طويلة الأجل تصوير لايف

Developmental Biology
 

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لعلى المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لقرص تخيلي ذبابة الفاكهة. وهو يدل التمايز مبصرة والتناوب ommatidial في غضون فترة 10 ساعة من التصوير المباشر لقرص العين. بروتوكول بسيط ولا يتطلب الإعداد مكلفة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tsao, C. K., Ku, H. Y., Sun, Y. H. Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc. J. Vis. Exp. (123), e55748, doi:10.3791/55748 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يوفر التصوير الحي القدرة على تتبع باستمرار العمليات الخلوية والتنموية ديناميكية في الوقت الحقيقي. وقد استخدمت ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي اليرقات لدراسة العديد من العمليات البيولوجية، مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والنمو، والهجرة، وموت الخلايا المبرمج، والمنافسة، مما يشير الى خلية خلية، وتشكيل الحدود المجزئ. ومع ذلك، لم تكن طرق على المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لأقراص تخيلي مرضية، على الرغم من الكثير من الجهود. مؤخرا، قمنا بتطوير طريقة لعلى المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لأقراص تخيلي لمدة تصل إلى 18 ساعة. بالإضافة إلى استخدام تركيز الأنسولين عالية في مستنبت، تم استخدام الاغاروز ذوبان منخفضة أيضا إلى تضمين القرص لمنعها من الانجراف خلال فترة التصوير. يستخدم هذا التقرير أقراص العين antennal كمثال على ذلك. وأعقب مبصرة R3 / 4 محددة التعبير mδ0.5-Ga4 لإثبات أن مبصرة مختلفاtiation والتناوب ommatidial يمكن ملاحظتها خلال 10 ساعة فترة التصوير الحي. هذا هو بروتوكول تفصيلا واصفا هذه الطريقة البسيطة.

Introduction

وكانت ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي اليرقات نظام تجريبي يفضل لدراسة مجموعة واسعة من الآليات البيولوجية. هذه الأقراص المنغلفة من ظهارة الجنينية وتصبح الهياكل الكيس مثل بنتها طبقتين الظهارية، Peripodial الظهارة (PE) والقرص المناسب (DP) 1 و 2. الخلايا قرص تخيلي تتكاثر وتتمايز تدريجيا خلال مراحل اليرقات والعذارى وتطوير في نهاية المطاف في هياكل الجسم الكبار. نظرا لهيكل من طبقتين مسطح وبسيط للأقراص تخيلي، فهي سهلة لمراقبة عند تشريح من اليرقات. ومع ذلك، على الرغم من عدة جهود من قبل العديد من الجماعات، لم تكن الطرق الحالية للثقافة على المدى الطويل من أقراص تخيلي مرضية. لقد وضعت مؤخرا طريقة الثقافة التي يمكن أن تحافظ على التطور الطبيعي للأقراص تخيلي متعددة لمدة تصل إلى 18 ساعة والتي تتيح التصوير الحي 3 3. طريقة بسيطة، وليس هناك حاجة تهوية خاصة أو تداول المتوسط.

واحدة من أفضل أقراص تخيلي مدروسة هو القرص العين antennal. هو مبني على العين ذبابة الفاكهة تتكون من حوالي 800 ommatidia. وتتألف كل مقيلة من ثماني خلايا مستقبلة للضوء (R1-R8). في القرص العين اليرقات، وخلايا مستقبلة للضوء نفرق عقب مرور تخلقية الشق (MF)، التي تجتاح عبر القرص العين من الخلفية إلى الأمامية 4 و 5. المستقبلات الضوئية في مقيلة تفرق في التسلسل، بدءا R8، يليه R2 / R5، R3 / R4، R1 / R6، وR7 6. وommatidia في ظهري وهاءنصفين ntral من القرص العين الخضوع لدوران 90 درجة في اتجاهين متعاكسين، مما أدى إلى شرليتي المعاكس 7 و 8. تحدث عملية تناوب على مرحلتين: أولا، يبدأ 45 درجة دوران في واكتمال في الصف السادس ommatidia وراء MF. اكتمال الثاني 45 درجة دوران بنحو التوالي 16 9 و 10. هذه الدراسة تستخدم دوران ommatidial، والتي تمثلت في R3 / 4 محددة 11 mδ0.5-Ga4، للتدليل على التمايز وديناميات الخلوية العادية التي يمكن ملاحظتها من خلال هذا الأسلوب للثقافة ويعيش صورة القرص العين.

