En Morphometric og mobilnettet analysemetode for Murine Mandibular Condyle

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dette manuskriptet presenterer metoder for å analysere morphometric og mobilnettet endringer i den mandibular condyle av gnagere.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dutra, E. H., O'Brien, M. H., Lima, A., Nanda, R., Yadav, S. A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle. J. Vis. Exp. (131), e55998, doi:10.3791/55998 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kjeveledd (TMJ) har kapasitet til å tilpasse seg ytre stimuli, og lasting endringer kan påvirke plasseringen av Kondyler og strukturelle og cellulær komponentene av mandibular condylar brusk (MCC). Dette manuskriptet beskriver metoder for å analysere disse endringene og en metode for å endre lasting av TMJ i mus (dvs. kompresjons statisk TMJ lasting). Strukturelle evalueringen illustrert her er en enkel morphometric tilnærming som bruker Digimizer programvare og utføres i røntgenbilder av små bein. I tillegg analyse av mobilnettet endres fører til endringer i kollagen uttrykk, ubalanse, celledeling, og proteoglycan distribusjon i MCC er beskrevet. Kvantifisering av endringene i histologiske seksjoner - ved å telle de positive fluorescerende bildepunktene med programvare og måle avstanden tilordningen og farget området med Digimizer - er også demonstrert. Metodene vises her er ikke begrenset til den murine TMJ, men kan brukes på flere bein av små forsøksdyr og i andre regioner i endochondral forbening.

Introduction

TMJ er en unik bærende felles ligger i craniofacial regionen og er dannet av fibrocartilage. MCC av TMJ er avgjørende for felles funksjon, inkludert uhindret kjeven bevegelse mens snakker og masticating, men det påvirkes vanligvis av degenerative sykdommer, inkludert slitasjegikt1. TMJ har kapasitet til å tilpasse seg eksterne stimuli og lasting endringer, fører til strukturelle og cellulær endringer i komponentene av MCC2,3,4,5. Bærende egenskapene til MCC kan forklares av samspillet mellom dens bestanddeler, inkludert vann, kollagen nettverket, og tett pakket proteoglycans. The MCC har fire forskjellige mobilnettet soner som uttrykker forskjellige typer kollagen og ikke-kollagen proteiner: 1) articular eller overfladiske sonen; 2) proliferativ sonen består av udifferensierte mesenchymal celler og som svarer til lasting krav; 3) de prehypertrophic sonen, består av modne chondrocytes uttrykke kollagen type 2; og 4) den hypertrofisk sone, regionen der de hypertrofisk chondrocytes uttrykke kollagen skriver 10 dø og gjennomgå forkalkninger. Ikke-mineraliserte regionen er rik på proteoglycans som gir motstand mot kompresjons styrker6.

Det er kontinuerlig mineralisering på hypertrofisk zone av MCC, der overgangen fra chondrogenesis til osteogenesis oppstår, garanterer robust mineral strukturen i subchondral bein av mandibular condyle7. Mobilnettet endringer i regionene unmineralized og mineralholdig til slutt føre til morfologiske og strukturelle endringer i mandibular condyle og kjeven. Vedlikehold av homeostase av alle mobilnettet regioner av MCC og mineraliseringen av delen subchondral er avgjørende for helse, bæreevne og integriteten til TMJ.

Flere kollagen transgene musemodell (som beskrevet av Utreja et al.) 8 er en stor verktøyet å bruk å forstå endringer i kollagen uttrykk fordi alle effekter av transgener uttrykkes i MCC. For en grundig histologiske evaluering brukes histologiske flekker å studere matrix deponering, mineralisering, celle spredning, og apoptose, samt protein uttrykk på ulike celle lag av MCC.

I dette brukes manuskriptet, histologiske og morphometric analyser til å evaluere mobilnettet og strukturelle endringer i MCC og subchondral Ben av det mandibular condyle mus. I tillegg er en celle kvantifisering metode, analysere fluorescerende histologiske bilder og kartlegging lys objektglass, beskrevet. Den kompresjons statisk TMJ lasting metoden, som fører til mobilnettet og morfologiske endringer på MCC og subchondral bein9, er også illustrert for å validere våre metoder.

