تحليل التفاعلات البروتين البروتين والمشاركة في توطين بين مكونات الفجوة، ضيق، والمالطيون تقاطعات في الغدد الثديية الفئران

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تقاطعات بين الخلايا هي متطلبات الغدة الثديية وظائف مرحلة محددة والتنمية. توفر هذه المخطوطة بروتوكول مفصل لدراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي) والمشاركة في التعريب باستخدام الغدد الثديية الفئران. هذه التقنيات تسمح للتحقيق في ديناميات الارتباط الجسدي بين التقاطعات بين الخلايا في مراحل تنموية مختلفة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التفاعلات خلية خلية تلعب دورا محوريا في الحفاظ على سلامة الأنسجة والحاجز بين المقصورات المختلفة للغدة الثديية. يتم توفير هذه التفاعلات من قبل البروتينات الوصلي التي تشكل الروابط بين الخلايا المجاورة. ويمكن أن يؤدي سوء توصيف البروتين الوصلي وتقليل الروابط الجسدية مع الشركاء الملتزمين إلى فقدان الوظيفة، وبالتالي إلى اختلال وظيفي في الجهاز. وبالتالي، تحديد توطين البروتين والتفاعلات البروتين البروتين (بي) في الأنسجة الطبيعية والمرض ذات الصلة أمر ضروري لإيجاد أدلة جديدة وآليات تؤدي إلى تطور الأمراض أو تغييرات في الوضع التنموي. تقدم هذه المخطوطة طريقة من خطوتين لتقييم مؤشر أسعار المنتجين في الغدد الثديية الفئران. في القسم بروتوكول 1، يتم وصف طريقة لأداء المناعي المشترك (شارك إف) باستخدام الأجسام المضادة التي تثار ضد البروتينات ذات الفائدة، تليها الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع فلوروكروميس. على الرغم من شارك في إف جميعويعود إلى مظاهرة من قرب من البروتينات، فإنه يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات المادية. لذلك، يتم توفير بروتوكول مفصل لالمناعي المشترك (إب المشترك) في القسم بروتوكول 2. وتستخدم هذه الطريقة لتحديد التفاعلات المادية بين البروتينات، دون التأكد مما إذا كانت هذه التفاعلات مباشرة أو غير مباشرة. في السنوات القليلة الماضية، وقد أثبتت إف شارك وتقنيات الملكية الفكرية المشتركة أن مكونات معينة من تقاطعات بين الخلايا تشارك في توطين والتفاعل معا، وخلق العلاقات التي تعتمد على مرحلة وظيفية التي تختلف أثناء تطوير الغدة الثديية.

Introduction

نمو الغدة الثديية والتنمية يحدث أساسا بعد الولادة. هذا الجهاز يعيد باستمرار نفسه في جميع أنحاء الحياة الإنجابية للثدييات 1 . وتتكون ظهارة الغدة الثديية الكبار من الطبقة الداخلية من الخلايا الظهارية اللمعية وطبقة خارجية من الخلايا القاعدية، وتتكون أساسا من الخلايا الظهارية، وتحيط بها غشاء الطابق السفلي 2 . لمراجعة جيدة على بنية الغدة الثديية والتنمية، يمكن للقارئ الرجوع إلى سترنليشت 1 . خلية الخلايا التفاعلات عبر الفجوة (غ)، ضيق (تي)، و تلتصق (آج) تقاطعات ضرورية للتطور الطبيعي وظيفة الغدة 1 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . المكونات الرئيسية لهذه التقاطعات في الغدة الثديية الفئران هي Cx26، Cx30، Cx32، و Cx43 (غ). كلودين -1، -3، -4، و -7 وزو-1 (تي)؛ و E-كادهيرين، P-كادهيرين، و β-كاتينين (آج) 7 ، 8 . مستويات التعبير عن هذه البروتينات متعددة وظيفية تختلف في طريقة تعتمد على مرحلة أثناء تطور الغدة الثديية، مما يشير إلى متطلبات التفاعل خلية خلية التفاضلية 9 . غ، تي، و آج ترتبط هيكليا ووظيفيا وحبل البروتينات الهيكلية أو التنظيمية الأخرى إلى المواقع المجاورة من الخلايا المجاورة، وبالتالي خلق علاقة الوصلية 10 . تكوين العلاقة الوصلية يمكن أن تؤثر على سد مع الهيكل الخلوي الكامنة، فضلا عن نفاذية العلاقة والاستقرار، ويمكن بالتالي تؤثر على وظيفة الغدة 8 ، 9 ، 10 ، 11 . مكونات تقاطعات بين الخلايا المقيمين في الوصلات الوصلي أو التفاعل مع بعضها البعض في ديفوقد تم تحليل مراحل النمو المتخلفة من تنمية الغدد الثديية مؤخرا باستخدام المناعي المشترك (شارك في إف) وشارك في مناعي (المشارك إب) 9 . في حين تسمح تقنيات أخرى لتقييم الارتباط الوظيفي بين البروتينات، لا يتم عرض هذه الأساليب في هذه المخطوطة.

كما البروتينات مجرد التصرف وحده للعمل، ودراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي)، مثل نقل الإشارات والتسلسل الكيميائي الحيوي، أمر ضروري لكثير من الباحثين ويمكن أن توفر معلومات هامة عن وظيفة البروتينات. كو-إف والتحليل المجهري يساعد على تقييم عدد قليل من البروتينات التي تشترك في نفس الفضاء تحت الخلوية. ومع ذلك، فإن عدد الأهداف يقتصر على الأجسام المضادة، والتي يجب أن تثار في الحيوانات المختلفة، ومن خلال الوصول إلى المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر مختلفة الطول الموجي وكاشف الطيفي لتعدد الإرسال. المشارك إب يؤكد أو يكشف التفاعلات المادية عالية تقارب بيتوإين اثنين أو أكثر من البروتينات المقيمين داخل مجمع البروتين. على الرغم من تطوير تقنيات جديدة، مثل مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) 12 وقرب ربط مقايسة (جيش التحرير الشعبى الصينى) 13 ، والتي يمكن أن تكتشف في وقت واحد توطين وتفاعلات البروتينات، إب المشترك يبقى تقنية مناسبة وبأسعار معقولة لدراسة التفاعلات بين البروتينات الذاتية.

