Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas

Developmental Biology

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Summary

As junções intercelulares são requisitos para funções e desenvolvimento específicos do estágio da glândula mamária. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para o estudo das interações proteína-proteína (IPPs) e co-localização usando glândulas mamárias murinas. Estas técnicas permitem a investigação da dinâmica da associação física entre junções intercelulares em diferentes estádios de desenvolvimento.

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Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

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Abstract

As interações célula-célula desempenham um papel fundamental na preservação da integridade do tecido e da barreira entre os diferentes compartimentos da glândula mamária. Essas interações são fornecidas por proteínas juncionais que formam nexos entre células adjacentes. A mislocalização da proteína juncional e as associações físicas reduzidas com seus parceiros de ligação podem resultar na perda de função e, consequentemente, na disfunção orgânica. Assim, identificar a localização da proteína e as interações proteína-proteína (IPPs) em tecidos normais e relacionados à doença é essencial para encontrar novas evidências e mecanismos que conduzam à progressão de doenças ou alterações no estado de desenvolvimento. Este manuscrito apresenta um método de dois passos para avaliar PPIs nas glândulas mamárias murinas. Na seção de protocolo 1, é descrito um método para realizar co-imunofluorescência (co-IF) utilizando anticorpos criados contra as proteínas de interesse, seguido por anticorpos secundários marcados com fluoroquemas. Embora co-IF tudoOws para a demonstração da proximidade das proteínas, permite estudar suas interações físicas. Portanto, um protocolo detalhado para co-imunoprecipitação (co-IP) é fornecido na seção de protocolo 2. Esse método é usado para determinar as interações físicas entre proteínas, sem confirmar se essas interações são diretas ou indiretas. Nos últimos anos, as técnicas de co-IF e co-IP demonstraram que certos componentes das junções intercelulares co-localizam e interagem juntos, criando nexos juncionais dependentes do estágio que variam durante o desenvolvimento das glândulas mamárias.

Introduction

O crescimento e desenvolvimento das glândulas mamárias ocorre principalmente após o nascimento. Este órgão se remodela constantemente ao longo da vida reprodutiva de um mamífero 1 . O epitélio da glândula mamária adulta é constituído por uma camada interna de células epiteliais luminal e uma camada externa de células basais, composta principalmente de células mioepiteliais, cercadas por uma membrana basal 2 . Para uma boa revisão sobre a estrutura e desenvolvimento da glândula mamária, o leitor pode se referir ao Sternlicht 1 . As interações célula-célula através das juntas gap (GJ), tight (TJ) e adherens (AJ) são necessárias para o desenvolvimento e função normal da glândula 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Os principais componentes dessas junções na glândula mamária murina são Cx26, Cx30, Cx32 e Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 e -7 eZO-1 (TJ); E E-caderina, P-caderina e β-catenina (AJ) 7 , 8 . Os níveis de expressão dessas diferentes proteínas juncionais variam de maneira dependente do estágio durante o desenvolvimento da glândula mamária, sugerindo requisitos diferenciais de interação célula-célula 9 . GJ, TJ e AJ estão ligados estruturalmente e funcionalmente e ligam outras proteínas estruturais ou reguladoras aos locais vizinhos de células adjacentes, criando assim um nexo juncional 10 . A composição do nexo juncional pode impactar a ponte com o citoesqueleto subjacente, bem como a permeabilidade e a estabilidade do nexo e, conseqüentemente, influenciar a função da glândula 8 , 9 , 10 , 11 . Os componentes das junções intercelulares que residem em nexos de junção ou interagem uns com os outros em difOs estádios de desenvolvimento do desenvolvimento da glândula mamária foram recentemente analisados ​​utilizando co-imunofluorescência (co-IF) e co-imunoprecipitação (co-IP) 9 . Enquanto outras técnicas permitem a avaliação da associação funcional entre proteínas, esses métodos não são apresentados neste manuscrito.

Como as proteínas apenas atuam sozinhas para funcionar, o estudo das interações proteína-proteína (IPPs), como transduções de sinais e cascatas bioquímicas, é essencial para muitos pesquisadores e pode fornecer informações significativas sobre a função das proteínas. A co-IF e a análise microscópica ajudam a avaliar algumas proteínas que compartilham o mesmo espaço subcelular. No entanto, o número de alvos é limitado pelos anticorpos, que devem ser criados em diferentes animais e pelo acesso a um microscópio confocal equipado com diferentes lasers de comprimento de onda e um detector espectral para multiplexação. O Co-IP confirma ou revela interações físicas de alta afinidade entreEen duas ou mais proteínas que residem dentro de um complexo protéico. Apesar do desenvolvimento de novas técnicas, como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) 12 e o ensaio de ligação de proximidade (PLA) 13 , que pode detectar simultaneamente a localização e as interações de proteínas, o co-IP continua sendo uma técnica apropriada e acessível para estudar interações entre Proteínas endógenas.