Metodene som er beskrevet her kan brukes til å fastslå morphometric og histologiske endringer i mandibular condyle og kjeven av gnagere eller analysere andre områder av endochondral forbening og morfologi av ekstra mineralholdig vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr institusjon komiteen av universitetet i Connecticut Health Center godkjent alle dyr prosedyrer.

1. kompresjons statisk TMJ lasting: Munnen tvunget åpen

Merk: Fire-uke-gamle transgene mus skjuler fluorescerende journalister for kollagen (Col2a1XCol10a1), ber levert av Dr. David Rowe (Universitetet i Connecticut), ble brukt til eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet (n = 8, 4 mannlige og 4 kvinnelige). Col2a1 cyan (blå) transgene er uttrykt i celler ved prehypertrophic sonen for MCC, mens Col10a1 kirsebær (rød) celler finnes i hypertrofisk regionen8 (figur 1). Mus var like delt i to grupper: 1) lastet gruppen der mus ble utsatt for kompresjons statisk TMJ lasting (beskrevet i trinn 2) og 2) kontrollgruppen, der mus mottatt uten innblanding.

Figure 1
Figur 1. Representant sagittal av condyle med dobbel-kollagen fluorescerende reporter musen (Col2a1XCol10a1). Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Dikte springs usingbeta titanium legering archwires (0.017 x 0.025 in) (figur 2A).
  2. Bedøve forsøksdyr ved en intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin (90 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (13 mg/kg kroppsvekt).
  3. Forsiktig åpne munnen av mus og sett kilder, engasjerende looper i maxillary og mandibular fortenner (figur 2B og C).
  4. Indusere kompresjons statisk TMJ lasting ved å holde kildene i fortenner av bedøvet mus for 1 h. Gjenta denne fremgangsmåten for 5 dager.
  5. Sprøyte mus med 5-ethnyl-2'-deoxyuridine (EdU, 30 mg/kg kroppsvekt) intraperitoneally for celle spredning analyse 2 dager og 1 dag før euthanasia.

Figure 2
Figur 2. Kompresjons statisk TMJ lasting: munnen tvunget åpen modell. (A) våren fabrikert av 0.017 x 0.025 beta titanium legering archwire. (B) lastet musen med våren. (C) røntgenbilde av lastet og kontroll mus viser forskjeller i plasseringen av mandible. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. mandible disseksjon og fiksering

  1. Ved endepunktet av tvunget-åpen munn prosedyrer, euthanize forsøksdyr ved en godkjent metode.
  2. Dissekere Accolade ved å kutte det muskulære vedlegget uten skraping brusken i condyle.
  3. Sett de rengjorte Accolade i 10% formalin 24 h for fiksering.
    Forsiktig: Formalin er irriterende; bruke riktig personlig verneutstyr.

3. X-ray bildebehandling og Morphometric mål

  1. Plasser Accolade i en flat beholder (f.eks en 55 mm x 16 mm Petriskål) og ta røntgenbilder av eksemplene bruker CAB x-ray system på en 26 kV 5 s.
    Merk: Plass en skala bar før du lagrer bildene.
  2. Utføre morphometric målinger av Accolade bruker en analyseprogramvare (se Tabell for materiale).
    Merk: Før du utfører eventuelle målinger, bruke skala på røntgenbilde for å finne enheten. Dette trinnet er viktig å måle riktig anatomiske strukturer. Klikk på knappen "Enhet" (Figur 3A).
  3. Velg anatomiske punktene bruker "markør stil 2" i tenkelig programvare (Figur 3B). For å følge metoden beskrevet i dette dokumentet, velger du følgende punkter (Figur 3B):
    1. Velg condylion (punkt 1), mest bakre poenget med mandibular condyle;
    2. Velg helikopteret prosessen (Velg 2);
    3. Velg det dypeste punktet sigmoid hakket (punkt 3);
    4. Velg det dypeste punktet i concavity av mandibular ramus (punkt 4);
    5. Velg mest fremre poenget med condylar articular overflaten (punkt 5); og
    6. Velg mest bakre poenget med condylar articular overflaten (punkt 6).
  4. Når du har valgt den anatomiske punkt, utføre morphometric mål med verktøyet "lengde", men i hele hodet condyle, kan du bruke verktøyet "vinkelrette linjen" fra poeng (3) og (4) (Figur 3C).
    1. Måle mandibular lengden, fra condylion (1) til helikopteret prosessen (2).
    2. Måle condyle hodet lengden - vinkelrette avstanden fra condylion (1) til en linje spores fra det dypeste punktet sigmoid hakket (3) det dypeste punktet i concavity av mandibular ramus (4).
    3. Måle condyle hodet bredden - avstanden fra de fremre mest bakre poenget med condylar articular overflaten (5-6).
    4. Kopier målinger fra "måling list" til høyre på skjermen (Figur 3C).

Figure 3
Figur 3 . Fremstilling av morphometric målinger av mandible. (A) bruke skala av røntgenbilde for å finne enheten (sirkler i rødt, skala bar: 10 mm). (B) Velg anatomiske punktene bruker "markør stil 2" (sirkler i rødt). 1) Condylion; 2) helikopteret prosessen; 3) dypeste punktet sigmoid hakket; 4) dypeste punktet concavity av mandibular ramus; 5) fremre punktet på condylar articular overflaten; 6) bakre punktet på condylar articular overflaten. Skala bar: 10 mm.(C) utføre målinger med "lengde" og "vinkelrett" verktøy (sirkler i rødt). Målinger fra punkt 1 til 2: mandibular lengde; fra punkt 5 til 6: condylar bredde; vinkelrett fra punkt 1 til 4 - 3: condylar hodet lengde. Lagre mσlinger fra "måling list." Skala bar = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. condyle innebygging

Merk: Etter tar røntgen bilder, de kan være innebygd og delt for histologiske analyse.

  1. Plass undecalcified Accolade (som er løst i trinn 2.3) i 30% sukrose i PBS natten før innebygging.
  2. Dissekere eventuelle overskytende bløtvev og klippe den mandibular condyle.
  3. Hell noen innebygging harpiks (nok til å dekke prøven) i engangs plast former og Legg mediale overflaten på condyle mot bunnen av mold, posisjonering prøven parallelt til bunnen av mold.
  4. Fastsette prøven på riktig sted med et stykke tørris.
  5. Fylle formen med innebygging harpiks og plassere mold med fast prøven i kalde 2-metyl-butan, som kan være pre kjølt i en 20 ° C eller-80 ° C fryser eller tørris.
  6. Lagre prøver på 20 ° C eller-80 ° C før snitting.

5. condyle Sagittal snitting og lysbildet forberedelse

  1. Opprett frosne sagittal deler av Kondyler (5-7 µm) og overføre prøvene på lysbildet ved hjelp av tape overføring metoden10,11.
  2. Overholde delene histologiske overført på båndet med UV-helbredelig metoden10.

6. histologiske flekker og mikroskopiske bildebehandling

Merk: De fleste av histologiske flekker utføres som beskrevet i delen histologiske i papir av Dyment et al10.

  1. For planlagt skanning, er det første trinnet å image for Col2a1 og Col10a1 effekter av transgener, som beskrevet av Dyment et al10 .
    1. Plasser coverslips på lysbildene i 30% glyserol og PBS. Utføre planlagt bildebehandling ofthesectionswitha fluorescerende mikroskop og riktig filtre.
  2. Utføre fluorescerende tartrate-resistente sure fosfatase (TRAP) flekker.
    Merk: TRAP er uttrykt ved blodkreft cellene, inkludert benet resorbing celler, osteoklast12. Formålet med denne flekken er å analysere MCC og ubalanse i subchondral.
    1. Fjern dekkglassvæske lysbildene ved soaking dem i PBS. Vask lysbildene i PBS tre ganger i 5 minutter hver.
    2. Klargjør FELLE buffer 1 ved oppløsning natrium acetate vannfri (9.2 g) og natrium L-tartrate dibasic dihydrate (11.4 g) i 1 L destillert vann. Justere pH å 4.2 med eddiksyre og lagre FELLE bufferen 1 på 4 ° C.
    3. Forberede FELLE buffer 2 av ferske oppløse natrium nitritt (40 mg) i 1 mL destillert vann.
    4. Forberede FELLE substrat buffer (like før farging) ved å blande 7,5 mL buffer 1 og 150 µL av buffer 2. Bruk denne løsningen (200 µL) på hvert lysbilde i 10 min ved romtemperatur.
    5. Forberede FELLE reaksjon bufferen ved å blande 1.840 mL substrat bufferen og 23 µL av fluorescerende substrat (se Tabell for materiale).
      Merk: Den fluorescerende substrategeneratesayellowfluorescentsignal FELLE aktivitet.
    6. Fjern overflødig FELLE substrat buffer ved forsiktig pipettering løsningen.
    7. Inkuber lysbildene med 200 µL FELLE reaksjon bufferen for 5 min under et UV kilde pære svart lys.
    8. Vask lysbildene i PBS tre ganger i 5 minutter hver.
    9. Plasser coverslips på lysbildene i 30% glyserol i PBS og utføre mikroskopiske imaging10.
  3. Utføre celle spredning flekker.
    Merk: I denne analysen, den endrede thymidine analoge 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) er innlemmet i nylig syntetisert DNA: dele celler er merket med et fluorescerende fargestoff.
    1. Avbildning for FELLE, fjerne coverslips og vaskes lysbildene i PBS tre ganger i 5 minutter hver. Følg trinnene i 5-ethynyl-2-deoxyuridine celle spredning Kit stain delene histologiske.
    2. Forberede en reaksjon cocktail ved å legge til 430 µL av 1 X reaksjon buffer, 20 µL CuSO4, 1,2 µL fluorescerende fargestoff og 50 µL 1 X buffer additiv (et totalt volum på 500 µL er nok for ett lysbilde).
      Merk: Produsenten anbefaler å legge ingrediensene i rekkefølgen som er beskrevet her.
    3. Inkuber lysbildene med forberedt cocktailer i 30 min ved romtemperatur, beskyttet mot lyset.
    4. Vask lysbildene i PBS tre ganger i 5 minutter hver.
    5. Plasser coverslips på lysbildene i 30% glyserol i PBS med 1:1,000 DAPI.
      Merk: DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) er en blå fluorescerende kjernefysiske flekk som binder til AT rike regioner i DNA.
  4. Utføre Toluidine blå (TB) flekker.
    Merk: TB flekker avslører proteoglycan distribusjonen på MCC.
    1. Skyll lysbilder-indistilledwater for å fjerne coverslips.
    2. Fjerne coverslips, vaskes lysbildene i destillert vann tre ganger i 5 min hver fjerne salter fra PBS.
    3. Forberede TB arbeider bufferen ved å gjøre løsning en (uttoning 28,4 g av natrium fosfat dibasic i 1 L destillert vann) og B (oppløsning 27.6 g av natrium fosfat monobasic i 1 L destillert vann)-løsning. Blanding 94,7 mL løsning A med 5,3 mL løsning B. Dilute denne løsning 1:1 i destillert vann å gjøre 200 mL 0.1 M arbeider buffer. Riktig pH til 8.0 ved å legge natriumhydroksid til pH er løst.
    4. Forberede 1% aksjer TB: Bland 1 g TB i 100 mL destillert vann.
    5. Forberede TB fungerende løsning ved å blande 40 mL 0.1 M arbeider buffer i 3 mL 1% aksjer TB.
    6. Inkuber lysbildene i TB arbeider løsningen for 14-17 s.
      Merk: Denne flekken er veldig tidsavhengig; inkubasjon tiden må justeres for å forhindre overstaining.
    7. Vask lysbildene i destillert vann tre ganger i 5 minutter.
    8. Plass coverslips på lysbildene i 30% glyserol i destillert vann. Utføre lys mikroskop imaging10.
      Merk: Gjør ikke dekkglassvæske lysbildene farget for TB glyserol + PBS. PBS vasker ut denne typen flekken.

