Análisis de las interacciones proteína-proteína y co-localización entre los componentes de la separación, estrecha, y adhiere a las uniones en las glándulas mamarias murinas

Developmental Biology

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Summary

Las uniones intercelulares son requisitos para las funciones y desarrollo específicos de la glándula mamaria. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP) y co-localización utilizando glándulas mamarias murinas. Estas técnicas permiten investigar la dinámica de la asociación física entre las uniones intercelulares en diferentes etapas del desarrollo.

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Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

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Abstract

Las interacciones célula-célula juegan un papel fundamental en la preservación de la integridad del tejido y la barrera entre los diferentes compartimentos de la glándula mamaria. Estas interacciones son proporcionadas por proteínas de unión que forman nexos entre células adyacentes. La pérdida de función y, en consecuencia, la disfunción de los órganos, pueden producir una errónea asociación de proteínas de unión y una asociación física reducida con sus socios de unión. Por lo tanto, identificar la localización de proteínas y las interacciones proteína-proteína (IPP) en los tejidos normales y relacionados con la enfermedad es esencial para encontrar nuevas evidencias y mecanismos que conduzcan a la progresión de enfermedades o alteraciones en el estado de desarrollo. Este manuscrito presenta un método de dos pasos para evaluar los IBP en las glándulas mamarias murinas. En la sección de protocolo 1, se describe un método para realizar co-inmunofluorescencia (co-IF) usando anticuerpos contra las proteínas de interés, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos. Aunque todos losOws para la demostración de la proximidad de las proteínas, permite estudiar sus interacciones físicas. Por lo tanto, se proporciona un protocolo detallado para co-inmunoprecipitación (co-IP) en la sección de protocolo 2. Este método se usa para determinar las interacciones físicas entre proteínas, sin confirmar si estas interacciones son directas o indirectas. En los últimos años, las técnicas co-IF y co-IP han demostrado que ciertos componentes de las uniones intercelulares co-localizan e interactúan entre sí, creando nexos de unión dependientes de la etapa que varían durante el desarrollo de la glándula mamaria.

Introduction

El crecimiento y desarrollo de la glándula mamaria ocurre principalmente después del nacimiento. Este órgano se remodela constantemente a lo largo de la vida reproductiva de un mamífero 1 . El epitelio de la glándula mamaria adulta está compuesto por una capa interna de células epiteliales luminales y una capa externa de células basales, compuestas principalmente por células mioepiteliales, rodeadas por una membrana basal 2 . Para una buena revisión sobre la estructura y desarrollo de la glándula mamaria, el lector puede referirse a Sternlicht 1 . Las interacciones célula-célula a través de la separación (GJ), estrecha (TJ), y adherens (AJ) las uniones son necesarias para el desarrollo normal y la función de la glándula 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los componentes principales de estas uniones en la glándula mamaria murina son Cx26, Cx30, Cx32 y Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 y -7 yZO - 1 (TJ); Y E-cadherina, P-cadherina y β-catenina (AJ) 7 , 8 . Los niveles de expresión de estas diferentes proteínas de unión varían de una manera dependiente de la etapa durante el desarrollo de la glándula mamaria, lo que sugiere diferencial célula-célula interacción requisitos [ 9] . GJ, TJ y AJ están ligados estructural y funcionalmente y atar otras proteínas estructurales o reguladoras a los sitios vecinos de las células adyacentes, creando así un nexo de unión 10 . La composición del nexo de unión puede impactar el puente con el citoesqueleto subyacente, así como la permeabilidad y estabilidad del nexo, y por consiguiente puede influir en la función de la glándula 8 , 9 , 10 , 11 . Los componentes de las uniones intercelulares que residen en nexos de unión o que interactúan entre sí en difSe analizaron recientemente las diferentes etapas del desarrollo de la glándula mamaria con co-inmunofluorescencia (co-IF) y co-inmunoprecipitación (co-IP) 9 . Mientras que otras técnicas permiten la evaluación de la asociación funcional entre proteínas, estos métodos no se presentan en este manuscrito.

Como las proteínas simplemente actúan solas para funcionar, el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP), como las transducciones de señales y las cascadas bioquímicas, es esencial para muchos investigadores y puede proporcionar información significativa sobre la función de las proteínas. Co-IF y el análisis microscópico ayudan a evaluar algunas proteínas que comparten el mismo espacio subcelular. Sin embargo, el número de dianas está limitado por los anticuerpos, que deben ser criados en diferentes animales, y por el acceso a un microscopio confocal equipado con láseres de longitud de onda diferentes y un detector espectral para multiplexación. Co-IP confirma o revela interacciones físicas de alta afinidad entreEntre dos o más proteínas que residen dentro de un complejo de proteínas. A pesar del desarrollo de nuevas técnicas, como la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) 12 y el ensayo de ligación de proximidad (PLA) 13 , que pueden detectar simultáneamente la localización e interacciones de proteínas, el co-IP sigue siendo una técnica apropiada y asequible para estudiar interacciones entre Proteínas endógenas.

El método paso a paso descrito en este manuscrito facilitará el estudio de la localización de proteínas y los IBP y señalará las trampas a evitar al estudiar IPP endógenos en las glándulas mamarias. La metodología comienza con la presentación de los diferentes procedimientos de conservación de los tejidos necesarios para cada técnica. La parte 1 presenta cómo estudiar la co-localización de las proteínas en tres etapas: i) el corte de las glándulas mamarias, ii) el etiquetado doble o triple de diferentes proteínas mediante la técnica del co-IF, y iii)Localización de proteínas. La Parte 2 muestra cómo precipitar una proteína endógena e identificar sus proteínas que interactúan en tres etapas: i) preparación del lisado, ii) inmunoprecipitación indirecta de la proteína, y iii) identificación del asociado de unión por SDS-PAGE y Western blot. Cada paso de este protocolo se optimiza para tejidos de glándula mamaria de roedor y genera resultados de alta calidad, específicos y reproducibles. Este protocolo también puede utilizarse como punto de partida para estudios PPI en otros tejidos o líneas celulares.

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Protocol

Todos los protocolos animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Universitario de Cuidado de Animales (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canadá).

1. Identificación de la co-localización de proteínas

  1. Del tejido a las diapositivas microscópicas
    NOTA: Los tejidos y secciones deben ser manipulados en hielo seco.
    1. Excise las glándulas mamarias de un animal (para una descripción completa de este procedimiento, consulte Plante et al. ) 14 .
    2. Incrusta el tejido escindido en medio de congelación / montaje sobre hielo seco. Añadir suficiente medio para cubrir la glándula. Cuando el medio se solidifica, transfiera los tejidos a un congelador a -80 ° C para uso posterior 9 .
    3. Usando un cryomicrotome establecido a ≤ -35 ​​° C, corte los tejidos en secciones de 7-10 μm de espesor y colóquelos en portaobjetos de microscopio.
      NOTA: Cuando sea posible, coloque dos secciones en cada diapositiva; La sección izquierda se utilizará comoUn control negativo para verificar la especificidad de los anticuerpos y la autofluorescencia del tejido, mientras que el lado derecho se marcará con los anticuerpos.
    4. Mantenga las secciones a -80 ° C para su uso posterior.
  2. Tinción con Co-IF
    1. Recuperar los portaobjetos microscópicos del congelador y fijar inmediatamente las secciones sumergiéndolas en formaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
    2. Luego sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a RT. Deje las diapositivas en PBS a RT hasta continuar con el paso siguiente.
    3. Circule cada sección de la diapositiva usando una barrera hidrófoba disponible comercialmente o un lápiz de laboratorio repelente al agua (vea la Tabla de Materiales ). Tenga cuidado de no tocar el tejido. Inmediatamente agregar gotas de PBS al tejido y colocar la diapositiva en una cámara de histología húmeda para el resto del procedimiento.
      NOTA: Las secciones de tejido deben permanecer hidratadas. AlternativaUtilice una caja con una tapa y coloque toallas de papel mojadas en la parte inferior.
    4. Bloquear cada sección de tejido con 100-200 μl de albúmina de suero bovino al 3% (BSA) - solución salina tamponada con Tris (TBS) -0,1% de polisorbato 20 (véase la Tabla de Materiales ) durante 30 minutos a TA. Mientras las muestras están bloqueando, preparar las soluciones de anticuerpos primario y secundario mediante la dilución de los anticuerpos en TBS-0,1% de polisorbato 20.
      NOTA: La concentración requerida para el anticuerpo es proporcionada por el fabricante; Véase la Tabla de Materiales y las Figuras 1 y 2 para ejemplos, así como Dianati et al. 9 . Aunque no es necesario trabajar en la oscuridad cuando se usa la mayoría de los anticuerpos conjugados con fluoróforo, evite exponer las soluciones de anticuerpos o tejidos teñidos a luz intensa y brillante.
    5. Se retira la solución de bloqueo por aspiración e incuba las secciones en 100-200 μl del anticuerpo primario diluido durante 60 minutos a TA. AlternativelY, incubar con el anticuerpo primario durante la noche a 4ºC.
    6. Eliminar la solución de anticuerpo primario por aspiración y lavar las secciones con 250-500 μ l de TBS-0,1% de polisorbato 20 durante 5 min. Retire la solución de lavado por aspiración y repita el lavado dos veces.
    7. Se retira la solución de lavado por aspiración e incuba las secciones con 100-200 μl del anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado durante 60 minutos a TA.
    8. Eliminar la solución de anticuerpo secundario por aspiración y lavar las secciones con 250-500 μ l de TBS-0,1% de polisorbato 20 durante 5 min. Retire la solución de lavado y repita dos veces.
    9. Repita el paso 2.5-2.8 usando la combinación apropiada de anticuerpos primarios y secundarios para la proteína o proteínas posteriores de interés.
    10. Se retira la solución de lavado por aspiración y se realiza la tinción del núcleo incubando la sección con 100-200 μl de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de 1 mg / ml en TBS-polisorbato al 0,1% 20 durante 5 min aRT.
    11. Retire la solución DAPI por aspiración y monte las diapositivas con un medio de montaje soluble en agua y no fluorescente (consulte la Tabla de materiales ) y cubreobjetos. Continúe con una diapositiva a la vez.
      NOTA: La incubación de la mancha del núcleo durante más de 5 min no cambiará la intensidad de la tinción. Alternativamente, retire la solución de DAPI en todas las diapositivas e incube los tejidos en PBS mientras monta las diapositivas.
    12. Coloque los portaobjetos planos en un refrigerador de 4 ° C durante al menos 8 h. Proceda a la obtención de imágenes microscópicas de fluorescencia (ver Figuras 1 y 2 ).
  3. Imágenes microscópicas
    1. Visualizar los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo utilizando un microscopio confocal equipado con los diversos láseres necesarios para excitar los fluoróforos en sus longitudes de onda específicas.
      Nota: Para poder visualizar conductos y alvéolos, se sugiere un objetivo de 40X con una apertura numérica de 0.95. Un ejemploE de los ajustes específicos se proporciona en la Figura 1 .
    2. Verificar la localización de cada proteína individualmente escaneando la imagen una longitud de onda en ese momento.
      Nota: En esta etapa, es importante analizar críticamente la localización de las proteínas de unión. Para poder formar nexos de unión, estas proteínas deben estar localizadas en la membrana plasmática.
    3. Determinar la co-localización de proteínas mediante la fusión de las imágenes escaneadas con los láseres en las diferentes longitudes de onda.
      Nota: La co-localización de las proteínas se puede visualizar mediante el cambio de color resultante de la emisión de dos o más fluoróforos en el mismo lugar y puede medirse utilizando el software apropiado ( Figuras 1 y 2 ).