Protocol

إعداد 1. ما قبل التجريبي

  1. جمع البيض الطيران التي تعبر عن النووي البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت mδ0.5-GAL4 والثقافة عند 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
  2. ميكروويف 0.7 غرام من الاسعار المنخفضة للذوبان الاغاروز في 10 مل من المالحة الفوسفات مخزنة-1X (PBS) حتى يذوب تماما agarose. حافظ على 0.7٪ هلام انصهار منخفضة في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. تعقيم جميع المعدات، بما في ذلك ملقط، مقص، 42 ملم coverslips س 0.17 ملم، 9 جيدا لوحة بقعة الزجاج، وغرفة الثقافة المغناطيسي، مع 70٪ من الإيثانول لأكثر من 12 ساعة.
  4. إعداد مستنبت 3: متوسط ذبابة الفاكهة شنايدر تستكمل مع 2٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 0.5٪ البنسلين ستربتومايسين، و 1.25 ملغ / مل الانسولين. لتجنب التلوث، وإعداد المتوسطة في غطاء ثقافة الخلية. تخزين مستنبت مستعد في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون شهر.
  5. تنظيف منصة التشريح ومجرب "يدي مع الايثانول 70٪ قبل البدء في تشريح.

تشريح 2. القرص

  1. الهواء الجاف جميع المعدات من 70٪ من الإيثانول.
  2. حدد اليرقة الطور الثالث من قارورة ذبابة. لتجنب التلوث من القارورة الطيران، وغسل يرقة في برنامج تلفزيوني 1X 3X لإزالة النفايات.
  3. تشريح اليرقة تنظيفها في 1 مل من مستنبت (في RT) في 9 جيدا الزجاج لوحة بقعة تحت المجهر تشريح.
  4. فهم اليرقة مع زوج من الملقط في حوالي ثلث الطريق من نهاية الخلفي وملقط آخر في ربط الفم. سحب الملقط في اتجاهين متعاكسين للافراج عن الأنسجة الداخلية.
    1. إزالة الغدد اللعابية، الدهون في الجسم، وبشرة من مجمع العين والدماغ تعلق على ربط الفم. إذا لا تزال تعلق على الحبل العصبي البطني، وقطع بعيدا مع المقص.
  5. استخدام زوج واحد من ملقط لفهم ورطتها الفم وزوج واحد من ملقط لإزالة قطعة من الأنسجة التي شاركnnects العقول وأقراص العين في الجزء الظهري.
    ملاحظة: إذا لم تتم إزالة هذا النسيج، وأقراص العين antennal اثنين تكون قريبة من بعضها البعض والدماغ. فإن أقراص العين ثم لا الاستلقاء على ساترة لهذا النسيج، والدماغ، والقرص العين antennal ستشكل مثلث.
  6. تدوير مجمع كامل للموقف بطني-التصاعدي. إزالة خيوط الذي يربط ربط أو القرص إلى الدماغ.
    ملاحظة: إذا لم يتم إزالة خيوط، فإن القرص العين antennal انقسم الى اثنين من قطعة عند إزالة ربط الفم.
    1. إزالة ربط الفم. والحرص على عدم تلف القرص العين أثناء العملية.
      ملاحظة: قرص العين هو الآن مجانا على المديين المتوسط ​​وتوصيل فقط إلى الدماغ عن طريق ساق البصرية.

3. تركيب

  1. الهواء الجاف وتجميع مكونات غرفة مع 42 مم × 0.17 مم ساترة. إرفاق طبقة مزدوجة من O-خواتم إلى مركز الغطاء زلة لعقد عشرالبريد الاغاروز.
  2. غرفة تجميع مع ساترة. وضع 42 مم × 0.17 مم ساترة على متقبل المرحلة. وضع السيليكون يا الدائري على غلاف زلة. وضع قاعدة. قفل خزانة الختم ووضع الغطاء (الشكل 1).
  3. نقل بعناية مجمع العين والدماغ تشريح لمركز O-حلقة باستخدام micropipette 20 ميكرولتر مع طرف 10-200 ميكرولتر.
  4. إزالة معظم المتوسطة وإضافة 12 ميكرولتر من 0.7٪ الاغاروز ذوبان منخفضة (عند 37 درجة مئوية) للعينة.
    ملاحظة: إن موقف القرص العين يمكن أن تتغير مع ملقط قبل التصلب من الاغاروز. فإن الاغاروز يصلب خلال 5 دقائق.
    1. إضافة 1 مل من مستنبت في درجة حرارة الغرفة إلى مركز O-حلقة. كل حلقة O-يمكن تحميل ما يصل إلى 4 عينات. تأكد من أن الاغاروز يتم لصقها إلى O-عصابة لتجنب الانجراف من العينة.
      ملاحظة: لا تهوية أو تداول متوسطة أمر ضروري.

4. متحد البؤر المجهري

  1. مكان الغرفة على مرحلة مجهر متحد البؤر مقلوب لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن درجة الحرارة. وهذا يمكن منع Z-محور الانحراف أثناء التصوير.
  2. قبل التصوير الحي على المدى الطويل، والتحقق ما إذا كانت الأنسجة سليمة من قبل التفاضلية المجهري تدخل التباين.
  3. لتجنب الضيائية، واستخدام قوة الليزر أقل من 2 ميغاواط. استخدام هدفا 40X للتصوير.
  4. الحصول على 62 ميكرومتر الصور Z-المكدس في 12 دقيقة في الفترة الفاصلة البصرية من 1 ميكرون. الحصول على 40 دورات المسح على ما مجموعه 10 ساعة. تأكد من أن كل دورة تتضمن 12 دقيقة من التصوير و 3 دقائق من الراحة.

Representative Results

في هذا المثال، وصفت خلايا مستقبلة للضوء R3 / R4 مع mδ0.5-Ga4 لمراقبة مبصرة التمايز. mδ0.5-Ga4 يدفع تعبير قوي في R4 والتعبير الأضعف في R3 11، مما يجعلها علامة ممتازة للR3 وR4، فضلا عن عملية التناوب ommatidial. في الفيلم 1، وصفت R3 وR4 مع GFP. في بداية 10 ساعة جلسة الحية التصوير، وكانت هناك 8 صفوف من كتل ommatidial (الشكل 2A وفيلم 1) و 14 صفوف من كتل ommatidial في نهاية (الشكل 2B). وكان معدل التمايز ommatidial 1.67 ساعة لكل صف واحد، وهو ما يقارب نسبة 1.5-2 ح / الصف في الجسم الحي في أقراص 10، 11،الصورة = "XREF"> 12 و 13 و 14. على أساس المواقف النسبية للR3 وR4، حدث دوران ommatidial في القرص مثقف خارج الحي خلال التصوير الحي (الشكل 2A، A ''، B، و B ''). وصفت كتلة R3 / R4 واحدة مع كرة بيضاء في الإطار الأول من فيلم 2. في البداية، محور R3 / R4 يبدو أن عمودي على خط الاستواء (الشكل 2C وفيلم 2). ومن ثم يبدو لتدوير 15 درجة و 30 درجة مئوية، و 45 درجة في 3 (الشكل 2C)، 6 (الشكل 2C '')، و 9 (الشكل 2C '' ') ساعة، على التوالي. وتشير هذه البيانات إلى أن هذه الطريقة يمكن الحفاظ مبصرة التمايز خلال التصوير الحي 10 ساعة.

شكل 1
فيقوري 1: الرسم التخطيطي للجمعية الغرفة. الرسم التخطيطي للتجمع الغرفة: ( 1 ) وضع طبقة مزدوجة o- حلقة ساترة المرفقة على المرحلة متقبل. ( 2 ) ضع السليكون o الدائري على زلة الغطاء. ( 3 ) ضع القاعدة. ( 4 ) قفل خزانة الختم. ( 5 ) تحميل العينة في وسط حلقة O ووضع الغطاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: التصوير لايف من R3 / R4 التمايز والتناوب. R3 / R4 المسمى مع Mδ0.5-Gal4 معربا عن شكل غفب النووي خلال 10 ساعة من التصوير الحي. تم التقاط جميع الأرقام من الفيلم 1 . ( A ) صورة اتخذت في البداية. ( > A-A ") الصورة الموسع من المنطقة المحاصرة على اليسار ( A ' ) والحق ( A" ). ( ب ) الصورة التي اتخذت في نهاية فترة 10 ساعة. ( B'-B " ) الصورة الموسع من المنطقة المحاصرة على اليسار ( B ' ) والحق ( B" ). ( سيسي '' ' ) ويتبع زوج واحد R3 / R4 (ملحوظ بالسهم في A') من خلال الوقت لإظهار دوران الزوج R3 / R4. الحانات مقياس = 15 ميكرون، 10 ميكرون، و 5 ميكرون في A، B، و C، على التوالي. جميع الأرقام هي أقصى كثافة Z- التوقعات. يظهر الجدول الزمني في h: مين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1
فيلم 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيلم.

فيلم 2
فيلم 1: الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيلم.

Discussion

في هذه الدراسة، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لعلى المدى الطويل تجربة التصوير مباشرة على أقراص تخيلي ذبابة الفاكهة. قضينا الكثير من الوقت في ممارسة تشريح دقيق لتجنب الضرر القرص والسماح للمرفق من القرص بالقرب لل coverslips. حاولنا بولي-L-ليسين (PLL) وانخفاض ذوبان الاغاروز لعقد الأنسجة. في النهاية، أظهر الاغاروز ذوبان منخفضة قدرة أفضل على عقد الأنسجة. وعلى الرغم من استخدام القرص العين فقط في هذه الورقة لإثبات وقوع العادي للتمايز مبصرة والتناوب ommatidial خلال 10 ساعة فترة التصوير الحي، ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة على قرص واحد آخر على الأقل، القرص الجناح، كما هو موضح في دراسة سابقة 3. وعلاوة على ذلك، وإعداد مستنبت والإعداد والتصوير الحية هي بسيطة ولا تتطلب تهوية أو تداول المتوسط.

تصوير حي المستمر يمكن أن توفر تسلسل زمني واضح لعشية البيولوجيةاليلة. في تقريرنا السابق من التمايز الدبقية والهجرة في القرص العين، قدمنا دليل مباشر على أن الدبقية التفاف تفرق من الدبقية الموجودة بعد الهجرة إلى الجزء الأمامي من القرص العين 3. على المدى الطويل ثقافة فيفو السابقين تسمح لوضع العلامات تنشيط ليزر معين من الخلايا، مثل الصور وتحويل البروتين الفلوري Kaede الذي، لمتابعة تصرفاتهم 3. كما يمكن أن تستوعب اختبار المواد الكيميائية التي تضاف مباشرة إلى مستنبت. وبالتالي، يمكن استخدامه كمنصة فحص المخدرات. منذ بعض عملية ديناميكية تحدث في غضون دقائق أو ثواني، مطلوب قرار زمنية عالية. لتعزيز القرار الزماني، وعلى ضوء ورقة المجهري 15، 16 أو الغزل القرص المجهري 17 قد يكون خيارا جيدا.

حالة الثقافة الحالية ليست مثالية. أنه لا يدعم نمو القرص. خلية صويدعم roliferation فقط لمدة تصل إلى 12 ساعة 3. بعد 12 ساعة في الثقافة فيفو السابقين، فإن معدل التمايز مبصرة يبدأ في الانخفاض 3. قد يكون هذا بسبب عدم وجود بعض العناصر الغذائية أو الهرمونات. لأن الفرق كبير في هذا مستنبت هو تركيز عال من الأنسولين، قد يكون الأنسولين الثدييات جزئيا محاكاة وظيفة الببتيد الذي يشبه الانسولين الذاتية. إضافة استخراج ذبابة، والحشرات طرهالوز السكر في الدم، وتركيز مختلف من هرمون طرح الريش 20 hydroxyecdysone، لم تكن مفيدة 3. ومع ذلك، فإن الفترة الثقافة 12-18 ساعة كافية لدراسة العديد من العمليات التنموية. وقد تم مقارنة طرق زراعة بديلة لزراعة أقراص تخيلي اليرقات ويوفر لدينا زراعة والتصوير شرط أطول نافذة الوقت، ومعظم الوضوح للتصوير الحي. على الرغم من أن أقراص داخل اليرقات الحية والشرانق يمكن تصوير مباشرة18، 19، 20، 21، 22، نافذة قرار والوقت للملاحظات محدودة. اليرقات في وقت متأخر وأقراص العذراء يمكن تربيتها لفترة طويلة 23 و 24، ولكن أقراص الخضوع التشكل كبير. للاستفادة من وأقراص اليرقات 2D مسطحة، لدينا طريقة زراعة والتصوير هو الحل الأفضل حتى الآن.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لتشون لان هسو ويو تشي يانغ لإعداد الطعام يطير والحفاظ على الأسهم ذبابة، وسو بينغ لي و إمب التصوير الأساسية لمساعدتهم مع المجهر متحد البؤر. وقد دعمت هذه الدراسة من المنح إلى يهس (نسك 101-2321-B-001 -004، نسك 100-2321-B-001 -012، نسك 102-2321-B-001 -002، موست 103-2311-B-001 -035 -MY3) من المجلس الوطني للعلوم ووزارة العلوم والتكنولوجيا في جمهورية الصين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low-melting agarose AMRESCO  0815-25G
Phosphate-buffered Saline (PBS) AMRESCO 0780-2PK
42 mm x 0.17 mm cover slips  PST G401-42
Schneider’s Drosophila medium  Thermo 21720-024
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665
Penicillin-streptomycin  GIBCO 759
Insulin Sigma I9278
Culture chamber  PECON POC-R2 Cell Cultivation System
40X objective C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective 
Fly strain:nls.GFP Bloominggton 4775

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, S. M. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).
  2. Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
  3. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11, (9), e0163744 (2016).
  4. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53, (2), 217-240 (1976).
  5. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, (3), 841-850 (1991).
  6. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120, (2), 366-376 (1987).
  7. Wolff, T., Ready, D. F. The Development of Drosophila Melanogaster. Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).
  8. Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2, (5), 525-535 (2002).
  9. Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12, (2), 423-431 (1994).
  10. Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121, (12), 4247-4256 (1995).
  11. Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130, (22), 5413-5423 (2003).
  12. Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28, (3), 363-380 (1995).
  13. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17, (4), 309-313 (2007).
  14. Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, (4), 545-557 (2013).
  15. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  16. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18, (6), 624-632 (2008).
  17. Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
  18. Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336, (6082), 724-727 (2012).
  19. Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7, (1), (2012).
  20. Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141, (11), 2339-2348 (2014).
  21. Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313, (2), 739-751 (2008).
  22. Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256, (2), 389-402 (2003).
  23. Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20, (1), 83-93 (1998).
  24. Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33, (2), 441-456 (1973).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics