-silencing durch eine neu identifizierten AR-targeting MiRNA, MiR-298. Wir überexprimiert MiR-298 mit einem rekombinanten Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Serotyp 9 Vektor Transduktion von nicht-teilenden Zellen zu erleichtern. Eine einzige Rute-Vene-Injektion bei SBMA Mäusen induziert nachhaltig und weit verbreitete Überexpression von MiR-298 im Skelettmuskel und motorischen Neuronen und führte zu Verbesserung der neuromuskulären Phänotyp in den Mäusen.

Introduction

MiRNAs sind nicht-RNAs, 21-23 Nukleotide in der Länge, Codierung, die eine wichtige bei der Regulation der Genexpression und Kontrolle der verschiedenen zellulären und metabolische Bahnen Rolle. 1 Genexpression wird hauptsächlich durch Induktion posttranskriptionelle gen zum Schweigen zu bringen oder mRNA Abbau reguliert. 2 MiRNAs ergänzen sich in der Regel um die 3' untranslatierten Region (UTR) Kodierung Gene, obwohl binden an den 5' UTR und Codierung Regionen des Ziels, die mRNA auch beschrieben worden ist. 3

Das gegenwärtige Verständnis der Rollen von MiRNA in der Pathogenese von Krankheiten des Menschen dehnt sich aus, wird pharmakologische Modulation der einzelnen MiRNAs oder MiRNA-Familien zunehmend eine sinnvolle therapeutische Option. Im Vergleich zu anderen RNA Hemmung Strategien, MiRNAs haben viele Vorteile: MiRNAs sind weniger toxisch und weniger immunogen und können leicht in Zellen aufgrund ihrer geringen Größe geliefert werden. 4 , 5 , 6 MiRNAs haben in der Regel viele Ziele innerhalb von Mobilfunknetzen, daher mögliche Ziel-Effekte und Sicherheitsbedenken müssen berücksichtigt werden, zusammen mit effizienten Auslieferung an Zielgeweben.

Neuromuskuläre Erkrankungen sind erworben oder geerbt Bedingungen, die Muskel- und motorischen Neuronen beeinflussen. Die Ausrichtung der Drogen in Skelettmuskeln ist eine aufstrebende Gebiet der Forschung, wo die größte Herausforderung ist, weite Verbreitung innerhalb des therapeutischen Fensters zu erreichen. 7 Motoneuronen sind schwieriger zu Zielen, vor allem, weil Zugang zu Medikamenten, durch die Blut-Hirn-Schranke verwehrt ist.

Kultur und Maus zellmodelle bulbärer und Spinale Muskelatrophie (SBMA) wurden in dieser Studie verwendet. SBMA ist eine neuromuskuläre Erkrankung, verursacht durch einen giftigen Gewinn Funktion Mechanismus, in dem Muskel und motorischen Neuronen betroffen sind. 8 , 9 SBMA (Kennedy-Krankheit; OMIM #313200) ist eine X-chromosomale Krankheit, gekennzeichnet durch Muskelschwäche und Atrophie, verursacht durch CAG Wiederholung Expansion in das AR-gen, das eine erweiterte Trinukleotiderkrankungen-Darm-Trakt in der AR -Protein kodiert. 10 keine krankheitsmodifizierende Therapie ist derzeit verfügbar für diese Störung. In dieser Studie verwendeten transgenen Mausmodell rekapituliert die Merkmale der Krankheit, einschließlich Geschlecht Spezifität, Motoneuron Pathologie und progressive Muskelatrophie. 11

In dieser Studie, unser konzentriert auf die Ermittlung eines MiRNA, die direkt herunterreguliert Ausdruck der mutierten AR Transgen und auf eine sichere und effiziente Art der Lieferung von MiRNA zum Rückenmark und Skelettmuskulatur von unserer Krankheit-Maus-Modell entwerfen.