طريقة خطوة بخطوة وصفها في هذه المخطوطة سيسهل دراسة توطين البروتين ومؤشرات الأداء القياسية، وتشير إلى المزالق لتجنب عند دراسة مؤشرات الأداء القياسية الذاتية في الغدد الثديية. تبدأ المنهجية مع عرض إجراءات المحافظة المختلفة للأنسجة المطلوبة لكل تقنية. الجزء 1 يعرض كيفية دراسة البروتين المشارك في توطين في ثلاث خطوات: ط) سيكتيونينغ من الغدد الثديية، إي) وضع علامات مزدوجة أو ثلاثية من البروتينات المختلفة باستخدام تقنية شارك في إف، و 3) التصوير منتوطين البروتين. الجزء 2 يبين كيفية ترسب البروتين الذاتية وتحديد البروتينات المتفاعلة في ثلاث خطوات: ط) إعداد المحللة، إي) غير مباشر مناعي البروتين، و 3) تحديد شريك ملزم من قبل سدز-بادج وغش لطخة الغربية. كل خطوة من هذا البروتوكول هو الأمثل للأنسجة الغدة الثديية القوارض ويولد ذات جودة عالية، محددة، وقابلة للتكرار النتائج. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لدراسات مؤشر أسعار المنتجين في الأنسجة الأخرى أو خطوط الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان في الجامعة (المعهد الوطني للإحصاء - أرماند-فرابير، لافال، كندا).

1. تحديد البروتين المشارك التعريب

  1. من الأنسجة إلى الشرائح المجهرية
    ملاحظة: يجب التعامل مع الأنسجة والأقسام على الجليد الجاف.
    1. استئصال الغدد الثديية من حيوان (للحصول على وصف كامل لهذا الإجراء، الرجوع إلى بلانتي وآخرون ) 14 .
    2. تضمين الأنسجة استئصال في تجميد / تصاعد المتوسطة على الجليد الجاف. إضافة ما يكفي من المتوسطة لتغطية الغدة. عندما يتم تدعيم المتوسطة، ونقل الأنسجة إلى الفريزر في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا 9 .
    3. باستخدام كريوميكروتوم مجموعة في ≤ -35 ​​درجة مئوية، وقطع الأنسجة إلى 7-10 ميكرون سميكة أقسام ووضعها على الشرائح المجهر.
      ملاحظة: عندما يكون ذلك ممكنا، ضع قسمين على كل شريحة. سيتم استخدام القسم الأيسر كالسيطرة إغاتيف للتحقق من خصوصية الأجسام المضادة و أوتوفلورزنس من الأنسجة، في حين سيتم وصف الجانب الأيمن مع الأجسام المضادة.
    4. الحفاظ على أقسام في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. شارك في تلطيخ إف
    1. استرداد الشرائح المجهرية المناسبة من الفريزر وعلى الفور إصلاح المقاطع عن طريق غمر لهم في الفورمالديهايد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (رت).
    2. ثم تزج الشرائح في الفوسفات مخزنة المالحة (بس) في رت. ترك الشرائح في برنامج تلفزيوني في رت حتى الشروع في الخطوة التالية.
    3. قم بتدوير كل قسم من الشريحة باستخدام حاجز مسعور متاح تجاريا أو قلم مختبر طارد للماء (انظر جدول المواد ). يجب الحرص على عدم لمس الأنسجة. على الفور إضافة قطرات من برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة ووضع الشريحة في غرفة الأنسجة الرطبة لبقية الإجراء.
      ملاحظة: يجب أن تبقى أقسام الأنسجة مرطب. لبديللي، استخدم مربع مع غطاء ومناشف ورقية رطبة في الجزء السفلي.
    4. منع كل قسم الأنسجة مع 100-200 ميكرولتر من 3٪ ألبومين المصل البقري (بسا) -Tris مخزنة المالحة (تبس) -0.1٪ بوليسوربات 20 (انظر جدول المواد ) لمدة 30 دقيقة في رت. في حين أن العينات تمنع، وإعداد الحلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية عن طريق تمييع الأجسام المضادة في تبس 0.1٪ بوليسوربات 20.
      ملاحظة: يتم توفير تركيز المطلوبة للجسم المضاد من قبل الشركة المصنعة. انظر جدول المواد والأشكال 1 و 2 للحصول على أمثلة، وكذلك دياناتي وآخرون. 9 - على الرغم من أنه ليس من الضروري للعمل في الظلام عند استخدام معظم الأجسام المضادة مترافق فلورفور، تجنب تعريض حلول الأجسام المضادة أو الأنسجة الملون إلى مكثفة، ضوء ساطع.
    5. إزالة الحل حجب عن طريق الشفط واحتضان الأقسام في 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخفف لمدة 60 دقيقة في رت. Alternativelذ، احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    6. إزالة حل الأجسام المضادة الأولية عن طريق الشفط وغسل المقاطع مع 250-500 ميكرولتر من تبس-0.1٪ بوليسوربات 20 لمدة 5 دقائق. إزالة الحل غسل عن طريق الشفط وتكرار غسل مرتين.
    7. إزالة الحل غسل عن طريق الشفط واحتضان المقاطع مع 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية فلورفور مترافق المناسب لمدة 60 دقيقة في رت.
    8. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق الشفط وغسل المقاطع مع 250-500 ميكرولتر من تبس-0.1٪ بوليسوربات 20 لمدة 5 دقائق. إزالة الحل غسل وتكرار مرتين.
    9. كرر الخطوة 2.5-2.8 باستخدام مزيج مناسب من الأجسام المضادة الأولية والثانوية للبروتينات التالية من الفائدة.
    10. إزالة الحل غسل عن طريق الشفط وأداء تلطيخ نوى من خلال احتضان القسم مع 100-200 ميكرولتر من 1 ملغ / مل 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي) في تبس 0.1٪ بوليسوربات 20 لمدة 5 دقائق فيRT.
    11. إزالة الحل دابي عن طريق الشفط وتركيب الشرائح باستخدام وسيلة للذوبان في الماء، غير متصاعدة تركيب (انظر جدول المواد ) و كوفرسليبس. المضي قدما شريحة واحدة في وقت واحد.
      ملاحظة: احتضان نواة وصمة عار لأكثر من 5 دقائق لن يغير شدة تلطيخ. بدلا من ذلك، إزالة الحل دابي على جميع الشرائح واحتضان الأنسجة في برنامج تلفزيوني في حين تصاعد الشرائح.
    12. وضع الشرائح شقة في 4 درجة مئوية الثلاجة لمدة 8 ساعة على الأقل. انتقل إلى التصوير المجهري مضان (انظر الشكلين 1 و 2 ).
  3. التصوير المجهري
    1. تصور الأجسام المضادة الثانوية فلورفور مترافق باستخدام المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر مختلفة المطلوبة لإثارة فلوروفوريس في موجات محددة.
      ملاحظة: لتكون قادرة على تصور القنوات والحويصلات الهوائية، واقترح هدف 40X مع فتحة عددية من 0.95. امتحانه من الإعدادات المحددة في الشكل 1 .
    2. التحقق من توطين كل بروتين بشكل فردي عن طريق مسح الصورة طول موجة واحدة في ذلك الوقت.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، من المهم تحليل نقدي توطين البروتينات الوصلي. لتكون قادرة على تشكيل الوصلات الوصلية، يجب أن تكون هذه البروتينات مترجمة في غشاء البلازما.
    3. تحديد التوطين المشترك للبروتينات عن طريق دمج الصور الممسوحة ضوئيا مع أشعة الليزر في أطوال موجية مختلفة.
      ملاحظة: يمكن أن تصور البروتين المشارك التعريب عن طريق تغيير اللون الناتجة عن انبعاث اثنين أو أكثر فلوروفوريس في نفس الموقع ويمكن قياسها باستخدام البرنامج المناسب ( الشكلان 1 و 2 ؛ انظر أيضا المرجع 9).

2. دراسة مؤشر أسعار المنتجين

ملاحظة: يجب استخدام الغدد الثديية البطن لدراسة مؤشرات الأداء القياسية، والغدد الصدرية هي في ارتباط وثيق مع الصدريةالعضلات. استئصال الغدد الثديية (للحصول على وصف كامل لهذا الإجراء، راجع بلانتي وآخرون ) 14 والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

  1. إعداد المحللة
    1. وضع وزنها ورقة و 2 مل أنابيب ميكروسنتريفوج على الجليد الجاف لتبريد قبل لهم قبل الشروع في الخطوات التالية.
    2. اتخاذ الأنسجة الغدة الثديية من -80 درجة مئوية والاحتفاظ بها على الجليد الجاف.
    3. تزن الأنسجة على أوراق وزنها قبل المبردة ومن ثم نقل الأنسجة إلى 2 مل أنابيب ميكروسنتريفوج (التعامل مع الجليد الجاف). استخدام ما بين 50 و 100 ملغ من الأنسجة لكل عينة. الحفاظ على الأنسجة على الجليد الجاف حتى الخطوة 2.1.5.
    4. إعداد المبلغ المطلوب من العازلة تحلل المنظفات الثلاثي تستكمل مع ناف، نافو 3 ، ومثبط البروتياز / الفوسفاتيز، كما هو مبين في جدول المواد ، وذلك باستخدام الصيغ التالية. الفئران: العازلة المطلوبة (μL) = وزن الأنسجة الماوس (ملغ) × 3؛ الجرذ: مطلوبالعازلة (μL) = وزن الأنسجة الفئران (ملغ) × 5.
    5. إضافة المبلغ المطلوب من الجليد الباردة تحلل العازلة (المحسوبة في الخطوة 2.1.4) إلى أنبوب 2 مل تحتوي على الأنسجة.
      ملاحظة: في الخطوات 2.1.5-2.1.6، المضي قدما مع أنبوب واحد في وقت واحد.
    6. تجانس الأنسجة لمدة 30-40 ثانية باستخدام التجانس المستمر على طاحونة الأنسجة. دائما الحفاظ على أنبوب على الجليد. ضبط الخالط الأنسجة لسرعة متوسطة وتحريك بلطف طاحونة صعودا وهبوطا داخل الأنبوب.
    7. كرر الخطوات 1.6 و 1.7 مع أنابيب أخرى.
    8. احتضان لستات على الجليد لمدة 10-30 دقيقة.
    9. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 170 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    10. وفي الوقت نفسه، وتحديد 6-10 أنابيب ميكروسنتريفوج (0.6 مل) لكل عينة والاحتفاظ بها على الجليد.
    11. بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي، والتحقق من الأنابيب. تأكد من أنها تحتوي على الطبقة العليا من الدهون، واضحة، الأصفر إلى الوردي لستات (اعتمادا على مرحلة من مراحل التنمية) وبيليه.
    12. إنشاء ثقب في طبقة الدهونوذلك باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر للوصول إلى المرحلة السائلة. تغيير غيض وجمع المحللة دون إزعاج بيليه أو الشفط طبقة الدهون. قسامة المحللة في أنابيب المسمى مسبقا على الجليد (الخطوة 2.1.11) وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    13. استخدام قسامة لقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مناسبة تجاريا مناسبة (انظر جدول المواد ).
  2. مناعي غير مباشر
    1. على الجليد، ذوبان الجليد اثنين أليكوتس من إجمالي الغدة الثديية المحللة أعدت سابقا.
      ملاحظة: سيتم استخدام قسامة واحدة ل إب من البروتين المستهدف، في حين أن الآخر سوف تكون بمثابة السيطرة السلبية.
    2. جمع 500-1،000 ميكروغرام من المحللة وتمييع ذلك في برنامج تلفزيوني للوصول إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر في كل أنبوب 1.5 مل.
      ملاحظة: كمية المحللة ليتم استخدامها يعتمد على وفرة البروتين من الفائدة وكفاءة الأجسام المضادة (انظر الشكل 3 للحصول علىمثال، وكذلك جدول المواد ). لتحسين كل هدف، يجب استخدام كميات مختلفة من المحللة ( أي 500 و 750 و 1000 ميكروغرام) والجسم المضاد ( أي 5 و 10 و 20 ميكروغرام). تابع الخطوات التالية (2.2.3-2.3.7.4).
    3. إضافة الأجسام المضادة ضد المستضد من الفائدة إلى الأنبوب الأول من المحللة والحفاظ على الجليد.
      ملاحظة: عادة ما يتم اقتراح المبلغ المطلوب على ورقة التعليمات التي تقدمها كل شركة (انظر جدول المواد ).
    4. في الأنبوب الثاني، وإعداد السيطرة السلبية عن طريق إضافة نفس تركيز السيطرة مفتش النمط إسوي كما الأجسام المضادة المستخدمة في الخطوة 2.2.3.
    5. احتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على أنبوب الأسطوانة خلاط في سرعة منخفضة.
    6. في اليوم التالي، إضافة 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى 1.5 مل أنابيب جديدة لغسل قبل.
      1. حدد بروتين A أو البروتين G الخرز المغناطيسي على أساس تقارب النسبي للجسم المضاد. من المهم تجنب استخدام الخرز المجمعة. مزج بلطف تعليق حبة حتى يتم إعادة تعليق بشكل موحد قبل إضافته إلى الأنابيب.
    7. وضع أنابيب تحتوي على الخرز على موقف المغناطيسي والسماح للخرز للهجرة إلى المغناطيس. إزالة المخزن المؤقت التخزين من الخرز باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
    8. غسل الخرز عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من بس-0.1٪ بوليسوربات 20 ودوامة أنابيب بقوة لمدة 10 ثانية.
    9. وضع الأنابيب مرة أخرى على موقف المغناطيسي والسماح للخرز للهجرة إلى المغناطيس.
    10. إزالة الفائض غسل العازلة التي بيبتينغ مع ماصة 200 ميكرولتر.
    11. إضافة مجمع التفاعل (ليسيت الأجسام المضادة) من الخطوة 2.2.5 إلى الخرز واحتضان لمدة 90 دقيقة في رت على خلاط الأسطوانة.
    12. وضع أنابيب على موقف المغناطيسي والسماح للخرز للهجرة إلى المغناطيس. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر، نضح وتجاهل المحللة ووضع أنابيب على الجليد.
    13. غسل حبةثانية عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، ووضع الأنابيب على موقف المغناطيسي، وإزالة السائل باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. كرر هذه الخطوة غسل. أثناء غسل الخطوات، تجنب فورتيكسينغ والحفاظ على عينات على الجليد.
    14. غسل الخرز مرة واحدة مع بس-0.1٪ بوليسوربات 20 دون فورتيكسينغ وتجاهل العازلة غسل الماضي باستخدام 200 ميكرولتر ماصة طرف.
    15. أزل، إضافة 20 ميكرولتر من 0.2 M جلايسين الحمضية (الرقم الهيدروجيني = 2.5) إلى أنابيب ويهز لهم لمدة 7 دقائق على خلاط الأسطوانة.
    16. الطرد المركزي بسرعة عالية لبضع ثوان (تدور سريع) وجمع طاف في أنبوب الجليد الباردة الجديدة.
    17. كرر الخطوات 2.2.14 و 2.2.15 لكل أنبوب.
      ملاحظة: سيكون حجم النهائي 40 ميكرولتر.
    18. إضافة 10 ميكرولتر من العازلة ليملي 4x إلى العينة ميكرولتر 40 ميكرولتر من الخطوة 2.2.16.
      ملاحظة: اللون سوف تتحول الصفراء بسبب درجة الحموضة الحمضية.
    19. على الفور إضافة 1 M تريس (الرقم الهيدروجيني = 8)، قطرة واحدة في وقت واحد، إلى عينة إلوتد من الخطوة 2.2.18 حتى لونهيتحول إلى اللون الأزرق. انتقل إلى الأنابيب القادمة.
    20. يغلي العينات من الخطوة 2.2.18 في 70-90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. انتقل فورا إلى هلام الكهربائي. بدلا من ذلك، نقل العينات إلى الثلاجة في -80 درجة مئوية حتى التحميل.
  3. تطبيق المصب: هلام الكهربائي تليها لطخة غربية
    1. إعداد فصل والتراص سدز-بادج المواد الهلامية الأكريلاميد (سمك 1.5 مم) بعد الإجراءات القياسية 15 .
      ملاحظة: يجب تحديد اختيار هلام (8-15٪ الأكريلاميد، التدرج: انظر جدول المواد ) على أساس الحجم الجزيئي للبروتين أن عجلت والشركاء ملزمة المحتملة ليتم تحليلها. يجب أن تحل هذه البروتينات من بعضها البعض للسماح لمناعي المناسبة.
    2. ذوبان الجليد المناعي (إب) - عينات المزالة (الخطوة 2.2.20) على الجليد.
    3. إعداد بروتين ليسيتس من نفس العينات (المستخدمة لإجراء إب أعلاه). استخدام 50ميكروغرام من مجموع المحللة وإضافة 4X العازلة عينة ليملي. يغلي العينات في 70-90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ومكان على الجليد حتى التحميل.
      ملاحظة: سيتم تحميل هذه العينات بجانب عينة إب إلوتد لإثبات وجود البروتينات عجلت في المحللة الكلي.
    4. تحميل ليسيتس استعداد من الخطوة 2.3.3 وعينات عجلت من الخطوة 2.2.20 جنبا إلى جنب في هلام الأكريلاميد وتشغيلها في تشغيل العازلة (10X العازلة تشغيل: 30.3 غرام من تريس، 144.1 غرام من الجلايسين، و 10 ز من سدز في 1 لتر من الماء المقطر) في 100 V لمدة تقريبية 95 دقيقة، أو حتى حافة البروتينات المهاجرة تصل إلى الجزء السفلي من هلام.
    5. نقل المواد الهلامية إلى نيتروسليلوز أو بفدف الغشاء باستخدام بروتوكول قياسي 9 ، 15 .
    6. منع الغشاء لمدة 1 ساعة على الروك على سرعة منخفضة في 5٪ الحليب الجاف تبس (20 ملي تريس، 500 ملي كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ بوليسوربات 20).
    7. تحديد ما إذا كان هطول الأمطار هو النجاحcessful.
      1. دقق الغشاء باستخدام الأجسام المضادة الأولى ضد البروتين عجل، المخفف في 5٪ الجافة الحليب تبس في التركيز الموصى بها من قبل الشركة المصنعة، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على منصة هزاز مع التحريض بطيئة.
        ملاحظة: انظر جدول المواد للتوصيات.
      2. في اليوم التالي، وغسل الغشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق مع كل تبس على منصة هزاز مع ارتفاع الإثارة.
      3. احتضان الغشاء في الأجسام المضادة الثانوية المناسبة مترافق مع البيروكسيديز الفجل (هرب)، المخفف في تبس، لمدة 1 ساعة في رت على منصة هزاز مع التحريض بطيئة.
        ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع فلوريكروم إذا كان جهاز مناسب للكشف عن إشارة متاحة.
      4. أداء 3 إلى 6 يغسل، كل لمدة 5 دقائق، مع تبس على منصة هزاز مع التحريض عالية. تحليل إشارة الأجسام المضادة الثانوية من خلال احتضان الغشاء مع تجاريا أمحلول لومينول قابل للفشل (انظر جدول المواد ) واتبع إرشادات الشركة المصنعة. كشف إشارة باستخدام نظام التصوير توهج (انظر جدول المواد ).
        ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل على تحليل لطخة غربية، انظر المرجع 16.
    8. لتحديد البروتينات المتفاعلة، تنفيذ الخطوات 2.3.7.1-2.3.7.4 باستخدام الأجسام المضادة المناسبة على نفس لطخة.
      ملاحظة: إذا البروتينات تتفاعل، والشركاء ملزم سيتم إيمونوبريسيبيتاتد المشارك مع البروتين المستهدف، وبالتالي سوف تكون قابلة للكشف عن طريق النشاف الغربية. يمكن تكرار الخطوة 2.3.8 مع المزيد من الأجسام المضادة لتحديد ما إذا كانت البروتينات الأخرى تقيم في نفس البروتينات المعقدة، طالما الأوزان الجزيئية للبروتينات تختلف بما فيه الكفاية لتكون منفصلة جيدا على هلام والغشاء.
    9. وللتأكد من أن الشركاء الملزمين الذين تم تحديدهم ليسوا أفعالا، ينبغي تنفيذ الملكية الفكرية المتبادلة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذا عن طريق تكرارالخطوات 2.2.1-2.2.20 مع نفس المحللة ولكن يعجل أحد الشركاء الملزم المحدد في الخطوة 3.8. ثم، يتم تكرار الخطوات 3،1-3،8 باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد البروتين الأول من الفائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحديد ما إذا كان غ، آج، و مكونات تي يمكن أن تتفاعل معا في الغدة الثديية، تم تنفيذ المقايسات شارك إف أولا. وقد تم البحث عن Cx26، بروتين غ، و β- كاتينين، بروتين آج، مع الأجسام المضادة المحددة وكشف باستخدام فلوروفور مترافق الماوس 647 (الأخضر، بسيودوكولور) والماعز 568 (الأحمر) الأجسام المضادة، على التوالي ( الشكل 1B و C ) . وأظهرت البيانات أنها تشارك في توطين في غشاء الخلية من الخلايا الظهارية في الغدة الثديية الفئران في يوم الرضاعة 7 (L7)، كما ينعكس في اللون الأصفر ( الشكل 1D ). ثانيا، كلودين -7، وهو البروتين تي. E-كادهيرين، وهو البروتين آج. و CIX26 (Cx26)، بروتين غ، تم بحثها مع الأجسام المضادة الخاصة بهم، وكشفت مع فلورفور مترافق الأرنب -488 (الأخضر)، الماوس 555 (الأحمر)، والماوس 647 (المرجان الأزرق، بسيودوكولور) الأجسام المضادة، على التوالي ( الشكل 2B-D ). E-كادهيرين و كلودين-7 التعريب المشترك هوكما عرض اللون الأصفر إلى الضوء البرتقالي، في حين Cx26 المشارك التعريب مع E كادهيرين وكلودين 7 أسفرت عن تلطيخ الأبيض تخلط في الغدد الثديية الفئران في يوم الحمل 18 (P18) ( الشكل 2E ).

لمعرفة البروتينات الوسيطة التي تختلط والحبل جسديا معا في غشاء الخلية، تم تنفيذ مناعي مشترك باستخدام الأنسجة الغدة الثديية من الفئران المرضعات (L14). وأظهرت النتائج أن Cx43، وهو مكون من غ، يتفاعل مع E-كادهرين وكلودين -7، ولكن ليس مع كلودين -3 ( الشكل 3A و B ). وقد أكدت هذه النتائج الملكية الفكرية المتبادلة؛ عندما كان E-كادهرين إمونوبريسيبيتاتد، فإنه تفاعل مع Cx43 وكلودين -7 ( الشكل 3C ).

شكل 1
الشكل 1: β-كاتينين و Cx26 شارك في توطين في الخلية ميمبران في الفئران الغدد الثديية. تم قطع كريوسكتيونس من الغدد الثديية من الفئران في يوم الرضاعة 7 (L7) (7 ميكرون) ومعالجتها لتلطيخ إمونوفلورسنت. ( A ) كانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). ( B ) Cx26 (الأخضر، بسيودوكولور) و ( C ) β-كاتينين (الأحمر) يتم عرضها جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة فلورفور المسمى المناسبة. ( D ) صورة مدمجة. تم الحصول على الصور مع المجهر متحد البؤر مجهزة كاشف الطيفي. تم تصور دابي باستخدام الإعدادات التالية: الطول الموجي الانبعاثات، 450.0 نانومتر. الإثارة الطول الموجي، 402.9 نانومتر؛ قوة الليزر، 1.2؛ كسب مكشاف، بمت هف 100؛ بمت أوفست، 0. تم تصور Cx26 (647) باستخدام الإعدادات التالية: الطول الموجي للانبعاث، 700.0 نانومتر؛ الإثارة الطول الموجي، 637.8 نانومتر؛ قوة الليزر، 2.1؛ كسب مكشاف، بمت هف 110؛ بمت تعويض، 0. β-كاتينين (568) تم تصور باستخدام الإعدادات التالية: الطول الموجي الانبعاثات، 595.0 نانومتر. الإثارة الطول الموجي، 561.6 نانومتر. الليزرالسلطة، 2.1؛ كسب مكشاف، بمت هف 110؛ بمت أوفست، 0. مقياس الحانات = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: Connexin26 (Cx26)، E كادهيرين، وكلودين -7 شارك في توطين في غشاء الخلية في الغدد الثديية الفئران. تم قطع كريوسكتيونس من الغدد الثديية في يوم الحمل 18 (P18) (7 ميكرون) ومعالجتها تلطيخ إمونوفلورسنت باستخدام ( B ) كلودين -7 (الأخضر)، ( C ) E-كادهرين (الأحمر)، و ( D ) Cx26 الأزرق؛ بسيودوكولور)، جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة المسمى فلوروفور المناسبة. ( A ) كانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). تم الحصول على الصور مع المجهر متحد البؤر مجهزة كاشف الطيفي. تم تصور دابي باستخدام fإعدادات التالية: الطول الموجي الانبعاثات، 450.0 نانومتر؛ الإثارة الطول الموجي، 402.9 نانومتر؛ قوة الليزر، 5.4؛ كسب مكشاف، بمت هف 65؛ بمت أوفست، 0. تم تصور كلودين -7 (488) باستخدام الإعدادات التالية: الطول الموجي للانبعاث، 525.0 نانومتر؛ الإثارة الطول الموجي، 489.1 نانومتر. قوة الليزر، 5.0؛ كسب مكشاف، بمت هف 12؛ بمت أوفست، 0. تم تصور E-كادهرين (568) باستخدام الإعدادات التالية: الطول الموجي الانبعاثات، 595.0 نانومتر. الإثارة الطول الموجي، 561.6 نانومتر. قوة الليزر، 13.5؛ كسب مكشاف، بمت هف 45؛ بمت أوفست، 0. تم تصور Cx26 (647) باستخدام الإعدادات التالية: الطول الموجي للانبعاثات، 700.0؛ الإثارة الطول الموجي، 637.8؛ قوة الليزر، 5.0؛ كسب مكشاف، بمت هف 55؛ بمت أوفست، 0. مقياس الحانات = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: Cx43، E-كادهرين، وكلودين -7، ولكن ليس كلودين -3، وتشارك في مجمع البروتين. CX43 ( A و B ) و E-كادهرين ( C ) كانت إمونوبريسيبيتاتد باستخدام 500 ملغ من ليسيتس الكلي من الغدد الثديية من الفئران في الرضاعة. تم تحميل إيبس و ليسيتس في المواد الهلامية ونقلها على أغشية بفدف. لأن كلودين -7 و كلودين-3 لها نفس الوزن الجزيئي، فإنها لا يمكن تحليلها على نفس الغشاء. وهكذا، تم تنفيذ اثنين من إبس موازية مع نفس المحللة ل Cx43، تحميلها على اثنين من المواد الهلامية، ونقلها (الأغشية A و B). تم بحث غشاء A أولا مع Cx43 لتأكيد كفاءة إب (اللوحة العليا). ثم، تم بحثها بالتسلسل الغشاء مع E-كادهرين وكلودين -7. أظهر تحليل لطخة غربية أن البروتينين تتفاعل مع Cx43. تم بحث غشاء B أولا مع Cx43 لتأكيد كفاءة إب (اللوحة العليا) ومن ثم بحث مع كلودين -3. أظهر تحليل لطخة غربية أن كلودين -3 دإد لا إب مع Cx43، مما يدل على أن البروتينين لا تتفاعل. تم بحث غشاء C أولا مع كادهيرين E لتأكيد كفاءة إب (اللوحة العليا). ثم، الغشاء، تم التحقيق بالتتابع مع Cx43 و كلودين -7. وأكد تحليل لطخة الغربية التفاعلات بين البروتينات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خلية الخلايا التفاعلات عن طريق تقاطعات مطلوبة للوظيفة المناسبة وتطوير العديد من الأجهزة، مثل الغدة الثديية. وقد أظهرت الدراسات أن البروتينات الوصفي يمكن أن تنظم وظيفة واستقرار بعضها البعض وتفعيل تنبيغ الإشارة عن طريق الربط بعضها البعض في غشاء الخلية 10 . البروتوكولات المقدمة في المخطوطة الحالية قدمت نتائج مثيرة للاهتمام حول الوصفي التعبير التفاضلي البروتين، توطين، والتفاعل خلال التنمية الغدة الفئران العادية 9 . وبالنظر إلى أن توطين البروتين التوصلي أمر بالغ الأهمية لوظيفة البروتينات، ولأنها معروفة للتفاعل مع بروتينات السقالات والعديد من كيناز 3 ، شارك إف و إب المشترك تقنيات فعالة في مجال التفاعلات خلية الخلية. ليس فقط هذه الأساليب ضرورية لتنوير ضرورة الوصلات الوصلي في تنمية الغدة الثديية و ديسالتنظيم في سرطان الثدي، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم في الأنسجة الأخرى وفي التجارب باستخدام خطوط الخلايا.

تتكون الغدة الثديية من اثنين من المقصورات الرئيسية: سدى و ظهارة 4 . ظهارة الكبار مصنوعة من طبقتين من الخلايا. وفي هذا النهج، تم تحديد قرب الشركاء المحتملين الملزمين باستخدام تقنية كو-إف، وتم تأكيد تفاعلاتهم المادية باستخدام بروتوكول الإنترنت المشترك. وقد استخدمت كو-إف بنجاح من قبل الآخرين لإثبات التوطين المشترك للبروتينات داخل نفس الأنسجة، والبنية، والخلية، أو حجرة داخل الخلايا 17 ، 18 . والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي المعلومات البصرية التي تجلب حول توطين الخلوية أو تحت الخلوية من كل بروتين داخل أنواع الخلايا المختلفة يؤلف الأنسجة. على الرغم من أن هذه التقنية بسيطة جدا، يجب اتباع بعض التوصيات. على سبيل المثال، لتجنب تلف الأنسجة،دائما إضافة حلول قطرة واحدة في وقت واحد باستخدام ماصة 200 ميكرولتر أو ماصة نقل. وهذا يسمح لغمر سطح الأنسجة دون الإضرار الأنسجة. وبالمثل، وإزالة الحلول باستخدام ماصة باستور وضعت بجانب الأنسجة عن طريق إمالة بلطف الشريحة. وعلاوة على ذلك، للأجسام المضادة التي تحتوي على محلول تخزين يحتوي على الجلسرين، مطلوب شفط دقيق من مخازن غسل للحد من الخلفية. وعلاوة على ذلك، فإن وجود بروتينات الحليب، مثل الكازينات، أثناء الرضاعة يمكن أن تتداخل مع الأجسام المضادة عن طريق محاصرة لهم، مما أدى إلى ايجابيات كاذبة. وبالتالي، يلزم إجراء تحليل نقدي للصورة الناتجة، وتحديدا في هذه المرحلة.

هذه التقنية شارك في إف أيضا بعض القيود أو المزالق. أولا، فإنه يتطلب الأجسام المضادة المحددة. كما ذكر سابقا (الخطوة 1.1)، فمن المستحسن استخدام قسم واحد ( أي واحد على الجانب الأيمن) على كل شريحة تلطيخ التالية الخطوات المذكورة أعلاه، إضافةوالأجسام المضادة الأولية والثانوية بالتتابع. بالنسبة للباقي القسم ( أي واحد على الجانب الأيسر)، اتبع نفس الإجراء، وذلك باستخدام تبس-بوليسوربات 20 0.1٪ بدلا من الحلول الأجسام المضادة الأولية. في حين أنه من الممكن أيضا، وحتى أفضل، للتحقق من ملزمة محددة من الأجسام المضادة باستخدام المنافسة الببتيد، والببتيدات المستخدمة لتوليد الأجسام المضادة التجارية ليست متاحة دائما. وبالتالي فمن المهم للتحقق من خصوصية ملزمة باستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية ( أي الأنسجة أو الخلايا المعروفة للتعبير عن، أو لا، والبروتين من الفائدة). وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون مواقع تثبيت مستضد لا يمكن الوصول إليها، وخاصة بالنسبة للأنسجة الثابتة الفورمالين، مما أدى إلى عدم وجود إشارة محددة. وبالتالي قد يتطلب إجراء استرجاع مستضد لبعض الأنسجة. ويمكن أيضا إجراء حضانة قصيرة مع المنظفات قبل استضد المستضد ل بيرمابيليز غشاء الخلية. ثانيا، لتعدد الإرسال، يجب أن تثار الأجسام المضادة في الحيوانات المختلفة.على سبيل المثال، إذا تم استخدام مكافحة الأرنب في الخطوة 1.2.6، يمكن تحديد المضادة للفأر في الخطوة 1.2.10، ولكن لا الأجسام المضادة الأخرى التي أثيرت في الأرنب. وبما أن معظم الأجسام المضادة التجارية تثار في الأرانب أو الفئران أو الماعز، فمن الصعب أحيانا، أو حتى المستحيل، استهداف بروتينين في نفس الوقت بسبب عدم وجود الأجسام المضادة المناسبة. للتغلب على هذه القيود، يمكن للمرء إما شراء الأجسام المضادة المتاحة تجاريا، أو المسمى مسبقا أو التسمية الأجسام المضادة الأولية مع فلوروفوريس باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا. ثالثا، يرتبط عيب آخر إلى الإثارة وانبعاث فلوروفوريس مختلفة. لتجنب تداخل الإشارات من اثنين من الأجسام المضادة المختلفة، يجب فصل الطيف الإثارة الانبعاثات من كل فلورفور. وبالتالي، فإن عدد الأهداف التي يمكن تحليلها في وقت واحد تختلف وفقا لتكوين المجهر المتاحة. وأخيرا، فإن نوعية التحليل تعتمد اعتمادا كبيرا على المجهر المستخدمة. بيانات أكثر تفصيلا ودقيقة يمكنيمكن الحصول عليها باستخدام المجهر متحد البؤر بالمقارنة مع المجهر إبيفلورزنت. استخدام فائقة الدقة المجهر يمكن أن تكشف البروتين شارك في توطين في مزيد من التفاصيل 19 .

على الرغم من أن المشارك إف يجلب رؤى هامة حول قرب الشركاء المحتملين ملزمة، ينبغي أن تستكمل بطرق أخرى لتحديد التفاعلات المادية بين البروتينات. ومن بين الأساليب المتاحة، قد تكون الملكية الفكرية المشتركة واحدة من أكثر التكاليف أداءا، حيث يمكن الوصول بسهولة إلى المعدات والمواد. باستخدام الأجسام المضادة ملزمة إلى الخرز المغناطيسي، يمكن للمرء عزل المجمعات البروتين وتحديد المكونات الموجودة في هذا المجمع باستخدام نموذجية لطخة غربية التحليل. ومثلما هو مشار إليه في إف، ينبغي اتباع بعض التوصيات بشأن أفضل الممارسات. على سبيل المثال، فمن المستحسن لتقليل العينات عند تجانس الأنسجة لتقليل الوقت بين الخطوات 2.1.5 و 2.1.9. في حين أن الشخص من ذوي الخبرة يمكن معالجة ما يصل إلى 10 عينات في فيإيم، مبتدئ لا ينبغي التعامل مع أكثر من 4-6 عينات. وبالمثل، ينبغي أن يكون عدد الأنابيب محدودة عند تنفيذ بروتوكول إب لأول مرة. فمن المستحسن أن تبدأ مع السيطرة السلبية ( أي مفتش) ومراقبة إيجابية ( أي الأنسجة المعروفة لاحتواء البروتين ليكون إمونوبريسيبيتاتد) فقط. يجب تخصيص التجربة الثانية للتحسين (انظر الخطوة 2.2.2). وبمجرد أن تعطي هذه الخطوات نتائج مرضية، يمكن معالجة العينات التي سيتم تحليلها. لاحظ أنه يجب دائما تضمين عنصر تحكم سلبي في الإجراء.

هذه التقنية المشتركة الملكية الفكرية لديها أيضا المزالق المحتملة. أولا، يتطلب أن تكون الأنسجة متجانسة في ظروف تسمح بالحفاظ على الروابط بين البروتينات. بالنسبة للبروتينات الغشائية، مثل البروتينات الوصيلة، فمن الضروري أيضا استخدام المخزن المؤقت الذي يحافظ على الروابط بين البروتينات مع السماح أيضا للذوبان. ثانيا، على غرار شارك في إف، فإنه يتطلب الأجسام المضادة عالية تقاربلكل من البروتين المستهدف والشركاء ملزم. وعلاوة على ذلك، لأن البروتينات لا تزال في التشكل العالي والمجمعات البروتينية لا تنفصل عن التجانس، إذا كان الجسم المضاد يعترف جزء من البروتين المستهدف الذي هو على مقربة من المجال الملزم للشريك أو التي كانت مخبأة داخل البنية الأصلية للبروتين ، إب يمكن أن يكون للخطر. ولذلك فمن الضروري دائما التحقق من كفاءة الملكية الفكرية باستخدام النشاف الغربية قبل اختتام غياب شريك ملزم. ثالثا، يمكن للملكية الفكرية المشتركة توليد نتائج إيجابية كاذبة بسبب البروتين إما ملزمة مباشرة إلى الخرز أو عجل خلال الإجراء دون أن تكون جزءا من المجمع. لتحديد هذه التحف، مطلوب مراقبة مفتش، وكذلك إب المتبادل، كما هو موضح في الأساليب المقدمة. ومن الممكن أيضا لإضافة إجراء "ما قبل التنظيف" بين الخطوات 2.2.2 و 2.2.3 لتجنب ملزمة غير محددة من البروتينات إلى الخرز. للقيام بذلك، احتضان ثه يحاكي مع 50 ميكروغرام من الخرز لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية على خلاط الأسطوانة. إزالة الخرز مع موقف المغناطيسي والمضي قدما إلى الخطوة 2.2.3. رابعا، سلاسل الثقيلة والخفيفة من مفتش يمكن أن يكون نفس حجم البروتينات من الفائدة أو شريك ملزم، وبالتالي إخفاء إشارة. أحد الحلول هو فصل سلاسل إيغ مع الجلايسين، كما هو موضح في هذه المخطوطة. ومن الممكن أيضا لشراء الأجسام المضادة الثانوية التي تعترف فقط الأجسام المضادة الأصلية وبالتالي لا تربط إلى الضوء التشويه والتحريف السلاسل الثقيلة في الغشاء (انظر جدول المواد ). وقد يلزم الجمع بين الأسلوبين أحيانا. خامسا، إب المشترك يسمح لتحديد عدد محدود من الشركاء الملزم، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدد من الأجسام المضادة التي يمكن بحثها على الغشاء. کما یتطلب ذلك تحدید مسبق لھؤلاء الشرکاء الملزمین، إما من خلال إف-كو أو من خلال مراجعة الأدب. أخيرا، إب المشترك يسمح لتحديد البروتينات بريزداخل داخل مجمع، وليس للتفاعل المباشر بين اثنين من البروتينات.

