Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Published 8/01/2017
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Biochemistry

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Summary

Este manuscrito describe métodos para aplicar la tecnología de microarrays de péptidos a la especificidad de perfiles de anticuerpos que reconocen las histonas y sus modificaciones post-traduccionales.

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Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

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Abstract

Las modificaciones postraduccionales (PTMs) en las proteínas histonas son ampliamente estudiadas por sus papeles en la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica. La producción en masa y la distribución de anticuerpos específicos de histonas PTMs ha facilitado enormemente la investigación sobre estas marcas. Como los anticuerpos histónicos PTM son reactivos clave para muchas aplicaciones de bioquímica de la cromatina, es necesario un análisis riguroso de la especificidad del anticuerpo para una interpretación precisa de los datos y un progreso continuo en el campo. Este protocolo describe una tubería integrada para el diseño, fabricación y uso de microarrays peptídicos para perfilar la especificidad de los anticuerpos histona. Los aspectos de diseño y análisis de este procedimiento son facilitados por ArrayNinja, un paquete de software interactivo y de código abierto que recientemente desarrollamos para simplificar la personalización de los formatos de impresión en microarrays. Este gasoducto se ha utilizado para examinar un gran número de anticonceptivos de histonas PTM comercialmente disponibles y ampliamente utilizadosS, y los datos generados a partir de estos experimentos están disponibles gratuitamente a través de una base de datos en línea y en expansión Histone Antibody Specificity. Más allá de las histonas, la metodología general aquí descrita puede aplicarse ampliamente al análisis de anticuerpos específicos de PTM.

Introduction

El ADN genómico se empaqueta elegantemente dentro del núcleo de la célula eucariota con proteínas histonas para formar cromatina. La subunidad de repetición de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pares de bases de ADN envueltas alrededor de un núcleo octameric de las proteínas histonas - H2A, H2B, H3 y H4 1 . La cromatina se organiza ampliamente en euchromatina libremente envasada y dominios de heterocromatina fuertemente envasados. El grado de compactación de la cromatina regula la medida en que las máquinas de proteínas pueden acceder al ADN subyacente para llevar a cabo procesos fundamentales basados ​​en el ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación.

Los reguladores clave de la accesibilidad del genoma en el contexto de la cromatina son PTMs en la cola no estructurada y los dominios centrales de las proteínas histonas 2 , 3 . Las PTM histonas funcionan directamente influyendo en la estructura de la cromatina 4 e indirectamenteH la contratación de proteínas lectoras y sus complejos macromoleculares asociados que tienen actividades de remodelación, enzimática y andamiaje de la cromatina 5 . Los estudios de la función PTM de las histonas durante las últimas dos décadas sugieren abrumadoramente que estas marcas juegan un papel clave en la regulación del destino celular, el desarrollo de organismos y la iniciación / progresión de la enfermedad. Impulsados ​​por los avances en espectrometría de masas basado en la tecnología proteómica, más de 20 único histone PTMs en más de 80 residuos distintos de histonas se han descubierto [ 6] . En particular, estas modificaciones a menudo se producen en combinaciones, y en consonancia con la hipótesis de "código de histonas", numerosos estudios sugieren que las proteínas lectoras son dirigidas a regiones discretas de cromatina a través del reconocimiento de combinaciones específicas de histonas PTMs 7 , 8 , 9 . Un desafío clave para avanzar será la asignación de funciones al grDebido a la lista de histonas PTMs y para determinar cómo específicas combinaciones de histonas PTMs orquestar las funciones dinámicas asociadas con la cromatina.

Los anticuerpos son los reactivos de la linterna para la detección de PTM histonas. Como tal, más de 1.000 histonas PTM anticuerpos específicos han sido comercialmente desarrollado para su uso en la investigación de la bioquímica de la cromatina. Con el rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación de ADN de alto rendimiento, estos reactivos están siendo utilizados ampliamente por investigadores individuales y iniciativas epigenómicas a gran escala ( por ejemplo , ENCODE y BLUEPRINT) en ChIP-seq (inmunoprecipitación de cromatina junto con secuenciación de próxima generación ) De tuberías para generar de alta resolución mapas espaciales de histonas PTM distribución de todo el genoma 10 , 11 . Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la especificidad de los anticuerpos PTM de las histonas puede ser altamente variable y que estos reactivos presentan Las propiedades avorables tales como el reconocimiento de epítopos fuera de objetivo, la fuerte influencia positiva y negativa por PTMs vecinas y la dificultad para discriminar la orden de modificación en un residuo particular ( por ejemplo , mono-, di- o trimetil-lisina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Por lo tanto, es necesario un riguroso control de calidad de los reactivos de anticuerpos específicos de histonas PTM para interpretar con precisión los datos generados con estos valiosos reactivos.

La tecnología de microarray permite la interrogación simultánea de miles de interacciones macromoleculares en un formato de alto rendimiento, reproducible y miniaturizado. Por esta razón, una variedad de plataformas de microarrays se han creado para analizar la proteína-ADN 19 ,20, la proteína-proteína 21 , y las interacciones proteína-péptido 22. De hecho, los microarrays de péptidos histona han surgido como una plataforma de descubrimiento informativo para la investigación de la bioquímica de la cromatina, permitiendo el perfilado de alto rendimiento de los escritores, borradores y lectores de histonas PTMs 15 , 23, 24, y también para el análisis de la especificidad del anticuerpo de histona 17, 25. más allá de su aplicación en la cromatina y la epigenética investigación, las matrices de péptidos de histona tienen utilidad potencial como una prueba de diagnóstico / pronóstico para el lupus eritematoso sistémico y otras enfermedades autoinmunes donde anti- Se generan autoanticuerpos de cromatina 26 , 27 .

Aquí, describimos una tubería integrada que hemos desarrollado para diseñar, fabricar yPara generar perfiles de especificidad para anticuerpos que reconocen las histonas y sus PTMs. El pipeline es facilitado por ArrayNinja, una aplicación de código abierto de software interactivo que recientemente desarrollamos, que integra las etapas de diseño y análisis de los experimentos con microarrays [ 28] . ArrayNinja funciona mejor en Google Chrome. En resumen, se utiliza una impresora de microarrays de contacto robótico para depositar una biblioteca de péptidos de histona conjugados con biotina en posiciones definidas en portaobjetos de microscopio de vidrio revestidos con estreptavidina. Las matrices se pueden utilizar entonces en un formato de ensayo competitivo y paralelo para interrogar las interacciones anticuerpo-epítopo ( Figura 1 ). La biblioteca de péptidos consiste en cientos de péptidos sintéticos únicos que albergan PTMs (acetilación de lisina, metilación de lisina / arginina y fosforilación serina / treonina) solos y en combinaciones relevantes derivadas en gran medida de conjuntos de datos proteómicos. Métodos de síntesis y validación de péptidos Se detallan en otra parte 23 . Los datos generados a partir de nuestros esfuerzos de detección de anticuerpos PTM de histonas en curso que utilizan esta plataforma de matriz se archivan en un recurso público de la web, la Base de datos de especificidad de anticuerpos de histonas (www.histoneantibodies.com). En particular, los microarrays de péptidos de histona fabricados con variaciones de este protocolo también se han utilizado ampliamente para caracterizar la actividad de los dominios de lectores de PTM de histonas 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 y más recientemente a histona de perfil Actividades de escritor y borrador de PTM 24 .

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Figura 1: Representación de dibujos animados del procedimiento escalonado para la detección de anticuerpos en un microarray de péptidos histona. Los péptidos de histona biotinilados que albergan modificaciones postraduccionales definidas (círculos rojos y azules) se co-imprimen con biotina-fluoresceína sobre vidrio revestido con estreptavidina. Las interacciones positivas se visualizan como fluorescencia roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. Instalación y ejecución de ArrayNinja

  1. Descargue e instale Oracle Virtual Box desde www.virtualbox.org.
  2. Descargue y descomprima la máquina virtual ArrayNinja (VM) de http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. Abra Virtual Box y agregue la VM ArrayNinja haciendo clic en 'Machine', 'Add' y seleccione arrayninja.vbox en la carpeta donde se guardó VM ArrayNinja.
  4. Inicie ArrayNinja seleccionándolo dentro de Virtual Box y haciendo clic en la flecha verde de inicio.
  5. Virtual Box abrirá una nueva ventana y mostrará un mensaje indicando que se puede acceder a la VM navegando el navegador web a localhost: 2080.60; NOTA: Una versión con contenedor de ArrayNinja también está disponible a través de hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. Diseño de la matriz de diapositivas y la disposición de la placa de origen

  1. En el encabezado "Planificar una presentación de diapositivas" en la interfaz ArrayNinja, haga clic en el vínculo que corresponde a la impresora de microarrays que se está utilizando.
    NOTA: ArrayNinja ha sido programado para imitar el movimiento robótico de dos impresoras de microarrays comúnmente usadas (ver Tabla1). La compatibilidad con los otros arrayers se puede configurar a petición.
  2. Haga clic en el cuadro de diálogo "Cargar placa", escriba "vacío" y haga clic en "introducir". Vea la Figura 2 para una captura de pantalla del módulo de diseño ArrayNinja.
  3. Ajuste el diámetro de la mancha a 275 μm y el espaciado de la mancha a 375 μm. Ajuste los ajustes restantes (Bloques de Placas / Línea de Placas, Líneas de Placas Totales, Replicas, Funciones en y, Super Arrays, SuperA fudge (vea la Figura 2 ) para personalizar cómo aparecerán las características en la diapositiva de microarrays.
    NOTA: El diámetro del punto se determina por el tamaño del pin del microarrays. A medida que se ajustan estos ajustes, la diapositiva de dibujos animados se actualizará en tiempo real. Utilice esta caricatura para ver cómo cada ajuste está modificando el diseño final de la diapositiva.
  4. Después de finalizar el diseño de las funciones de la diapositiva, pase el mouse sobre cada característica única e ingrese el identificador de función en el cuadro de diálogo emergente.
    NOTA: Los identificadores de función pueden consistir en números, letras o combinaciones. Esto solo es necesario para las características únicas, y un cuadro de diálogo no aparecerá cuando se seleccionan las repeticiones.
  5. Después de asignar un identificador a todas las características únicas, haga clic en 'rellenar'. Introduzca un nombre para el diseño de la diapositiva y haga clic en "imprimir el plato" para guardar. Se abrirá una nueva página que mostrará el número de placas fuente de 384 pocillos necesarias para fabricar el diseño de la diapositiva elegido y una tabla que correlacionará la ubicación física de cada característica que se va a cargar en la placa o placas fuente.
    NOTA: Recuerde este nombre, ya que se usará para recordar este diseño al analizar los datos de microarrays (ver sección 6.2). Al hacer clic en 'imprimir el plato' se guarda el diseño dentro de ArrayNinja.

Figura 2
Figura 2: Módulo de diseño de ArrayNinja. Una captura de pantalla del El módulo de diseño ArrayNinja se muestra en la línea de puntos. El panel de control (parte superior) muestra todos los parámetros que se pueden modificar en la impresora de microarrays. A medida que se ajustan estos parámetros, la imagen de dibujos animados del diseño de diapositivas (abajo a la izquierda) se actualiza en tiempo real. Una vez configurado el diseño, el usuario puede pasar el mouse sobre puntos individuales para ingresar identificadores de funciones únicas. ArrayNinja construye a partir de este usuario un mapa de la posición de cada característica en la placa fuente (s) (abajo a la derecha) necesaria para fabricar un diseño de diapositivas de microarrays especificado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Fabricación de microarrays

  1. Preparación de la placa fuente
    1. Utilice el mapa generado con ArrayNinja en la sección 2.5 para crear la (s) placa (s) fuente (es) de 384 pozos.
      NOTA: Las descripciones detalladas de los péptidos consultados en esta plataforma se pueden encontrar en otra parteS = "xref"> 17.
    2. Deposite 1 - 2 μl de cada característica ( p . Ej. , Péptido de histona biotinilado) en el pocillo correcto de la (s) placa (s) fuente de 384 pocillos.
      NOTA: Los péptidos de histona biotinilados se depositan típicamente de 200 a 400 μM de soluciones madre, lo que equivale a 10 a 25 veces el exceso molar de péptido a sitios de unión a estreptavidina en un único punto de matriz. Esto se calcula usando la ecuación:
      Ecuación
      Donde V es el volumen entregado por un pasador, [ P ] es la concentración de la entidad que se está imprimiendo, N A es el número de Avogadro y S es la superficie de un punto. C es la cobertura de la diapositiva, expresada como el número de moléculas de estreptavidina por unidad de área multiplicada por tres (el número medio de sitios de unión a estreptavidina disponibles). V y C se obtienen por los respectivos fabricantes. Otras características puedenRequieren diferentes concentraciones dependiendo del tamaño de la biomolécula donde el apiñamiento puede ser una preocupación. Una gama de concentraciones de impresión para cada nuevo tipo de característica debe ser probada empíricamente para determinar la concentración óptima de impresión.
    3. Diluir cada característica 10 veces con 1x tampón de impresión suplementado con 1% de albúmina de suero bovino (BSA). Girar la (s) placa (s) fuente a 500 xg durante 2 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Se recomienda la inclusión de la biotina marcada con fluoresceína (5 μg / μl) en el tampón de impresión como control de manchas y como ayuda visual para facilitar la alineación apropiada de la matriz durante el análisis (ver Figura 4 ).
  2. Protocolo de impresión ( Figura 3A - B ).
    1. Prepare el aparato vaciando el recipiente de recogida de residuos y llenando el recipiente de la solución de lavado y el recipiente del humidificador con agua destilada estéril.
    2. Introduzca los parámetros uSed para diseñar la diapositiva en ArrayNinja (sección 2 y Figura 2 ) en el programa de control de impresora de microarrays.
    3. Utilizando el programa de control de la impresora de microarrays, ajuste el procedimiento de lavado para un lavado de 1 s con una inmersión. Ajuste los ajustes posteriores al lavado para volver a sumergir los pines 5 veces después de cada lavado. Ajuste la humedad al 60%.
      NOTA: La configuración de lavado óptima puede variar dependiendo de la impresora de microarrays que se está utilizando. La configuración óptima de inmersión de pines después del lavado puede variar dependiendo de la impresora de microarrays que se está utilizando.
    4. Inserte diapositivas funcionalizadas ( p . Ej. , Vidrio revestido con estreptavidina) en las placas del sustrato y coloque todos los platos en el elevador del rodillo. Inserte la (s) placa (s) de fuente en el (los) soporte (s) de la placa y colóquela en el elevador de la placa de origen.
    5. Haga clic en "Imprimir". Supervise el proceso de impresión durante unas pocas rondas de deposición de características para asegurarse de que todos los ajustes de lavado y de inmersión son correctos. Cuando se haya completado la tirada,Las placas de sustrato del arrayer.
      NOTA: Cuando las tiradas grandes impiden la finalización de los pasos de bloqueo dentro de un día, las diapositivas impresas se pueden incubar en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. Incube los portaobjetos junto a un pequeño vaso de agua dentro de una caja de cartón sellada con una envoltura de plástico.
    6. Bloquear los portaobjetos con tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente con mezcla.
    7. Lavar los portaobjetos 2 x 10 min a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,6 con mezcla. Seque las diapositivas girando en una centrifugadora de microarrays durante 30 s a temperatura ambiente.
      NOTA: Para procesar un gran número de portaobjetos a la vez, se puede usar una cámara de lavado de diapositivas de microscopio de alto rendimiento, permitiendo que 50 diapositivas sean lavadas en paralelo.
    8. Para los portaobjetos diseñados para ser divididos con cera, proceda a la sección 4.1. Para todos los demás diseños, guarde los portaobjetos a 4 ° C protegidos de la luz y la humedad.
      NOTA: Los péptidos de histona biotinilados impresosSon estables durante al menos 6 meses cuando se almacenan de esta manera.

4. Partición de diapositivas de microarrays

  1. Pluma de cera hidrófoba ( Figura 3C )
    1. Aplique cera alrededor de las áreas que contienen características usando una pluma de cera. Deje que la cera se seque al aire durante 5 minutos antes de continuar con la sección 5.
      NOTA: Después del bloqueo, los puntos de matriz pueden ser muy difíciles de visualizar a simple vista. El diseño de la diapositiva de ArrayNinja se puede imprimir a escala y se utiliza como una guía para la aplicación de cera.
  2. Junta de silicona ( Figura 3D )
    1. Pelar la película transparente de la parte posterior de la junta del conjunto y colocar el lado adhesivo hacia abajo sobre la corredera de microarrays.
    2. Sostenga la junta en su lugar durante 5 s antes de proceder a la sección 5.
  3. Impresión de cera ( Figura 3E )
    1. Para diapositivas diseñadas para ser divididas por cera, imprima una diapositiva de prueba sobre vidrio liso usando BSA al 10%. Utilice esta diapositiva de prueba para optimizar las guías de imprimación de cera o los ajustes de matriz para asegurar que todas las características estarán dentro de las cámaras de molde de cera.
    2. Calentar la impresora de cera de microarray a 85 ° C hasta que toda la cera se funda completamente, aproximadamente 30 min.
    3. Inserte la diapositiva con el lado impreso hacia abajo y empuje la diapositiva hasta la guía derecha en la impresora de microarrays. Levante la palanca para poner el molde en contacto con la superficie de la corredera. Mantener durante 2 s.
      NOTA: El tiempo de retención puede ser alterado para lograr un espesor de borde de cera óptimo.
    4. Retire rápidamente la diapositiva e inspeccione visualmente los bordes de cera para asegurarse de que todos los pocillos están cerrados y que los bordes no son tan gruesos que invaden los puntos. Almacene los portaobjetos a 4 ° C protegidos de la humedad y la luz.
      NOTA: El tiempo de retención se puede aumentar o disminuir para obtener bordes más gruesos o más delgados.

"Figura Figura 3: Fabricación de microarrays. (A) Fabricación de microarrays de péptido de histona en portaobjetos de microscopio recubiertos con estreptavidina usando una impresora de microarrays de contacto. (B) Microarrays fabricados con 3 sub-redes de una cuadrícula 48 x 48 de características peptídicas. Separación de (C) 3 subarrays con una pluma de cera hidrofóbica, (D) 2 subarrays con un adhesivo de silicio, y (E) 48 subarrays con una impresión de cera. Todos los microarrays mostrados se fabrican usando diapositivas de microscopio de 25 x 75 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Hibridación de un anticuerpo histona PTM con un microarrays de péptidos

  1. Preparar el tampón de hibridación (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
  2. Equilibrar la diapositiva en tampón de hibridaciónUtilizando un recipiente de hibridación. Cubrir completamente la diapositiva entera en tampón de hibridación e incubar durante 30 min a 4 ° C en un agitador orbital a baja velocidad.
  3. Prepare una solución que contenga un anticuerpo PTM de histona diluido en un tampón de hibridación.
    NOTA: En los datos del ejemplo, el anticuerpo histona 1 y el anticuerpo n ◦ 2 se diluyeron 1: 1.000 en tampón de hibridación. Como punto de partida se recomienda un rango de dilución similar al utilizado para la inmunotransferencia.
  4. Incubar el conjunto con la solución de anticuerpo durante 1 h a 4 ° C. Eliminar la solución de anticuerpo y lavar el conjunto 3 veces durante 5 min a 4 ° C con PBS frío, pH 7,6.
  5. Preparar una dilución 1: 5.000 - 1: 10.000 de anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente en tampón de hibridación.
  6. Incubar la matriz con solución de anticuerpos secundarios durante 30 minutos a 4 ° C protegido de la luz. Se retira la solución de anticuerpo secundario y se lava la lámina de microarrays 3 veces durante 5 minutos a 4 ° C con PBS, pH 7,6. InmersiónEl microarray en un tubo cónico de 50 ml que contenía 0,1 x PBS, pH 7,6 para eliminar el exceso de sal a temperatura ambiente. Secar el portaobjetos en una centrifugadora de microarrays a temperatura ambiente.
  7. Escanee la diapositiva con un escáner de microarrays a una resolución de 25 μm o superior, siguiendo el protocolo de escaneo recomendado por el fabricante del escáner de microarrays.
    NOTA: Si está presente un trazador de biotina marcado con fluoresceína, escanee tanto el canal verde (por ejemplo, 488 nm, em: 509 nm) como el canal que corresponde al anticuerpo secundario conjugado con tinte fluorescente, típicamente rojo (por ejemplo: 635 nm, em : 677 nm). El objetivo de la exploración es obtener archivos .tif de un solo canal que se pueden fusionar en un único archivo .png (como se describe en la sección 6.1).

6. Análisis de los datos de microarrays utilizando ArrayNinja

  1. Preparación de una imagen de microarray fusionada
    NOTA: El objetivo de esta sección es crear un archivo de imagen .png que combine los dos archivos .tif de canal único (obtenidos en la sección 5). EstaEs el único formato de imagen compatible con el módulo de análisis ArrayNinja. Las siguientes instrucciones representan una forma posible de obtener un archivo de imagen fusionado. Sin embargo, hay otras soluciones disponibles ( por ejemplo , el freeware ImageJ).
    1. Desde la línea de comandos en un terminal bash de un ordenador con el programa gratuito ImageMagick instalado, navegue a la carpeta que contiene los archivos .tif de un solo canal y copie / pegue los siguientes pasos, pulsando 'enter' entre cada paso (6.1.4 - 6.1 .7).
      NOTA: Los nombres de archivo en letras mayúsculas ( por ejemplo , RED_CHANNEL) deben reemplazarse con el nombre de archivo de las imágenes de diapositivas de microarrays.
    2. Si es necesario, primero invierta las imágenes usando el comando 'convert INPUT.tif -negate OUTPUT.tif'. Esto es necesario si el escáner guarda archivos .tif con la señal en blanco y el fondo en negro.
      1. Convert -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel GB -evaluate set 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. ConvErt - depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel RB -evaluate set 0 -delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. Convert -depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel RG -evaluate set 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
      4. Convertir out.png outa.png outB.png -set colorspace RGV -combine fusionado.png.
        NOTA: Un archivo denominado 'fusionado.png' se guardará en la misma carpeta que los archivos .tif originales.
  2. Cuantificación de datos mediante ArrayNinja
    1. Abra ArrayNinja y haga clic en el enlace de la impresora de microarrays correspondiente en "Para cuantificar las imágenes que tienen una placa de fuente conocida". Escriba el nombre del diseño de diapositivas guardado (paso 2.5) en el cuadro de diálogo "placa de carga" y haga clic en "introducir". Vea la Figura 4 para una captura de pantalla del módulo de análisis ArrayNinja.
    2. Haga clic en 'Elegir archivo' y navegue hasta el archivo 'fusionado.png' creado en la sección 6.1. La imagen fusionadaE se cargará, así como una cuadrícula para el diseño de la diapositiva.
    3. Utilice los controles deslizantes en la parte inferior del panel de control ArrayNinja para ajustar el contraste, el brillo y el punto medio.
      NOTA: Estos ajustes son sólo para fines de visualización y no tienen impacto en la cuantificación.
    4. Seleccione "resolución" e introduzca el valor que coincida con la resolución de la imagen escaneada. Utilice el "lado de margen" y "margen superior" para mover la cuadrícula en alineación con los puntos de la matriz. Ajuste según sea necesario para que la cuadrícula se alinee lo más posible en cada punto.
    5. Haga clic en "Spot Seek" y espere a que el botón vuelva al color gris original.
      NOTA: Esto puede repetirse varias veces para centrar los círculos de rejilla en puntos individuales. La función Seek relaja la cuadrícula hacia cada punto para afinar la alineación.
    6. Cambie el valor "Super Arrays" a "1" para trabajar cada panel de sub-array individualmente (si lo desea). Si utiliza un 4X 12 de cera ( figura 3E ), utilice los controles "iPin" "jPin" y "subA" para desactivar las funciones para analizar cualquier combinación deseada de 4 x 12 pozos. Por ejemplo, para analizar los pozos superior izquierdo y superior derecho como réplicas entre sí, ingrese "1 4" en iPin, "1 1" en jPin y "1 4" en subA. Presione 'enter'.
    7. Pase el mouse sobre puntos individuales para ver la identidad de esa característica.
    8. Haga clic en 'Toggle zoom' para revisar las funciones con más cuidado. Seleccione puntos de referencia de fondo pulsando la tecla 'R' mientras el ratón está sobre un punto. Los puntos de referencia se resaltarán en naranja.
      NOTA: En el modo "cambiar zoom", una imagen ampliada de la función que el ratón ha terminado se muestra en la esquina superior derecha. Una discusión detallada de las características adicionales de corrección de fondo en ArrayNinja se tratan en otra parte [ 28] .
    9. Cambie de manchas (con una morfología de manchas muy variada o restos que afectan la cuantificación exacta) presionando la tecla 'A' mientras se pasa el ratón sobre los puntos afectados. Los puntos inactivados se volverán blancos.
    10. Haga clic en "rellenar" seguido de "Enviar" para cuantificar los puntos.
      NOTA: Una nueva pestaña se abrirá y mostrará un gráfico de barras de los datos normalizados al promedio de puntos más brillantes. Una tabla debajo del gráfico de barras contiene los valores de datos normalizados y sin procesar. Esta tabla se puede copiar en una hoja de cálculo para archivar y analizar más a fondo.

Figura 4
Figura 4: Módulo de análisis de ArrayNinja. Se muestra una captura de pantalla del módulo de análisis ArrayNinja. El panel de control (arriba a la izquierda) muestra todos los parámetros que se pueden ajustar para visualizar la matriz, encontrar puntos y alinear una cuadrículaImagen del arreglo. Pasar el ratón por encima de una función muestra una vista ampliada (arriba a la derecha) y muestra una ventana emergente que contiene la información de identificación asociada con esa función (abajo). Los puntos de referencia seleccionados para la corrección de fondo son naranja. Las características que deben excluirse del análisis posterior son de color blanco. ArrayNinja contiene una función de búsqueda basada en texto que resalta las características que coinciden en amarillo, como se muestra en el ejemplo para H4K16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Este protocolo se ha utilizado para diseñar y fabricar una plataforma de microarrays de péptidos para el análisis de la especificidad de anticuerpos histona PTM. El array consulta una biblioteca de más de 300 características únicas de péptidos (20 - 40 residuos de longitud) que representan muchas de las combinaciones conocidas de PTMs que se encuentran en el núcleo y la variante de las proteínas histonas [ 38] . Este gasoducto ha sido un caballo de batalla para el cribado de muchos anticuerpos de histona PTM ampliamente utilizados y comercialmente disponibles, y se dispone de conjuntos de datos completos en la base de datos de especificidad de anticuerpos histona (www.histoneantibodies.com). 17

La espina dorsal de nuestro oleoducto es ArrayNinja, una aplicación de código abierto que recientemente desarrollamos, que integra las etapas de planificación y análisis del trabajo con microarrays 28 . El módulo de análisis ArrayNinja permite a los usuarios interactuar en informaciónCon su archivo de imagen RAW. Las identidades de entidad impresas se integran automáticamente con la imagen, y estas identidades pueden revelarse colocando el cursor del ratón sobre un punto. Esta integración también permite la búsqueda rápida de características de interés por el nombre y la exclusión de características de análisis de aguas abajo. ArrayNinja también ofrece opciones para la corrección de ruido de fondo local y no local, así como un esquema de corrección que se adapta a la morfología del punto. Los detalles completos de ArrayNinja y sus capacidades se pueden encontrar en otra parte 28 .

ArrayNinja calcula intensidades de señal para cada característica peptídica y agrega esas intensidades en promedios con error basado en la identidad de la entidad. Se devuelven los promedios de señal crudos y normalizados, donde la constante de normalización está determinada por el promedio más brillante de las características. Las intensidades de señal para cada péptido pueden usarse para comparar la afinidad relativa Del anticuerpo entre las características de la microarrays. Aquí, se muestran los datos representativos de dos anticuerpos perfilados con este gasoducto, destacando epítopo reconocimiento propiedades que deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados obtenidos con estos reactivos ( Figura 5 ].

El reconocimiento fuera del objetivo es una preocupación para todos los anticuerpos, y las similitudes en los epítopes que rodean los residuos de histonas modificables hacen que este sea un desafío particular para los anticuerpos histona PTM. De hecho, un anticuerpo elevado para reconocer la lisina 9 trimetilada en la histona H3 (H3K9me3) se une a péptidos trimetilados en H3K18, H3K27 y lisina 20 en la histona H4 (H4K20me3) o mejor que H3K9me3 ( Figura 5A ). La secuencia que rodea a H3K9 (ARKS) se conserva con H3K27, y se ha observado la reactividad cruzada de anticuerpos PTM de histonas y reguladores de cromatina que se unen y modifican estos sitiosSs = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 . Otra propiedad de reconocimiento observada fuera del objetivo común a los anticuerpos de metil-lisina es una incapacidad para discriminar el orden de los metilo. Esto se ejemplifica por los resultados obtenidos con un anticuerpo H3K4me3, que reacciona de forma cruzada con péptidos H3K4me2 y H3K4me1 ( Figura 5B ). Distinguir entre el orden de metil es importante, ya que los estudios han demostrado que H3K4me3, H3K4me2, y H3K4me1 se distribuyen de forma diferente a través del genoma y la función probable de diferentes maneras [ 42 , 43] . Por ejemplo, H3K4me3 se encuentra en la transcripción inicio sitios de la mayoría de los genes transcritos activamente, mientras que los potenciadores activos son comúnmente marcados por H3K4me1 [ 44] .

Además del reconocimiento fuera del objetivo, la influencia positiva y negativaE por los PTM vecinos es una propiedad comúnmente observada de los anticuerpos histona. El anticuerpo H3K9me3 mostrado en la Figura 5A está influenciado positivamente por los grupos acetilo en los residuos de lisina vecinos. De hecho, el reciente análisis de espectrometría de masas muestra que los grupos acetilo, en particular H3K14ac, con frecuencia co-ocurren con H3K9me3 [ 38] . El anticuerpo H3K4me3 mostrado en la Figura 5B es afectado negativamente por la fosforilación vecina a la treonina 6 (H3T6p). Se sabe que H3T6p tiene un impacto tanto positivo como negativo en el reconocimiento de H3K4me3 por las proteínas lectoras, y esto puede servir como mecanismo dinámico para regular el reclutamiento de factores específicos de la cromatina 15 , 45 .

Figura 5
Figura 5: Análisis de anticuerpos en microarrays de péptidos. Análisis de anticuerpos (A) H3K9me3 (Anticuerpo # 1) y (B) H3K4me3 (Anticuerpo # 2) en microarrays de péptidos. Las líneas / barras verdes indican que el péptido alberga sólo la PTM objetivo deseada. Las líneas / barras grises indican péptidos cuya intensidad de señal no es significativamente diferente (p> 0,05) de la línea verde / barra, calculada usando un ANOVA unidireccional comparando la intensidad relativa media de todos los péptidos con el péptido diana. Las líneas / barras rojas y azules indican una señal que está significativamente disminuida o aumentada (p <0.05) de la línea verde / barra, respectivamente. Las líneas / barras naranjas indican los péptidos fuera del objetivo. Los datos se muestran como (izquierda) una ilustración visual de la complejidad PTM en péptidos que abarcan regiones N-terminales de las colas H3 y H4, donde el ancho de cada línea corresponde a la intensidad relativa medida para esa característica peptídica, y gráficos de barra (derecha) Mostrando las medias de intensidad de señal relativa ± SEM de 6 mediciones de punto individualesEn microarrays. Todos los péptidos incluidos en este análisis tienen 20 aminoácidos de longitud que corresponden a los aminoácidos de la histona H3 1 - 20 o 15 - 34. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La fiabilidad de los anticuerpos en aplicaciones de investigación biomédica es fundamental 46 , 47 . Esto es especialmente cierto en la bioquímica de la cromatina dada la posición de los anticuerpos como herramientas clave para la mayoría de las técnicas desarrolladas para caracterizar la abundancia y distribución de histonas PTMs. El protocolo presentado aquí detalla un oleoducto optimizado para el diseño, fabricación y uso de microarrays de péptidos para analizar la especificidad de anticuerpos histona PTM. Este gasoducto se ha utilizado para la detección de un gran número de anticuerpos histona PTM comercialmente disponibles y ampliamente utilizados, y los datos generados a partir de estos experimentos están disponibles gratuitamente a través de una base de datos de antigüedad de anticuerpos histona en línea y en expansión (www.histoneantibodies.com) 17 .

Aparente de nuestro trabajo y otros son frecuentes casos de histora desfavorable PTM anticuerpo comportamiento que puede complicar la interpretatDe los datos generados con estos reactivos 12 , 15 , 17 . Por lo tanto, se justifican medidas de control de calidad más rigurosas y completas de las compañías de anticuerpos. Experimentalistas y líderes del consorcio de epigenoma ( por ejemplo , ENCODE, BLUEPRINT) también deben mostrar rigor en su propia evaluación de los anticuerpos PTM histona al elegir un reactivo para su estudio. Además, los esfuerzos para minimizar la variabilidad de lote a lote, estandarizar el uso de reactivos de afinidad altamente validados a través de las plataformas de mapeo del epigenoma y desarrollar herramientas de afinidad alternativas son todos los elementos procesables para abordar este problema de investigación.

Los microarrays tienen una serie de ventajas sobre los ensayos basados ​​en microplacas ( por ejemplo , ELISA) que los hacen particularmente útiles para caracterizar la especificidad de anticuerpos de histonas PTM. Microarrays permiten el análisis paralelo y competitivo de miles de péptido-Anticuerpo con un consumo mínimo de material. En el protocolo descrito aquí, 700 picomoles de cada característica peptídica es suficiente para producir 100 diapositivas de microarrays. Además, el análisis de anticuerpos puede completarse usando menos de 1 μg de anticuerpo, y los formatos de matriz personalizados permiten que múltiples anticuerpos y diversas diluciones de anticuerpos sean examinados en paralelo.

Diseñar diseños de características personalizadas en microarrays puede ser una laboriosa tarea. Además, cada nuevo diseño de microarray requiere la construcción de una nueva plantilla de análisis. Encontramos esto para ser prohibitivo para realizar la utilidad completa de la tecnología del microarray. Esto motivó el desarrollo de ArrayNinja, una aplicación de software interactivo de código abierto que integra perfectamente los aspectos de diseño y análisis de los experimentos con microarrays 28 . El módulo de diseño de ArrayNinja permite al usuario diseñar interactivamente una diapositiva para ajustarse a la disposición requerida para un experimento. ArrayNinja virtEl robot mide el movimiento robótico de la impresora y lo traduce al diseño de la placa fuente para un diseño de diapositiva dado ( Figura 2 ). Crear formatos de matriz personalizados es ahora una práctica rápida y rutinaria. Otra característica clave de ArrayNinja es la conexión entre el diseño y los pasos de análisis del trabajo de microarrays. Con configuraciones definidas por el usuario desde el módulo de diseño, ArrayNinja superpone una cuadrícula interactiva en una imagen de microarray escaneada, permitiendo al usuario pasar por encima de cualquier característica para revelar su identidad o buscar características de interés ( Figura 4 ).

Cabe destacar varios pasos críticos de este oleoducto. En primer lugar, al diseñar el diseño de impresión, se debe considerar incluir suficientes puntos de replicación para lograr significación en la recolección de datos. Además, para tener en cuenta la variabilidad pin-to-pin, cada característica debe ser depositada por al menos dos pines diferentes. Finalmente, quizás el paso más crítico sea el generador físicoIon de la placa fuente. El uso exitoso de los microarrays de alta densidad descritos en este protocolo se basa en la capacidad de asignar la identidad de cada característica a su ubicación física en la diapositiva final. Esta tarea de mapeo no es trivial, pero ArrayNinja facilita enormemente este paso proporcionando un mapa de placas. Cualquier desviación a este mapa mientras se crean las placas fuente dará lugar a conclusiones incorrectas durante el análisis.

Es importante considerar las limitaciones del uso de microarrays para el análisis de la especificidad de anticuerpos. Aunque se ha demostrado que las propiedades de los anticuerpos de PTM de histona fuera de la diana capturadas en el conjunto se traducen a aproximaciones experimentales con condiciones de hibridación similares ( por ejemplo , inmunotransferencia) 17 , 18 , el grado en que el perfilado basado en array de especificidad de anticuerpo se traduce en protocolos ChIP es sugestivo 14 , 17 pero waRante una evaluación más crítica.

Las variaciones a este oleoducto se han descrito previamente para el análisis de lectores de histonas, escritores y borradores 23 , 24 . La modificación de esta plataforma para la utilidad más allá de la investigación de la epigenética podría adaptarse fácilmente a cualquier biblioteca imprimible de interés. También es posible que el material más complejo que los péptidos se puede utilizar para construir microarrays para la investigación de la bioquímica de la cromatina. Por ejemplo, los nucleosomas recombinantes que muestran varios PTM ahora se generan rutinariamente en el entorno de laboratorio 48 y el perfil de la especificidad de los anticuerpos histona PTM en el contexto de esta subunidad de cromatina fisiológicamente relevante será un área interesante de estudio futuro.

Un enfoque alternativo ampliamente utilizado para el protocolo descrito aquí utiliza tecnología de matriz SPOT, donde cientos de péptidos se sintetizan directamente en un celluPierde el soporte de la membrana 49 . La propia membrana se puede utilizar para aplicaciones de microarray [ 50] . La tecnología SPOT es ventajosa desde el punto de vista de la complejidad de la biblioteca y del coste de síntesis. Sin embargo, se ha informado que la pureza de los péptidos sintetizados usando el método SPOT varía, y las medidas de control de calidad y purificación comunes a la síntesis de péptidos en fase sólida ( por ejemplo , HPLC y espectrometría de masas) no se realizan rutinariamente 50 , 51 . Adicionalmente, la presentación de péptidos sobre nitrocelulosa no es uniforme y puede proteger epítopos. En particular, ambos tipos de plataformas de matriz de péptidos de histonas están disponibles comercialmente para usuarios que no tienen acceso al equipo especializado necesario para sintetizar péptidos y fabricar matrices.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto de Investigación Van Andel y una beca de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (CA181343) a SBR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

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