O método passo-a-passo descrito neste manuscrito facilitará o estudo da localização da proteína e PPIs e apontará armadilhas para evitar ao estudar PPIs endógenos nas glândulas mamárias. A metodologia começa com a apresentação dos diferentes procedimentos de preservação dos tecidos necessários para cada técnica. A Parte 1 apresenta como estudar a co-localização de proteínas em três etapas: i) o corte das glândulas mamárias, ii) a rotulagem dupla ou tripla de diferentes proteínas usando a técnica co-IF, e iii) a imagem deLocalização de proteínas. A Parte 2 mostra como precipitar uma proteína endógena e identificar suas proteínas que interagem em três etapas: i) preparação do lisado, ii) imunoprecipitação indireta da proteína e iii) identificação do parceiro de ligação por SDS-PAGE e Western blot. Cada passo deste protocolo é otimizado para os tecidos das glândulas mamárias de roedores e gera resultados de alta qualidade, específicos e reprodutíveis. Este protocolo também pode ser usado como ponto de partida para estudos de PPI em outros tecidos ou linhas celulares.

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Protocol

Todos os protocolos de animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados de Animais da Universidade (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canadá).

1. Identificando Co-localização de Proteína

  1. Do tecido para lâminas microscópicas
    NOTA: Os tecidos e as seções devem ser manuseados em gelo seco.
    1. Impeça as glândulas mamárias de um animal (para uma descrição completa deste procedimento, consulte Plante et al. ) 14 .
    2. Incorporar o tecido excisado no meio de congelação / montagem em gelo seco. Adicione meio suficiente para cobrir a glândula. Quando o meio é solidificado, transfira os tecidos para um congelador a -80 ° C para uso posterior 9 .
    3. Usando um cryomicrotome ajustado em ≤ -35 ​​° C, corte os tecidos em secções de 7-10 μm de espessura e coloque-os em lâminas de microscópio.
      NOTA: Quando possível, coloque duas seções em cada slide; A seção esquerda será usada como umControle negativo para verificar a especificidade dos anticorpos e a autofluorescência do tecido, enquanto o lado direito será rotulado com os anticorpos.
    4. Mantenha as secções a -80 ° C para uso posterior.
  2. Co-IF coloração
    1. Recupere as lâminas microscópicas apropriadas do congelador e conserte imediatamente as secções imergindo-as em formaldeído 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT).
    2. Em seguida, mergulhe os slides em solução salina tamponada com fosfato (PBS) à RT. Deixe os slides em PBS na RT até prosseguir para o próximo passo.
    3. Circule cada seção do slide usando uma barreira hidrofóbica comercialmente disponível ou uma caneta de laboratório repelente de água (veja a Tabela de Materiais ). Tenha cuidado para não tocar o tecido. Adicione imediatamente gotas de PBS ao tecido e coloque o slide em uma câmara de histologia úmida pelo restante do procedimento.
      NOTA: As secções de tecido devem permanecer hidratadas. AlternativaUse uma caixa com uma tampa e coloque toalhas de papel molhadas na parte inferior.
    4. Bloqueie cada seção de tecido com 100-200 μL de albumina de soro bovino a 3% (BSA) - solução salina tamponada com Tris (TBS) -0,1% de polissorbato 20 (ver Tabela de Materiais ) durante 30 min à TA. Enquanto as amostras estão bloqueando, prepare as soluções de anticorpos primário e secundário diluindo os anticorpos em TBS-0.1% polissorbato 20.
      NOTA: A concentração requerida para o anticorpo é fornecida pelo fabricante; Veja a Tabela de Materiais e as Figuras 1 e 2 para exemplos, bem como Dianati et al. 9 . Embora não seja necessário trabalhar no escuro ao usar a maioria dos anticorpos conjugados com fluoróforos, evite expor as soluções de anticorpos ou os tecidos coloridos a luz intensa e brilhante.
    5. Remova a solução de bloqueio por aspiração e incube as seções em 100-200 μL do anticorpo primário diluído durante 60 min à TA. AlternativelIn, incubar com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C.
    6. Remova a solução de anticorpo primário por aspiração e lave as secções com 250-500 μL de TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min. Remova a solução de lavagem por aspiração e repita a lavagem duas vezes.
    7. Remova a solução de lavagem por aspiração e incube as secções com 100-200 μL do anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado durante 60 min à TA.
    8. Remova a solução de anticorpo secundário por aspiração e lave as secções com 250-500 μL de TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min. Remova a solução de lavagem e repita duas vezes.
    9. Repita o passo 2.5-2.8 utilizando a combinação apropriada de anticorpos primários e secundários para a (s) proteína (s) subsequente (s) de interesse.
    10. Remova a solução de lavagem por aspiração e realize a coloração dos núcleos incubando a seção com 100-200 μL de 1 mg / mL de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) em TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min aRT.
    11. Remova a solução DAPI por aspiração e monte as lâminas usando um meio de montagem solúvel em água e não fluorescente (veja a Tabela de Materiais ) e lamínulas. Prossiga um slide de cada vez.
      NOTA: Incubar a mancha do núcleo por mais de 5 min não alterará a intensidade da coloração. Alternativamente, remova a solução DAPI em todos os slides e incuba os tecidos em PBS enquanto monta as lâminas.
    12. Coloque as lâminas plana em uma geladeira de 4 ° C por pelo menos 8 h. Proceda à imagem microscópica de fluorescência (ver Figuras 1 e 2 ).
  3. Imagem microscópica
    1. Visualize os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos usando um microscópio confocal equipado com os vários lasers necessários para excitar os fluoróforos em seus comprimentos de onda específicos.
      Nota: Para poder visualizar canais e alvéolos, sugere-se um objetivo 40X com uma abertura numérica de 0,95. Um exemploE da configuração específica é fornecida na Figura 1 .
    2. Verifique a localização de cada proteína individualmente, digitalizando a imagem um comprimento de onda no momento.
      Nota: Nesta fase, é importante analisar criticamente a localização das proteínas juncionais. Para poder formar nexos de junção, estas proteínas devem ser localizadas na membrana plasmática.
    3. Determine a co-localização das proteínas pela fusão das imagens digitalizadas com os lasers nos diferentes comprimentos de onda.
      Nota: A co-localização das proteínas pode ser visualizada pela mudança de cor resultante da emissão de dois ou mais fluoróforos no mesmo local e pode ser medida usando o software apropriado ( Figuras 1 e 2 , veja também a Referência 9).

2. Estudando PPIs

NOTA: As glândulas mamárias abdominais devem ser usadas para estudar IPP, pois as glândulas torácicas estão em estreita associação com o peitoralMúsculos. Esqueça as glândulas mamárias (para uma descrição completa deste procedimento, consulte Plante et al .) 14 e mantenha-os a -80 ° C para uso posterior.

  1. Preparação de lisado
    1. Coloque papel de pesagem e 2 mL de tubos de microcentrífuga em gelo seco para pré-esfriar antes de prosseguir com os próximos passos.
    2. Pegue o tecido da glândula mamária a partir de -80 ° C e mantenha-os em gelo seco.
    3. Pesar os tecidos nos papéis de pesagem pré-refrigerados e depois transferir o tecido para tubos de microcentrífuga de 2 mL (pega em gelo seco). Use entre 50 e 100 mg de tecido por amostra. Mantenha o tecido em gelo seco até o passo 2.1.5.
    4. Prepare a quantidade necessária de tampão de lise detergente triplo suplementado com NaF, NaVO 3 e inibidor de protease / fosfatase, conforme indicado na Tabela de Materiais , utilizando as seguintes fórmulas. Ratos: tampão necessário (μL) = peso do tecido do mouse (mg) x 3; Rato: necessárioTampão (μL) = peso do tecido do rato (mg) x 5.
    5. Adicione a quantidade necessária de tampão de lise gelada (calculado no passo 2.1.4) ao tubo de 2 mL contendo o tecido.
      NOTA: Nas etapas 2.1.5-2.1.6, avance com um único tubo por vez.
    6. Homogeneizar o tecido por 30-40 s usando homogeneização contínua em um moedor de tecido; Sempre mantenha o tubo no gelo. Ajuste o homogeneizador de tecido em velocidade média e mova suavemente o moedor para cima e para baixo dentro do tubo.
    7. Repita os passos 1.6 e 1.7 com os outros tubos.
    8. Incubar os lisados ​​no gelo durante 10 a 30 minutos.
    9. Centrifugue os tubos a 170 xg durante 10 min a 4 ° C.
    10. Enquanto isso, identifique 6-10 tubos de microcentrífuga (0.6 mL) para cada amostra e mantenha-os em gelo.
    11. Assim que a centrifugação for feita, verifique os tubos. Certifique-se de que eles contêm uma camada superior de lisados ​​gordos, límpidos, amarelos a rosa (dependendo do estágio de desenvolvimento) e uma pelota.
    12. Crie um buraco na camada lipídicaUsando uma ponta de pipeta de 200 μL para acessar a fase líquida. Mude a ponta e cole o lisado sem perturbar o sedimento ou aspirar a camada lipídica. Alíquota o lisado em tubos pré-rotulados em gelo (passo 2.1.11) e guarde-os a -80 ° C.
    13. Use uma alíquota para quantificar a concentração de proteína usando um kit disponível comercialmente disponível (veja a Tabela de Materiais ).
  2. Imunoprecipitação indireta
    1. No gelo, descongelar duas alíquotas do total de lisados ​​de glândula mamária preparados anteriormente.
      NOTA: Uma alíquota será usada para o IP da proteína alvo, enquanto a outra servirá como controle negativo.
    2. Coletar 500-1,000 μg do lisado e diluí-lo em PBS para atingir um volume final de 200 μL em cada tubo de 1,5 mL.
      NOTA: A quantidade de lisado a ser usado depende da abundância da proteína de interesse e da eficiência do anticorpo (veja a Figura 3 para umaN exemplo, bem como a tabela de materiais ). Para otimizar para cada alvo, devem ser utilizadas diferentes quantidades de lisado ( isto é, 500, 750 e 1000 μg) e anticorpo ( isto é, 5, 10 e 20 μg). Prossiga com as seguintes etapas (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Adicione o anticorpo contra o antígeno de interesse para o primeiro tubo de lisado e mantenha-o no gelo.
      NOTA: A quantidade necessária geralmente é sugerida na folha de instruções fornecida por cada empresa (consulte a Tabela de Materiais ).
    4. No segundo tubo, prepare um controle negativo adicionando a mesma concentração de controle de isotipo IgG como o anticorpo usado no passo 2.2.3.
    5. Incubar os tubos durante a noite a 4 ° C em um misturador de rolos de tubo a baixa velocidade.
    6. No dia seguinte, adicione 50 μL de pérolas magnéticas a novos tubos de 1,5 mL para pré-lavagem.
      1. Selecione as pérolas magnéticas Protein A ou Protein G com base na afinidade relativa do anticorpo. É importante evitar o uso de grânulos agregados; Misture suavemente a suspensão do talão até que seja novamente suspenso antes de adicioná-lo aos tubos.
    7. Coloque os tubos contendo as contas no suporte magnético e permita que as pérolas migrem para o ímã. Remova o buffer de armazenamento das contas usando uma pipeta de 200 μL.
    8. Lavar as esferas adicionando 500 μL de PBS-0,1% de polissorbato 20 e agitar os tubos vigorosamente durante 10 s.
    9. Coloque os tubos de volta no suporte magnético e permita que os grânulos migrem para o ímã.
    10. Remova o excesso de tampão de lavagem por pipetagem com uma pipeta de 200 μL.
    11. Adicionar o complexo de reação (anticorpo-lisado) do passo 2.2.5 às esferas e incubar durante 90 minutos à TA no misturador de rolos.
    12. Coloque os tubos no suporte magnético e permita que os grânulos migrem para o ímã. Usando uma pipeta de 200 μL, aspirar e descartar o lisado e colocar os tubos no gelo.
