पेप्टाइड माइक्रोरायर्स के साथ हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता का विश्लेषण

Published 8/01/2017
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Biochemistry

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Summary

यह पांडुलिपि एंटीबॉडी की विशिष्टता प्रोफाइलिंग के लिए पेप्टाइड माइक्रोएरे तकनीक को लागू करने के तरीकों का वर्णन करती है जो कि हिस्टोन्स और उनके बाद के अनुवादकारी संशोधनों को पहचानते हैं।

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Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

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Abstract

हिस्टोन प्रोटीनों पर पोस्ट-ट्रांसलेशन संबंधी संशोधनों (पीटीएम) का व्यापक रूप से क्रोमेटिन संरचना और जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में उनकी भूमिकाओं के लिए अध्ययन किया गया है। हिस्टोन्स पीटीएम के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के बड़े पैमाने पर उत्पादन और वितरण ने इन अंकों के शोध में काफी मदद की है। जैसे हीस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी कई क्रोमैटिन जैव रसायन अनुप्रयोगों के लिए प्रमुख अभिकर्मकों हैं, सटीक डेटा व्याख्या और क्षेत्र में जारी प्रगति के लिए एंटीबॉडी विशिष्टता का कठोर विश्लेषण आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में हिस्टोन एंटीबॉडी की विशिष्टता को परिभाषित करने के लिए पेप्टाइड माइक्रोएरे के डिजाइन, निर्माण और उपयोग के लिए एकीकृत पाइपलाइन का वर्णन किया गया है। इस प्रक्रिया के डिजाइन और विश्लेषण पहलुओं को आसानी से माइक्रोएरे प्रिंट स्वरूपों के अनुकूलन को सुव्यवस्थित करने के लिए विकसित एक खुला स्रोत और इंटरैक्टिव सॉफ्टवेयर पैकेज, अररेनिनजा द्वारा सहायता प्रदान की गई है। इस पाइपलाइन का उपयोग बड़ी संख्या में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी को स्क्रीन करने के लिए किया गया हैएस, और इन प्रयोगों से उत्पन्न डेटा एक ऑनलाइन और विस्तारित हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता डेटाबेस के माध्यम से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है। हिस्टॉन्स से परे, यहां वर्णित सामान्य पद्धति PTM- विशिष्ट एंटीबॉडी के विश्लेषण के लिए मोटे तौर पर लागू की जा सकती है।

Introduction

जीनोमिक डीएनए सुंदर रूप से यूकेरियोटिक सेल नाभिक के अंदर हीस्टोन प्रोटीन के साथ क्रोमेटिन बनाने के लिए पैक किया गया है। क्रोमैटिन का दोहराव उप-भाग न्यूक्लिओसॉम है, जिसमें एचआईएए, एच 2 बी, एच 3, और एच 4 1 - एचिस्टाइन प्रोटीन के एक अक्टेमरिक कोर के चारों ओर लिपटा डीएनए के 147 आधार जोड़े शामिल हैं। क्रोमैटिन मोटे तौर पर ढीले से पैक यूक्ट्रोटिन में व्यवस्थित किया जाता है और कसकर पैक किया गया हैटेरोरामेटिन डोमेन। क्रोमैटिन कंपैक्शन की डिग्री, जो कि प्रोटीन मशीनरी मूलभूत डीएनए टेम्पलेटेड प्रक्रियाओं जैसे प्रतिकृति, प्रतिलेखन और मरम्मत करने के लिए अंतर्निहित डीएनए का उपयोग कर सकती है, उस सीमा को नियंत्रित करती है।

क्रोमेटिन के सन्दर्भ में जीनोम पहुंच के प्रमुख नियामक पीटीएम हैं जो हिस्टोन प्रोटीन के अनस्ट्रक्टेड पूंछ और कोर डोमेन पर हैं , 2 , 3 । हिस्टोन PTMs सीधे क्रोमेटिन 4 की संरचना को प्रभावित करके और अप्रत्यक्ष रूप से throug कार्य करते हैंज। रीडर प्रोटीन की भर्ती और उनके जुड़े मैक्रोमोलेकुलर परिसरों में क्रोमेटिन रीमॉडेलिंग, एंजाइमेटिक, और मचान गतिविधियों 5 है । पिछले दो दशकों में हिस्टोन पीटीएम समारोह के अध्ययन से यह संकेत मिलता है कि ये निशान सेल भाग्य, जीव-विकास, और रोग की दीक्षा / प्रगति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जन स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक टेक्नोलॉजी में अग्रिमों द्वारा इंधन, 80 से ज्यादा विशिष्ट हिस्टोन पीटीएम से 80 अलग-अलग हिस्टोन अवशेषों पर 6 की खोज की गई है। विशेष रूप से, ये संशोधनों अक्सर संयोजन में होती हैं, और "हिस्टोन कोड" परिकल्पना के अनुरूप होती हैं, कई अध्ययनों से पता चलता है कि पाठक प्रोटीन हिस्टोन PTMs 7 , 8 , 9 के विशिष्ट संयोजनों की पहचान के माध्यम से क्रोमैटिन के असतत क्षेत्रों को लक्षित कर रहे हैं। एक महत्वपूर्ण चुनौती आगे बढ़ने के लिए जीआर को कार्य सौंपेगीहिस्टोन पीटीएम की सूची के मुताबिक और यह पता लगाने के लिए कि हिस्टोन पीटीएम के विशिष्ट संयोजनों में क्रोमैटिन से जुड़े गतिशील कार्यों का परीक्षण किया गया है।

एंटीबॉडी हिस्टोन पीटीएम की पहचान के लिए लिंचपिन अभिकर्मक हैं। जैसे, 1,000 से अधिक हिस्टोइन पीटीएम-विशिष्ट एंटीबॉडी को क्रोमेटिन बायोकैमिस्ट्री अनुसंधान में उपयोग के लिए व्यावसायिक रूप से विकसित किया गया है। उच्च-थ्रुपुट डीएनए अनुक्रमण तकनीक के तेजी से विकास के साथ, इन अभिकर्मकों को अलग-अलग जांचकर्ताओं और बड़े पैमाने पर epigenomics "रोडमैप" पहल ( उदाहरण के लिए , एनकोड और BLUEPRINT) चिप-सेक में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जा रहा है (अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ मिलकर क्रोमैटिन प्रतिरक्षा ) पाइपलाइनों को हिस्टोन पीटीएम वितरण जीनोम चौड़ा 10 , 11 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्पेसियल मैप्स उत्पन्न करने के लिए। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी की विशिष्टता बेहद चर हो सकती है और ये अभिकर्मक अप्रत्यक्ष प्रदर्शन कर सकते हैं। ऑफ-टावर एपेटोप मान्यता जैसे आकर्षक गुण, पड़ोसी पीटीएम द्वारा मजबूत सकारात्मक और नकारात्मक प्रभाव, और किसी विशेष अवशेष ( उदा । मोनो, डाय- या त्रि-मेथिलिलीन) , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 इसलिए, हिस्टोन PTM- विशिष्ट एंटीबॉडी अभिकर्मकों के सख्त गुणवत्ता नियंत्रण इन मूल्यवान अभिकर्मकों से उत्पन्न डेटा को सही ढंग से व्याख्या करने के लिए आवश्यक है।

