형태학 및 Murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법

Biology

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Summary

이 원고 형태학 및 설치류의 악의 관절 돌기 내의 세포질 변화를 분석 하기 위한 메서드를 제공 합니다.

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Dutra, E. H., O'Brien, M. H., Lima, A., Nanda, R., Yadav, S. A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle. J. Vis. Exp. (131), e55998, doi:10.3791/55998 (2018).

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Abstract

턱 관절 (TMJ) 외부 자극에 적응 하는 능력 있고 변경 로드 condyles의 위치 뿐만 아니라 악의 condylar 연골 (MCC)의 구조와 세포 구성 요소에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 원고에는 이러한 변경 및 마우스 (즉, 압축 정적 TMJ 로드)에서 TMJ의 로드를 변경 하는 방법을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 여기에 그림 구조 평가 Digimizer 소프트웨어를 사용 하 고 작은 뼈의 방사선에서 수행 되는 간단한 형태학 접근 이다. 또한, 휴대의 분석 선도 콜라겐 식, 뼈, 세포 분열, 변경에 변화와 proteoglycan 메일 고객 센터에서 설명 하는. 이러한 변화는 긍정적인 형광 픽셀을 사용 하 여 계산 하 여 조직학 단면도-의 정량화 이미지 소프트웨어 및 측정 거리 매핑 및 스테인드 영역 Digimizer-는 또한 설명 했다. 여기에 표시 된 메서드는 murine TMJ에 국한 되지 않습니다 하지만 추가 뼈 작은 실험 동물의 및 endochondral 나오고의 다른 지역에서 사용 될 수 있습니다.

Introduction

TMJ craniofacial 지역에 위치한 독특한 로드 베어링 조인트 이며 fibrocartilage의 형성 된다. MCC는 TMJ의 말하기와 masticating, unhindered 턱 운동을 하 여 관절 기능을 위해 필수적 이지만 일반적으로 관절염1를 포함 한 퇴행 성 질환에 의해 영향을 받습니다. TMJ 고객 센터2,3,,45의 구성 요소 구조와 세포 변화를 선도 외부 자극 및 로드 변경에 적응 하는 능력이 있다. MCC의 부하 베어링 속성 그것의 성분, 물, 콜라겐 네트워크를 포함 하 고 밀도가 proteoglycans 포장 사이 상호 작용에 의해 설명 될 수 있다. 고객 센터는 콜라겐과 비 콜라겐 단백질의 종류를 나타내는 4 개의 고유 셀룰러 영역: 1) 표면 또는 관절 영역; 요구; 로드에 응답 하는 2) 증식 영역, 미 분화 간 엽 세포의 구성 성숙한 chondrocytes 표현 콜라겐 유형 2; 3) prehypertrophic 영역 구성 그리고 4)는 hypertrophic 영역, 콜라겐 표현 hypertrophic chondrocytes 10 다를 입력 하는 지역 및 석 회화를 받 다. 비 mineralized 지역 proteoglycans 압축 력을6에 저항을 제공 하는 풍부 하다.

Hypertrophic 영역에서 골 chondrogenesis에서 전환 발생 하면 고객 센터의 지속적인 강화는 악의 관절 돌기7의 마찰의 뼈의 강력한 미네랄 구조를 보장. Unmineralized 및 광물 화 된 지역에서 세포질 변화는 궁극적으로 악의 관절 돌기에 mandible 형태학 및 구조 변화에 리드. 고객 센터의 모든 세포질 영역 및 마찰의 부분의 강화 작용의 항상성 유지, 부하 베어링 용량, 건강과 TMJ의 무결성을 필수적입니다.

여러 콜라겐 유전자 변형 마우스 모델 (Utreja 그 외 여러분에 의해와 같이) 8 모든 transgenes는 MCC에서 표현 됩니다 때문에 콜라겐 식의 변화를 이해를 사용 하 여 훌륭한 도구입니다. 깊이 조직학 평가, 대 한 조직학 얼룩 매트릭스 증 착, 강화 작용, 세포 증식, apoptosis, 뿐만 아니라 고객 센터의 다른 세포 층에 단백질 식 공부 하는 데 사용 됩니다.

이 원고, 조직학 및 형태학 분석 쥐의 악의 관절 돌기의 MCC 및 마찰의 뼈에서 세포 및 구조 변화를 평가 하는 데 사용 됩니다. 또한, 세포 정량화 방법, 형광 조직학 이미지를 분석 하 고 가벼운 현미경 슬라이드를 매핑 설명 되어 있습니다. 고객 센터 및 마찰의 뼈9세포 형태학 변화 원인, 메서드를 로드 압축 정적 TMJ 또한 우리의 방법을 확인 하기 위해 그림입니다.

형태학 및 악의 관절 돌기에 설치류의 mandible 조직학 변화 결정 또는 endochondral 나오고의 다른 지역 및 추가 광물 화 된 직물의 형태 분석 여기에 설명 된 방법은 사용할 수 있습니다.

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Protocol

코네티컷 대학 건강 센터의 기관 동물 관리 위원회 승인 모든 동물 절차.

1. 압축 정적 TMJ 로드: 입 오픈 강요

참고: 4 주 오래 된 유전자 변형 쥐 박사 데이비드 로우 (코네티컷 대학), 친절 하 게 제공 하는 콜라겐 (Col2a1XCol10a1)에 대 한 형광 기자를 품고이 원고에 설명 된 실험을 위해 사용 되었다 (n = 8; 4 남성 및 4 명의 여성). 시안색 Col2a1 (블루) transgene MCC의 prehypertrophic 영역에는 셀에 표시 됩니다, 그리고는 Col10a1 동안 벚꽃 (빨간색) 셀 hypertrophic 지역8 (그림 1)에 있습니다. 마우스 동등 하 게 두 그룹으로 분할 되었다: 1) 로드 그룹, 쥐 쥐 없는 개입을 받은 컨트롤 그룹 (에서 설명한 단계 2) 및 2)를 로드 압축 정적 TMJ를 복종 되었다.

Figure 1
그림 1. 더블 콜라겐 형광 기자 마우스 (Col2a1XCol10a1)의 관절 돌기의 화살 대표. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 조작 스프링 usingbeta 티타늄 합금 archwires (0.017 x 0.025) (그림 2A).
  2. 케 타 민 (90 밀리 그램/kg 체중) 및 xylazine (13 mg/kg 체중)의 혼합물의 복 주사 하 여 실험 동물을 anesthetize.
  3. 부드럽게 쥐의 입 열고 상 악 및 악의 앞 니 (그림 2B와 C)에 루프를 매력적인 스프링을 삽입 합니다.
  4. 5 일 동안이 절차를 반복 하는 1 헤 대 한 마 취 쥐의 앞 니에 스프링을 유지 하 여 압축 정적 TMJ 로드를 유도.
  5. 5-ethnyl-2'-deoxyuridine (듀; 30 mg/kg 체중)와 쥐 주사 intraperitoneally 셀 확산 분석 2 일 및 1 일전 안락사에 대 한.

Figure 2
그림 2. 압축 정적 TMJ 로드: 입 강제 오픈 모델. (A) 봄 0.017 0.025 베타 티타늄 합금 archwire x의 조작. (B) 스프링 로드 된 마우스. (C) 로드의 방사선 사진 그리고 제어 마우스는 mandible의 위치에 차이 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. mandible 해 부 및 고정

  1. 강제 오픈 입 절차의 끝점에서 승인 된 방법으로 실험 동물을 안락사.
  2. 관절 돌기의 연골을 근 근이 없이 근육 부착을 절단 하 여는 mandibles를 해 부.
  3. 10% 포 르 말린 고정을 위한 24 시간에 청소 mandibles를 놓습니다.
    주의: 포 르 말린은 자극; 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오.

3. x-레이 이미징 및 형태학 측정

  1. 플랫 컨테이너 (예: 55 x 16 mm 페 트리 접시는)에 있는 mandibles를 놓고는 26에 캐비닛 엑스레이 시스템을 사용 하 여 샘플의 검사를 받아 5 k v s.
    참고: 이미지를 저장 하기 전에 눈금 막대를 배치 합니다.
  2. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 mandibles의 형태학 측정을 수행 ( 재료의 표참조).
    참고: 어떤 측정을 수행 하기 전에 사용 하 여 눈금 막대 방사선 사진에는 단위를 확인 하. 이 단계는 제대로 해 부 구조를 측정 하는 것이 중요. (그림 3A) "단위" 버튼 클릭 합니다.
  3. 이미징 소프트웨어 (그림 3B)에서 "마커 스타일 2"를 사용 하 여 해 부 포인트를 선택 합니다. 이 문서에서 설명 하는 방법을 따라 다음과 같은 포인트를 (그림 3B)를 선택 합니다.
    1. Condylion (포인트 1), 악의 관절 돌기;의 가장 뒷부분 포인트 선택
    2. 선택 하 니 프로세스 (2 점);
    3. 시그모이드 노치 (3 포인트);에서 가장 깊은 지점 선택
    4. 악의 ramus (4 포인트);의 오목 함에서 가장 깊은 지점 선택
    5. Condylar 관절 표면 (5 포인트);의 가장 앞쪽 지점 선택 그리고
    6. Condylar 관절 표면 (6 점)의 가장 뒷부분 포인트를 선택 합니다.
  4. 해 부 포인트를 선택한 후 "길이" 도구를 사용 하 여 형태학 측정을 수행 하지만 관절 돌기 머리 길이 대 한 포인트 (3), (4) (그림 3C)에서 "수직 라인" 도구 사용 하 여.
    1. (1) (2) 니 프로세스에 condylion에서 악의 길이 측정 합니다.
    2. 관절 돌기 머리 길이-선 악의 ramus (4)의 오목 함에서 가장 깊은 지점 sigmoid 노치 (3)에서 가장 깊은 지점에서 추적 하는 condylion (1)에서 수직 거리를 측정 합니다.
    3. 관절 돌기 머리 폭-condylar 관절 표면 (5-6)의 가장 뒷부분 포인트 앞쪽 대부분에서 거리를 측정 합니다.
    4. (그림 3C) 스크린의 오른쪽에 "측정 목록"에서 측정을 복사 합니다.

Figure 3
그림 3 . mandible의 형태학 측정의 표현입니다. (A) 방사선 사진의 눈금 막대를 사용 하 여 단위 결정 (빨간색, 눈금 막대에 동그라미: 10 m m). (B) "마커 스타일 2" (빨간색에서 동그라미)를 사용 하 여 해 부 포인트를 선택 합니다. 1) Condylion; 2) 니 과정; 3) 깊은 시점 sigmoid 노치; 4) 깊은 위치는 오목 함에 악의 ramus; Condylar 관절 표면의; 5) 대부분 앞쪽 포인트 6) 대부분 후부 포인트 condylar 관절 표면. 눈금 막대:(C) 수행 측정 10. "길이"와 "수직" 도구 (빨간색에서 동그라미). 1 ~ 2 지점에서 측정: 악의 길이; 5 ~ 6 지점에서: condylar 폭; 수직에서 1-4 3 지점: condylar 머리 길이. "측정 목록." 측정 결과 저장 눈금 막대 = 10 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 관절 돌기 포함

참고: 방사선 이미지, 복용 후에 mandibles 포함 고 조직학 분석에 대 한 구분.

  1. 밤새 껏 포함 하기 전에 PBS에서 30% 자당에서 (그 단계 2.3에서에서 수정 되었습니다) undecalcified mandibles를 배치 합니다.
  2. 어떤 초과 연 조직 부와 신중 하 게 악의 관절 돌기를 잘라.
  3. (샘플을 충당 하기 위해 충분히) 일부 포함 수 지 일회용 플라스틱 금형에 부 어 및 장소 샘플을 병렬 형의 하단에 위치, 금형의 베이스에 대 한 관절 돌기의 중간 표면.
  4. 드라이 아이스의 조각으로 표본을 올바른 위치에 수정.
  5. 형 수 지를 포함 하는 것을 채워 및 장소 고정 샘플 형 감기 2-메 틸-부탄, 또는 드라이 아이스는-20 ° C 또는-80 ° C 냉동 고에서 미리 냉장 될 수 있는.
  6. 단면까지 표본-80 ° C 또는-20 ° C에서 저장 합니다.

5. 관절 돌기 화살 단면화 및 슬라이드 준비

  1. Condyles (5-7 µ m)의 냉동된 화살 섹션 만들고 테이프 전송 방법10,11을 사용 하 여 슬라이드에 샘플을 전송 합니다.
  2. UV 치료할 수 있는 방법10를 사용 하 여 테이프에 전송 조직학 섹션을 준수 합니다.

6. 조직학 얼룩이 지 고 현미경 이미징

참고: 대부분의 조직학 얼룩 Dyment 10여 종이의 조직학 섹션에 설명 된 대로 수행 됩니다.

  1. 초기 검색에 대 한 첫 번째 단계 Dyment 10 에 의해 설명 된 대로 Col2a1 및 Col10a1 transgenes, 이미지 것입니다.
    1. 30% 글리세롤과 PBS에 슬라이드 위에 coverslips를 배치 합니다. 초기 이미징 ofthesectionswitha 형광 현미경 및 적절 한 필터를 수행 합니다.
  2. 형광 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 얼룩을 수행 합니다.
    참고: 트랩 조 혈 모 세포, 뼈 세포, osteoclasts12resorbing를 포함 하 여 표현 됩니다. 이 얼룩의 목적은 MCC 및 마찰의 뼈 리 모델링 분석 하입니다.
    1. PBS에서 그들을 몸을 담글 하 여 슬라이드의 coverslip를 제거 합니다. 3 시간 5 분 대 한 PBS에 슬라이드를 씻어.
    2. 아세트산 나트륨의 무수 (9.2 g) 및 나트륨 L-주석산 염기이 수화물 (11.4 g) 1 L 증류수에 용 해 하 여 트랩 버퍼 1을 준비 합니다. 4.2 초 산에 pH를 조정 하 고 4 ° c.에 트랩 버퍼 1 저장
    3. 트랩 버퍼 2 갓 나트륨 아 질산염 (40mg) 1 mL의 증류수에 용 해 하 여 준비 합니다.
    4. 버퍼 2의 버퍼 1과 150 µ L의 7.5 mL를 혼합 하 여 (의 바로 전에 얼룩) 트랩 기판 버퍼를 준비 합니다. 이 솔루션 (200 µ L) 실 온에서 10 분 동안 각 슬라이드에 적용 됩니다.
    5. 23 µ L 형광 기판의 기판 버퍼의 1.840 mL를 혼합 하 여 트랩 반응 버퍼를 준비 ( 재료의 표참조).
      참고: 트랩 활동에 대 한 형광 substrategeneratesayellowfluorescentsignal입니다.
    6. 부드럽게 솔루션 pipetting으로 초과 트랩 기판 버퍼를 제거 합니다.
    7. UV 소스 전구 검은 빛 아래 5 분에 대 한 트랩 반응 버퍼의 200 µ L로 슬라이드를 품 어.
    8. 3 시간 5 분 대 한 PBS에 슬라이드를 씻어.
    9. PBS에서 30% 글리세롤에 슬라이드에 coverslips를 놓고 현미경 이미징10를 수행 합니다.
  3. 셀 확산 얼룩을 수행 합니다.
    참고:이 분석 결과에 수정 된 티 미 딘 아날로그 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (듀)에 통합 되어 새로 합성된 DNA: 나누어 세포 형광 염료와 함께 표시 됩니다.
    1. 트랩에 대 한 이미징, 후에 coverslips를 제거 하 고 세척 슬라이드 PBS에 3 시간 5 분. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine 셀 확산 kit 얼룩 조직학 섹션에서에서 단계를 따릅니다.
    2. 반응 준비 430을 추가 하 여 칵테일 반응 버퍼, CuSO4의 20 µ L, 형광 염료, 1.2 µ L 및 1 X의 50 µ L X 1 µ L 버퍼 첨가제 (500 µ L의 총 볼륨은 충분 한 슬라이드).
      : 제조업체 권장 여기에 설명 된 순서 대로 재료를 추가 합니다.
    3. 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 준비 된 칵테일 슬라이드를 품 어.
    4. 3 시간 5 분 대 한 PBS에 슬라이드를 씻어.
    5. 1:1,000 DAPI와 PBS에서 30% 글리세롤에 슬라이드 위에 coverslips를 배치 합니다.
      참고: DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)은 DNA에 AT 풍부한 지역에는 파란색 형광 핵 얼룩.
  4. 톨루이 블루 (TB) 얼룩을 수행 합니다.
    참고: 고객 센터에서 proteoglycan 배포를 보여준다 TB 얼룩.
    1. 린스는 coverslips을 제거 하려면 슬라이드 indistilledwater.
    2. 제거한 후에 coverslips, PBS에서 소금을 완전히 제거 하려면 각 5 분에 대 한 세 번 증류수에 슬라이드를 씻어.
    3. 함으로써 결핵 작업 버퍼를 준비 솔루션 (28.4 g에 증류수 1 L 염기 나트륨 인산 염의 분해) 및 솔루션 B (디졸브 27.6 g 나트륨 인산 이수소 증류수 1 L에). 솔루션 작업 버퍼는 0.1 m M의 200 mL를 만들려고 B. Dilute 증류수에 1: 1이이 솔루션의 5.3 mL와 솔루션 A의 혼합 94.7 mL. 8.0 pH 산도 해결 될 때까지 수산화 나트륨을 추가 하 여 수정 합니다.
    4. 1% 주식 TB 준비: 증류수 100 mL에 TB의 1 g을 혼합.
    5. 1% 주식 TB의 3 mL에 0.1 m M 작업 버퍼의 40 mL를 혼합 하 여 결핵 작업 솔루션을 준비 합니다.
    6. 14-17 s t B 작업 솔루션에 슬라이드를 품 어.
      참고:이 얼룩은 매우 시간에 민감한; 보육 시간 overstaining를 방지 하기 위해 조정 될 필요가 있습니다.
    7. 5 분에 대 한 세 번 증류수에 슬라이드를 씻어.
    8. Coverslips 슬라이드 위에 증류수에 30% 글리세롤에 놓습니다. 가벼운 현미경 이미징10을 수행 합니다.
      참고: 슬라이드 글리세롤 + PBS에서 결핵에 대 한 스테인드 coverslip 하지 마십시오. PBS는 얼룩의이 유형을 밖으로 씻어.

7. 형광 조직학 정량화

  1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지의 조직학 정량화를 수행 ( 재료의 표참조).
    참고: 조직학 부 량이 방법에서의 기본 원리는 형광 x 관심의 관심 분야의 픽셀의 총 수의 숫자를 100, 긍정적인 픽셀의 비율의 결과로 얻은 수를 곱하면 내에서 그 지역.
  2. Condyles의 화살 섹션의 고객 센터에 Col10a1 식의 정량화를 수행 합니다.
    1. 셀 및이 메서드를 사용 하 여 얼룩 모든 종류의 측정 영역을 측정할 수를 선택 합니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 조직학 이미지를 열고 "올가미 도구 (패)"(그림 4)를사용 하 여 영역을 선택 합니다. 여기서 설명 하는 분석을 위해 고객 센터 영역; 선택 영역을 선택한 후 픽셀의 총 수는 소프트웨어(그림 4)의 화면에 "히스토그램" 상자에 표시 됩니다. 관심의 영역에서 픽셀 수를 저장 합니다.
    2. 샘플링 도구를 사용 하 여 빨간색 Col10a1 픽셀을 선택 합니다. 상단 패널 그리고 "색상 범위."에서 "선택" 클릭 선택 샘플 이미지의 픽셀 색상 하 고 "확인"을 클릭 합니다 "스포이드 도구" 클릭 모든 영역을 선택한 픽셀 색상에 될 것입니다 긍정적인 선택 (그림 4B). 형광 픽셀 (스크린의 "막대 그래프" 상자에 표시 된) 수를 복사 하는 스프레드시트 또는 분석용 통계 소프트웨어에 붙여 넣을.
    3. 관심 분야의 픽셀의 수에 형광 픽셀의 수를 분할 하 고 100이이 숫자를 곱하면: 형광 픽셀 / 관심의 영역에서 픽셀 * 100.
      참고: 셀, 블루 Col2a1 등의 다른 유형이 같은 방법으로 측정할 수 있지만 파란색 픽셀 Col10a1 빨간 픽셀 대신 선택 해야 합니다.

Figure 4
그림 4 . Transgene Col10a1 정량화의 표현입니다. (A) "올가미 도구" (L)에 대 한 관심의 영역을 선택. Col10a1 긍정적인 세포에 대 한 전체 악의 연골을 선택 합니다. "그래프" 상자에서 픽셀 수를 저장 합니다. (B) 관심,이 경우에, 빨간 형광 Col10a1 픽셀의 픽셀을 선택 합니다. 참고 관심의 영역 내에서 빨간 픽셀만 선택 됩니다. "그래프" 상자에서 빨강 픽셀의 수를 저장 합니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 고객 센터 및 마찰의 뼈에서 트랩 활동의 정량화를 수행 합니다.
    1. 8.2, 단계에 설명 된 절차를 따라 하지만 고객 센터 영역 선택, 대신 연골과 마찰의 뼈 영역그림 5(A)를 선택 합니다.
    2. 8.2.2 (그림 5B); 단계에서 설명한 대로 선택 ELF97 기판에 의해 생성 된 노란색 픽셀을 트랩 활동 분석에 대 한 긍정적인 픽셀; 수 복사 그리고는 스프레드시트 또는 분석용 통계 소프트웨어에 붙여 넣을.
    3. 마찰의 뼈 지역에서 픽셀의 총 수로 노란색 픽셀의 수를 분할 하 고 100을 곱한 여 트랩-긍정적인 픽셀의 비율을 얻을.

Figure 5
그림 5 . 형광 트랩 정량화의 표현입니다. (A) (악의 연골과 마찰의 뼈)의 영역을 선택 하 고이 영역의 픽셀 수를 저장. (B) 트랩 활동을 나타내는 노란색 형광 픽셀을 선택 합니다. Note 트랩-긍정적인 픽셀만 선택 됩니다. 선택 된 픽셀의 수를 저장 합니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 듀-긍정적인 세포의 정량화를 수행 합니다.
    1. 듀 스테인드 슬라이드 DAPI와 counterstained는, 그래서 관심 영역에서 픽셀의 총 수를 계산 하는 대신 듀 긍정적인 픽셀의 비율을 계산 DAPI 긍정적인 픽셀을 선택 합니다. 8.2, 단계에서 설명한 대로 관심의 영역을 선택 하지만 픽셀의 총 수를 저장 하지 마십시오. 8.2.2; 단계에서 설명한 대로 DAPI 파란색 픽셀을 샘플링된 한 색상으로 선택 DAPI 긍정적인 픽셀 (그림 6A); 수 복사 그리고는 스프레드시트 또는 분석용 통계 소프트웨어에 붙여 넣을.
    2. 다음으로, 듀 긍정적인 픽셀 (노란색 형광 픽셀)를 선택 하 고 (그림 6B) "히스토그램" 상자에 픽셀 수를 저장.
    3. DAPI 긍정적인 픽셀 수에 의해 듀 긍정적인 픽셀 수를 분할 하 고 100를 곱하여 얻은 수 여 듀 픽셀의 비율을 계산 합니다.

Figure 6
그림 6 . 듀 정량화의 표현입니다. (A) (연골의 외부 층) 고객 센터의 증식 영역 선택. DAPI 긍정적인 픽셀을 선택 하 고 픽셀 수를 저장 합니다. (B) 듀 긍정적인 픽셀 (형광 노랑) 선택한 픽셀의 수를 저장 합니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

8. 연골 두께 Proteoglycan 배포의 정량화

  1. 연골 두께 (거리 매핑)와 Digimizer 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 톨루이 블루 스테인드 영역을 분석 합니다.
    참고: 조직학 이미지에 눈금 막대를 사용 하 여 단위 (그림 7A) 결정.
  2. 거리 매핑 측정을 수행 합니다.
    참고: 거리 매핑 측정 악의 관절 돌기에서 연골의 두께 제공할 것입니다. 여기 설명 하는 방법을 주는 고객 센터의 전체 두께의 평균 고객 센터의 5 개 영역이 선택 됩니다. 연구원은 3 개의 서로 다른 지역, 또는 고객 센터 가운데 하나의 단일 영역 측정 선택할 수 있습니다.
    1. "길이" 도구를 사용 하 여 톨루이 블루 스테인드 영역 (그림 7B) 5 개 지역, 또는 기본으로 많은 위치에의 끝에 외부 표면에서 연골의 길이 측정 합니다.
    2. "측정 목록."에서 길이 측정 복사
      참고: 소프트웨어 또한 측정 (그림 7B)의 평균을 제공합니다.
  3. 톨루이 블루 스테인드 영역을 측정 합니다.
    참고: 톨루이 블루 스테인드 영역의 측정에서 proteoglycan 지역 고객 센터에서 얻을 수 것입니다.
    1. "영역" 도구를 선택 하 고 윤곽 톨루이 블루 스테인드 영역 (그림 7C).
    2. "측정 목록."에서 지역 측정 복사

Figure 7
그림 7 : Proteoglycan 배포 정량화의 표현. (A) 조직학 이미지의 눈금 막대를 사용 하 여 "단위" 버튼을 클릭 하 여 단위를 결정 (빨간색, 단위 선택에 동그라미: 500 µ m). (B)는 (빨간색에서 동그라미) "의 길이" 도구를 사용 하 여 다른 위치에 연골의 두께 측정 합니다. 오른쪽 위 패널에서 "측정 목록"에서 측정을 저장 합니다. 의미와 측정의 SD는 직접 얻을 수 있습니다 그래서 소프트웨어는 또한 낮은 오른쪽 패널에서 "통계를"를 제공 합니다. (C) (빨간색에서 동그라미) "지역" 도구를 사용 하 여 톨루이 블루 스테인드 영역을 측정 합니다. 동그라미 관심 영역 및 저장 "측정 목록."에서 측정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Representative Results

기술 통계는 형태학 측정 (악의 길이, condylar 길이, condylar 폭) 및 조직학 분석의 분포를 검사를 수행 했다. 결과 로드 그룹 (즉, 마우스 베타 티타늄 스프링 압축 선적을 복종)와 (즉, 일치 하는 모든 프로시저에는 영향을 받지 않은 통제 쥐) 컨트롤 그룹 사이 비교 되었다. 수단 간의 통계적으로 유의 한 차이 짝이 없는 t-검정, 및 p-값에 의해 결정 되었다 < 0.05 통계적으로 중요 한 것으로 간주 되었다.

형태학 측정, 단계 4 및 그림 3에서 설명한 대로 로드의 mandibles 및 제어 그룹에서 수행 했다. 크게 증가 mandible 길이 제시 로드 그룹 (로드: 16.62 ± 0.23 m m 제어 대: 16.21 ± 0.2 m m; p < 0.05) 및 관절 돌기 머리 길이 (로드: 4.6 m m, SD 제어 대 0.08 m m: 4.4 m m; SD 0.06; p < 0.05) 컨트롤 그룹에 비해. 그럼에도 불구 하 고, 그룹 사이 관절 돌기 폭에 큰 차이가 없었다 (로드: 3.06 ± 0.12 m m 제어 대: 2.9 ± 0.11; p = 0.09).

크게 공개 8 단계에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 콜라겐 배포의 정량화 Col10a1 컨트롤에 비해 로드 그룹의 condyles MCC에 표현의 증가 (로드: 컨트롤에 비해 21% ± 4.46%: 7.50% ± 2.03%; p < 0.005; 그림 8 A와 D)입니다. 다른 한편으로, 아니 통계적으로 로드 사이 Col2a1 식에 차이 제어 그룹 (로드: 4.85% ± 1.95% 제어 대: 2.92% ± 1.89%; p = 0.13; 그림 8 B와 E)입니다. 또한, 트랩 활동의 분석 로드 된 마우스의 condyles의 마찰의 지역에서 증가 트랩-긍정적인 지역 보였다 (로드: 5.28% ± 1.45% 제어 대: 2.41% ± 1.39%; p < 0.05; 그림 8 C와 F)입니다. 컨트롤 마우스에 비해 로드 그룹의 고객 센터에서 증가 듀 긍정적인 셀에 표시 된 대로 증가 세포 증식, 마찬가지로, 관찰 (로드: 6.23% ± 1.89% 제어 대: 1.90% ± 1.03%; p < 0.05; 그림 9 A와 C)입니다.

로드의 고객 센터에 통제 쥐 Proteoglycan 배포 단계 9 및 그림 7에 설명 된 대로 톨루이 블루 스테인드 지역 및 거리 지도, 평가 하 여 정량 했다. 우리는 컨트롤에 비해 로드 그룹의 condyles의 고객 센터에 있는 크게 증가 거리 매핑 (로드: 컨트롤 대 210.22 µ m ± 4.11 µ m: 187.36 µ m ± 8.64 µ m; p < 0.005; 그림 9 B와 D)입니다. 그러나, proteoglycan 스테인드 영역 이었다는 로드 사이 통계적으로 다른 그룹을 제어 하 고 (로드: 203,897.93 µ m2 ± 10,171.00 µ m2 제어 대: 202,875.09 µ m2 ± 33,419.09 µ m2; p = 0.94; 그림 9 B와 E)

Figure 8
그림 8 : 대표 결과: (A) condyles 제어 및 로드 된 마우스에서의 고객 센터의 화살 단원의 Col10a1 긍정적인 세포. 증가 숫자 Col10a1 긍정적인 셀 로드 그룹 (D)에 있다. (B) Col2a1-긍정적인 세포 제어 및 로드 쥐에. 그룹 (E)사이 Col2a1-긍정적인 세포에 차이가 있다. ((C)) 트랩 제어 및 로드 된 마우스의 condyles에 얼룩. 제어 (F)에 비해 로드 그룹에서 트랩 활동 증가 히스토그램 (D-F) 대표 n 수단 ± SD = 4 그룹 당. * * 중요 한 차이 제어 및 로드 그룹 (p < 0.005). 눈금 막대 = 200µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9:대표 결과: (A) 듀 제어 및 로드 된 마우스의 condyles에 얼룩. 로드 된 그룹에 있는 증가 세포 증식으로 증가 듀-긍정적인 표현 (C)세포. (B) 톨루이 블루는 제어 및 로드 된 마우스의 condyles에 얼룩. 증가 거리 매핑 실험 그룹 (D)에서 같이 로드 된 마우스에서 연골 두께 증가. 아무 차이 proteoglycan 스테인드 영역에서 제어 및 로드 그룹 ((E)). 히스토그램 (C-E) 대표 n 수단 ± SD = 4 그룹 당. * * 중요 한 차이 제어 및 로드 그룹 (p < 0.005). 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 원고는 형태학 측정 및 세포 분석 murine 악의 condyles mandibles의 방법을 설명합니다. 방사선 형태학 측정 작은 실험 동물에서 다른 뼈 분석을 사용할 수 있습니다. 또한, 세포 분석 (셀 정량화 및 연골 거리 매핑) 설치류 악의 관절 돌기에 국한 되지 않습니다 하지만 수많은 조직의 조직학 섹션 척도를 사용할 수 있습니다.

유전자 변형 마우스 모델 표현 형광 기자는 유전자 발현에 변화를 시각적으로 이해 우수한 도구입니다. Transgenes는 고객 센터의 prehypertrophic 및 hypertrophic 지역에서 그렇게 표현 됩니다 이후 더블 콜라겐 형광 기자 마우스 모델 (Col2a1XCol10a1)이이 보고서에 사용 되는 고객 센터의 연구에 특히 적합 했다 그 콜라겐 배포 평가 될 수 있습니다. 연구원에 형광 기자를 표현 하는 유전자 변형 마우스 모델에 액세스할 수 없는 경우에 조직학 단백질 표정 분석, 면역 형광 검사, 등의 다른 방법은 사용할 수 있습니다.

형태학 측정 캐비닛 방사선 사진 이미지를 복용 하기 전에 중요 한 단계는 mandible 또는 분석 하기 위해 뼈의 모든 부드러운 조직 제거 것입니다. 과도 한 근육 이나 뼈에 연결 하는 부드러운 조직 구조의 실제 측정 마스크 수 있습니다. 그것은 캐비닛 방사선 사진 시스템의 제한 사항에 유의 해야 합니다. 모든 x 선 처럼 그것은 3 차원 구조의 2 차원 표현 하 고 구조 및 유물의 중복을 신중 하 게 해석 되어야 합니다. 또한, 방사선 캐비닛에 뼈의 위치 일치 해야한다.

긍정적인 픽셀의 수를 계산에 의하여 세포 정량화 셀-풍부한 지역, 고객 센터 등에서 조직학 정량화는 효율적인 방법 이지만이 방법의 한계는 그것은 세포의 정확한 수를 제공 하지 않습니다. 또한,만 픽셀 선택 단정, 그것 것이 좋습니다 같은 "샘플링" 픽셀을 사용 하 여 다른 이미지를 분석할 때 다른 농도의 픽셀의 정량화를 피하기 위해의 모든 이미지를 계량 하기.

조직학 단면도 측정 하는 경우 조언의 일반적인 조각 여러 직렬 섹션의 각 샘플을 분석 하는 (이 원고 3 직렬 섹션 분석 되었다 각 관절 돌기에 대 한), 이후 유사 각 샘플 내에서 일반적으로 관찰 된다.

우리의 실험에 언급 된 방법론 간단 하 고 사용 하기 쉬운, 그리고 어떤 기자에 마우스 사용 되는 어떤 광물 화 된 조직 연구에 사용할 수 있습니다. 기존의 방법론으로 셀을 셀의 공동 지역화를 시각화 하 여 트랩 (Col2a1 또는 Col10a1) 또는 듀 Col1a1 (Col2a1)에 대 한 스테인드 시각화 가능 하다.

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Disclosures

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

Acknowledgements

저자는 친절 하 게 제공 하 고 유전자 변형 쥐 리 첸 조직학 지원에 대 한 박사 데이비드 로우를 감사 하 고 싶습니다.

이 간행물에 보고 된 연구는 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구의 보너스 번호 K08DE025914에서 건강의 국가 학회 및 미국 협회의 교정 기초 Sumit Yadav에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MX20 Radiography System Faxitron X-Ray LLC 
Digimizer Image software  MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006
Manual microscope Axio Imager Z1 Carl Zeiss 208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP Chroma Technology Corp 49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP Chroma Technology Corp 49001
red fluoresecent protein filter - Cy5 Chroma Technology Corp 49009
sodium acetate anhydrous Sigma-Aldrich S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate  Sigma-Aldrich 228729
sodium nitrite  Sigma-Aldrich 237213
ELF97 substrate Thermo Fisher Scientific E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit Life Technologies C10339  includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Scientific D1306
Sodium phosphate dibasic  Sigma-Aldrich S3264
Sodium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich 71505
Toluidine Blue O  Sigma-Aldrich T3260
Adobe Photoshop  Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Research Products International P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism  GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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