2. El estudio de los IPP

NOTA: Las glándulas mamarias abdominales deben usarse para estudiar los IPP, ya que las glándulas torácicas están en estrecha asociación con el pectoralmúsculos. Excise las glándulas mamarias (para una descripción completa de este procedimiento, véase Plante et al .) 14 y mantenerlos a -80 ° C para su uso posterior.

  1. Preparación del lisado
    1. Coloque papel de pesaje y tubos de microcentrífuga de 2 mL en hielo seco para precalentarlos antes de proceder con los siguientes pasos.
    2. Tome el tejido de la glándula mamaria desde -80 ° C y mantenerlos en hielo seco.
    3. Pesar los tejidos en los papeles de pesaje pre-enfriados y luego transferir el tejido a tubos de microcentrífuga de 2 ml (mango en hielo seco). Utilizar entre 50 y 100 mg de tejido por muestra. Mantenga el tejido en hielo seco hasta el paso 2.1.5.
    4. Preparar la cantidad requerida de tampón de lisis de detergente triple suplementado con NaF, NaVO 3 y inhibidor de proteasa / fosfatasa, como se indica en la Tabla de Materiales , usando las siguientes fórmulas. Ratones: tampón requerido (μL) = peso de tejido de ratón (mg) x 3; Rata: requeridoTampón (μL) = peso del tejido de rata (mg) x 5.
    5. Añadir la cantidad necesaria de tampón de lisis enfriado con hielo (calculado en el paso 2.1.4) al tubo de 2 ml que contiene el tejido.
      NOTA: En los pasos 2.1.5-2.1.6, proceda con un solo tubo a la vez.
    6. Homogeneizar el tejido durante 30-40 s utilizando homogeneización continua en un molino de tejidos; Siempre mantener el tubo en el hielo. Ajuste el homogeneizador de tejidos a velocidad media y mueva suavemente la amoladora hacia arriba y hacia abajo dentro del tubo.
    7. Repita los pasos 1.6 y 1.7 con los otros tubos.
    8. Incubar los lisados ​​en hielo durante 10-30 min.
    9. Centrifugar los tubos a 170 xg durante 10 min a 4 ° C.
    10. Mientras tanto, identifique 6-10 tubos de microcentrífuga (0.6 mL) para cada muestra y manténgalos en hielo.
    11. Una vez realizada la centrifugación, revise los tubos. Asegúrese de que contienen una capa superior de lípidos claros, amarillos a rosados ​​(dependiendo de la etapa de desarrollo) y un gránulo.
    12. Crear un agujero en la capa de lípidosUtilizando una punta de pipeta de 200 μl para acceder a la fase líquida. Cambiar la punta y recoger el lisado sin alterar el gránulo ni aspirar la capa lipídica. Alícuota del lisado en tubos previamente marcados sobre hielo (paso 2.1.11) y almacénelos a -80 ° C.
    13. Utilice una alícuota para cuantificar la concentración de proteína usando un kit comercial apropiado disponible (véase la Tabla de Materiales ).
  2. Inmunoprecipitación indirecta
    1. En hielo, descongelar dos alícuotas de los lisados ​​totales de glándula mamaria preparados previamente.
      NOTA: Se utilizará una alícuota para la IP de la proteína diana, mientras que la otra servirá como control negativo.
    2. Recoger 500-1.000 μ g del lisado y diluir en PBS para llegar a un volumen final de 200 μ l en cada 1,5 ml de tubo.
      NOTA: La cantidad de lisado a utilizar depende de la abundancia de la proteína de interés y de la eficacia del anticuerpo (véase la Figura 3 para unaN ejemplo, así como la Tabla de Materiales ). Para optimizar para cada blanco, deben usarse diferentes cantidades de lisado ( es decir, 500, 750 y 1.000 mu g) y anticuerpo ( es decir, 5, 10 y 20 mu g). Proceda con los siguientes pasos (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Añadir el anticuerpo contra el antígeno de interés para el primer tubo de lisado y mantenerlo en hielo.
      NOTA: La cantidad requerida suele ser sugerida en la hoja de instrucciones proporcionada por cada empresa (vea la Tabla de Materiales ).
    4. En el segundo tubo, preparar un control negativo mediante la adición de la misma concentración de isotipo IgG control que el anticuerpo utilizado en el paso 2.2.3.
    5. Incubar los tubos durante una noche a 4 ° C en un mezclador de rodillos de tubo a baja velocidad.
    6. Al día siguiente, añadir 50 μl de perlas magnéticas a nuevos tubos de 1,5 ml para el prelavado.
      1. Seleccione las perlas magnéticas de Proteína A o Proteína G basadas en la afinidad relativa con el anticuerpo. Es importante evitar el uso de cuentas agregadas; Mezcle suavemente la suspensión del talón hasta que se vuelva a suspender uniformemente antes de añadirlo a los tubos.
    7. Coloque los tubos que contienen las perlas en el soporte magnético y permita que las perlas migren al imán. Retire el tampón de almacenamiento de las perlas utilizando una pipeta de 200 μl.
    8. Lavar las perlas mediante la adición de 500 μ l de PBS-0,1% polisorbato 20 y vórtice los tubos vigorosamente durante 10 s.
    9. Coloque los tubos de nuevo en el soporte magnético y permitir que los granos de migrar al imán.
    10. Retire el exceso de tampón de lavado pipeteando con una pipeta de 200 μl.
    11. Añadir el complejo de reacción (lisado-anticuerpo) del paso 2.2.5 a las perlas e incubar durante 90 minutos a RT en el mezclador de rodillos.
    12. Coloque los tubos sobre el soporte magnético y permita que las perlas migren al imán. Utilizando una pipeta de 200 μl, aspirar y descartar el lisado y colocar los tubos sobre hielo.
    13. Lavar el cordónS añadiendo 500 μl de PBS, colocando los tubos en el soporte magnético y retirando el líquido usando una pipeta de 200 μl. Repita este paso de lavado. Durante los pasos de lavado, evitar vórtex y mantener las muestras en hielo.
    14. Lavar las perlas una vez con PBS-0,1% de polisorbato 20 sin agitar en vórtice y descartar el último tampón de lavado usando una punta de pipeta de 200 mu l.
    15. Para eluir, añadir 20 μL de glicina ácida 0,2 M (pH = 2,5) a los tubos y agitarlos durante 7 min en el mezclador de rodillos.
    16. Centrifugar a alta velocidad durante unos segundos (centrifugado rápido) y recoger el sobrenadante en un tubo fresco helado.
    17. Repita los pasos 2.2.14 y 2.2.15 para cada tubo.
      NOTA: El volumen final será de 40 μl.
    18. Añadir 10 μl de tampón Laemmli 4x a la muestra eluida de 40 μl de la etapa 2.2.16.
      NOTA: El color se vuelve amarillo debido al pH ácido.
    19. Se añade inmediatamente Tris 1 M (pH = 8), una gota a la vez, a la muestra eluida del paso 2.2.18 hasta que su colorSe vuelve azul. Proceda a los tubos siguientes.
    20. Hervir las muestras de la etapa 2.2.18 a 70-90 ° C durante 10 min. Proceder inmediatamente a electroforesis en gel. Alternativamente, transfiera las muestras a un congelador a -80 ° C hasta su carga.
  3. Aplicación aguas abajo: electroforesis en gel seguido de Western blot
    1. Preparar separando y apilando geles de SDS-PAGE acrilamida (espesor de 1,5 mm) siguiendo los procedimientos estándar 15 .
      NOTA: La elección del gel (8-15% de acrilamida, gradiente: véase la Tabla de Materiales ) debe determinarse en base al tamaño molecular de la proteína a precipitar y de los posibles socios de unión a analizar. Estas proteínas deben resolverse entre sí para permitir una inmunodetección adecuada.
    2. Descongele las muestras de inmunoprecipitación (IP) (paso 2.2.20) sobre hielo.
    3. Preparar lisados ​​de proteínas de las mismas muestras (utilizadas para el procedimiento de IP anterior). Utilice 50 Mu g de lisado total y añadir tampón de muestra Laemmli 4X. Hervir las muestras a 70-90 ° C durante 5 min y colocar en hielo hasta la carga.
      NOTA: Estas muestras se cargarán junto a la muestra de IP eluida para demostrar la presencia de proteínas precipitadas en el lisado total.
    4. Cargar los lisados ​​preparados de la etapa 2.3.3 y las muestras precipitadas de la etapa 2.2.20 lado a lado en un gel de acrilamida y ejecutarlos en tampón de funcionamiento (10 x tampón de funcionamiento: 30,3 g de Tris, 144,1 g de glicina y 10 G de SDS en 1 L de agua destilada) a 100 V durante aproximadamente 95 min, o hasta que el borde de las proteínas migratorias alcance el fondo del gel.
    5. Transferir los geles a una membrana de nitrocelulosa o PVDF utilizando un protocolo estándar 9 , 15 .
    6. Bloquear la membrana durante 1 h en un balancín a baja velocidad en leche seca al 5% -TTBS (Tris 20 mM, NaCl 500 mM y polisorbato 20 al 0,05%).
    7. Identificar si la precipitación fue satisfactoriaExitosa.
      1. Examinar la membrana utilizando el primer anticuerpo contra la proteína precipitada, diluida en 5% de leche seca-TTBS a la concentración recomendada por el fabricante, durante la noche a 4 ° C sobre una plataforma de balanceo con agitación lenta.
        NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para recomendaciones.
      2. Al día siguiente, se lava la membrana 3 veces durante 5 min cada una con TTBS sobre una plataforma basculante con alta agitación.
      3. Incubar la membrana en el anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), diluido en TTBS, durante 1 h a RT en una plataforma oscilante con agitación lenta.
        NOTA: Alternativamente, puede usarse un anticuerpo secundario conjugado con un fluorocromo si está disponible un aparato apropiado para detectar la señal.
      4. Realizar 3 a 6 lavados, cada uno durante 5 min, con TTBS en una plataforma de balanceo con alta agitación. Analizar la señal del anticuerpo secundario incubando la membrana con un anticuerpo comercial(Véase la tabla de materiales ) y siga las instrucciones del fabricante. Detectar la señal utilizando un sistema de imagen de quimioluminiscencia (véase la tabla de materiales ).
        NOTA: Para un protocolo detallado sobre el análisis de transferencia de Western, véase la Referencia 16.
    8. Para identificar proteínas que interactúan, realizar los pasos 2.3.7.1-2.3.7.4 usando los anticuerpos apropiados en la misma mancha.
      NOTA: Si las proteínas están interactuando, los compañeros de unión serán co-inmunoprecipitados con la proteína diana y, por tanto, serán detectables por transferencia Western. El paso 2.3.8 puede repetirse con más anticuerpos para determinar si otras proteínas residen en el mismo complejo de proteínas, siempre y cuando los pesos moleculares de las proteínas difieran lo suficiente como para estar bien separados en el gel y la membrana.
    9. Para confirmar que los interlocutores identificados no son artefactos, se debe realizar una IP recíproca.
      NOTA: Esto se realiza repitiendoPasos 2.2.1-2.2.20 con el mismo lisado pero precipitando uno de los socios de unión identificados en el paso 3.8. Después, los pasos 3.1-3.8 se repiten usando el anticuerpo primario contra la primera proteína de interés.

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Representative Results

Para determinar si los componentes de GJ, AJ y TJ pueden interactuar juntos en la glándula mamaria, se realizaron primero ensayos de co-IF. Cx26, una proteína GJ, y β-Catenina, una proteína AJ, se probaron con anticuerpos específicos y se revelaron usando anticuerpos de ratón-647 (verde, pseudocolor) y cabra-568 (rojo) conjugados con fluoróforo, respectivamente ( Figura 1B y C ) . Los datos mostraron que co-localizar en la membrana celular de células epiteliales en los ratones glándula mamaria en la lactancia día 7 (L7), como se refleja en el color amarillo ( Figura 1D ). En segundo lugar, Claudin-7, una proteína TJ; E-cadherina, una proteína AJ; Y Connexin26 (Cx26), una proteína GJ, se probaron con sus anticuerpos específicos y se revelaron con anticuerpos de conejo-488 (verde), ratón-555 (rojo) y ratón-647 (coral azul, pseudocolor) conjugados con fluoróforo, respectivamente ( Figura 2B-D ). E-cadherina y co-localización de Claudin-7 esMientras que la co-localización de Cx26 con E-cadherina y Claudin-7 dio como resultado una tinción puntuada blanca en las glándulas mamarias de ratones el día 18 del embarazo (P18) ( Figura 2E ).

Para descubrir qué proteínas de unión se entremezclan y físicamente se atan juntos en la membrana celular, la co-inmunoprecipitación se realizó utilizando tejidos de glándula mamaria de ratones lactantes (L14). Los resultados mostraron que Cx43, un componente de GJ, interactúa con E-cadherina y Claudin-7, pero no con Claudin-3 ( Figura 3A y B ). Estos resultados fueron confirmados por el IP recíproco; Cuando E-cadherina fue immunoprecipitated, interactuó con Cx43 y Claudin-7 ( Figura 3C ].

Figura 1
Figura 1: β-Catenina y Cx26 co-localizar en la célula membRana en ratones glándulas mamarias. Las criosecciones de glándulas mamarias de ratones en la lactancia el día 7 (L7) se cortaron (7 μm) y se procesaron para tinción inmunofluorescente. ( A ) Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). ( B ) Cx26 (verde, pseudocolor) y ( C ) β-catenina (rojo) se muestran combinados con anticuerpos marcados con fluoróforo adecuados. ( D ) Una imagen fusionada. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal equipado con un detector espectral. DAPI se visualizó utilizando los siguientes ajustes: longitud de onda de emisión, 450,0 nm; Longitud de onda de excitación, 402,9 nm; Potencia láser, 1,2; Ganancia del detector, PMT HV 100; PMT offset, 0. Cx26 (647) se visualizó usando los siguientes ajustes: longitud de onda de emisión, 700,0 nm; Longitud de onda de excitación, 637,8 nm; Potencia del láser, 2.1; Ganancia del detector, PMT HV 110; PMT, 0. β-Catenina (568) se visualizó usando los siguientes ajustes: longitud de onda de emisión, 595,0 nm; Longitud de onda de excitación, 561,6 nm; láserPotencia, 2,1; Ganancia del detector, PMT HV 110; PMT offset, 0. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherina y Claudin-7 co-localizan en la membrana celular en glándulas mamarias de ratones. Las crioesecciones de las glándulas mamarias del día 18 del embarazo (P18) se cortaron (7 μm) y se procesaron para tinción inmunofluorescente usando ( B ) Claudin-7 (verde), ( C ) E-Cadherina (rojo) y ( D ) Cx26 Azul, pseudocolor), combinado con los anticuerpos marcados con fluoróforo apropiados. ( A ) Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal equipado con un detector espectral. DAPI se visualizó utilizando el fAjustes siguientes: longitud de onda de emisión, 450,0 nm; Longitud de onda de excitación, 402,9 nm; Potencia del láser, 5,4; Ganancia del detector, PMT HV 65; PMT offset, 0. Se visualizó Claudin-7 (488) usando los siguientes ajustes: longitud de onda de emisión, 525,0 nm; Longitud de onda de excitación, 489,1 nm; Potencia láser, 5.0; Ganancia del detector, PMT HV 12; PMT offset, 0. La E-cadherina (568) se visualizó usando los siguientes ajustes: longitud de onda de emisión, 595,0 nm; Longitud de onda de excitación, 561,6 nm; Potencia del láser, 13,5; Ganancia del detector, PMT HV 45; PMT offset, 0. Cx26 (647) se visualizó usando los siguientes ajustes: longitud de onda de emisión, 700,0; Longitud de onda de excitación, 637,8; Potencia láser, 5.0; Ganancia del detector, PMT HV 55; PMT offset, 0. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Cx43, E-cadherina y Claudin-7, pero no Claudin-3, están implicados en un complejo de proteínas. Se inmunoprecipitaron Cx43 ( A y B ) y E-Cadherina ( C ) usando 500 mg de lisados ​​totales de glándulas mamarias de ratones durante la lactancia. Los IP y los lisados ​​se cargaron en geles y se transfirieron sobre membranas de PVDF. Como Claudin-7 y Claudin-3 tienen el mismo peso molecular, no pudieron analizarse en la misma membrana. De este modo, se realizaron dos IP paralelos con el mismo lisado para Cx43, cargado sobre dos geles y transferido (membranas A y B). La membrana A se probó primero con Cx43 para confirmar la eficacia de la IP (panel superior). A continuación, la membrana se probó secuencialmente con E-cadherina y Claudin-7. Western blot análisis mostró que las dos proteínas interactúan con Cx43. La membrana B se probó primero con Cx43 para confirmar la eficacia de la IP (panel superior) y después se probó con Claudin-3. El análisis de transferencia de Western mostró que Claudin-3 dId no IP con Cx43, lo que demuestra que las dos proteínas no interactúan. La membrana C se probó primero con E-cadherina para confirmar la eficacia de la IP (panel superior). A continuación, la membrana se probó secuencialmente con Cx43 y Claudin-7. Western blot análisis confirmó las interacciones entre las proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las interacciones célula-célula a través de las uniones son necesarias para el correcto funcionamiento y desarrollo de muchos órganos, como la glándula mamaria. Los estudios han demostrado que las proteínas de unión pueden regular la función y la estabilidad de unos a otros y activar la transducción de señales al atarse mutuamente en la membrana celular [ 10] . Los protocolos presentados en el actual manuscrito han proporcionado interesantes descubrimientos sobre la proteína de unión expresión diferencial, la localización y la interacción durante el desarrollo normal de glándulas murinas [ 9] . Dado que la localización de proteínas de unión es fundamental para la función de las proteínas, y debido a que se sabe que interactúan con proteínas de andamios y numerosas quinasas 3 , co-IF y co-IP son técnicas eficaces en el campo de las interacciones célula-célula. No sólo son estos métodos esenciales para iluminar la necesidad de nexos de unión en el desarrollo de la glándula mamaria y su disRegulación en el cáncer de mama, pero también pueden ser utilizados en otros tejidos y en experimentos utilizando líneas celulares.

La glándula mamaria se compone de dos compartimentos principales: el estroma y el epitelio 4 . El epitelio adulto se compone de dos capas de células. En este enfoque, la proximidad de los posibles socios de unión se determinó mediante la técnica de co-IF, y sus interacciones físicas se confirmaron utilizando co-IP. Co-IF ha sido utilizado con éxito por otros para demostrar la co-localización de proteínas dentro de un mismo tejido, estructura, célula o compartimiento intracelular [ 17 , 18] . La principal ventaja de esta técnica es la información visual que aporta sobre la localización celular o subcelular de cada proteína dentro de los diferentes tipos celulares que componen el tejido. Aunque esta técnica es bastante simple, algunas recomendaciones deben ser seguidas. Por ejemplo, para evitar daños en los tejidos,Siempre agregue las soluciones una gota a la vez usando una pipeta de 200 μl o una pipeta de transferencia. Esto permitirá la inmersión de la superficie del tejido sin dañar los tejidos. De forma similar, retire las soluciones usando una pipeta Pasteur colocada al lado de los tejidos, inclinando suavemente el portaobjetos. Además, para los anticuerpos cuya solución de almacenamiento contiene glicerol, se requiere una cuidadosa succión de los tampones de lavado para reducir el fondo. Además, la presencia de proteínas de la leche, como las caseínas, durante la lactancia puede interferir con los anticuerpos atrapándolos, dando como resultado falsos positivos. Por lo tanto, se requiere un análisis crítico de la imagen resultante, específicamente en esta etapa.

Esta técnica co-IF también tiene ciertas limitaciones o escollos. En primer lugar, requiere anticuerpos específicos. Como se mencionó anteriormente (paso 1.1), se recomienda usar una sección ( es decir, la del lado derecho) en cada diapositiva para la tinción siguiendo los pasos descritos anteriormente, agregando laPrimarios y secundarios secuencialmente. Para la sección restante ( es decir, la del lado izquierdo), siga el mismo procedimiento, utilizando TBS-polisorbato 20 0,1% en lugar de las soluciones de anticuerpos primarios. Aunque también es posible, y aún mejor, verificar la unión específica del anticuerpo usando competencia de péptidos, los péptidos usados ​​para generar anticuerpos comerciales no siempre están disponibles. Por lo tanto, es importante verificar la especificidad de la unión usando controles positivos y negativos ( es decir, tejidos o células conocidos para expresar o no la proteína de interés). Además, los sitios de fijación de antígenos pueden ser inaccesibles, especialmente para tejidos fijados con formalina, dando como resultado la ausencia de una señal específica. Por lo tanto, puede requerirse un procedimiento de recuperación de antígeno para algunos tejidos. También se puede realizar una incubación corta con detergente antes de la recuperación del antígeno para permeabilizar la membrana celular. En segundo lugar, para la multiplexación, los anticuerpos deben ser criados en diferentes animales.Por ejemplo, si se utilizó anti-conejo en el paso 1.2.6, se podría seleccionar anti-ratón en el paso 1.2.10, pero no otro anticuerpo elevado en conejo. Dado que la mayoría de los anticuerpos comerciales son criados en conejos, ratones o cabras, a veces es difícil, o incluso imposible, dirigir dos proteínas al mismo tiempo debido a la falta de anticuerpos apropiados. Para superar estas limitaciones, se pueden comprar anticuerpos pre-etiquetados comercialmente disponibles o marcar anticuerpos primarios con fluoróforos utilizando kits comercialmente disponibles. En tercer lugar, otra deficiencia está relacionada con la excitación y la emisión de los diferentes fluoróforos. Para evitar la superposición de las señales de dos anticuerpos diferentes, el espectro de emisión de excitación de cada fluoróforo debe separarse. Así, el número de blancos que se pueden analizar de una vez variará según la configuración del microscopio disponible. Por último, la calidad del análisis depende en gran medida del microscopio utilizado. Los datos más detallados ySe puede obtener utilizando un microscopio confocal en comparación con un microscopio epifluorescente. El uso de la microscopía super-resolución puede revelar co-localización de la proteína en aún más detalle [ 19] .

Aunque co-IF aporta importantes ideas sobre la proximidad de potenciales socios vinculantes, debe ser complementado por otros métodos para identificar las interacciones físicas entre las proteínas. Entre los métodos disponibles, el co-IP es probablemente uno de los más asequibles para realizar, ya que el equipo y el material son fácilmente accesibles. Utilizando un anticuerpo unido a perlas magnéticas, se pueden aislar complejos de proteínas e identificar los componentes presentes en ese complejo usando un análisis de transferencia Western típico. De manera similar a la IFC conjunta, se deben seguir algunas recomendaciones para las mejores prácticas. Por ejemplo, se recomienda minimizar las muestras al homogeneizar los tejidos para reducir el tiempo entre los pasos 2.1.5 y 2.1.9. Mientras que una persona experimentada puede procesar hasta 10 muestras enIme, un principiante no debe manejar más de 4-6 muestras. De forma similar, el número de tubos debe estar limitado al realizar el protocolo IP por primera vez. Se recomienda comenzar con un control negativo ( es decir, IgG) y un control positivo ( es decir, un tejido que se sabe que contiene la proteína a ser inmunoprecipitada) solamente. El segundo ensayo debe dedicarse a la optimización (ver paso 2.2.2). Una vez que estos pasos dan resultados satisfactorios, las muestras a analizar pueden ser procesadas. Tenga en cuenta que siempre se debe incluir un control negativo en el procedimiento.

Esta técnica de co-IP también tiene peligros potenciales. En primer lugar, requiere homogeneizar los tejidos en condiciones que permitan la preservación de los enlaces entre las proteínas. Para las proteínas de membrana, tales como las proteínas de unión, también es crucial utilizar un tampón que preserve los enlaces entre las proteínas al tiempo que también permite su solubilidad. Segundo, similar al co-IF, requiere anticuerpos de alta afinidadTanto para la proteína diana como para los socios de unión. Además, debido a que las proteínas permanecen en su conformación terciaria y los complejos de proteínas no se disocian por homogeneización, si el anticuerpo reconoce parte de la proteína diana que está muy cerca del dominio de unión de un compañero o que está oculta dentro de la estructura nativa de la proteína , El IP puede verse comprometido. Por lo tanto, es esencial verificar siempre la eficacia de la IP utilizando Western blot antes de concluir la ausencia de un socio de unión. En tercer lugar, la co-IP puede generar resultados falsos positivos debido a que la proteína se une directamente a las perlas o se precipita durante el procedimiento sin formar parte del complejo. Para identificar estos artefactos, se requiere un control de IgG, así como un IP recíproco, como se describe en los métodos presentados. También es posible añadir un procedimiento de "pre-limpieza" entre los pasos 2.2.2 y 2.2.3 para evitar la unión inespecífica de proteínas a las perlas. Para ello, incubaE lisados ​​con 50 μg de perlas durante 1 ha 4 ◦ C en un mezclador de rodillos. Retire las perlas con el soporte magnético y continúe con el paso 2.2.3. En cuarto lugar, las cadenas pesada y ligera de IgG pueden ser del mismo tamaño que las proteínas de interés o la pareja de unión, con lo que se enmascara la señal. Una solución es disociar las cadenas de IgG con glicina, como se describe en este manuscrito. También es posible adquirir anticuerpos secundarios que sólo reconocen anticuerpos nativos y por lo tanto no se unen a las cadenas ligeras y pesadas desnaturalizadas cargadas en la membrana (véase la Tabla de Materiales ). A veces, los dos métodos pueden combinarse. En quinto lugar, el co-IP permite la identificación de un número limitado de socios de unión, en parte debido al número de anticuerpos que pueden ser sondados en la membrana. También requiere la pre-identificación de estos socios vinculantes, ya sea por co-IF o mediante una revisión de la literatura. Por último, el co-IP permite la identificación de las proteínas presDentro de un complejo, y no para la interacción directa entre dos proteínas.

Los resultados de la co-IP se pueden analizar de diferentes maneras. Es posible identificar únicamente a los interlocutores que interactúan volviendo a probar la misma membrana con diferentes anticuerpos, como se describe en este manuscrito. También es posible cuantificar esta interacción. Para ello, se cuantifica en primer lugar la cantidad de la proteína inmunoprecipitada sondando la membrana con un anticuerpo contra esta proteína. La intensidad de la señal se analiza utilizando un software de imagen, como se describe en este manuscrito. A continuación, se vuelve a probar la membrana con un anticuerpo contra la pareja de unión, y se cuantifica también la intensidad de la señal. Las interacciones entre las dos proteínas pueden expresarse entonces como una relación de la cantidad de la pareja de unión a la cantidad de la proteína inmunoprecipitada. Sin embargo, para permitir la comparación, las diferentes muestras deben ser procesadas al mismo tiempo y cargadas en la misma membrana. BiologPuede realizarse y analizarse análogamente, y se puede realizar un análisis estadístico.

En los últimos años, se desarrollaron otras técnicas para analizar los IBP. Por ejemplo, FRET permite la identificación de las proteínas que interactúan a través de la transferencia de energía de una etiqueta a otra, sólo cuando las proteínas están lo suficientemente cerca para interactuar [ 20] . Sin embargo, debido a que requiere que las proteínas se etiqueten, esta técnica no se puede utilizar en los tejidos. Del mismo modo, es posible identificar PPIs utilizando una proteína fusionada con una biotina ligasa bacteriana, BirA 21 . Esta ligasa añadirá biotina a proteínas que se encuentran en estrecha proximidad ( es decir, interactúan) con la proteína quimérica. Si bien este método es innovador e imparcial, no puede realizarse en los tejidos. Alternativamente, el PLA puede usarse en tejidos. Similar a co-IF, este ensayo se basa en la afinidad de anticuerpos. Para este ensayo, los anticuerpos secundarios se marcan con secuencias de ADN queT puede interactuar cuando están en estrecha proximidad ( es decir, sobre PPI) y formar una molécula circular de ADN [ 22] . Esta molécula de ADN circular se amplifica y detecta usando oligonucleótidos complementarios marcados fluorescentemente. Aunque este ensayo es elegante, requiere muchos pasos de validación y todavía se basa en la afinidad primaria de anticuerpos y algún conocimiento de potenciales parejas que interactúan. Finalmente, se ha desarrollado una alternativa imparcial al ensayo tradicional de PI para identificar los IPP. En los ensayos de inmunoprecipitación rápida-espectrometría de masas de proteína endógena (RIME), las muestras de IP se analizan por espectrometría de masas (IP / MS) 23 en lugar de análisis de transferencia Western. La principal ventaja de este método de alto rendimiento es que proporciona información masiva sobre todas las proteínas interactivas endógenas usando pocos materiales. Sin embargo, requiere el acceso a un instrumento de secuenciación de péptidos [ 23] .

EsEs importante mencionar que, después de varias pruebas preliminares, cada paso de este protocolo ha sido optimizado para la glándula mamaria. Sin embargo, el método sin duda puede ser utilizado para otros órganos después de algunas modificaciones. Para co-IF, la temperatura óptima para la sección de la glándula mamaria, el bloqueo adecuado y el lavado y las soluciones, y las concentraciones de anticuerpos apropiados fueron todos probados. Para el co-IP, se probaron diversos lisis y tampones de elución y métodos de extracciones y tuvieron un impacto importante en el éxito de IP. En suma, cada paso de este protocolo es importante para obtener resultados de alta calidad y reproducibles con el mínimo fondo posible y la mayor especificidad. Mientras que otros métodos están disponibles, co-IF seguido de co-IP siguen siendo válidos y métodos simples para evaluar PPIs. Estas dos técnicas se pueden utilizar tanto en tejidos como en líneas celulares y sólo requieren unos pocos pasos de validación y controles.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que declarar.

Acknowledgements

IP es financiado por una beca del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería del Canadá (NSERC # 418233-2012); Un Fondo de Investigación de Quebec-Santé (FRQS), un premio de carrera de la Fundación de Cáncer de Mama de Quebec y una subvención de Leader Founds de la Fundación Canadiense para la Innovación. ED recibió una beca de la Fundación universitaria Armand-Frappier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice strain and stage St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock) 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock) 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  See Comments β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061 Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

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