माइक्रोएरे तकनीक एक उच्च-थ्रूपुट, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और लघुरूप प्रारूप में हजारों मैक्रोमोलेकुलर इंटरैक्शन के साथ-साथ पूछताछ के लिए सक्षम बनाता है। इस कारण से, विभिन्न प्रकार के माइक्रोएरे प्लेटफार्म प्रोटीन-डीएनए 1 9 का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया है ,"20, प्रोटीन-प्रोटीन 21 , और प्रोटीन-पेप्टाइड इंटरैक्शन 22. दरअसल, हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरे क्रोमेटिन बायोकैमिस्ट्री अनुसंधान के लिए एक जानकारीपूर्ण खोज मंच के रूप में उभरा है, जिससे लेखकों, ईरासर्स और हिस्टोन पीटीएम 15 के पाठकों की उच्च-थ्रुपुटप्रोफ़ाइलिंग को सक्षम किया जा सकता है , 23 , 24 और हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता 17 , 25 के विश्लेषण के लिए। क्रोमैटिन और एपिजेनेटिक्स रिसर्च में अपने आवेदन से परे, हिस्टोन पेप्टाइड एरेज़ में प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोस और अन्य ऑटोइम्यूनस रोगों के लिए नैदानिक ​​/ क्रोमेटिन ऑटोटेनिबॉडीज 26 , 27 उत्पन्न होते हैं।

यहां, हम एक एकीकृत पाइपलाइन का वर्णन करते हैं जो हमने डिजाइनिंग, निर्माण, और क्यू के लिए विकसित किया हैएंटीबॉडी के लिए विशिष्टता प्रोफाइल बनाने के लिए हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरी का शिकार करना जो कि हिस्टोन और उनके पीटीएम को पहचानते हैं। ऐरेनिनजा द्वारा पाइपलाइन की सुविधा है, एक खुला स्रोत, इंटरैक्टिव सॉफ्टवेयर एप्लीकेशन जिसे हमने हाल ही में विकसित किया है, जो माइक्रोएरे प्रयोगों के डिजाइन और विश्लेषण चरणों को एकीकृत करता है 28 । ArrayNinja Google Chrome में सबसे अच्छा काम करता है संक्षेप में, एक रोबोट सम्पर्क माइक्रोएरे प्रिंटर स्ट्रेप्टिविन-लेपित ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड्स पर परिभाषित पदों पर बायोटिन-संयुग्मित हिस्टोन पेप्टाइड्स के पुस्तकालय को जमा करने के लिए उपयोग किया जाता है। एंटेबॉडी-एपिटेप इंटरैक्शन ( चित्रा 1 ) से पूछताछ करने के लिए एरेज़ एक प्रतियोगी और समानांतर परख प्रारूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। पेप्टाइड पुस्तकालय में पीटीएम (अकेले लाइसिन एसिटिलेशन, लाइसिन / आर्गेनिन मेथिलैशन, और सेरीन / थ्रेऑनिन फॉस्फोरायलेशन) को सशक्त अद्वितीय सिंथेटिक पेप्टाइड्स होते हैं और प्रायोगिक डेटासेट्स से बड़े पैमाने पर प्रासंगिक संयोजनों में शामिल होते हैं। पेप्टाइड संश्लेषण और सत्यापन के लिए तरीके कहीं और 23 विस्तृत हैं हमारे मौजूदा हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी स्क्रीनिंग प्रयासों से उत्पन्न इस सरणी मंच से उत्पन्न डेटा को सार्वजनिक वेब संसाधन, हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता डेटाबेस (www.histoneantibodies.com) पर संग्रहीत किया जाता है। विशेष रूप से, हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरेज़, इस प्रोटोकॉल के विविधताओं के साथ गढ़े हुए हैं, इसका इस्तेमाल हिस्टोन पीटीएम रीडर डोमेन 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 और हाल ही में प्रोफाइल हिस्टोन के लिए किया गया है। PTM लेखक और रबड़ की गतिविधियों 24

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चित्रा 1 चित्रा 1: एक हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरे पर एंटीबॉडी स्क्रीनिंग के लिए कदमवाही प्रक्रिया की कार्टून चित्रण। बायोटिनिलेटेड हिस्टोन पेप्टाइड्स परिभाषित पोस्ट-ट्रांसलेशन संबंधी संशोधनों (लाल और नीले हलकों) को संरक्षित करते हैं जो स्ट्रैप्टिविंस-लेपित ग्लास पर बायोटिन-फ्लोरोसिसिन के साथ सह-मुद्रित होते हैं। सकारात्मक संपर्कों को लाल प्रतिदीप्ति के रूप में देखा जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Protocol

1. अर्रेनिन्जा स्थापित और चल रहा है

  1. Www.virtualbox.org से ओरेकल वर्चुअल बॉक्स को डाउनलोड और इंस्टॉल करें।
  2. Http://research.vai.org/Tools/arrayninja से ArrayNinja वर्चुअल मशीन (वीएम) को डाउनलोड और असम्प्स करें।
  3. वर्चुअल बॉक्स को खोलें और 'मशीन,' 'ऐड' पर क्लिक करके अररेनैनजा वीएम को जोड़ें और अररेनिना वीएम को सहेजे जाने वाले फ़ोल्डर से arrayninja.vbox चुनें।
  4. वर्चुअल बॉक्स के अंदर इसे चुनें और हरे रंग की 'शुरुआत' तीर पर क्लिक करके ऐरेनिनजा को प्रारंभ करें
  5. वर्चुअल बॉक्स एक नई विंडो खोल देगा और एक संदेश प्रदर्शित करेगा कि वेब ब्राउज़र को स्थानीय होस्ट पर नेविगेट करके वीएम को एक्सेस किया जा सकता है: 208060; नोट: ArrayNinja का कंटेनर संस्करण भी hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/ के माध्यम से उपलब्ध है

2. सरणी स्लाइड और स्रोत प्लेट लेआउट डिजाइनिंग

  1. ऐरेएनआईज इंटरफ़ेस पर 'प्लान ए स्लाइड लेआउट' शीर्षक के तहत, उपयोग किए जाने वाले माइक्रोएरे प्रिंटर से संबंधित लिंक पर क्लिक करें।
    नोट: ArrayNinja (तालिका देखने के दो आमतौर पर इस्तेमाल किया माइक्रोएरे प्रिंटर के रोबोट आंदोलन की नकल करने के लिए प्रोग्राम किया गया है1) अनुरोध पर अन्य सरणी के साथ संगतता को कॉन्फ़िगर किया जा सकता है।
  2. 'लोड प्लेट' संवाद बॉक्स के अंदर क्लिक करें, "खाली" टाइप करें, और 'दर्ज करें' पर क्लिक करें। ArrayNinja डिजाइन मॉड्यूल के स्क्रीनशॉट के लिए चित्र 2 देखें।
  3. स्थान व्यास 275 माइक्रोन को समायोजित करें और स्पेस स्पेसिंग को 375 माइक्रोन तक समायोजित करें। शेष सेटिंग्स समायोजित; अनुकूलित करने के लिए कैसे सुविधाओं माइक्रोएरे स्लाइड पर दिखाई देगा (y में प्लेट ब्लाकों / प्लेट पंक्ति, कुल प्लेट पंक्तियाँ, प्रतिकृति, सुविधाओं, सुपर सरणी, SuperA फ़ज चित्रा 2 देखें)।
    नोट: स्पॉट व्यास को माइक्रोएरे पिन के आकार से निर्धारित किया जाता है। चूंकि ये सेटिंग्स समायोजित की जाती हैं, कार्टून स्लाइड को वास्तविक समय में अपडेट किया जाएगा। इस कार्टून का उपयोग करके देखें कि प्रत्येक सेटिंग अंतिम स्लाइड लेआउट को कैसे संशोधित कर रही है।
  4. स्लाइड पर सुविधाओं के लेआउट को अंतिम रूप देने के बाद, प्रत्येक अनूठी विशेषताओं पर माउस और पॉप-अप संवाद बॉक्स में फीचर पहचानकर्ता दर्ज करें।
    नोट: फ़ीचर पहचानकर्ता संख्याओं, अक्षरों या संयोजनों से मिलकर बना सकते हैं यह केवल अनूठी विशेषताओं के लिए आवश्यक है, और प्रतिकृति चयनित होने पर एक डायलॉग बॉक्स दिखाई नहीं देगा।
  5. सभी अनूठी विशेषताओं को पहचानकर्ता को असाइन करने के बाद, 'आबाद करें' पर क्लिक करें। स्लाइड लेआउट के लिए एक नाम दर्ज करें और सहेजने के लिए 'अपनी प्लेट प्रिंट करें' पर क्लिक करें। एक नया पृष्ठ चयनित स्लाइड्स डिजाइन तैयार करने के लिए आवश्यक 384-अच्छी तरह के स्रोत प्लेटों की संख्या को प्रदर्शित करेगा और स्रोत प्लेट (ओं) में लोड होने वाले प्रत्येक फीचर के भौतिक स्थान को मानचित्रित करेगा।
    नोट: इस नाम को याद रखें, क्योंकि यह माइक्रोएरे डेटा का विश्लेषण करते समय इस डिज़ाइन को याद करने के लिए उपयोग किया जाएगा (अनुभाग 6.2 देखें)। 'अपनी प्लेट प्रिंट करें' पर क्लिक करके आरेनिनजा में लेआउट बचाया जाता है

चित्र 2
चित्रा 2: सरणी डिजाइन मॉड्यूल की एक स्क्रीन शॉट अर्रेनीजा डिजाइन मॉड्यूल बिंदीदार रेखा में दिखाया गया है। नियंत्रण कक्ष (शीर्ष) माइक्रोएरे प्रिंटर पर बदला जा सकता है सभी पैरामीटर दिखाता है चूंकि इन मापदंडों को समायोजित किया जाता है, वास्तविक समय में स्लाइड लेआउट (नीचे बाएं) अपडेट की कार्टून छवि। लेआउट सेट होने के बाद, उपयोगकर्ता व्यक्तिगत स्पॉट पर अद्वितीय फीचर पहचानकर्ता दर्ज करने के लिए माउस कर सकता है। ऐरेनिनजा इस उपयोगकर्ता इनपुट से एक विशिष्ट माइक्रोएरे स्लाइड लेआउट तैयार करने के लिए आवश्यक स्रोत प्लेट (निचले दाएं) में प्रत्येक सुविधा की स्थिति का एक नक्शा बनाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

3. माइक्रोरायरी बनाना

  1. स्रोत प्लेट की तैयारी
    1. 384 अच्छी तरह से स्रोत प्लेट (एस) बनाने के लिए धारा 2.5 में ऐरेनिनजा के साथ बनाए गए नक्शे का उपयोग करें।
      नोट: इस मंच पर पूछे जाने वाले पेप्टाइड्स के विस्तृत विवरण कहीं और मिल सकते हैंS = "xref"> 17
    2. 384 अच्छी तरह से स्रोत प्लेट (एस) के सही कुएं में प्रत्येक फीचर ( जैसे बायोटिनिलेटेड हिस्टोन पेप्टाइड) के 1 μL जमा करें।
      नोट: बायोटिनिलेटेड हिस्टोन पेप्टाइड्स को आम तौर पर 200-400 माइक्रोन स्टॉक समाधान से जमा किया जाता है, जो एक सरणी स्थान में स्ट्रेप्टिविन बाध्यकारी साइटों के पेप्टाइड के 10 से 25 गुना दाढ़ी के बराबर होता है। समीकरण का उपयोग करके यह गणना की जाती है:
      समीकरण
      जहां वी एक पिन द्वारा वितरित मात्रा है, [ पी ] इस सुविधा की एकाग्रता को मुद्रित किया जा रहा है, एन अवागैड्रो की संख्या है, और एस एक स्थान का सतह क्षेत्र है सी स्लाइड का कवरेज है, जो तीन इकाई (उपलब्ध स्ट्रेक्टिविन बाध्यकारी साइटों की औसत संख्या) से गुणा करके प्रति यूनिट क्षेत्र में स्ट्रेप्टिविडिन अणुओं की संख्या के रूप में व्यक्त की गई है। वी और सी संबंधित निर्माता द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। अन्य विशेषताओंजैमोलेक्यूल के आकार के आधार पर अलग-अलग सांद्रता की आवश्यकता होती है, जहां भीड़ एक चिंता का विषय हो सकती है। प्रत्येक नए प्रकार की सुविधा के लिए मुद्रण सांद्रता की एक सीमा इष्टतम छपाई एकाग्रता निर्धारित करने के लिए अनुभवपूर्वक परीक्षण किया जाना चाहिए।
    3. 1% गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए) के साथ पूरक 1x मुद्रण बफर के साथ प्रत्येक सुविधा को 10 गुना पतला। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 500 ग्राम पर सोर्स प्लेट (एस) को स्पिन करें।
      नोट: मुद्रण बफर में फ्लोरोसिसिन लेबल बायोटिन (5 माइक्रोग्राम / μL) को शामिल करने के लिए एक खोलने नियंत्रण के रूप में सिफारिश की जाती है और विश्लेषण के दौरान उचित सरणी संरेखण को सुविधाजनक बनाने के लिए दृश्य सहायता के रूप में ( चित्रा 4 देखें)।
  2. प्रिंटिंग प्रोटोकॉल ( चित्रा 3 ए - बी )
    1. अपशिष्ट संग्रह कंटेनर खाली करके और बाँझ डिस्टिल्ड वॉटर के साथ धोने के कंटेनर और आर्मीडिफायर कंटेनर को भरकर सरणी तैयार करें।
    2. पैरामीटर यू दर्ज करेंSed ऐरेएनिनजा (अनुभाग 2 और चित्रा 2 ) में स्लाइड को माइक्रोएरे प्रिंटर नियंत्रण कार्यक्रम में डिजाइन करने के लिए।
    3. माइक्रोएरे प्रिंटर नियंत्रण प्रोग्राम का उपयोग करना, एक विसर्जन के साथ धोने की प्रक्रिया 1 सेकंड धोने के लिए सेट करें प्रत्येक धोने के बाद 5 बार पिंस को डुबकी करने के लिए पोस्ट-वॉश सेटिंग सेट करें। नमी को 60% तक सेट करें
      नोट: इष्टतम धोने का विन्यास इस्तेमाल किए जाने वाले माइक्रोएरे प्रिंटर के आधार पर भिन्न हो सकता है। इष्टतम पोस्ट वॉश पिन डुबकी विन्यास माइक्रोएरे प्रिंटर के उपयोग के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
    4. सब्सट्रेट प्लैटेंस में फ़ंक्लाइलाइज्ड स्लाइड ( उदाहरण के लिए , स्ट्रेप्टिविन-लेपित गिलास) डालें और प्लैट एलेवेटर में सभी प्लैटेंस को रखें। प्लेट प्लेट धारक (प्लेटों) में सोर्स प्लेट डालें और स्रोत प्लेट एलेवेटर में रखें।
    5. 'प्रिंट' पर क्लिक करें सभी धोने और डुबकी सेटिंग्स सही हैं सुनिश्चित करने के लिए सुविधा बयान के कुछ दौर के लिए मुद्रण प्रक्रिया की निगरानी। जब प्रिंट रन पूर्ण हो जाता है, तो निकालेंसरणी से सब्सट्रेट प्लैटेंस
      नोट: जब बड़े प्रिंट रन एक दिन के भीतर अवरुद्ध करने के कदमों को पूरा करने पर रोक लगाते हैं, मुद्रित स्लाइड्स 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्मीडिफाइड चैम्बर में हो सकता है। प्लास्टिक की चादर से सील किए गए कार्डबोर्ड बॉक्स के अंदर पानी की एक छोटी बीकर के बगल में स्लाइड को सेते हैं।
    6. ब्लॉकिंग बफर के साथ कमरे के तापमान पर मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए स्लाइड करें।
    7. फॉस्फेट बफरर खारा (पीबीएस), पीएच 7.6 मिक्सिंग के साथ कमरे के तापमान पर स्लाइड्स को 2 एक्स 10 मिनट धो लें। कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए एक माइक्रोएरे स्लाइड अपकेंद्रित्र में कताई करके स्लाइड्स सूखें।
      नोट: एक साथ बड़ी संख्या में स्लाइड प्रसंस्करण के लिए, एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोस्कोप स्लाइड वॉशिंग चैम्बर का इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे 50 स्लाइड्स को समानांतर में धोया जा सकता है।
    8. मोम के साथ विभाजन के लिए डिज़ाइन किए गए स्लाइड्स के लिए, अनुभाग 4.1 पर जाएं। अन्य सभी डिजाइनों के लिए, प्रकाश और नमी से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड करें।
      नोट: मुद्रित बायोटिनिलाटेड हिस्टोन पेप्टाइड्सइस तरह से संग्रहीत होने पर कम से कम 6 महीने तक स्थिर होते हैं