ويمكن تحليل النتائج من الملكية الفكرية المشتركة بطرق مختلفة. فمن الممكن أن تحدد فقط الشركاء المتفاعلين عن طريق إعادة فحص نفس الغشاء مع الأجسام المضادة المختلفة، كما هو موضح في هذه المخطوطة. ومن الممكن أيضا تحديد هذا التفاعل. للقيام بذلك، يتم قياس كمية من إيمونوبريسيبيتاتد البروتين أولا عن طريق فحص الغشاء مع الأجسام المضادة ضد هذا البروتين. يتم تحليل كثافة الإشارة باستخدام برنامج التصوير، كما هو موضح في هذه المخطوطة. ثم، يتم إعادة فحص الغشاء مع الأجسام المضادة ضد شريك ملزم، وكمية الإشارة أيضا كميا. ويمكن بعد ذلك التعبير عن التفاعلات بين البروتينات اثنين كنسبة من مبلغ شريك ملزم لكمية من البروتين إمونوبريسيبيتاتد. ومع ذلك، للسماح للمقارنة، يجب معالجة عينات مختلفة في نفس الوقت وتحميلها على نفس الغشاء. Biologيمكن إجراء نسخ متماثلة إيكال وتحليلها بالمثل، ويمكن إجراء تحليل إحصائي.

في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير تقنيات أخرى لتحليل مؤشر أسعار المنتجين. على سبيل المثال، الحنق يسمح لتحديد البروتينات المتفاعلة من خلال نقل الطاقة من علامة واحدة إلى أخرى، فقط عندما تكون البروتينات قريبة بما فيه الكفاية للتفاعل 20 . ومع ذلك، لأنه يتطلب البروتينات الموسومة، لا يمكن استخدام هذه التقنية في الأنسجة. وبالمثل، فمن الممكن لتحديد مؤشر أسعار المنتجين باستخدام البروتين تنصهر مع ليغاز البيوتين البكتيرية، بيرا 21 . وهذا ليغاز إضافة البيوتين إلى البروتينات التي تأتي على مقربة ( أي التفاعل) مع البروتين الخيميري. في حين أن هذه الطريقة مبتكرة وغير منحازة، فإنه لا يمكن أن يؤديها في الأنسجة. بدلا من ذلك، جيش التحرير الشعبى الصينى يمكن استخدامها في الأنسجة. على غرار شارك في إف، ويستند هذا الفحص على تقارب الأجسام المضادة. لهذا الفحص، يتم وضع علامات على الأجسام المضادة الثانوية مع تسلسل الحمض النووي ثار يمكن أن تتفاعل عندما تكون على مقربة ( أي على مؤشر أسعار المنتجين) وتشكيل جزيء دنا دائري 22 . ثم يتم تضخيم هذا جزيء دنا دائري وكشف باستخدام أوليغونوكليوتيدس التكميلية فلورزنتلي المسمى. على الرغم من أن هذا الفحص هو أنيق، فإنه يتطلب العديد من الخطوات التحقق من الصحة، ولا يزال يعتمد على تقارب الأجسام المضادة الأولية وبعض المعرفة من الشركاء المحتملين المتفاعلين. وأخيرا، تم تطوير بديل غير متحيز لمقايسة الملكية الفكرية التقليدية لتحديد مؤشرات أسعار المنتجين. في مناعي السريع الطيف الكتلي من المقايسات البروتين الداخلي (ريم)، يتم تحليل عينات إب من قبل مطياف الكتلة (إب / مس) 23 بدلا من تحليل لطخة غربية. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة الإنتاجية العالية هو أنه يوفر معلومات هائلة عن جميع البروتينات المتفاعلة الذاتية باستخدام مواد قليلة. ومع ذلك، فإنه يتطلب الوصول إلى أداة تسلسل الببتيد 23 .

أنهمن المهم أن نذكر أنه بعد عدة اختبارات أولية، وقد تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول للغدة الثديية. ومع ذلك، يمكن بالتأكيد أن تستخدم هذه الطريقة لأعضاء أخرى بعد بضعة تعديلات. لمشاركة إف، تم اختبار جميع درجة الحرارة المثلى لغشاء الثديية سيكتيونينغ، مناسبة الحجب والغسيل والحلول، وتركيزات الأجسام المضادة المناسبة. أما بالنسبة للملكية الفكرية المشتركة، فقد تم اختبار العديد من المخازن المؤقتة للتحلل والشطف وطرق الاستخلاص ولها تأثير كبير على نجاح الملكية الفكرية. وخلاصة القول، كل خطوة من هذا البروتوكول هو المهم للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار مع أقل الخلفية الممكنة والأكثر خصوصية. وفي حين تتوفر طرق أخرى، يظل التعاون المشترك بين الشركات (إيف-إيف) متبوعا بملكية بروتوكول الإنترنت (إب-كو) صالحا وأساليب بسيطة لتقييم مؤشرات أسعار المنتجين. ويمكن استخدام هاتين التقنيتين في الأنسجة وفي خطوط الخلايا وتتطلب فقط بضع خطوات للتحقق والضوابط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفين ليس لديهم ما يعلن.

Acknowledgements

يتم تمويل إب من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا منحة (نسيرك # 418233-2012)؛ (فروز دي ريشيرتش دو كيبيك-Santé (فروس)، وهي جائزة مهنية لمؤسسة سرطان الثدي في كيبيك، ومنحة ليدر فونز من منحة المؤسسة الكندية للابتكار. حصل إد على منحة دراسية من مؤسسة ونيفرزيتير أرماند-فرابير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice strain and stage St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock) 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock) 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  See Comments β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061 Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8, (1), 201 (2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8, (2), 207 (2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8, (2), 207 (2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8, (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10, (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3, (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149, (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416, (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788, (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270, (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97, (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345, (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55, (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4, (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846, (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19, (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16, (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10, (3), e0117074 (2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (6), 2431-2436 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics