Analisi delle interazioni proteine-proteine ​​e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine

Developmental Biology

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Summary

Le giunzioni intercellulari sono requisiti per le funzioni specifiche e lo sviluppo delle ghiandole mammarie. Questo manuale fornisce un protocollo dettagliato per lo studio delle interazioni proteico-proteiche (PPIs) e la co-localizzazione usando le ghiandole mammarie murine. Queste tecniche consentono l'analisi della dinamica dell'associazione fisica tra giunzioni intercellulari a differenti fasi di sviluppo.

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Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

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Abstract

Le interazioni delle cellule cellulari svolgono un ruolo fondamentale nel preservare l'integrità dei tessuti e la barriera tra i diversi compartimenti della ghiandola mammaria. Queste interazioni sono fornite da proteine ​​junctional che formano nexus tra cellule adiacenti. La misloalizzazione della proteina giunzionale e la riduzione delle associazioni fisiche con i loro partner di legame possono provocare la perdita di funzione e, di conseguenza, la disfunzione dell'organismo. Quindi, identificare la localizzazione proteica e le interazioni proteine-proteine ​​(PPI) nei tessuti normali e legati alla malattia è essenziale per trovare nuove evidenze e meccanismi che conducano alla progressione di malattie o alterazioni nello stato di sviluppo. Questo manuale presenta un metodo in due fasi per valutare i PPI in ghiandole mammarie murine. Nella sezione 1 del protocollo, è descritto un metodo per eseguire co-immunofluorescenza (co-IF) usando anticorpi sollevati contro le proteine ​​di interesse, seguite da anticorpi secondari etichettati con fluorochromi. Anche se co-IF tuttiPer la dimostrazione della vicinanza delle proteine, rende possibile studiare le loro interazioni fisiche. Di conseguenza, un protocollo dettagliato per la co-immunoprecipitazione (co-IP) è fornito nella sezione del protocollo 2. Questo metodo è utilizzato per determinare le interazioni fisiche tra le proteine, senza confermare se queste interazioni sono dirette o indirette. Negli ultimi anni, le tecniche co-IF e co-IP hanno dimostrato che alcuni componenti delle giunzioni intercellulari co-localizzano e interagiscono insieme, creando nexus giunzionali dipendenti da fase che variano durante lo sviluppo della ghiandola mammaria.

Introduction

La crescita e lo sviluppo delle ghiandole mammarie si verificano principalmente dopo la nascita. Questo organo si rinnova costantemente per tutta la vita riproduttiva di un mammifero1. L'epitelio adulte della ghiandola mammaria è composto da uno strato interno di cellule epiteliali luminali e da uno strato esterno di cellule basali, composto principalmente da cellule mioepiteleali, circondate da una membrana basale 2 . Per una buona revisione della struttura e dello sviluppo delle ghiandole mammarie, il lettore può fare riferimento a Sternlicht 1 . Le interazioni delle cellule cellulari attraverso il divario (GJ), i giunti stretti (TJ) e gli aderenti (AJ) sono necessari per lo sviluppo normale e la funzione della ghiandola 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Le principali componenti di queste giunzioni nella ghiandola mammaria murina sono Cx26, Cx30, Cx32 e Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 e -7 eZO-1 (TJ); E E-cadherina, P-cadherina e β-catenina (AJ) 7 , 8 . I livelli di espressione di queste diverse proteine ​​junzionali variano in modo dipendente dalla fase durante lo sviluppo della ghiandola mammaria, suggerendo requisiti di interazione cellulare-cellule differenziali 9 . GJ, TJ e AJ sono collegati strutturalmente e funzionalmente e collegano altre proteine ​​strutturali o regolamentari ai siti vicini di cellule adiacenti, creando così un collegamento giunzionale 10 . La composizione del nesso giunzionale può influenzare il ponte con il citoscheletro sottostante, nonché la permeabilità e la stabilità del nesso e può quindi influenzare la funzione della ghiandola 8 , 9 , 10 , 11 . I componenti delle giunzioni intercellulari che risiedono in nexus giunzionali o interagiscono tra di loro a diffLe fasi di sviluppo progressive dello sviluppo delle ghiandole mammarie sono state recentemente analizzate utilizzando co-immunofluorescenza (co-IF) e co-immunoprecipitazione (co-IP) 9 . Mentre altre tecniche consentono la valutazione dell'associazione funzionale tra proteine, questi metodi non sono presentati in questo manoscritto.

Poiché le proteine ​​agiscono solo per funzionare, studiare le interazioni proteine-proteine ​​(PPI), quali trasduzione di segnali e cascate biochimiche, è essenziale per molti ricercatori e può fornire informazioni significative sulla funzione delle proteine. Co-IF e analisi microscopica aiutano a valutare alcune proteine ​​che condividono lo stesso spazio subcellulare. Tuttavia, il numero degli obiettivi è limitato dagli anticorpi che devono essere elevati in diversi animali e dall'accesso a un microscopio confocale dotato di diversi laser a lunghezza d'onda e di un rivelatore spettrale per il multiplexing. Co-IP conferma o rivela interazioni fisiche di elevata affinità tra i dueDue o più proteine ​​che risiedono all'interno di un complesso proteico. Nonostante lo sviluppo di nuove tecniche, come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) 12 e il test di legatura di prossimità (PLA) 13 , che possono contemporaneamente rilevare la localizzazione e le interazioni delle proteine, il co-IP rimane una tecnica appropriata e conveniente per studiare le interazioni tra Proteine ​​endogene.

Il metodo passo-passo descritto in questo manoscritto agevolerà lo studio della localizzazione proteica e dei PPI e segna le insidie ​​per evitare quando studia PPI endogeni nelle ghiandole mammarie. La metodologia inizia con la presentazione delle diverse procedure di conservazione dei tessuti necessari per ogni tecnica. La Parte 1 illustra come studiare la co-localizzazione proteica in tre fasi: i) la sezione delle ghiandole mammarie, ii) la doppia o tripla etichettatura di diverse proteine ​​usando la tecnica co-IF, e iii) l'imaging diLocalizzazione proteica. La seconda parte mostra come precipitare una proteina endogena e identificare le sue proteine ​​interagenti in tre fasi: i) preparazione di lysate, ii) immunoprecipitazione indiretta di proteine ​​e iii) identificazione del partner di legame mediante SDS-PAGE e Western blot. Ogni fase di questo protocollo è ottimizzata per i tessuti delle ghiandole mammarie di roditore e genera risultati di alta qualità, specifici e riproducibili. Questo protocollo può anche essere utilizzato come punto di partenza per gli studi PPI in altri tessuti o linee cellulari.

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Protocol

Tutti i protocolli animali utilizzati in questo studio sono stati approvati dal comitato universitario di cura degli animali (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. Identificazione della co-localizzazione della proteina

  1. Dal tessuto alle diapositive microscopiche
    NOTA: I tessuti e le sezioni devono essere trattati su ghiaccio secco.
    1. Incisa le ghiandole mammarie da un animale (per una descrizione completa di questa procedura, fare riferimento a Plante et al. ) 14 .
    2. Incorporare il tessuto in eccedenza nel mezzo di congelamento / montaggio su ghiaccio secco. Aggiungere abbastanza mezzo per coprire la ghiandola. Quando il mezzo è solidificato, trasferire i tessuti in un congelatore a -80 ° C per un uso successivo 9 .
    3. Utilizzando un set di criomicrotoma a ≤ -35 ​​° C tagliate i tessuti in sezioni spesse da 7-10 μm e posizionatele su vetrini a microscopio.
      NOTA: quando possibile, posizionare due sezioni su ciascuna diapositiva; La sezione sinistra verrà utilizzata come unaPer verificare la specificità degli anticorpi e l'autofluorescenza del tessuto, mentre il lato destro sarà etichettato con gli anticorpi.
    4. Tenere le sezioni a -80 ° C per un uso successivo.
  2. Co-IF colorazione
    1. Recuperare le diapositive microscopiche appropriate dal congelatore e fissare immediatamente le sezioni immersandole in formaldeide 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
    2. Quindi immergere le diapositive in salina fosfata-bufferizzata (PBS) a RT. Lasciare le diapositive in PBS a RT fino al passo successivo.
    3. Cerchi ciascuna sezione della diapositiva usando una barriera idrofoba disponibile in commercio o una penna di laboratorio idrorepellente (vedi tabella dei materiali ). Fare attenzione a non toccare il tessuto. Aggiungere immediatamente gocce di PBS al tessuto e posizionare la diapositiva in una camera istologica umida per il resto della procedura.
      NOTA: Le sezioni dei tessuti devono rimanere idratate. AlternativaUtilizzare una scatola con un coperchio e posizionare gli asciugamani bagnati sul fondo.
    4. Bloccare ogni sezione tissutale con 100-200 μL di 3% di albumina bovina del siero (BSA) -Tris-buffered salina (TBS) -0,1% di polisorbato 20 (vedi tabella dei materiali ) per 30 minuti a RT. Mentre i campioni bloccano, preparare le soluzioni anticorpali primarie e secondarie diluendo gli anticorpi in polisorbato 20 in TBS-0.1%.
      NOTA: la concentrazione richiesta per l'anticorpo è fornita dal produttore; Vedere la tabella dei materiali e le figure 1 e 2 per esempi, nonché Dianati et al. 9 . Anche se non è necessario lavorare al buio quando si utilizza la maggior parte degli anticorpi coniugati con fluoroforo, evitare di esporre le soluzioni anticorpali oi tessuti macchiati ad una luce intensa e luminosa.
    5. Rimuovere la soluzione di blocco aspirando e incubare le sezioni in 100-200 μL dell'anticorpo primario diluito per 60 min a RT. AlternativelY, incubare con l'anticorpo primario per una notte a 4 ° C.
    6. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria aspirando e lavare le sezioni con 250-500 μL di polisorbato 20 di TBS-0,1% per 5 min. Rimuovere la soluzione di lavaggio aspirando e ripetere due volte il lavaggio.
    7. Rimuovere la soluzione di lavaggio aspirando ed incubare le sezioni con 100-200 μL dell'appropriato anticorpo secondario coniugato con fluoroforo per 60 min a RT.
    8. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria aspirando e lavare le sezioni con 250-500 μl di polisorbato 20 TBS-0,1% per 5 min. Rimuovere la soluzione di lavaggio e ripetere due volte.
    9. Ripetere il passaggio 2.5-2.8 usando la combinazione appropriata di anticorpi primari e secondari per le successive proteine ​​di interesse.
    10. Rimuovere la soluzione di lavaggio mediante aspirazione e eseguire la colorazione dei nuclei incubando la sezione con 100-200 μL di 1 mg / ml 4 ', 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) in polisorbato 20 TBS-0,1% per 5 minRT.
    11. Rimuovere la soluzione DAPI per aspirazione e montare le diapositive utilizzando un supporto di montaggio non fluorescente solubile in acqua (vedere la tabella dei materiali ) e le copertine. Procedere una diapositiva alla volta.
      NOTA: L'incubazione del nucleo per più di 5 minuti non cambierà l'intensità della colorazione. In alternativa, rimuovere la soluzione DAPI su tutte le diapositive e incubare i tessuti in PBS durante il montaggio delle diapositive.
    12. Posizionare le diapositive in un frigorifero da 4 ° C per almeno 8 ore. Procedere all'immagine microscopica a fluorescenza (vedere le figure 1 e 2 ).
  3. Imaging microscopico
    1. Visualizzare gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo utilizzando un microscopio confocale dotato dei vari laser necessari per eccitare i fluorofori alle loro lunghezze d'onda specifiche.
      Nota: Per poter visualizzare i canali e gli alveoli, è suggerito un obiettivo 40X con apertura numerica di 0,95. Un esempioE delle impostazioni specifiche è riportato in Figura 1 .
    2. Verificare la localizzazione di ciascuna proteina singolarmente eseguendo la scansione dell'immagine una lunghezza d'onda all'epoca.
      Nota: in questa fase è importante analizzare criticamente la localizzazione delle proteine ​​junctional. Per essere in grado di formare i nexus giunzionali, queste proteine ​​devono essere localizzate alla membrana plasmatica.
    3. Determinare la co-localizzazione delle proteine ​​unendo le immagini scansionate con i laser alle diverse lunghezze d'onda.
      Nota: la co-localizzazione della proteina può essere visualizzata con la variazione del colore risultante dall'emissione di due o più fluorofori nella stessa posizione e può essere misurata utilizzando il software appropriato ( figure 1 e 2 , vedi anche il riferimento 9).

2. Studiare i PPI

NOTA: Le ghiandole mammarie addominali dovrebbero essere utilizzate per studiare i PPI, poiché le ghiandole toraciche sono in stretta associazione con il pettoralemuscoli. Incise le ghiandole mammarie (per una descrizione completa di questa procedura, fare riferimento a Plante et al .) 14 e mantenerli a -80 ° C per un uso successivo.

  1. Preparazione al lisato
    1. Posizionare la carta di pesatura e 2 ml di microcentrifuga sui ghiaccioli secco per pre-raffreddare prima di procedere con i passi successivi.
    2. Prendi il tessuto delle ghiandole mammarie da -80 ° C e tenerli su ghiaccio secco.
    3. Pesare i tessuti sui fogli di pesatura pre-refrigerati e trasferire il tessuto a 2 ml di tubi di microcentrifuga (manico sul ghiaccio secco). Utilizzare tra 50 e 100 mg di tessuto per campione. Tenere il tessuto in ghiaccio secco fino al punto 2.1.5.
    4. Preparare la quantità richiesta di triplicato tampone di lisi detergente integrato con NaF, NaVO 3 e inibitore della proteasi / fosfatasi, come indicato nella tabella dei materiali , utilizzando le seguenti formule. Mouse: buffer richiesto (μL) = peso del tessuto del mouse (mg) x 3; Ratto: obbligatorioBuffer (μL) = peso del tessuto ratto (mg) x 5.
    5. Aggiungere la quantità necessaria di tampone di lisi a ghiaccio (calcolato al punto 2.1.4) nel tubo da 2 mL contenente il tessuto.
      NOTA: nei passaggi 2.1.5-2.1.6, procedere con un singolo tubo alla volta.
    6. Homogenizzare il tessuto per 30-40 s usando l'omogeneizzazione continua su un macinino di tessuto; Tenere sempre il tubo sul ghiaccio. Regolare l'omogeneizzatore tissutale a velocità media e spostare delicatamente il macinatore verso l'alto e verso il basso all'interno del tubo.
    7. Ripetere i passi 1.6 e 1.7 con gli altri tubi.
    8. Incubare i lisati in ghiaccio per 10-30 min.
    9. Centrifugare i tubi a 170 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    10. Nel frattempo, individuare 6-10 microcentrifuga tubi (0,6 mL) per ogni campione e tenerli in ghiaccio.
    11. Una volta effettuata la centrifugazione, controllare i tubi. Assicurarsi di contenere uno strato superiore di lisati grassi, chiari, giallo-rosa (a seconda dello stadio di sviluppo) e di un pallone.
    12. Crea un buco nello strato lipidicoUtilizzando una punta pipetta da 200 μl per accedere alla fase liquida. Cambiare la punta e raccogliere il lisato senza disturbare il pellet o aspirare lo strato lipidico. Aliquota il lisato in tubi pre-etichettati su ghiaccio (punto 2.1.11) e conservarli a -80 ° C.
    13. Utilizzare un'aliquota per quantificare la concentrazione proteica usando un apposito kit disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali ).
  2. Immunoprecipitazione indiretta
    1. Su ghiaccio, scongelare due aliquote dei lisati delle ghiandole mammarie preparate in precedenza.
      NOTA: Una aliquota verrà utilizzata per l'IP della proteina bersaglio, mentre l'altra servirà come controllo negativo.
    2. Raccogliere 500-1000 μg di lisato e diluirlo in PBS per raggiungere un volume finale di 200 μL in ogni tubo da 1,5 ml.
      NOTA: La quantità di lisato da utilizzare dipende dall'abbondanza della proteina di interesse e dall'efficienza dell'anticorpo (vedere la figura 3 per unN esempio, nonché la tabella dei materiali ). Per ottimizzare per ogni obiettivo, dovrebbero essere utilizzate diverse quantità di lisato ( es. 500, 750 e 1000 μg) e di anticorpi (5, 10 e 20 μg). Procedere con le seguenti fasi (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Aggiungere l'anticorpo contro l'antigene di interesse al primo tubo di lisato e tenerlo su ghiaccio.
      NOTA: L'importo richiesto viene generalmente suggerito nel foglio istruzioni fornito da ciascuna società (vedi tabella dei materiali ).
    4. Nel secondo tubo, preparare un controllo negativo aggiungendo la stessa concentrazione di controllo isotipo IgG come l'anticorpo utilizzato nel passaggio 2.2.3.
    5. Incubare i tubi durante la notte a 4 ° C su un rullo-miscelatore a bassa velocità.
    6. Il giorno seguente, aggiungere 50 μL di perline magnetiche a nuovi tubi da 1,5 ml per il pre-lavaggio.
      1. Selezionare le perline magnetiche Protein A o Protein G basate sull'affinità relativa all'anticorpo. È importante evitare l'utilizzo di perline aggregate; Mescolare delicatamente la sospensione del tallone fino a riposizionarla uniformemente prima di aggiungerla ai tubi.
    7. Posizionare i tubi che contengono le perle sul supporto magnetico e consentire ai perline di migrare verso il magnete. Rimuovere il buffer di memoria dalle perle usando una pipetta da 200 μL.
    8. Lavare le perle aggiungendo 500 μL di PBS-0.1% polysorbato 20 e vortexare i tubi vigorosamente per 10 s.
    9. Mettete di nuovo i tubi sul supporto magnetico e lasciate che i branelli migrano verso il magnete.
    10. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso pipettando con una pipetta da 200 μL.
    11. Aggiungere il complesso di reazione (antigene lisato) dal punto 2.2.5 alle perle e incubare per 90 minuti a RT sul mixer a rulli.
    12. Posizionare i tubi sul supporto magnetico e permettere ai branelli di migrare verso il magnete. Usando una pipetta da 200 μL, aspirare e scartare il lisato e mettere i tubi sul ghiaccio.
    13. Lavare il talloneS aggiungendo 500 μL di PBS, posizionando i tubi sul supporto magnetico e rimuovendo il liquido usando una pipetta da 200 μL. Ripetere questo passaggio di lavaggio. Durante i passaggi di lavaggio, evitare di vortexare e conservare i campioni in ghiaccio.
    14. Lavare le perle una volta con PBS-0,1% di polisorbato 20 senza vortice e scartare l'ultimo tampone di lavaggio usando una punta da pipetta da 200 μL.
    15. Per eluire, aggiungere 20 μL di glicina acido 0,2 M (pH = 2,5) ai tubi e agitare per 7 minuti sul mixer a rulli.
    16. Centrifugare ad alta velocità per alcuni secondi (rotazione rapida) e raccogliere il surnatante in un tubo fresco ghiacciato.
    17. Ripetere i passaggi 2.2.14 e 2.2.15 per ogni tubo.
      NOTA: Il volume finale sarà di 40 μL.
    18. Aggiungere 10 μl di tampone 4 mg Laemmli al campione eluito da 40 μl dalla fase 2.2.16.
      NOTA: il colore diventerà giallo a causa del pH acido.
    19. Aggiungere immediatamente 1 M Tris (pH = 8), una goccia alla volta, al campione eluito dalla fase 2.2.18 fino al suo coloreDiventa blu. Procedere ai tubi successivi.
    20. Boilare i campioni dal punto 2.2.18 a 70-90 ° C per 10 min. Procedere immediatamente all'elettroforesi gel. In alternativa, trasferire i campioni in un congelatore a -80 ° C fino al caricamento.
  3. Applicazione a valle: elettroforesi a gel seguita da Western blot
    1. Preparare separare e impilare gel SDS-PAGE acrilammide (spessore 1,5 mm) seguendo le procedure standard 15 .
      NOTA: La scelta del gel (8-15% di acrilammide, gradiente: vedi tabella dei materiali ) deve essere determinata sulla base della dimensione molecolare della proteina da precipitare e dei potenziali partner di legame da analizzare. Queste proteine ​​devono essere risolte l'una dall'altra per consentire una corretta immunodezione.
    2. Sciogliere i campioni selezionati con immunoprecipitazione (IP) (punto 2.2.20) sul ghiaccio.
    3. Preparare i lisati proteici dagli stessi campioni (utilizzati per la procedura IP sopra). Usa 50Μg di lisato totale e aggiungere 4 volte il campione di tampone Laemmli. Boilare i campioni a 70-90 ° C per 5 minuti e mettere in ghiaccio fino al caricamento.
      NOTA: Questi campioni saranno caricati accanto al campione IP eluito per dimostrare la presenza di proteine ​​precipitate nel lisato totale.
    4. Caricare i lisati preparati dalla fase 2.3.3 e i campioni precipitati dal punto 2.2.20 in un gel di acrilammide e farli scorrere in tampone di esecuzione (tampone di esecuzione 10 volte: 30,3 g di Tris, 144,1 g di glicina e 10 G di SDS in 1 L di acqua distillata) a 100 V per circa 95 minuti, o fino a quando il bordo delle proteine ​​migratorie raggiunge il fondo del gel.
    5. Trasferire i gel a una membrana di nitrocellulosa o PVDF utilizzando un protocollo standard 9 , 15 .
    6. Bloccare la membrana per 1 h su un bilanciere a bassa velocità in 5% di latte secco-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl e 0,05% polisorbato 20).
    7. Identificare se la precipitazione fosse stata eseguitacessful.
      1. Sonda la membrana utilizzando il primo anticorpo contro la proteina precipitata, diluito in 5% di latte secco-TTBS alla concentrazione raccomandata dal produttore, durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a dondolo con agitazione lenta.
        NOTA: Consultare la tabella dei materiali per le raccomandazioni.
      2. Il giorno seguente, lavare la membrana 3 volte per 5 minuti ciascuno con TTBS su una piattaforma a dondolo con agitazione alta.
      3. Incubare la membrana nell'appropriato anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP), diluito in TTBS, per 1 h a RT su una piattaforma a dondolo con agitazione lenta.
        NOTA: In alternativa, un anticorpo secondario coniugato con un fluorochrome può essere utilizzato se è disponibile un apparecchio appropriato per rilevare il segnale.
      4. Eseguire da 3 a 6 lavaggi, ciascuno per 5 minuti, con TTBS su una piattaforma a dondolo ad alta agitazione. Analizzare il segnale dell'anticorpo secondario incubando la membrana con un commercialmente a(Vedere la tabella dei materiali ) e seguire le istruzioni del produttore. Rileva il segnale utilizzando un sistema di imaging chemiluminescenza (vedere la tabella dei materiali ).
        NOTA: Per un protocollo dettagliato sull'analisi della blot western, vedere il riferimento 16.
    8. Per identificare le proteine ​​interattive, eseguire i passaggi 2.3.7.1-2.3.7.4 utilizzando gli anticorpi appropriati sulla stessa macchia.
      NOTA: Se le proteine ​​stanno interagendo, i partner di legame saranno co-immunoprecipitati con la proteina bersaglio e saranno così rilevabili mediante Western blotting. Il punto 2.3.8 può essere ripetuto con più anticorpi per determinare se altre proteine ​​risiedono nello stesso complesso di proteine, a patto che i pesi molecolari delle proteine ​​abbiano sufficientemente diversi da essere ben separati sul gel e sulla membrana.
    9. Per confermare che i partner di identificazione identificati non sono artefatti, è necessario eseguire IP reciproci.
      NOTA: questo viene eseguito ripetendoPassaggi 2.2.1-2.2.20 con lo stesso lisato, ma precipitando uno dei partner di rilegatura individuati al punto 3.8. Quindi, i punti 3.1-3.8 vengono ripetuti utilizzando l'anticorpo primario contro la prima proteina di interesse.

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Representative Results

Per determinare se i componenti GJ, AJ e TJ possono interagire insieme nella ghiandola mammaria, sono stati eseguiti primi test di co-IF. Cx26, una proteina GJ e una beta-Catenina, una proteina AJ, sono stati saggiati con anticorpi specifici e sono stati rivelati rispettivamente con gli anticorpi coniugati con fluoroforo (verde, pseudocolore) e capra-568 (rosso) ( figura 1B e C ) . I dati hanno dimostrato che essi co-localizzano alla membrana cellulare delle cellule epiteliali nel ghiandola mammaria dei topi durante il giorno di lattazione 7 (L7), come risulta dal colore giallo ( Figura 1D ). In secondo luogo, Claudin-7, una proteina TJ; E-cadherina, una proteina AJ; E Connexin26 (Cx26), una proteina GJ, sono stati saggiati con i loro anticorpi specifici e sono stati rivelati rispettivamente con gli anticorpi coniugati con fluoroforo coniglio 488 (verde), mouse 555 (rosso) e mouse-647 (corallo blu, pseudocolore) ( Figura 2B-D ). E-cadherina e Claudin-7 co-localizzazione èMostrato come colore giallo-chiaro-arancione, mentre la co-localizzazione di Cx26 con E-cadherina e Claudin-7 ha provocato la colorazione punteggiata bianca nelle ghiandole mammarie dei topi durante la gravidanza 18 (P18) ( Figura 2E ).

Per scoprire quali proteine ​​junctionali si mescolano e si legano fisicamente alla membrana cellulare, è stata eseguita una co-immunoprecipitazione usando i tessuti delle ghiandole mammarie da topi da lattazione (L14). I risultati hanno mostrato che Cx43, un componente di GJ, interagisce con E-Cadherin e Claudin-7, ma non con Claudin-3 ( Figura 3A e B ). Questi risultati sono stati confermati dal reciproco IP; Quando E-Cadherin è stato immunoprecipitato, ha interagito con Cx43 e Claudin-7 ( Figura 3C ).

Figura 1
Figura 1: β-catenina e Cx26 co-localizzano al membrane cellulareRane in topi ghiandole mammarie. Criosesi dalle ghiandole mammarie di topi al giorno di allattamento 7 (L7) sono stati tagliati (7 μm) e trattati per la colorazione immunofluorescenti. ( A ) I nuclei sono stati macchiati con DAPI (blu). ( B ) Cx26 (verde, pseudocolore) e ( C ) β-catenina (rosso) sono mostrati in combinazione con appropriati anticorpi contrassegnati con fluoroforo. ( D ) un'immagine unita. Le immagini sono state ottenute con un microscopio confocale dotato di un rivelatore spettrale. DAPI è stato visualizzato utilizzando le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda emissione, 450.0 nm; Lunghezza d'onda di eccitazione, 402.9 nm; Potenza laser, 1,2; Guadagno del rilevatore, PMT HV 100; L'offset PMT, 0. Cx26 (647) è stata visualizzata utilizzando le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda di emissione, 700,0 nm; Lunghezza d'onda di eccitazione, 637,8 nm; Potenza laser, 2.1; Guadagno del rilevatore, PMT HV 110; Offset PMT, 0. β-catenina (568) è stata visualizzata utilizzando le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda emissione, 595,0 nm; Lunghezza d'onda di eccitazione, 561.6 nm; laserPotenza, 2,1; Guadagno del rilevatore, PMT HV 110; Offset PMT, 0. Barre scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherina e Claudin-7 co-localizzano nella membrana cellulare nelle ghiandole mammarie dei topi. Criosesi dalle ghiandole mammarie durante la gravidanza 18 (P18) sono stati tagliati (7 μm) e trattati per la colorazione immunofluorescenti utilizzando ( B ) Claudin-7 (verde), C ) E-Cadherina (rosso) e ( D ) Cx26 Blu, pseudocolore), combinati con gli appropriati anticorpi contrassegnati con fluoroforo. ( A ) I nuclei sono stati macchiati con DAPI (blu). Le immagini sono state ottenute con un microscopio confocale dotato di un rivelatore spettrale. DAPI è stato visualizzato utilizzando il fImpostazioni seguenti: lunghezza d'onda di emissione, 450.0 nm; Lunghezza d'onda di eccitazione, 402.9 nm; Potenza laser, 5,4; Guadagno del rilevatore, PMT HV 65; PMT offset, 0. Claudin-7 (488) è stato visualizzato utilizzando le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda di emissione, 525,0 nm; Lunghezza d'onda di eccitazione, 489,1 nm; Potenza laser, 5,0; Guadagno del rilevatore, PMT HV 12; Offset di PMT, 0. E-Cadherin (568) è stato visualizzato utilizzando le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda di emissione, 595,0 nm; Lunghezza d'onda di eccitazione, 561.6 nm; Potenza laser, 13,5; Guadagno del rilevatore, PMT HV 45; Offset di PMT, 0. Cx26 (647) è stato visualizzato utilizzando le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda emissione, 700,0; Lunghezza d'onda di eccitazione, 637,8; Potenza laser, 5,0; Guadagno del rilevatore, PMT HV 55; Offset PMT, 0. Barre scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Cx43, E-Cadherin e Claudin-7, ma non Claudin-3, sono coinvolti in un complesso proteico. Cx43 ( A e B ) e E-Cadherin ( C ) sono stati immunoprecipitati usando 500 mg di lisati totali dalle ghiandole mammarie di topi all'attacco. IP e lisati sono stati caricati in gel e trasferiti su membrane PVDF. Poiché Claudin-7 e Claudin-3 hanno lo stesso peso molecolare, non possono essere analizzati sulla stessa membrana. Così, due IP paralleli sono stati eseguiti con lo stesso lysato per Cx43, caricati su due gel e trasferiti (membrane A e B). La membrana A è stata prima analizzata con Cx43 per confermare l'efficienza dell'IP (pannello superiore). Poi, la membrana viene analizzata in sequenza con E-Cadherin e Claudin-7. L'analisi Western Blot ha mostrato che le due proteine ​​interagiscono con Cx43. La membrana B è stata collaudata con Cx43 per confermare l'efficienza del IP (pannello superiore) e quindi sondata con Claudin-3. L'analisi di blot western ha mostrato che Claudin-3 dId non IP con Cx43, dimostrando che le due proteine ​​non interagiscono. La membrana C è stata prima analizzata con E-cadherina per confermare l'efficienza dell'IP (pannello superiore). Poi, la membrana, è stata analizzata in sequenza con Cx43 e Claudin-7. L'analisi Western blot ha confermato le interazioni tra le proteine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le interazioni cellulare attraverso le giunzioni sono necessarie per la corretta funzione e lo sviluppo di molti organi, come la ghiandola mammaria. Gli studi hanno dimostrato che le proteine ​​giunzionali possono regolare la funzione e la stabilità dell'altro e attivare la trasduzione del segnale legandosi tra loro alla membrana cellulare 10 . I protocolli presentati nel manoscritto attuale hanno fornito interessanti risultati sull'espressione, la localizzazione e l'interazione tra proteine ​​junctional durante il normale sviluppo della ghiandola murina 9 . Dato che la localizzazione della proteina junctional è fondamentale per la funzione delle proteine ​​e perché sono noti per interagire con le proteine ​​di ponteggio e numerose chinasi 3 , co-IF e co-IP sono tecniche efficaci nel campo delle interazioni delle cellule cellulari. Non solo questi metodi sono essenziali per illuminare la necessità dei nexus giunzionali nello sviluppo della ghiandola mammaria e della loro disRegolamentazione nel cancro al seno, ma possono anche essere utilizzati in altri tessuti e negli esperimenti che utilizzano linee cellulari.

La ghiandola mammaria è composta da due comparti principali: lo stroma e l'epitelio 4 . L'epitelio adulto è costituito da due strati di cellule. In questo approccio, la vicinanza dei potenziali partner legati è stata determinata utilizzando la tecnica co-IF e le loro interazioni fisiche sono state confermate usando co-IP. Co-IF è stato utilizzato con successo da altri per dimostrare la co-localizzazione delle proteine ​​all'interno dello stesso tessuto, struttura, cellula o compartimento intracellulare 17 , 18 . Il principale vantaggio di questa tecnica è l'informazione visiva che porta alla localizzazione cellulare o subcellulare di ciascuna proteina all'interno dei diversi tipi di cellule che compongono il tessuto. Anche se questa tecnica è abbastanza semplice, alcune raccomandazioni devono essere seguite. Ad esempio, per evitare danni ai tessuti,Aggiungere sempre le soluzioni una goccia alla volta usando una pipetta da 200 μL o una pipetta di trasferimento. Ciò consentirà l'immersione della superficie del tessuto senza danneggiare i tessuti. Allo stesso modo, rimuovere le soluzioni utilizzando una pipetta Pasteur posta accanto ai tessuti, facendo inclinare delicatamente la diapositiva. Inoltre, per gli anticorpi la cui soluzione di stoccaggio contiene glicerolo, è necessaria un'accurata aspirazione dei tamponi di lavaggio per ridurre lo sfondo. Inoltre, la presenza di proteine ​​del latte, come le caseine, durante l'allattamento può interferire con gli anticorpi intrappolandoli, causando falsi positivi. In questo modo è necessaria un'analisi critica dell'immagine risultante.

Questa tecnica co-IF ha anche alcune limitazioni o trappole. In primo luogo, richiede anticorpi specifici. Come indicato in precedenza (punto 1.1), si raccomanda di utilizzare una sezione ( cioè quella di destra) su ciascuna diapositiva per la colorazione seguendo le fasi descritte sopra, aggiungendoAnticorpi primari e secondari in sequenza. Per la restante sezione ( cioè quella sul lato sinistro), seguire la stessa procedura, utilizzando il polisorbato TBS 20 0,1% invece delle soluzioni anticorpali primarie. Mentre è anche possibile e ancora meglio verificare il legame specifico dell'anticorpo utilizzando concorrenza peptidica, i peptidi utilizzati per generare anticorpi commerciali non sono sempre disponibili. È quindi importante verificare la specificità del legame utilizzando controlli positivi e negativi ( cioè tessuti o cellule noti per esprimere o meno la proteina di interesse). Inoltre, i siti di fissazione dell'antigene possono essere inaccessibili, soprattutto per i tessuti fissati in formalina, con conseguente assenza di un segnale specifico. Per alcuni tessuti può quindi essere necessaria una procedura di recupero di antigeni. È anche possibile eseguire una breve incubazione con detergente prima di recuperare l'antigene per permeabilizzare la membrana cellulare. In secondo luogo, per il multiplexing, gli anticorpi devono essere elevati in diversi animali.Ad esempio, se il anti-coniglio è stato utilizzato nel passaggio 1.2.6, l'anti-mouse potrebbe essere selezionato nel passaggio 1.2.10, ma non un altro anticorpo sollevato nel coniglio. Poiché la maggior parte degli anticorpi commerciali sono aumentati in conigli, topi o caprini, a volte è difficile o addirittura impossibile individuare due proteine ​​contemporaneamente a causa della mancanza di anticorpi appropriati. Per superare queste limitazioni, si possono acquistare anticorpi pre-etichettati in commercio o etichettati primari con i fluorofori usando i kit commercialmente disponibili. Terzo, un altro difetto è legato all'eccitazione e all'emissione dei diversi fluorofori. Per evitare sovrapposizioni dei segnali provenienti da due diversi anticorpi, lo spettro di emissione di emissione di ogni fluoroforo deve essere separato. Quindi, il numero di obiettivi che possono essere analizzati contemporaneamente varia a seconda della configurazione del microscopio disponibile. Infine, la qualità dell'analisi dipende fortemente dal microscopio utilizzato. I dati più dettagliati e precisi possonoEssere ottenuto utilizzando un microscopio confocale rispetto ad un microscopio epifluorescente. L'uso di microscopia a super-risoluzione può rivelare anche il dettaglio della co-localizzazione delle proteine 19 .

Sebbene la co-IF porta importanti riflessioni sulla vicinanza di potenziali partner legati, dovrebbe essere completata da altri metodi per identificare le interazioni fisiche tra le proteine. Tra i metodi disponibili, il co-IP è probabilmente uno dei più convenienti da eseguire, in quanto l'attrezzatura e il materiale sono facilmente accessibili. Utilizzando un anticorpo legato alle perline magnetiche, si possono isolare complessi proteici e identificare i componenti presenti in quel complesso usando una tipica analisi Western blot. Simile al co-IF, alcune raccomandazioni dovrebbero essere seguite per le migliori pratiche. Ad esempio, è consigliabile ridurre al minimo i campioni quando si omogeneizzano i tessuti per ridurre il tempo tra le fasi 2.1.5 e 2.1.9. Mentre una persona esperta può elaborare fino a 10 campioni all'indirizzoNome, un principiante non deve occupare più di 4-6 campioni. Allo stesso modo, il numero di tubi dovrebbe essere limitato quando si effettua il protocollo IP per la prima volta. Si raccomanda di iniziare solo con un controllo negativo ( cioè IgG) e un controllo positivo ( cioè un tessuto conosciuto per contenere la proteina da immunoprecipitata). La seconda prova dovrebbe essere dedicata all'ottimizzazione (vedi punto 2.2.2). Una volta che questi passaggi forniscono risultati soddisfacenti, i campioni da analizzare possono essere elaborati. Si noti che un controllo negativo dovrebbe essere sempre incluso nella procedura.

Questa tecnica co-IP ha anche delle insidie ​​potenziali. In primo luogo, richiede che i tessuti siano omogeneizzati in condizioni che permettano la conservazione dei legami tra le proteine. Per le proteine ​​di membrana, come le proteine ​​junctional, è anche fondamentale l'uso di un tampone che preserverà i legami tra le proteine ​​pur consentendo la loro solubilità. In secondo luogo, simile al co-IF, richiede anticorpi ad alta affinitàSia per la proteina bersaglio che per i partner legati. Inoltre, poiché le proteine ​​rimangono nella loro conformazione terziaria ei complessi proteici non sono dissociati per omogeneizzazione, se l'anticorpo riconosce una parte della proteina bersaglio che è in prossimità del dominio di legame di un partner o che è nascosta all'interno della struttura nativa della proteina , L'IP può essere compromesso. È quindi essenziale verificare sempre l'efficienza del IP utilizzando Western blotting prima di concludere l'assenza di un partner di legame. In terzo luogo, il co-IP può generare risultati falsi positivi in ​​quanto la proteina si lega direttamente alle perle o si precipita durante la procedura senza essere parte del complesso. Per identificare questi artefatti, è necessario un controllo IgG, nonché un IP reciproco, come descritto nei metodi presentati. È inoltre possibile aggiungere una procedura di "pre-pulizia" tra i punti 2.2.2 e 2.2.3 per evitare l'associazione non specifica delle proteine ​​alle perle. Per farlo, incubare thI lisati con 50 μg di perline per 1 ora a 4 ° C su un mixer a rullo. Rimuovere le perle con il supporto magnetico e procedere al punto 2.2.3. Quarto, le catene pesanti e leggere di IgG possono essere le stesse dimensioni delle proteine ​​di interesse o del partner di legame, in modo da mascherare il segnale. Una soluzione è dissociare le catene IgG con glicina, come descritto in questo manoscritto. È inoltre possibile acquistare anticorpi secondari che riconoscono solo anticorpi nativi e quindi non si legano alla luce denaturata e alle catene pesanti caricate nella membrana (vedi tabella dei materiali ). A volte potrebbero essere combinati i due metodi. Quinto, il co-IP consente l'identificazione di un numero limitato di partner di legame, in parte a causa del numero di anticorpi che possono essere sondati sulla membrana. Richiede anche la pre-identificazione di questi partner legati, sia tramite co-IF che attraverso una revisione della letteratura. Infine, il co-IP consente l'identificazione delle proteine ​​presAll'interno di un complesso, e non per l'interazione diretta tra due proteine.

I risultati del co-IP possono essere analizzati in modi diversi. È possibile identificare esclusivamente partner interagenti riconrollando la stessa membrana con diversi anticorpi, come descritto in questo manoscritto. È anche possibile quantificare questa interazione. Per fare ciò, la quantità di proteina immunoprecipitata viene prima quantificata sondando la membrana con un anticorpo contro questa proteina. L'intensità del segnale viene analizzata utilizzando un software di imaging, come descritto in questo manoscritto. Quindi, la membrana viene rieseguita con un anticorpo contro il partner di legame e l'intensità del segnale anche quantificata. Le interazioni tra le due proteine ​​possono quindi essere espresse come un rapporto della quantità del partner di legame con la quantità della proteina immunoprecipitata. Tuttavia, per consentire il confronto, i diversi campioni devono essere elaborati contemporaneamente e caricati sulla stessa membrana. BiologLe repliche ical possono essere procedute e analizzate in modo analogo e possono essere eseguite analisi statistiche.

Negli ultimi anni sono state sviluppate altre tecniche per analizzare i PPI. Per esempio, FRET consente di identificare le proteine ​​interagenti attraverso il trasferimento di energia da un tag a un altro, solo quando le proteine ​​sono abbastanza vicine da interagire 20 . Tuttavia, poiché richiede la marcatura delle proteine, questa tecnica non può essere utilizzata nei tessuti. Allo stesso modo, è possibile identificare i PPI utilizzando una proteina fusa con una biotina batterica ligasi, BirA 21 . Questa ligasi aggiungerà biotina alle proteine ​​che vengono in prossimità ( cioè interagiscono) con la proteina chimerica. Mentre questo metodo è innovativo e imparziale, non può essere eseguito nei tessuti. In alternativa, PLA può essere utilizzato nei tessuti. Simile al co-IF, questo test si basa sull'affinità degli anticorpi. Per questo saggio, gli anticorpi secondari sono contrassegnati con sequenze di DNA thaPossono interagire quando sono in prossimità ( ad esempio, su PPI) e formano una molecola circolare del DNA 22 . Questa molecola circolare del DNA viene quindi amplificata e rilevata utilizzando oligonucleotidi complementari etichettati a fluorescenza. Anche se questo test è elegante, richiede numerosi passaggi di convalida e si basa ancora sull'affinità primaria degli anticorpi e sulla conoscenza di potenziali partner interagenti. Infine, è stata sviluppata un'alternativa imparziale al metodo IP tradizionale per identificare i PPI. Nella rapida spettrometria di immunoprecipitazione-massa di proteine ​​endogene (RIME), i campioni IP sono analizzati mediante spettrometria di massa (IP / MS) 23 anziché Western blot analysis. Il principale vantaggio di questo metodo ad alto rendimento è che fornisce informazioni massicce su tutte le proteine ​​interagenti endogene usando pochi materiali. Tuttavia, richiede l'accesso ad uno strumento di sequenziamento peptidico 23 .

ÈImportante ricordare che, dopo diversi test preliminari, ogni fase di questo protocollo è stata ottimizzata per la ghiandola mammaria. Tuttavia, il metodo può essere utilizzato sicuramente per altri organi dopo alcune modifiche. Per co-IF è stata testata la temperatura ottimale per la sezione delle ghiandole mammarie, il blocco e il lavaggio adatti e le soluzioni e le concentrazioni corrette di anticorpi. Per co-IP, sono stati anche testati vari tamponi di lisi e eluizione e metodi di estrazione e hanno un impatto importante sul successo IP. In sintesi, ogni passaggio di questo protocollo è importante per ottenere risultati di alta qualità e riproducibili con il minimo sfondo possibile e la più specifica. Mentre altri metodi sono disponibili, co-IF seguiti da co-IP restano validi e semplici metodi per valutare i PPI. Queste due tecniche possono essere utilizzate sia nei tessuti che nelle linee cellulari e richiedono solo alcuni passaggi e controlli di convalida.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Acknowledgements

IP è finanziato da una sovvenzione scientifica di scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC # 418233-2012); Un Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), un premio per la carriera di Cancer Breast Cancer di Quebec, e una sovvenzione di Leader Found della sovvenzione Canadian Foundation for Innovation. ED ha ricevuto una borsa di studio dalla Fondation universitaire Armand-Frappier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice strain and stage St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock) 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock) 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  See Comments β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061 Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

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