4. विभाजन माइक्रोएरे स्लाइड

  1. हाइड्रोफोबिक वैक्स पेन ( चित्रा 3 सी )
    1. उन क्षेत्रों के आसपास मोम लागू करें जिनमें एक मोम पेन का उपयोग कर सुविधाओं को शामिल किया गया हो। 5 मिनट के लिए आगे बढ़ने से पहले 5 मिनट के लिए मोम हवा में सूखने दें।
      नोट: अवरुद्ध करने के बाद, आंखों के जरिए सरणी के धब्बे बहुत मुश्किल हो सकते हैं। ऐरेनिनजा से स्लाइड डिजाइन पैमाने पर मुद्रित किया जा सकता है और मोम लगाने के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. सिलिकॉन गैस्केट ( चित्रा 3 डी )
    1. ऐरे गैस्केट के पीछे की स्पष्ट फिल्म को छील कर दें और सूक्ष्म आरेख स्लाइड पर चिपकने वाला पक्ष रखें।
    2. अनुभाग 5 में जाने से पहले 5 सेकंड के लिए गैस्केट को पकड़ो
  3. वैक्स छाप ( चित्रा 3 ई )
    1. मोम द्वारा विभाजित होने के लिए डिज़ाइन किए गए स्लाइड्स के लिए, 10% बीएसए का उपयोग करके सादे ग्लास पर एक परीक्षण स्लाइड मुद्रित करें। सभी सुविधाओं को मोम-मोल्ड चेंबर के भीतर होगा यह सुनिश्चित करने के लिए मोम छाप मार्गदर्शिका या सरणी सेटिंग को अनुकूलित करने के लिए इस परीक्षण स्लाइड का उपयोग करें
    2. माइक्रोएरे मोम को 85 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें जब तक कि सभी मोम पूरी तरह से पिघल न हो जाए, लगभग 30 मिनट।
    3. नीचे की तरफ मुद्रित पक्ष के साथ स्लाइड सम्मिलित करें और स्लाइड को पूरी तरह से माइक्रोएरे छाप पर सही मार्गदर्शिका में डालें। स्लाइड की सतह के संपर्क में ढालना लाने के लिए लीवर को खींचें। 2 एस के लिए पकड़ो
      नोट: इष्टतम मोम सीमा मोटाई प्राप्त करने के लिए पकड़ का समय बदला जा सकता है।
    4. स्लाइड को तुरंत हटा दें और मोम सीमाओं का निरीक्षण करें ताकि सुनिश्चित हो सके कि सभी कुएं संलग्न हैं और सीमाएं इतनी मोटी नहीं हैं कि वे स्पॉट पर अतिक्रमण करें। नमी और प्रकाश से 4 डिग्री सेल्सियस से सुरक्षित रखें।
      नोट: पकड़ समय मोटा या पतली सीमाओं को प्राप्त करने के लिए बढ़ा या घटाया जा सकता है।

चित्रा 3: माइक्रोएरे निर्माण (ए) स्ट्रेप्टिविडिन-लेपित माइक्रोस्कोप पर हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरे का निर्माण एक संपर्क माइक्रोएरे प्रिंटर का उपयोग करते हुए स्लाइड करता है। (बी) पेप्टाइड विशेषताओं के 48 x 48 ग्रिड के 3 उपरिये के साथ गढ़े माइक्रोआरएरे। (सी) 3 हाइड्रोफोबिक मोम पेन के साथ उपनियम, (डी) एक सिलिकॉन चिपकने वाला 2 सबरायरे, और (ई) एक मोम छाप के साथ 48 उप-पुर्जों। दिखाए गए सभी माइक्रोएरे 25 x 75 मिमी माइक्रोस्कोप स्लाइड्स का उपयोग करके गढ़े हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

5. पेप्टाइड माइक्रोएरे के साथ एक हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी संकरित करना