Hier haben wir eine relativ fußgelenkes MiRNA, MiRNA-298 (Zbl-Nummer MIMAT0004901),12 , mutierte AR Ausdruck in SBMA Modellen direkt zu reduzieren. Um Lieferung von MiR-298 an Zielgeweben zu erreichen, verwenden wir eine virale Strategie mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 (rAAV9). rAAV9 ist in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke und langfristige Genexpression in nicht-teilenden Zellen, einschließlich Neuronen zu vermitteln. 13 eine einzelne systemische Verabreichung von AAV9-MiR-298 führte zu nachhaltigen Ausdruck der MiRNA, effizienten Transduktion von Muskel- und motorischen Neuronen, Down-Regulierung der AR Ausdruck und Besserung der Krankheit Phänotyp bei SBMA Mäusen. 14 dieser Methodik lässt sich MiRNA oder antagomire Überexpression in Vivozu bieten.

Protocol

Alle Verfahren wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Aufl., National Academies Press überarbeitet 2011), und von der NINDS Animal Care Committee genehmigt worden.

1. AAV9-MiRNA Design Strategie und MiRNA-Auswahl

  1. Verwenden Sie MiRWalk prädiktive Datenbank Kandidat MiRNAs auswählen, die mit der mRNA 3' UTR Region des Zielgens interagieren. 15
    Hinweis: Beschränken Sie minimale Samen Länge der MiRNA-Sequenz auf mindestens 7 Nukleotide. Wählen Sie andere etablierte MiRNA Vorhersage Programme (MiRanda, MiRDB, Zielscan) für die vergleichende Analyse. Basierend auf diesen Auswahlkriterien, wurden hier, MiR-185, MiR-298, MiR-873 und MiR-877 zur weiteren Auswertung ausgewählt.
  2. Die Reihenfolge der ausgewählten MiRNA aus MiRBase (http://www.mirbase.org/) abrufen.
  3. Klonen die Pri-Mir (60-70 Nts) und seine 250-300 Nts flankierende genomischen Sequenz auf beiden Seiten oder eine mock Sequenz, in der entsprechenden AAV GUS Vektor.
    Hinweis: Die flankierende Sequenz ist für korrekte Pri-Mir Ausdruck und Reife MicroRNA Verarbeitung erforderlich. Wählen Sie einen Dual-Promotor rAAV GUS-Vektor mit einer Expressionskassette bestehend z. B. aus menschlichen Dehnung Faktor-1 Alpha (EIF1α) Förderer gefolgt von dem ausgewählten MiRNA oder mock-Sequenz, und der Projektträger menschliches Cytomegalovirus (CMV) gefolgt von cDNA Kodierung das GFP fluoreszierende Tag. Der Veranstalter EIFα wurde gewählt, weil es stabile und homogene Ausdruck, mit minimalen Risiken der zum Schweigen zu bringen garantiert. Gewebe-spezifische oder bedingte Promotoren können je nach spezifischen Anwendungen verwendet werden.
  4. Bereiten Sie vor, reinigen Sie und Titrieren Sie AAV, folgenden veröffentlichten Protokolle. 16
    Hinweis: Hier wurden Klonen der Pri-Mir in der AAV Vektor und virale Produktion von einem externen Hersteller durchgeführt.

(2) Tail Vene Injektion von AAV-MiRNA Plasmid

Hinweis: Dieser Schritt braucht Regulierung je nach Alter und Gewicht der Mäuse das Zielgen. Verwenden Sie die institutionelle und Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Richtlinien der Dosisbereich, Volumen und beste Art der Verabreichung, basierend auf Alter und Gewicht der Mäuse zu bestimmen. GFP Fluoreszenz-Signal und MiRNA Ausdruck Niveaus im Zielgewebe sollen Gipfel ab 2 Wochen nach der Injektion. Das folgende Protokoll bezieht sich auf männliche Mäuse im frühen Erwachsenenalter. AAV sollte als ein Biohazard unter Biosafety Level 1 Richtlinien behandelt werden.

  1. Unterteilen Sie AAV-MiRNA Plasmid Lager in 100-200 µL Aliquots, enthält eine Viruslast von 1010-1011 virale Genom pro mL (Vg/mL) mit steriler Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Labor Biohazard persönlicher Schutzausrüstung sollte verwendet werden, um die AAV-Lösung zu behandeln.
    Hinweis: Wenn ein Aliquot aufgetaut ist kann es bei 4 ° C bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden. Virale Lager kann bei-80 ° C Gefrierschrank gespeichert werden.
  2. Bändigen Sie die Maus in handelsüblichen wachstumsbefürworter wie Kunststoff oder konische Kunststoff-filmschlauchs der richtigen Größe.
  3. Reinigen Sie die Oberfläche des Hecks mit 70 % Alkohol abwischen.
  4. Halten Sie eine warmen Pad (28-30 ° C) unter der Rute zu Vasodilatation für 30 s. Alternativ, wärmen die Tiere mit einer roten Wärmelampe (in einem Abstand von 2-3 Fuß) oder durch die Rute ins warme Wasser eintauchen.
  5. Ausgehend von den distalen Teil des Hecks, Stechen Sie die Nadel (27-30 G) mit der viralen aliquoten geladen, Abschrägung, 15° vom Heck in die Vene. Vor der Injektion stellen Sie sicher, dass die Nadel richtig eingesetzt ist.
    1. Wenn Widerstand zu beim Einspritzen spüren ist oder Schwellungen unter der Haut erscheint, beenden Sie das Verfahren. Die Nadel entfernen und wieder einsetzen der Nadel oberhalb der bisherigen Injektionsstelle.
      Hinweis: Alternativ kann dies durch die Nadel vorsichtig Absaugen und Beobachtung Blut erreicht werden. Harte Aspiration kann die Rute Vene zusammenbrechen. Wenn die Vene beim Einspritzen blanches, wird die Nadel korrekt eingefügt.
  6. Nach die Injektion abgeschlossen ist, warten Sie ein paar Sekunden vor dem Auslösen der Nadelöhrs.
  7. Beobachten Sie die Injektionsstelle für Blutungen. Mäßiger Druck mit zwei Fingern auf die Website, bis die Blutung stoppt.
  8. Das Tier in seinen Käfig zurück.

(3) Verhaltens Assays

Hinweis: Durch einen Dritten mit Verschleierung der Behandlungen durch eindeutig codierten Fläschchen wurden blind alle Experimente durchgeführt. Reihenfolge der Behandlungen war randomisiert. Wenn Sie die nachfolgend beschriebenen Tests durchführen, sollte Versuchsbedingungen (Zimmertyp) und der Tageszeit kontrolliert werden, um Schwankungen zu reduzieren. Dieser Test sollte durchgeführt werden, an Mäusen, die älter als vier Wochen, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Maus wurde behavioral Beurteilung einmal vor viralen Injektion bei 5 Wochen alt, Überblick über normale Leistung zu erhalten. Nach viralen Injektion wurden Mäuse einmal wöchentlich ab 48 h nach der Injektion bis zum Alter von 40 Wochen bewertet.

  1. Bringen Sie die Maus zu einem ruhigen, dunklen Raum, das frei von Lärm oder andere Störungen mindestens 30 min vor Beginn der Tests mit AAV injiziert. Stören Sie die Tiere nicht während dieser Zeit der Akklimatisierung.
  2. Akklimatisieren Sie die Maus, um den neuen Raum für 30 min und starten Sie dann die folgenden Verhaltens Assays (Schritt 3.3 und 3.4). Halten Sie einen Abstand von 10 Minuten zwischen jedem Verhaltens Assay.
  3. Hängende Kabel test
    Hinweis: Dieser Test überwacht Muskelkraft und motorische Störungen.
    1. Verwenden Sie eine Polsterung Blatt als Sitzkissen zu handeln. Heben Sie die Maus durch seinen Schweif, und legen Sie sie in der Mitte des Rasters Drahtzahnstange. Heben Sie das Rack 15-20 Zoll über der Oberfläche und kehren Sie langsam den Bildschirm, um das Tier seinen Griff auf dem Bildschirm anpassen kann.
    2. Sobald das Rack komplett invertiert ist, der Timer gestartet wird, und notieren Sie die Zeit zu fallen.
      Hinweis: Mäuse werden auf einem Raster mit vier Gliedmaßen hängen. Wenn der Draht zu niedrig eingestellt ist können die Mäuse nicht hängen. Wenn Mäuse aus dem Netz vor 60 fallen s, legen Sie sie wieder am Netz, den Timer zurückgesetzt, und wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu zwei weitere Versuche. Registrieren Sie die beste Leistung.
    3. Wenn die Frist von 60 s erreicht ist, wird das Tier zurück in den Käfig zurück.
  4. Fuß-print-assay
    Hinweis: Die saugfähige Blatt einer schmalen Landebahn ca. 70 cm lang und 5 cm breit mit 5 cm hohen Mauern sollte.
    1. Halten Sie die Maus vorsichtig mit einer Hand und Auftragen Sie roter Tinte auf Vorderpfoten und blauer Tinte, die Hinterpfoten mit einem Pinsel.
    2. Legen Sie die saugfähige Blatt, auf dem Boden einer schmalen Landebahn.
    3. Lassen Sie die Maus zu gehen oder laufen über ein saugfähiges Blatt in einer geraden Linie in der Start-und Landebahn von einem Ende zum anderen.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male mit der Maus mit einem frischen saugfähigen Blatt.
    5. Messen Sie den Abstand zwischen zwei aufeinander folgenden Schritten in der Vorwärtsbewegung. Gehören Sie zunächst nicht und dauern Sie wenige Fußspuren, wo das Tier nur initiieren und Veredelung seinen Lauf.

(4) Sterbehilfe und Gewebe-Ernte

  1. Verwenden Sie eine Euthanasie-Kammer oder einer Glasglocke. Wenn eine Glasglocke verwenden, führen Sie die unter einem Abzug.
  2. Genießen Sie Baumwolle mit Isofluran und legen Sie sie in die Glasglocke. Verwenden Sie eine physische Trennzeichen, um das Tier von Körperkontakt mit dem Anästhesie-Material zu halten. Legen Sie das Tier in das Glas sofort nach diesem Schritt.
    Hinweis: Die Glasglocke sollte nicht vorgeladen mit Isofluran zur Vermeidung von Hypoxämie bei den Tieren sein.
  3. Weiter Isofluran Exposition bis 30 s nach Atmung stoppt.
  4. Sofort nach dem entfernen die Maus aus dem Glas einschläfern durch zervikale Dislokation.
    Hinweis: Dieser Schritt sollte so schnell wie möglich zum Abbau des Gewebes zu vermeiden statt.
  5. Ernte das Rückenmark zuerst und dann die Quadrizeps skelettartiger Muskel.
    1. Um das Rückenmark zu ernten, setzen Sie die Rückseite der Maus und befestigen Sie die vier Gliedmaßen auf der Seite um eine Dissektion Board.
    2. Waschen Sie die Website der Dissektion mit 70 % Ethanol.
    3. Führen Sie durch zervikale Dislokation mit einer scharfen Schere.
    4. Machen Sie einen Schnitt in der Haut in der Mittellinie. Entfernen Sie das Fell durch Schneiden oder vorsichtig Aufreißen der Haut in der Querebene, gefolgt von das Fell, und über den Kopf ziehen. Entfernen Sie den Kopf durch das Schneiden mit der Schere unter den Schulterblättern und an die C1-2-Region der Spalte (angrenzend an der Schädelbasis zu finden).
      1. Die Muskulatur der Bauchwand auf der ventralen Seite geschnitten und weiter seitlich, eine Richtung zu einem Zeitpunkt, bis die Wirbelsäule erreicht ist.
    5. Verwenden eine scharfe Schere entfernen Wirbel des zervikalen Rückenmarks ab. Entfernen Sie die seitlichen Teile der Wirbel durch Schneiden über die vertebralen Bögen auf beiden Seiten.
    6. Lassen Sie nach dem Entfernen der ganze Wirbel das Rückenmark.
  6. Snap freeze der geernteten Gewebe in vorgekühlt 2-Methylbutane mithilfe der folgenden Methode:
    1. Die Hälfte füllen Sie eine Schale aus Edelstahl mit 2-Methylbutane und Tauchen Sie die unteren Viertel der Schüssel in einem Behälter mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
    2. Pre-chill 2-Methylbutane in flüssigem Stickstoff für 1-2 min.
    3. Legen Sie der Skelettmuskulatur mit der Pinzette in die 2-Methylbutane, bis es weiß wird. Sofortüberweisung des Gewebes zu Trockeneis und speichern Sie es dann bei-80 ° C.
  7. Für Rückenmark Immunostaining Einbetten des Gewebes in Paraffin-Blöcke bei Raumtemperatur vor Snap Einfrieren, wie beschrieben. 17
  8. Für die biochemische Analyse und Quantifizierung der MiRNA1 legen Sie die geerntete Gewebe in ein Cryoröhrchen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C.

Representative Results

Eine Viruslast von 1011 Vg von AAV9-MiR-298 wurde durch eine einzige Rute-Vene-Injektion in 5 Wochen alten SBMA Mäuse injiziert. Diese Mäuse tragen das menschliche AR Transgen mit abnorm erweiterte Trinukleotiderkrankungen-Darm-Trakt in der AR (AR97Q) und Anzeichen für neuromuskuläre Erkrankungen mit 10 Wochen alt (Gewichtsverlust, Rundrücken und Muskelatrophie) zu entwickeln. 11 lumbar Rückenmark und Quadrizeps bei 2, 4, 8 und 12 Wochen nach der Verabreichung für MiRNA Quantifizierung, biochemische Tests und Immunohistochemistry (Abbildung 1) geerntet wurden. Verwaltung der Behandlung und die nachfolgende Analysen wurden durch verblindeten Untersucher durchgeführt.

qRT-PCR-Analyse zeigte MiR-298 Ausdruck in der Skelettmuskulatur und des Rückenmarks, zwei und vier Wochen nach der Behandlung bzw. mit Spitzenwerten Ausdruck nach 8 Wochen in der Skelettmuskulatur und 12 Wochen im Rückenmark nach der Injektion (Abbildung 2 ). Unter Verwendung eines Mikroskops (Axiovert 100 M), war grünes Fluoreszenzsignal röntgenologisch im Muskelgewebe und im spinalen Motorneuronen Co Lokalisierung von GFP und das Motoneuron Marker Cholin-Acetyltransferase (ChAT) 10 Wochen nach der Behandlung, wenn die Mäuse zu zeigen beginnen Manifestationen der Krankheit (Abbildung 2).

Mit der gleichen Dosierung, war eine Kohorte der SBMA Mäuse randomisiert entweder MiR-298 oder verspotten 7 Wochen alt über Heck Vene Injektion für Biochemische Analysen und funktionelle Charakterisierung. Injektion wöchentlich Gewicht und Verhaltensstörungen Bewertung zu 40 Wochen alt folgte. qRT-PCR-Analyse zeigte, dass MiR-298 Behandlung verringert das Niveau der Mutant AR in den betroffenen Geweben (Abbildung 3), und Körpergewicht erhöht und Motorleistung (Abbildung 4 verbessert) 10 Wochen nach der Injektion ab.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Studiendesign. Zum Ausdruck von MiR-298 in vivo erhöhen injiziert wir SBMA Mäuse mit (A) der dual-Promoter AAV Vektor Plasmid mit dem Ausdruck GFP und MiR-298 oder Mock. (B) Mäuse wurden über eine einzige Rute eitel Injektion bei 7 Wochen alt (präsymptomatischen Stadium) injiziert. Rückenmark und Quadrizeps wurden aus einer Kohorte von SBMA Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten für Gewebe Verteilungsanalyse (Grüne) erhoben. Eine Kohorte von SBMA Mäusen wurde behandelt und auf 16 Wochen alt für Biochemische Analysen (rot) geopfert. Gewicht und Verhaltensstörungen Assays wurden wöchentlich bis zu 40 Wochen alt für funktionelle Charakterisierung (blau) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: AAV9-MiR-298 Lieferung bei Mäusen. Mit der beschriebenen Methode hier, erhielten Mäuse entweder AAV9-MiR-298-GFP oder AAV9-Mock-GFP durch intravenöse Injektion. Insgesamt MiRNA war von lumbalen Rückenmarks und Quadrizeps bei 2,4,8 und 12 Wochen nach der Injektion gesammelt. qRT-PCR wurde durchgeführt, um den Ausdruck von MiR-298 in (A) Quadrizeps einschätzen (n = 5) (B) Lendenwirbelsäule Rückenmark (n = 5, P < 0,01). Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler bedeutet gemeldet. Die weit verbreitete Transduktion des AAV Vektors in Geweben, die 10 Wochen nach Behandlung durch Lokalisierung der Färbung für GLP in der Quadrizeps (C) (ursprüngliche Vergrößerung, 10 X. bestätigt wurde geerntet Maßstabsleiste = 100 µm) und (D) Motoneuronen im lumbalen Rückenmarks (original 40 X Vergrößerung. Maßstabsleiste = 10 µm. GFP (grün), ChAT (rot) und DAPI (blau). Die Figur verändert wurde, vom Doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: MiRNA-298 Überexpression herunterreguliert Mutant AR in Rückenmark und Quadrizeps bei Mäusen. qRT-PCR wurde durchgeführt, um Ausdruck Niveaus der AR-mRNA in Lendenwirbelsäule Rückenmark (A) und (B) Quadrizeps behandelt mit AAV9-MiR-298-GFP oder AAV9-Mock-GFP zu schätzen. Transkript Ebenen wurden auf snoRNA202 normalisiert (n = 5 pro Behandlung). * P < 0,05, ** P < 0,01. Alle Daten werden als ± Standardfehler bedeutet gemeldet. Die Figur verändert wurde, vom Doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Figure 4
Abbildung 4: MiR-298 Überexpression verbessert die Motorik und Gewichtsverlust reduziert. Verhaltens wurde einmal in der Woche (w), zwischen 5 bis 40 Woche durchgeführt. Body-Gewicht (links) und hängende Kabel (rechts) Leistung von Mäusen (n = 15 pro Gruppe). Alle Daten werden als ± Standardfehler bedeutet gemeldet. Die Figur verändert wurde, vom Doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Discussion

Hier zeigen wir eine hocheffiziente und zugänglich Methodik um auszuwählen und liefern über Heck Injektion eine MiRNA mit rAAV9 als viraler Vektor Skelettmuskulatur und motorischen Neuronen in den Mäusen. 14 im Vergleich zu anderen RNAi-Strategien, sind MiRNAs weniger giftig und weniger immunogen. 18 darüber hinaus ihre geringe Größe machen sie gut geeignet, um die begrenzten Verpackungskapazität von viralen Vektoren. 2 numerische Algorithmen und Vorhersage Werkzeuge ermöglichen die Identifizierung von vermeintlichen MiRNA-mRNA Zielen. Einmal identifiziert, müssen die Auswirkungen der MiRNA auf Ziel Genexpression nachgewiesen werden. Ein gemeinsamer Ansatz ist einer bestimmten MiRNA in Vitro overexpress und Protein Ausdruck Zielwerte mit westlichen Analyse zu erkennen. 14 , 19

Verschiedene Studien haben virale und nicht-viralen Strategien verwendet, für die Bereitstellung von MiRNAs. 13 hier wir Adeno-assoziierte Virus (AAV) als gen Lieferung-Tool verwendet. Im Vergleich zu anderen viralen Vektoren, AAV entlockt niedrige Immunogenität ermöglicht langfristige Gentransfer, und hat ein breites Spektrum an Tropismus zu Spalten und nicht-teilenden Zellen. 18 diese Versandart kann auch die Notwendigkeit einer chemischen Veränderung umgehen, die Funktionalität und die Spezifität der RNS-Molekül beeinträchtigen können. Es gibt mehrere Serotypen der AAV, die meist durch die Zusammensetzung der Kapsid-Proteine bestimmt werden. Diese Serotypen unterscheiden sich in ihren Tropismus und transduzieren verschiedener Zelltypen. Es ist notwendig, die korrekte Serotyp auszuwählen, wenn man bedenkt das Zielgewebe. Wir haben rAAV9, aufgrund seiner hohen Transduktion Effizienz in das zentrale Nervensystem und Skelettmuskulatur nach peripheren Verwaltung19,20. Dieser Ansatz hat größere Transduktion Wirksamkeit bei Neugeborenen Tieren im Vergleich zu erwachsenen Tieren, wahrscheinlich wegen der Unterschiede in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, Neuron-Glia-Verhältnis und Reife der Blut-Hirn-Schranke gezeigt. 21 , 22

Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist das Design des Expressionsvektors. Im Vergleich zu Bicistronic Vektoren, die durch niedrigere Ausdruck des zweiten Gens im Vergleich mit dem ersten Gen neben der Projektträger behindert sind, ermöglicht der dual Promotor Vektor eine kaskadierende Konfiguration so hohe Expression der MiRNA und EGFP, nachgeben Lokalisierung von der MiRNA ermöglicht im Maus-Gewebe durch Immunfluoreszenz.