    13. Lave a contaS adicionando 500 μL de PBS, colocando os tubos no suporte magnético e removendo o líquido usando uma pipeta de 200 μL. Repita este passo de lavagem. Durante as etapas de lavagem, evite o vortex e mantenha as amostras no gelo.
    14. Lave as contas uma vez com PBS-0.1% de polissorbato 20 sem vortexar e descarte o último tampão de lavagem usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
    15. Para eluir, adicione 20 μL de glicina ácida 0,2 M (pH = 2,5) aos tubos e agite-os durante 7 minutos no misturador de rolos.
    16. Centrifugar a alta velocidade por alguns segundos (rotação rápida) e coletar o sobrenadante em um tubo gelado fresco.
    17. Repita as etapas 2.2.14 e 2.2.15 para cada tubo.
      NOTA: O volume final será de 40 μL.
    18. Adicione 10 μL de tampão 4x Laemmli à amostra eluída de 40 μL do passo 2.2.16.
      NOTA: A cor ficará amarela devido ao pH ácido.
    19. Adicione imediatamente 1 M Tris (pH = 8), uma gota por vez, à amostra eluída do passo 2.2.18 até sua corFica azul. Prossiga para os próximos tubos.
    20. Ferver as amostras do passo 2.2.18 a 70-90 ° C durante 10 min. Proceda imediatamente à eletroforese em gel. Alternativamente, transfira as amostras para um congelador a -80 ° C até o carregamento.
  3. Aplicação a jusante: eletroforese em gel seguida de Western Blot
    1. Prepare a separação e o empilhamento de gel de acrilamida SDS-PAGE (1,5 mm de espessura) seguindo os procedimentos padrão 15 .
      NOTA: A escolha do gel (8-15% de acrilamida, gradiente: ver a Tabela de Materiais ) deve ser determinada com base no tamanho molecular da proteína a ser precipitada e dos potenciais parceiros de ligação a serem analisados. Essas proteínas devem ser resolvidas umas das outras para permitir a imunodetecção adequada.
    2. Destilar as amostras ligadas à imunoprecipitação (IP) (passo 2.2.20) no gelo.
    3. Prepare lisins proteicos das mesmas amostras (usado para o procedimento IP acima). Use 50Μg de lisado total e adicione o tampão de amostra 4X Laemmli. Cozinhe as amostras a 70-90 ° C por 5 min e coloque no gelo até o carregamento.
      NOTA: Estas amostras serão carregadas ao lado da amostra IP eluída para demonstrar a presença de proteínas precipitadas no lisado total.
    4. Carregar os lisados ​​preparados a partir do passo 2.3.3 e as amostras precipitadas do passo 2.2.20 lado a lado em um gel de acrilamida e executá-los em tampão de corrida (10x tampão corrente: 30,3 g de Tris, 144,1 g de glicina e 10 G de SDS em 1 L de água destilada) a 100 V por aproximadamente 95 min, ou até a borda das proteínas migratórias chegar ao fundo do gel.
    5. Transfira os géis para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF usando um protocolo padrão 9 , 15 .
    6. Bloqueie a membrana durante 1 h em um balancim em baixa velocidade em 5% de TTBS com leite seco (Tris 20 mM, NaCl 500 mM e polissorbato a 0,05% 20).
    7. Identifique se a precipitação foi sucObrigado.
      1. Sonda a membrana utilizando o primeiro anticorpo contra a proteína precipitada, diluída em 5% de TTBS de leite seco na concentração recomendada pelo fabricante, durante a noite a 4 ° C em uma plataforma de balanço com agitação lenta.
        NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter recomendações.
      2. No dia seguinte, lave a membrana 3 vezes por 5 min cada uma com TTBS em uma plataforma de balanço com alta agitação.
      3. Incube a membrana no anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase de rábano (HRP), diluído em TTBS, durante 1 h na RT em uma plataforma de balanço com agitação lenta.
        NOTA: Alternativamente, um anticorpo secundário conjugado com um fluorochrome pode ser usado se um aparelho apropriado para detectar o sinal estiver disponível.
      4. Execute 3 a 6 lavagens, cada uma por 5 min, com TTBS em uma plataforma de balanço com alta agitação. Analisar o sinal do anticorpo secundário incubando a membrana com um comercialmenteSolução luminólica disponível (consulte a Tabela de Materiais ) e siga as instruções do fabricante. Detectar o sinal usando um sistema de imagem de quimioluminiscência (ver Tabela de Materiais ).
        NOTA: Para um protocolo detalhado sobre análise de transferência de Western, consulte a Referência 16.
    8. Para identificar as proteínas que interagem, execute as etapas 2.3.7.1-2.3.7.4 usando os anticorpos apropriados na mesma mancha.
      NOTA: Se as proteínas estão interagindo, os parceiros de ligação serão co-imunoprecipitados com a proteína alvo e, portanto, serão detectáveis ​​por Western Blot. O passo 2.3.8 pode ser repetido com mais anticorpos para determinar se outras proteínas residem no mesmo complexo de proteínas, desde que os pesos moleculares das proteínas diferem o suficiente para estar bem separados no gel e na membrana.
    9. Para confirmar que os parceiros de ligação identificados não são artefatos, o IP recíproco deve ser realizado.
      NOTA: isto é executado repetindoPassos 2.2.1-2.2.20 com o mesmo lisado, mas precipitando um dos parceiros de ligação identificados no passo 3.8. Em seguida, as etapas 3.1-3.8 são repetidas usando o anticorpo primário contra a primeira proteína de interesse.

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Representative Results

Para determinar se os componentes GJ, AJ e TJ podem interagir juntos na glândula mamária, os ensaios co-IF foram realizados pela primeira vez. Cx26, uma proteína GJ e β-Catenin, uma proteína AJ, foram sondados com anticorpos específicos e revelaram-se com anticorpos conjugados com mouse-647 (verde, pseudocolor) e cabra-568 (vermelho), respectivamente ( Figura 1B e C ) . Os dados mostraram que eles co-localizam na membrana celular das células epiteliais na glândula mamária no dia 7 da lactação (L7), conforme refletido pela cor amarela ( Figura 1D ). Em segundo lugar, Claudin-7, uma proteína TJ; E-caderina, uma proteína AJ; E Connexin26 (Cx26), uma proteína GJ, foram sondados com seus anticorpos específicos e foram revelados com anticorpos conjugados com fluoróforo-488 (verde), mouse-555 (vermelho) e mouse-647 (coral azul, pseudocolor), respectivamente ( Figura 2B-D ). A co-localização de E-cadherin e Claudin-7 éExibido como cor amarela a luz-laranja, enquanto a co-localização Cx26 com E-cadherin e Claudin-7 resultou em coloração pontilhada branca em glândulas mamárias de ratos no dia 18 de gravidez (P18) ( Figura 2E ).

Para descobrir quais proteínas juncionais se misturam e se ligam fisicamente na membrana celular, a co-imunoprecipitação foi realizada usando tecidos de glândula mamária a partir de camundongos lactantes (L14). Os resultados mostraram que Cx43, um componente da GJ, interage com E-Cadherin e Claudin-7, mas não com Claudin-3 ( Figura 3A e B ). Estes resultados foram confirmados pelo IP recíproco; Quando E-Cadherin foi imunoprecipitado, interagiu com Cx43 e Claudin-7 ( Figura 3C ).

figura 1
Figura 1: co-localizar β-Catenin e Cx26 no memb da célulaRane em camundongos glândulas mamárias. As criosecções das glândulas mamárias dos camundongos no dia 7 da lactação (L7) foram cortadas (7 μm) e processadas para coloração imunofluorescente. ( A ) Os núcleos foram corados com DAPI (azul). ( B ) Cx26 (verde, pseudocolor) e ( C ) β-Catenina (vermelho) são mostrados combinados com anticorpos marcados com fluoróforo apropriados. ( D ) Uma imagem mesclada. As imagens foram obtidas com um microscópio confocal equipado com um detector espectral. DAPI foi visualizado usando as seguintes configurações: comprimento de onda de emissão, 450,0 nm; Comprimento de onda de excitação, 402,9 nm; Poder laser, 1,2; Ganho do detector, PMT HV 100; Deslocamento PMT, 0. Cx26 (647) foi visualizado usando as seguintes configurações: comprimento de onda de emissão, 700,0 nm; Comprimento de onda de excitação, 637,8 nm; Poder laser, 2,1; Ganho do detector, PMT HV 110; Desvio de PMT, 0. β-Catenin (568) foi visualizado usando as seguintes configurações: comprimento de onda de emissão, 595,0 nm; Comprimento de onda de excitação, 561,6 nm; laserPoder 2.1; Ganho do detector, PMT HV 110; Deslocamento PMT, 0. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherin e Claudin-7 co-localizam na membrana celular em glândulas mamárias de camundongos. As crosecções das glândulas mamárias no dia 18 da gravidez (P18) foram cortadas (7 μm) e processadas para coloração imunofluorescente usando ( B ) Claudin-7 (verde), ( C ) E-Caderina (vermelho) e ( D ) Cx26 (coral Azul, pseudocolor), combinado com os anticorpos apropriados com fluoróforo. ( A ) Os núcleos foram corados com DAPI (azul). As imagens foram obtidas com um microscópio confocal equipado com um detector espectral. DAPI foi visualizado usando o fConfigurações: comprimento de onda de emissão, 450,0 nm; Comprimento de onda de excitação, 402,9 nm; Potência do laser, 5,4; Ganho do detector, PMT HV 65; Deslocamento PMT, 0. Claudin-7 (488) foi visualizado usando as seguintes configurações: comprimento de onda de emissão, 525,0 nm; Comprimento de onda de excitação, 489,1 nm; Poder laser, 5,0; Ganho do detector, PMT HV 12; Deslocamento PMT, 0. A E-Cadherin (568) foi visualizada usando as seguintes configurações: comprimento de onda de emissão, 595,0 nm; Comprimento de onda de excitação, 561,6 nm; Poder laser, 13,5; Ganho do detector, PMT HV 45; Deslocamento PMT, 0. Cx26 (647) foi visualizado usando as seguintes configurações: comprimento de onda de emissão, 700,0; Comprimento de onda de excitação, 637,8; Poder laser, 5,0; Ganho do detector, PMT HV 55; Deslocamento PMT, 0. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Cx43, E-Cadherin e Claudin-7, mas não Claudin-3, estão envolvidos em um complexo protéico. Cx43 ( A e B ) e E-Cadherin ( C ) foram imunoprecipitados utilizando 500 mg de lisados ​​totais de glândulas mamárias de camundongos na lactação. IPs e lisados ​​foram carregados em géis e transferidos em membranas PVDF. Como Claudin-7 e Claudin-3 têm o mesmo peso molecular, não podem ser analisados ​​na mesma membrana. Assim, dois IPs paralelos foram realizados com o mesmo lisado para Cx43, carregados em dois géis e transferidos (membranas A e B). A Membrana A foi inicialmente testada com Cx43 para confirmar a eficiência do IP (painel superior). Então, a membrana foi sequencialmente sondada com E-Cadherin e Claudin-7. A análise Western Blot mostrou que as duas proteínas interagem com Cx43. A membrana B foi testada pela primeira vez com Cx43 para confirmar a eficiência do IP (painel superior) e depois sondada com Claudin-3. A análise Western Blot mostrou que Claudin-3 dId não IP com Cx43, demonstrando que as duas proteínas não interagem. A membrana C foi testada pela primeira vez com E-caderina para confirmar a eficiência do IP (painel superior). Então, a membrana, foi sondada sequencialmente com Cx43 e Claudin-7. A análise Western Blot confirmou as interações entre as proteínas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As interações célula-célula através das junções são necessárias para o bom funcionamento e desenvolvimento de muitos órgãos, como a glândula mamária. Estudos demonstraram que as proteínas juncionais podem regular a função e a estabilidade uns dos outros e ativar a transdução do sinal ao se amarrar na membrana celular 10 . Os protocolos apresentados no manuscrito atual forneceram achados interessantes sobre expressão, localização e interação diferencial de proteínas juncionais durante o desenvolvimento normal da glândula murina 9 . Dado que a localização da proteína de junção é fundamental para a função das proteínas, e porque é conhecido por interagir com proteínas de andaimes e numerosas quinases 3 , co-IF e co-IP são técnicas eficazes no campo das interações célula-célula. Não só esses métodos são essenciais para esclarecer a necessidade de nexos juncionais no desenvolvimento das glândulas mamárias e sua disRegulação no câncer de mama, mas também podem ser usados ​​em outros tecidos e em experimentos usando linhas celulares.

A glândula mamária é composta por dois compartimentos principais: estroma e epitélio 4 . O epitélio adulto é feito de duas camadas de células. Nessa abordagem, a proximidade dos possíveis parceiros de ligação foi determinada usando a técnica co-IF, e suas interações físicas foram confirmadas usando co-IP. A co-IF foi utilizada com sucesso por outros para demonstrar a co-localização de proteínas dentro do mesmo tecido, estrutura, célula ou compartimento intracelular 17 , 18 . A principal vantagem desta técnica é a informação visual que traz sobre a localização celular ou subcelular de cada proteína dentro dos diferentes tipos de células que compõem o tecido. Embora esta técnica seja bastante simples, algumas recomendações devem ser seguidas. Por exemplo, para evitar danos nos tecidos,Adicione sempre as soluções uma gota por vez usando uma pipeta de 200 μL ou uma pipeta de transferência. Isso permitirá a imersão da superfície do tecido sem danificar os tecidos. Da mesma forma, remova as soluções usando uma pipeta Pasteur colocada ao lado dos tecidos, inclinando suavemente o slide. Além disso, para os anticorpos cuja solução de armazenamento contém glicerol, é necessária uma sucção cuidadosa dos buffers de lavagem para reduzir o fundo. Além disso, a presença de proteínas do leite, como caseínas, durante a lactação pode interferir com os anticorpos, prendendo-os, resultando em falsos positivos. Por conseguinte, é necessária uma análise crítica da imagem resultante, especificamente nesta fase.