  1. संकरण बफर (पीबीएस, पीएच 7.6, 5% बीएसए, 0.1% ट्विल -20) तैयार करें।
  2. संकरण बफर में स्लाइड समेकित करेंहाइब्रिडिजेशन पोत का उपयोग करना पूरी तरह से हाइब्रिडिजेशन बफर में पूरी स्लाइड को कवर करें और कम गति पर कक्षीय प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेवन करें।
  3. संकरण बफर में पतला हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी वाला समाधान तैयार करें।
    नोट: उदाहरण डेटा में, हिस्टोन एंटिबॉडी # 1 और एंटीबॉडी # 2 दोनों संकरणित बफर में 1: 1,000 पतला थे। Immunoblotting के लिए इस्तेमाल की तरह एक कमजोर पड़ने रेंज एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सिफारिश की है।
  4. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एंटीबॉडी समाधान के साथ सरणी सेते एंटीबॉडी समाधान को निकालें और 5 मिनट के लिए 3 बार सरसों को ठंडे पीबीएस, पीएच 7.6 के साथ धो लें।
  5. Hybridization बफर में फ्लोरोसेंट डाई-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 1: 5,000 - 1: 10,000 कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
  6. प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ सरणी सेते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान को निकालें और पीबीएस, पीएच 7.6 के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए माइक्रोएरे स्लाइड 3 बार धो लें। डुबोना50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में माइक्रोएरे 0.1x पीबीएस युक्त, पीएच 7.6 कमरे के तापमान पर अतिरिक्त नमक निकालने के लिए। कमरे के तापमान पर एक माइक्रोएरे स्लाइड अपकेंद्रित्र में स्लाइड सूखी।
  7. माइक्रोएरे स्कैनर निर्माता की सिफारिश की स्कैनिंग प्रोटोकॉल के बाद, 25 माइक्रोन रिजोल्यूशन या उच्चतर पर एक माइक्रोएरे स्कैनर के साथ स्लाइड स्कैन करें।
    नोट: यदि fluorescein-labeled बायोटिन ट्रेसर मौजूद है, तो हरा चैनल दोनों (पूर्व: 488 एनएम, एम: 50 9 एनएम) और चैनल जो फ्लोरोसेंट डाई-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी से मेल खाती है, आमतौर पर लाल (उदाहरण: 635 एनएम, एम : 677 एनएम) स्कैनिंग का लक्ष्य एकल चैनल .टीआईफ़ फाइल प्राप्त करना है जिसे एक .पीएनजी फ़ाइल में विलय किया जा सकता है (जैसा कि अनुभाग 6.1 में वर्णित है)।

6. ऐरेन एनिनजा का उपयोग कर माइक्रोएरे डेटा का विश्लेषण

  1. मर्ज किए गए माइक्रोएरे छवि तैयार करना
    नोट: इस खंड का लक्ष्य एक। Png इमेज फ़ाइल बनाना है जो दो सिंगल-चैनल .टीआईफ़ फ़ाइलों (अनुभाग 5 में प्राप्त) में विलय कर लेता है। इसएरेएनिनजा विश्लेषण मॉड्यूल के साथ संगत एकमात्र छवि प्रारूप है। निम्न निर्देश एक मर्ज किए गए छवि फ़ाइल को प्राप्त करने के एक संभावित तरीके से प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अन्य समाधान उपलब्ध हैं ( जैसे , फ्रीवेयर छविज)
    1. फ्रीवेयर इमेजमेजिक के साथ एक कंप्यूटर के एक बैश टर्मिनल में कमांड लाइन से, उस फ़ोल्डर को नेविगेट करें जिसमें एकल चैनल .टीआईफ़ फाइलें शामिल हैं और निम्न चरणों का प्रतिलिपि / पेस्ट करें, प्रत्येक चरण के बीच 'एंट' मारकर (6.1.4 - 6.1) .7)।
      नोट: बड़े अक्षरों में फ़ाइल नाम ( उदाहरण के लिए , RED_CHANNEL) को माइक्रोएरे स्लाइड चित्रों के फ़ाइल नाम से बदला जाना चाहिए
    2. यदि आवश्यक हो, तो पहले 'INPUT.tif -negate OUTPUT.tif' कन्वर्ट 'कमांड इन कन्वर्ट' का उपयोग करके चित्रों को पलटना। यह आवश्यक है यदि स्कैनर सफेद और पृष्ठभूमि में काले रंग में सिग्नल के साथ .tif फ़ाइलें सहेजता है।
      1. कनवर्ट करें -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0-चैनल जीबी -अनुलाइट सेट 0 -delete 0 out.png 2> error.file
      2. रूपाएर्ट-गहराई 16 नियंत्रण_CHANNEL.TIF -clone 0-चैनल आरबी -अनुलाइट सेट 0-डिलीट 0 outa.png 2> त्रुटि.फ़ाइल।
      3. कन्वर्ट-डीपेथ 16 कंट्रोल_CHANNEL.TIF -क्लोन 0-चैनल आरजी -अनुलाइट सेट 0-डिलीट 0 आउटबैंक 2> त्रुटि.फाइल
      4. कन्वर्ट आउट पेज आउटआ.png.png बीटा
        नोट: 'मर्ज किए गए' नाम की एक फ़ाइल को मूल फ़ोल्डर के रूप में मूल .tif फाइलों में सहेजा जाएगा।
  2. ArrayNinja का उपयोग कर डेटा को बढ़ाएं
    1. ऐरेनिनजा खोलें और उपयुक्त माइक्रोएरे प्रिंटर लिंक पर क्लिक करें "छवियों का पता लगाने के लिए जो ज्ञात स्रोत प्लेट हैं।" "लोड प्लेट" संवाद बॉक्स में सहेजे गए स्लाइड डिजाइन (चरण 2.5) का नाम टाइप करें और 'दर्ज करें' पर क्लिक करें। ArrayNinja विश्लेषण मॉड्यूल की स्क्रीनशॉट के लिए आकृति 4 देखें
    2. 'फाइल चुनें' पर क्लिक करें और नेविगेट करें और 'मर्ज किए गए।' फ़ाइल को खंड 6.1 में बनाया गया है। मर्ज किए गए इमेजई स्लाइड लेआउट के लिए ग्रिड के साथ-साथ लोड भी होगी।
    3. इसके विपरीत, चमक और मिडपॉइंट को समायोजित करने के लिए ArrayNinja कंट्रोल पैनल के तल पर स्लाइडर्स का उपयोग करें।
      नोट: इन समायोजन केवल विज़ुअलाइजेशन प्रयोजनों के लिए हैं और मात्रा का ठहराव पर कोई प्रभाव नहीं है।
    4. "रिज़ोल्यूशन" चुनें और स्कैन की गई छवि के रिजोल्यूशन से मेल खाती मान दर्ज करें। सरणी पर स्पॉट के साथ ग्रिड को संरेखण में स्थानांतरित करने के लिए "मार्जिन पक्ष" और "मार्जिन शीर्ष" का उपयोग करें। ग्रिड प्राप्त करने की आवश्यकता के अनुसार समायोजित करें जितनी संभव हो सके प्रत्येक स्थान पर बारीकी से गठबंधन।
    5. 'स्पॉट लीक' पर क्लिक करें और जब तक बटन मूल ग्रे रंग में लौटा न जाए, तब तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: ग्रिड मंडल को अलग-अलग स्थानों पर केन्द्रित करने के लिए कई बार दोहराया जा सकता है। सीक फ़ंक्शन संरेखण को ठीक-ठाक करने के लिए प्रत्येक स्थान की ओर ग्रिड को आराम देता है।
    6. प्रत्येक सुपर ऐरे पैनल व्यक्तिगत रूप से कार्य करने के लिए "1 सुपर" को "1" में परिवर्तित करें (यदि वांछित)। अगर 4 का उपयोग करनाएक्स 12 मोम छाप स्लाइड लेआउट ( चित्रा 3 ई ), 4 x 12 कुओं के किसी भी इच्छित संयोजन का विश्लेषण करने के लिए सुविधाओं को बंद करने के लिए "आईपिन" "जेपीन" और "उप-ए" नियंत्रण का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, एक दूसरे की प्रतिकृति के रूप में शीर्ष बायां और शीर्ष दायां कुओं का विश्लेषण करने के लिए, आईपिन में "1 4", "1 1" और जेपीएन में "1 4" और सबए में "1 4" दर्ज करें। एंटर दबाए'।
    7. उस सुविधा की पहचान को देखने के लिए व्यक्तिगत स्पॉट पर माउस को हॉवर रखें।
    8. अधिक ध्यान से सुविधाओं की समीक्षा करने के लिए 'टॉगल ज़ूम' पर क्लिक करें जब माउस एक स्थान पर है, तो 'आर' कुंजी दबाकर पृष्ठभूमि संदर्भ के स्थान को चुनें। संदर्भ स्थलों को नारंगी में उजागर किया जाएगा
      नोट: "टॉगल ज़ूम" मोड में, उस सुविधा की एक विस्तृत छवि जो माउस खत्म हो गई है, ऊपरी दाहिने हाथ कोने में प्रदर्शित की जाती है। ऐरेनिनजा में अतिरिक्त पृष्ठभूमि सुधार सुविधाओं के बारे में विस्तृत चर्चा 28 तारीख को हुई है।
    9. प्रभावित स्थलों पर माउस को मँडरा करते हुए 'ए' कुंजी दबाकर स्पॉट्स को टॉगल करें (व्यापक रूप से भिन्न स्थान की आकृति विज्ञान या मलबे जो सही मात्रा का ठहराव प्रभावित करती है) के साथ टॉगल करें निष्क्रिय स्पॉट सफेद हो जाएगा
    10. स्पॉट्स को मापने के लिए 'सबमिट करें' के बाद 'पॉप्युलेट' पर क्लिक करें।
      नोट: एक नया टैब उज्ज्वल हाजिर औसत के लिए सामान्यीकृत डेटा के बार ग्राफ़ को खोलने और प्रदर्शित करेगा। बार ग्राफ़ के नीचे एक तालिका में सामान्यीकृत और कच्चे डेटा मान दोनों होते हैं। इस तालिका को संग्रहित और आगे विश्लेषण के लिए एक स्प्रैडशीट में कॉपी किया जा सकता है।

चित्रा 4
चित्रा 4: सरणी विश्लेषण मॉड्यूल ArrayNinja विश्लेषण मॉड्यूल की एक स्क्रीन शॉट दिखाया गया है। नियंत्रण कक्ष (ऊपर बायां) सभी पैरामीटर दिखाता है, जिन्हें सरणी को देखने, धब्बे खोजने, और ग्रिड को संरेखित करने के लिए समायोजित किया जा सकता हैसरणी छवि किसी फीचर पर माउस को मंडराते हुए ज़ूम इन-इन दृश्य (ऊपर दाएं) दिखाता है और एक पॉपअप दिखाता है जिसमें उस सुविधा से संबंधित पहचान की जानकारी शामिल है (नीचे) पृष्ठभूमि सुधार के लिए चयनित संदर्भ स्पॉट नारंगी हैं। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से बाहर रखा जाने वाली विशेषताएं सफेद हैं ऐरेनिनजा में एक टेक्स्ट-आधारित खोज सुविधा है जो पीले रंग की मिलान विशेषताओं को दर्शाती है, जैसा कि एच 4 के 16 उदाहरण के लिए दिखाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी विशिष्टता के विश्लेषण के लिए पेप्टाइड माइक्रोएरे प्लेटफॉर्म को डिजाइन और तैयार करने के लिए किया गया है। सरणी 300 से अधिक अद्वितीय पेप्टाइड विशेषताओं (20 - 40 अवशेषों की लंबाई) की एक लाइब्रेरी को पूछता है जो कि कोर और वेरिएंट हिस्टोन प्रोटीन 38 पर पाए जाने वाले पीटीएम के कई संयोजनों का प्रतिनिधित्व करता है। यह पाइपलाइन कई व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैस्टन पीटीएम एंटीबॉडी के स्क्रीनिंग के लिए एक वर्कहार्स है, और हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता डेटाबेस (www.histoneantibodies.com) पर पूर्ण डेटासेट उपलब्ध है। 17

हमारी पाइपलाइन की रीढ़ है ArrayNinja, एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग है जिसे हमने हाल ही में विकसित किया है, जो माइक्रोएरे काम 28 की योजना और विश्लेषण चरणों को एकीकृत करता है। ArrayNinja विश्लेषण मॉड्यूल उपयोगकर्ताओं को जानकारी में बातचीत करने के लिए अनुमति देता हैअपनी कच्ची सरणी छवि फ़ाइल के साथ छिपकर तरीके मुद्रित सुविधा की पहचान स्वतः छवि के साथ एकीकृत हो जाती है, और इन पहचानों को एक स्थान पर माउस कर्सर पर मँडरा कर दिखाया जा सकता है। यह एकीकरण, ब्याज की सुविधाओं के लिए तेजी से खोज और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से सुविधाओं के बहिष्करण को सक्षम करता है। ऐरेनिनजा स्थानीय और गैर-स्थानीय पृष्ठभूमि शोर सुधार के साथ-साथ एक सुधार योजना के लिए विकल्प प्रदान करता है जो कि आकृति विज्ञान के स्थान पर पहुंचता है। आरेनिनजा की पूर्ण जानकारी और इसकी क्षमताओं को 28 में कहीं और पाया जा सकता है।

ऐरेनिनजा प्रत्येक पेप्टाइड सुविधा के लिए संकेत तीव्रता की गणना करता है और उन तीव्रताओं को सुविधा पहचान के आधार पर त्रुटि के साथ औसत में जोड़ता है। कच्चे और सामान्यीकृत संकेत औसत लौटाए जाते हैं, जहां सामान्यीकरण स्थिर प्रतिभाशाली विशेषता औसत से निर्धारित होता है प्रत्येक पेप्टाइड के लिए सिगनल तीव्रता का उपयोग रिश्तेदार आत्मीयता की तुलना करने के लिए किया जा सकता है माइक्रोएरे पर सुविधाओं के बीच एंटीबॉडी की यहां, हम इस पाइपलाइन के साथ प्रोटीन किए गए दो एंटीबॉडी के लिए प्रतिनिधि डेटासेट दिखाते हैं, ऐसे एपिटेप मान्यता गुणों को उजागर करते हैं, जिन्हें इन अभिकर्मकों ( चित्रा 5 ) से प्राप्त परिणामों को व्याख्या करते समय माना जाना चाहिए।

ऑफ-लक्ष्य मान्यता सभी एंटीबॉडी के लिए एक चिंता है, और संशोधित हिस्टोन अवशेषों के आसपास के एपिटोप्स में समानताएं यह हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी के लिए एक विशेष चुनौती बनाता है। दरअसल, हिस्टोन एच 3 (एच 3 के 9 4 एम 3) पर त्रि-मेथिलेटेड लाइसिन 9 को पहचानने के लिए उठाए गए एंटीबॉडी एच 3 के 18, एच 3 के 27 में त्रि-मेथिलेटेड पेप्टाइड्स बाँधते हैं, और हिस्टोन एच 4 (एच 4 के 20 मी 3) पर लाइसेन 20 या एच 3 के 9 एम 3 3 ( चित्रा 5 ए ) की तुलना में बेहतर है। H3K9 (ARKS) के आसपास के क्रम को एच 3 के 27 के साथ संरक्षित किया गया है, और हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी और क्रोमेटिन रेग्युलेटर के क्रॉस-रिएक्टिव हैं जो इन साइटों को बाध्य और संशोधित करते हैं कहीं औरSs = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 मिथाइल-लाइसिन एंटीबॉडी के लिए आम तौर पर एक अन्य मनाया बंद-लक्ष्य मान्यता संपत्ति मिथाइल आदेश को भेदभाव करने में असमर्थता है। यह H3K4me3 एंटीबॉडी से प्राप्त परिणामों से उदाहरण है, जो H3K4me2 और H3K4me1 पेप्टाइड्स ( चित्रा 5 बी ) के साथ क्रॉस-रिएक्ट करता है। मिथाइल ऑर्डर के बीच भेद करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि अध्ययनों से पता चला है कि एच 3 के 4me3, एच 3 के 4me2 और एच 3 के 4me1 अलग-अलग तरीकों 42 , 43 में जीनोम और संभावित समारोह में अलग-अलग वितरित किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, एच 3 के 4me3 सबसे अधिक सक्रिय रूप से लिखित जीन के ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट्स पर स्थित है, जबकि सक्रिय एन्हांसरों को सामान्यतः एच 3 के 4 आई 1 44 द्वारा चिह्नित किया गया है।

ऑफ-लक्ष्य मान्यता के अलावा, सकारात्मक और नकारात्मक प्रभावपड़ोसी पीटीएम द्वारा ई हिस्टोन एंटीबॉडीज की सामान्य रूप से मनाई गई संपत्ति है। चित्रा 5 ए में दिखाए गए H3K9me3 एंटीबॉडी पड़ोसी लाइसिन अवशेषों पर एसिटाइल समूह द्वारा सकारात्मक रूप से प्रभावित हैं। दरअसल, हाल ही में जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पता चलता है कि एसिटील समूह, विशेषकर एच 3 के 14 ए सी, अक्सर एच 3 के 9 003 38 के साथ सह होते हैं। चित्रा 5 बी में दिखाए गए H3K4me3 एंटीबॉडी को थ्रेऑनिन 6 (एच 3 टी 6 पी) पर पड़ोसी फास्फोरायलेशन द्वारा नकारात्मक प्रभाव पड़ा है। एच 3 टी 6 पी को रीडर प्रोटीन द्वारा एच 3 के 4 एम 3 3 की पहचान पर सकारात्मक और नकारात्मक प्रभाव पड़ता है, और यह विशिष्ट क्रोमैटाइन कारकों 15 , 45 की भर्ती को विनियमित करने के लिए एक गतिशील तंत्र के रूप में काम कर सकता है।

चित्रा 5
चित्रा 5: पेप्टाइड माइक्रोआरएरे पर एंटीबॉडी का विश्लेषण। पेप्टाइड माइक्रोएरेज़ पर ए (ए) एच 3 के 9 एम 3 (एंटीबॉडी # 1) और (बी ) एच 3 के 4 एम 3 (एंटीबॉडी # 2) एंटीबॉडी का विश्लेषण। हरे रंग की रेखाएं / बार केवल लक्षित लक्ष्य पीटीएम को आश्रित पेप्टाइड से संकेत मिलता है। ग्रे लाइनों / बार पेप्टाइड्स संकेत करते हैं जिनके संकेत तीव्रता हरे रंग की पंक्ति / बार से काफी अलग नहीं होती (पी> 0.05), एक पे-एपिडाई के सभी पेप्टाइड्स के मतलब सापेक्ष तीव्रता की औसत सापेक्ष तीव्रता की तुलना करते हुए गणना की जाती है। रेड और नीली लाइन / बार संकेत संकेत देते हैं जो क्रमशः हरे रंग की रेखा / बार से कम या बढ़ जाती है (पी <0.05)। ऑरेंज लाइन / बार ऑफ-टार्च पेप्टाइड्स दर्शाते हैं। एच 3 और एच 4 पुच्छों के एन-टर्मिनल क्षेत्रों में फैले पेप्टाइड्स पर डेटा (बाएं) के रूप में प्रदर्शित किया जाता है, जहां प्रत्येक लाइन की चौड़ाई उस पेप्टाइड सुविधा के लिए मापा रिश्तेदार तीव्रता से मेल खाती है, और (दाएं) बार ग्राफ़ रिश्तेदार सिग्नल की तीव्रता की औसत ± 6 व्यक्तिगत स्थान माप से एसईएम प्रदर्शित करनामाइक्रोएरे पर मेंट इस विश्लेषण में शामिल सभी पेप्टाइड 20 एचआई एमिनो एसिड 1 - 20 या 15 - 34 के समान लंबाई में 20 एमिनो एसिड हैं । इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

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Discussion

जैव चिकित्सा अनुसंधान अनुप्रयोगों में एंटीबॉडी विश्वसनीयता सर्वोच्च 46 , 47 है । यह क्रोमेटिन बायोकैमिस्ट्री में विशेष रूप से सच है, जो कि हिस्टोन पीटीएम के बहुतायत और वितरण को चिह्नित करने के लिए विकसित की गई बहुविध तकनीकों के लिए प्रमुख उपकरण के रूप में एंटीबॉडी की स्थिति को देखते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी विशिष्टता का विश्लेषण करने के लिए डिजाइन, निर्माण, और पेप्टाइड माइक्रोएरी के उपयोग के लिए एक अनुकूलित पाइपलाइन का विवरण देता है। इस पाइपलाइन का उपयोग बड़ी संख्या में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी को स्क्रीन करने के लिए किया गया है, और इन प्रयोगों से उत्पन्न डेटा ऑनलाइन और विस्तार करने वाले हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता डेटाबेस (www.histoneantibodies.com) 17 के माध्यम से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है।

हमारे और दूसरों के काम से स्पष्ट रूप से प्रतिकूल हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी व्यवहार के अक्सर उदाहरण जो व्याख्यात्मक को जटिल बना सकते हैंइन अभिकर्मकों 12 , 15 , 17 से उत्पन्न आंकड़ों का आयन। इसलिए एंटीबॉडी कंपनियों से अधिक कठोर और व्यापक गुणवत्ता नियंत्रण उपायों की गारंटी होती है। प्रयोगात्मक और एपीजिनेम कंसोर्टियम के नेताओं ( जैसे , एनकोड, ब्ल्यूप्रिंट) को उनके अध्ययन के लिए अभिकर्मक चुनते समय हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी के अपने स्वयं के मूल्यांकन में कठोरता दिखाना होगा। इसके अलावा, बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता को कम करने के प्रयास, एपिगेंनो मैपिंग प्लेटफार्मों में अत्यधिक मान्य संबंधों के अभिकर्मकों के उपयोग को मानकीकृत करते हैं, और वैकल्पिक अनुसंधान उपकरण विकसित करने के लिए इस शोध समस्या को हल करने के लिए सभी कार्रवाई योग्य आइटम हैं।

माइक्रोप्रोरेज में माइक्रोफ़्लैट-आधारित एसेज ( जैसे एलिसा) पर कई फायदे हैं जो कि उन्हें हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी विशिष्टता को चित्रित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी बनाते हैं। माइक्रोआरएरे हजारों व्यक्ति पेप्टाइड- के समानांतर और प्रतिस्पर्धी विश्लेषण को सक्षम करते हैं-न्यूनतम सामग्री की खपत के साथ एंटीबॉडी बातचीत वर्णित प्रोटोकॉल में, प्रत्येक पेप्टाइड सुविधा के 700 picomoles 100 माइक्रोएरे स्लाइड्स का निर्माण करने के लिए पर्याप्त है। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी विश्लेषण 1 माइक्रोग्राम से कम एंटीबॉडी का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है, और कस्टम सरणी स्वरूप कई एंटीबॉडीज और समानांतर में जांच के लिए विभिन्न एंटीबॉडी dilutions को सक्षम करते हैं।

माइक्रोएरे पर कस्टम फीचर लेआउट डिजाइन करना एक श्रमसाध्य कार्य हो सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक नए माइक्रोएरे डिजाइन के लिए एक नया विश्लेषण टेम्पलेट के निर्माण की आवश्यकता है। हमने माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी की पूर्ण उपयोगिता को महसूस करने के लिए इसे निषेधात्मक माना। इसने एरेनिनजा के विकास को प्रेरित किया, एक इंटरैक्टिव, ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन जो माइक्रोएरे प्रयोगों के डिजाइन और विश्लेषण पहलुओं को एकीकृत करता है 28 । अर्रेनीजा की डिजाइन मॉड्यूल उपयोगकर्ता को एक प्रयोग के लिए आवश्यक लेआउट फिट करने के लिए एक स्लाइड डिजाइन करने की अनुमति देता है। ऐरेनिनजा वर्कप्रत्येक प्रिंटर की रोबोट गति को मानचित्रित करता है और यह किसी दिए गए स्लाइड डिजाइन ( चित्रा 2 ) के लिए स्रोत प्लेट लेआउट में अनुवाद करता है। कस्टम सरणी स्वरूप बनाना अब एक त्वरित और नियमित अभ्यास है। ऐरेनिनजा की एक अन्य प्रमुख विशेषता माइक्रोएरे काम के डिजाइन और विश्लेषण चरणों के बीच संबंध है। डिजाइन मॉड्यूल से उपयोगकर्ता परिभाषित सेटिंग्स के साथ, अर्रेएनिजा स्कैन किए गए माइक्रोएरे छवि पर एक इंटरैक्टिव ग्रिड को ओवरले करता है, जिससे उपयोगकर्ता अपनी पहचान प्रकट करने या ब्याज की विशेषताओं ( चित्रा 4 ) के लिए खोज करने के लिए किसी भी सुविधा पर माउस को अनुमति देता है।

इस पाइप लाइन के कई महत्वपूर्ण कदम ध्यान देने योग्य हैं। सबसे पहले, प्रिंट लेआउट डिजाइन करते समय, डेटा संग्रह में महत्व प्राप्त करने के लिए पर्याप्त प्रतिकृति स्पॉट को शामिल करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, पिन-टू-पिन परिवर्तनशीलता के लिए खाते में, प्रत्येक फीचर को कम से कम दो अलग-अलग पिनों से जमा करना चाहिए। अंत में, शायद सबसे महत्वपूर्ण कदम भौतिक जनरेट हैस्रोत प्लेट का आयन इस प्रोटोकॉल में वर्णित उच्च घनत्व वाले माइक्रोएरेज़ के सफल उपयोग, प्रत्येक फीचर की पहचान को अंतिम स्थान पर उनके भौतिक स्थान पर डालने की क्षमता पर निर्भर करता है। यह मैपिंग कार्य तुच्छ नहीं है, लेकिन ऐरेनिनजा एक प्लेट नक्शा प्रदान करके इस चरण की सुविधा प्रदान करते हैं। स्रोत प्लेट बनाने के दौरान इस मैप के कोई भी विचलन विश्लेषण के दौरान गलत निष्कर्ष की ओर ले जाएगा।

एंटीबॉडी विशिष्टता के विश्लेषण के लिए माइक्रोएरी का उपयोग करने की सीमाओं पर विचार करना महत्वपूर्ण है। ऐरे पर कब्जा कर रहे ऑफ-टाईश हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी गुणों को समान संकरण की स्थिति ( जैसे , इम्यूनोबलॉट) 17 , 18 , के साथ प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में अनुवाद करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें सीमा प्रोटोकॉल का अनुवाद करने वाली एंटीबॉडी विशिष्टता की सरणी-आधारित प्रोफ़ाइलिंग सूचक है 14 , 17 लेकिन वाअधिक महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए आवंटित

इस पाइपलाइन के लिए भिन्नताएं पहले ही हिस्टोन पाठकों, लेखकों और ईराजर्स 23 , 24 के विश्लेषण के लिए वर्णित हैं। एपिजेनेटिक्स अनुसंधान से परे उपयोगिता के लिए इस मंच को संशोधित करने के लिए आसानी से ब्याज की किसी भी प्रिंट योग्य लायब्रेरी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह भी संभव है कि क्रोमैटिन बायोकैमिस्ट्री अनुसंधान के लिए माइक्रोएरे बनाने के लिए पेप्टाइड की तुलना में अधिक जटिल सामग्री का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न पीटीएम को प्रदर्शित करने वाले पुनः संयोजक न्युक्लिओसोम अब प्रयोगशाला सेटिंग 48 में नियमित रूप से तैयार किए जा रहे हैं और भौतिक-संबंधी क्रोमेटिन उपकुंड के संदर्भ में हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी की विशिष्टता की व्याख्या भविष्य के अध्ययन का एक रोमांचक क्षेत्र होगा।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला वैकल्पिक दृष्टिकोण SPOT सरणी तकनीक का उपयोग करता है, जहां सैकड़ों पेप्टाइड सीधे सेलु पर संश्लेषित होते हैंझिल्ली समर्थन खो देते हैं 49 झिल्ली तब ही माइक्रोएरे एप्लीकेशन 50 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्पॉट टेक्नोलॉजी लाइब्रेरी जटिलता और संश्लेषण की लागत से लाभप्रद है। हालांकि, SPOT विधि का उपयोग करके संश्लेषित पेप्टाइड्स की शुद्धता अलग-अलग होने की सूचना दी गई है, और ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण ( जैसे , एचपीएलसी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री) के लिए गुणवत्ता नियंत्रण और शुद्धि उपायों को नियमित रूप से 50 , 51 नहीं किया जाता है। इसके अतिरिक्त, नाइट्रॉसेल्यूलोज पर पेप्टाइड प्रस्तुति एक समान नहीं है और एपोटॉप को बचा सकता है। विशेष रूप से, दोनों प्रकार के हिस्टोन पेप्टाइड सरणी प्लेटफार्म उन उपयोगकर्ताओं के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जिनके पास पेप्टाइड्स को संश्लेषित करने और एरे को तैयार करने के लिए आवश्यक विशेष उपकरणों तक पहुंच नहीं है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

यह काम वैन एन्डेल रिसर्च इंस्टीट्यूट और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हैल्थ (सीए 181343) से रिसर्च अनुदान के हिस्से में एसबीआर से समर्थित था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839, (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311, (5762), 844-847 (2006).
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