Intravenöser Injektion von AAV9 führte zu hohen Wirkungsgrad und homogene Transduktion in den Zielgeweben, Skelettmuskel und motorischen Neuronen. Diese Route der Injektion ermöglicht der verabreichte Dosis zu erreichen die systemische Zirkulation und Hirn-Schranke das Blut, das für Therapien, die auf das zentrale Nervensystem wichtig ist. Darüber hinaus ist es eine nicht-invasive Methode zur Auslieferung an die CNS. MiR-298 Ausdruck erhöht in das Rückenmark und Muskel nach 2-4 Wochen mit einer einzigen peripheren Injektion bei 5 Wochen alt. Wenn mit einsträngiger Genom AAV Vektoren, die de-Novo -Synthese des zweiten DNA-Strang für die verzögerte Transduktion ausmachen können. 23

Ebenen der menschlichen MiR-298 waren nicht nachweisbar im behandelten Mäuse 20 Wochen nach einer einzigen Verwaltung, darauf hindeutet, dass bei chronischen Erkrankungen, mehrere Injektionen erforderlich, um einen therapeutischen Nutzen zu erreichen. Jedoch kann die MiRNA Verschlechterung im Laufe der Zeit Begrenzung wenn ein lebenslange wiederholter Verabreichung erforderlich ist. Darüber hinaus kann adaptive Immunität gegen AAV-Vektoren ein weiteres Hindernis für eine erfolgreiche gen-Lieferung bilden. 24 so Generation der AAV-Vektoren, die immunologisch inerten ist entscheidend für wiederholter Verabreichung und langfristige Effekte mit diesem vielversprechenden-Delivery-System zu erreichen. 25

Eine Beschränkung auf die Verwendung von MiRNA als therapeutische Strategie ist das Risiko von Ziel-Effekten. MiRNAs können durch incomplementary Basenpaarung mit anderen gen-Transkripte, die eine Sicherheit Gefahr mit diesem Ansatz interagieren. Verbesserte Gestaltung der RNAi-Sequenzen, einschließlich der Verwendung von nicht-kanonischen MiRNAs, z. B. Mirtrons, das umgehen des Mikroprozessor-komplexes und umfangreiche Sicherheits- und Verträglichkeitsprofil Langzeitstudien kritisieren vor der Umsetzung dieser Strategie in eine sichere und effektive Therapie. 26 , 27 , 28

Die hier beschriebene Methode wurde ursprünglich für MiRNA Überexpression entwickelt, aber es kann auch für MiRNA Hemmung Therapie mit antagomire genutzt werden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt. Wir danken SignaGen Laboratories (Rockvile, MD, USA) für das AAV9-Virus-Produktion. Diese Forschung wurde durch das intramurale Forschungsprogramm der NINDS, NIH unterstützt. Philip R. Lee wurde aus der Division von intramuralen Forschung NICHD Mitteln unterstützt. Carlo Rinaldi wurde durch ein Stipendium von der Association Française Contre Les Myopathien (AFM) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306 Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 Purification of miRNA and total RNA
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit ThermoFisher Scientific 4366596 A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs
snoRNA202 Primer ThermoFisher Scientific 1232 Taqman miRNA control assay in mouse
miR-298 Primer ThermoFisher Scientific 2190 Taqman miRNA-298 assay in mouse
Anti-GFP antibody abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade
Red ink pad Dovecraft Essentials
Blue ink pad Dovecraft Essentials
AAV9-GFP vector SignaGen Laboratories SL100840 Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification
mmu-miR-298-5p ThermoFisher Scientific MC12525 mirVana miRNA mimic
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP Vector Biosystems Inc

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