Esta técnica de co-IF também possui certas limitações ou armadilhas. Primeiro, requer anticorpos específicos. Conforme mencionado anteriormente (etapa 1.1), recomenda-se usar uma seção ( ou seja, a do lado direito) em cada slide para coloração seguindo as etapas descritas acima, adicionando aPrimários e secundários de forma sequencial. Para a seção restante ( ou seja, a do lado esquerdo), siga o mesmo procedimento, usando TBS-polissorbato 20 0,1% em vez das soluções primárias de anticorpos. Embora seja possível, e ainda melhor, verificar a ligação específica do anticorpo usando competição de péptidos, os péptidos usados ​​para gerar anticorpos comerciais nem sempre estão disponíveis. Portanto, é importante verificar a especificidade da ligação usando controles positivos e negativos ( ou seja, tecidos ou células que expressam, ou não, a proteína de interesse). Além disso, os locais de fixação do antígeno podem ser inacessíveis, especialmente para os tecidos fixados em formalina, resultando na ausência de um sinal específico. Um procedimento de recuperação de antígeno pode, portanto, ser necessário para alguns tecidos. Uma pequena incubação com detergente também pode ser realizada antes da recuperação do antígeno para permeabilizar a membrana celular. Em segundo lugar, para a multiplexação, os anticorpos devem ser criados em diferentes animais.Por exemplo, se o anti-coelho fosse usado no passo 1.2.6, o anti-mouse poderia ser selecionado no passo 1.2.10, mas não outro anticorpo criado em coelho. Uma vez que a maioria dos anticorpos comerciais são criados em coelhos, camundongos ou cabras, às vezes é difícil, ou mesmo impossível, alvejar duas proteínas ao mesmo tempo devido à falta de anticorpos apropriados. Para superar essas limitações, pode-se comprar anticorpos pré-marcados comercialmente disponíveis ou rotular anticorpos primários com fluoróforos usando kits comercialmente disponíveis. Em terceiro lugar, outra lacuna está ligada à excitação e à emissão dos diferentes fluoróforos. Para evitar a sobreposição dos sinais de dois anticorpos diferentes, o espectro de emissão de excitação de cada fluoróforo deve ser separado. Assim, o número de alvos que podem ser analisados ​​ao mesmo tempo variará de acordo com a configuração do microscópio disponível. Finalmente, a qualidade da análise é altamente dependente do microscópio utilizado. Dados mais detalhados e precisos podemSer obtido usando um microscópio confocal em comparação com um microscópio epifluorescente. O uso de microscopia de super resolução pode revelar a co-localização de proteínas em detalhes ainda mais 19 .

Embora o co-IF traga informações importantes sobre a proximidade de potenciais parceiros de ligação, ele deve ser complementado por outros métodos para identificar interações físicas entre proteínas. Entre os métodos disponíveis, o co-IP é provavelmente um dos mais acessíveis a serem executados, já que o equipamento e o material são facilmente acessíveis. Usando um anticorpo ligado a pérolas magnéticas, pode-se isolar complexos de proteínas e identificar os componentes presentes nesse complexo usando a análise de Western blot típica. Semelhante ao co-IF, algumas recomendações devem ser seguidas para as melhores práticas. Por exemplo, recomenda-se minimizar as amostras ao homogeneizar os tecidos para reduzir o tempo entre as etapas 2.1.5 e 2.1.9. Enquanto uma pessoa experiente pode processar até 10 amostras emUm novato não deve lidar com mais de 4-6 amostras. Da mesma forma, o número de tubos deve ser limitado ao executar o protocolo IP pela primeira vez. Recomenda-se que comece com um controle negativo ( isto é, IgG) e um controle positivo ( ou seja, um tecido conhecido por conter a proteína para ser imunoprecipitado) apenas. O segundo teste deve ser dedicado à otimização (ver passo 2.2.2). Uma vez que estas etapas dão resultados satisfatórios, as amostras a serem analisadas podem ser processadas. Observe que um controle negativo deve sempre ser incluído no procedimento.

Esta técnica de co-IP também possui armadilhas potenciais. Primeiro, requer que os tecidos sejam homogeneizados em condições que permitam a preservação das ligações entre as proteínas. Para as proteínas da membrana, como as proteínas juncionais, também é crucial usar um tampão que preserve as ligações entre as proteínas, ao mesmo tempo que permite a sua solubilidade. Em segundo lugar, semelhante ao co-IF, requer anticorpos de alta afinidadeTanto para a proteína alvo como para os parceiros de ligação. Além disso, uma vez que as proteínas permanecem na sua conformação terciária e os complexos proteicos não são dissociados por homogeneização, se o anticorpo reconhecer parte da proteína alvo que está em estreita proximidade com o domínio de ligação de um parceiro ou que está escondido dentro da estrutura nativa da proteína , O IP pode ser comprometido. Portanto, é essencial verificar sempre a eficiência do IP usando Western blot antes de concluir a ausência de um parceiro de ligação. Em terceiro lugar, o co-IP pode gerar resultados falso-positivos porque a proteína se liga diretamente às pérolas ou precipita durante o procedimento sem fazer parte do complexo. Para identificar esses artefatos, é necessário um controle IgG, bem como um IP recíproco, conforme descrito nos métodos apresentados. Também é possível adicionar um procedimento de "pré-limpeza" entre as etapas 2.2.2 e 2.2.3 para evitar a ligação inespecífica de proteínas às pérolas. Para isso, incubarE lisados ​​com 50 μg de pérolas durante 1 h a 4 ° C em um misturador de rolos. Remova as contas com o suporte magnético e avance para a etapa 2.2.3. Em quarto lugar, as cadeias pesadas e leves de IgG podem ser do mesmo tamanho que as proteínas de interesse ou o parceiro de ligação, mascarando o sinal. Uma solução é dissociar as cadeias de IgG com glicina, conforme descrito neste manuscrito. Também é possível comprar anticorpos secundários que apenas reconheçam anticorpos nativos e, portanto, não se ligam à luz desnaturada e às cadeias pesadas carregadas na membrana (ver Tabela de Materiais ). Os dois métodos às vezes podem ser combinados. Em quinto lugar, o co-IP permite a identificação de um número limitado de parceiros de ligação, em parte devido ao número de anticorpos que podem ser investigados na membrana. Também requer a pré-identificação desses parceiros de ligação, seja por co-IF ou através de uma revisão da literatura. Finalmente, co-IP permite a identificação das proteínas presDentro de um complexo, e não para a interação direta entre duas proteínas.

Os resultados do co-IP podem ser analisados ​​de diferentes maneiras. É possível identificar exclusivamente os parceiros que interagem ao re-examinar a mesma membrana com diferentes anticorpos, conforme descrito neste manuscrito. Também é possível quantificar essa interação. Para fazer isso, a quantidade de proteína imunoprecipitada é primeiro quantificada por sondagem da membrana com um anticorpo contra esta proteína. A intensidade do sinal é analisada usando um software de imagem, conforme descrito neste manuscrito. Então, a membrana é re-sondada com um anticorpo contra o parceiro de ligação, e a intensidade do sinal também é quantificada. As interacções entre as duas proteínas podem então ser expressas como uma proporção da quantidade do parceiro de ligação para a quantidade da proteína imunoprecipitada. No entanto, para permitir a comparação, as diferentes amostras devem ser processadas ao mesmo tempo e carregadas na mesma membrana. BiologAs repetições históricas podem ser processadas e analisadas de forma semelhante, e a análise estatística pode ser realizada.

Nos últimos anos, outras técnicas foram desenvolvidas para analisar PPIs. Por exemplo, o FRET permite a identificação de proteínas interativas através da transferência de energia de uma etiqueta para outra, apenas quando as proteínas estão próximas o suficiente para interagir 20 . No entanto, porque exige que as proteínas sejam marcadas, esta técnica não pode ser utilizada nos tecidos. Da mesma forma, é possível identificar PPIs usando uma proteína fundida com uma biotina ligase bacteriana, BirA 21 . Esta ligase irá adicionar biotina a proteínas que se aproximem ( ou seja, interagem) com a proteína quimérica. Embora este método seja inovador e imparcial, não pode ser realizado em tecidos. Alternativamente, PLA pode ser usado em tecidos. Semelhante ao co-IF, este ensaio baseia-se na afinidade do anticorpo. Para este ensaio, os anticorpos secundários são marcados com sequências de DNA thaT pode interagir quando estão em proximidade ( ou seja, em PPIs) e formar uma molécula circular de DNA 22 . Esta molécula de ADN circular é então amplificada e detectada usando oligonucleótidos complementares marcados com fluorescência. Embora este ensaio seja elegante, ele requer muitas etapas de validação e ainda depende da afinidade primária dos anticorpos e de algum conhecimento de possíveis parceiros interativos. Finalmente, uma alternativa imparcial ao teste de IP tradicional também foi desenvolvida para identificar IPPs. Em espectrometria de massa rápida de imunoprecipitação de ensaios de proteínas endógenas (RIME), as amostras IP são analisadas por espectrometria de massa (IP / MS) 23 em vez de análise Western Blot. A principal vantagem deste método de alto rendimento é que ele fornece informações maciças sobre todas as proteínas interativas endógenas usando poucos materiais. No entanto, requer acesso a um instrumento de sequenciação de péptidos 23 .

Isto éImportante mencionar que, após vários testes preliminares, cada passo deste protocolo foi otimizado para a glândula mamária. No entanto, o método certamente pode ser usado para outros órgãos após algumas modificações. Para co-IF, a temperatura ideal para seccionamento da glândula mamária, bloqueio e lavagem adequados e soluções e as concentrações apropriadas de anticorpos foram todas testadas. Para o co-IP, vários tampões de lise e eluição e métodos de extração também foram testados e têm um grande impacto no sucesso da IP. Em suma, cada passo deste protocolo é importante para a obtenção de resultados de alta qualidade e reprodutíveis com o menor antecedente possível e a maior especificidade. Enquanto outros métodos estão disponíveis, co-IF seguido de co-IP permanecem válidos e métodos simples para avaliar PPIs. Essas duas técnicas podem ser usadas nos tecidos e nas linhas celulares e requerem apenas algumas etapas e controles de validação.

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Disclosures

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgements

O IP é financiado por uma doação do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC nº 418233-2012); Um Fundo de Pesquisa do Québec-Saúde (FRQS), um prêmio de carreira da Fundação do Câncer do Quebec e uma doação Leader Founds da Fundação Canadense para Inovação. ED recebeu uma bolsa de estudos da Fondation universitaire Armand-Frappier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice strain and stage St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock) 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock) 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  See Comments β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061 Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

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