7. fluorescerende histologiske kvantifisering

  1. Utføre histologiske kvantifisering av fluorescerende bilder ved hjelp av en analyseprogramvare (se Tabell for materiale).
    Merk: For histologiske kvantifisering i denne metoden er å dele antall fluorescerende piksler rundt antall piksler på området av interesse og multiplisere fått nummeret med 100, som resulterer i en prosentandel av positive piksler i regionen.
  2. Utføre kvantifiseringen Col10a1 uttrykk i MCC sagittal deler av Kondyler.
    1. Når kvantifisere alle typer celler og flekker med denne metoden, kan du velge området for å være kvantifisert. Åpne histologiske i en analyseprogramvare og Velg området ved hjelp av "Lasso verktøyet (L)" (Figur 4A). For analyse beskrevet her, Velg MCC regionen Når du har valgt området, vises antall piksler i boksen "Histogrammet" på skjermen av programvaren (Figur 4A). Lagre antall piksler i området av interesse.
    2. Velg Col10a1 rød bildepunktene ved hjelp av verktøyet prøvetaking. Klikk på "Velg" på topp panel og deretter "Fargeområde." Klikk på "pipetteverktøyet," Velg prøven farge for bildepunktet rundt i bildet, og klikk "OK". Alle områder positiv for valgte pixel fargen blir valgt (Figur 4B). Kopier antall fluorescerende piksler (vist i boksen "Histogrammet" på skjermen) og lime dem inn i et regneark eller statistisk programvare for analyse.
    3. Skillet fluorescent pikselantallet over antall piksler på området av interesse og multipliserer du dette tallet med 100: fluorescerende piksler / piksler i interesseområde * 100.
      Merk: Andre typer celler, for eksempel blå Col2a1, kan kvantifiseres med denne samme metode, men blå bildepunktene skal velges i stedet for Col10a1 røde bildepunktene.

Figure 4
Figur 4 . Representasjon av transgene Col10a1 kvantifisering. (A) Velg området av interesse med "Lasso Tool" (L). For Col10a1-positive celler, merker du hele mandibular brusk. Lagre antall piksler i boksen "histogrammet". (B) Velg piksel av interesse, i dette tilfellet de røde fluorescerende Col10a1 pikslene. Merk at bare røde bildepunktene innenfor området av interesse vil bli valgt. Lagre antall røde piksler i boksen "histogrammet". Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Utføre kvantifiseringen FELLE aktivitet i MCC og subchondral benet.
    1. Følg fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 8.2, men i stedet for bare å velge MCC området, Velg brusk og subchondral bein områdene (figur 5A).
    2. For TRAP aktivitetsanalyse, Velg gule bildepunktene generert av ELF97 underlaget, som beskrevet i trinn 8.2.2 (figur 5B); kopiere antall positive piksler; og lime dem inn i et regneark eller statistisk programvare for analyse.
    3. Få andelen FELLE-positive piksler ved å dele antall gule x antall piksler i regionen subchondral bein og multiplisere med 100.

Figure 5
Figur 5 . Representasjon av fluorescerende FELLE kvantifisering. (A) velge området av interesse (mandibular brusk og subchondral bein) og lagre antall piksler i denne regionen. (B) Velg gule fluorescerende piksler, som representerer FELLE aktivitet. Merk at bare FELLE-positive bildepunkter skal velge. Lagre valgte pikselantallet. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Utføre kvantifiseringen EdU-positive celler.
    1. EdU-farget lysbilder er counterstained med DAPI, så i stedet for å telle antall piksler i regionen rundt, velger DAPI-positive bildepunktene å beregne prosentdelen EdU-positive piksler. Velg området av interesse som beskrevet i trinn 8.2, men ikke lagre antall piksler. Velg DAPI blå bildepunktet som fargeprøven, som beskrevet i trinn 8.2.2; kopiere antall DAPI-positive piksler (figur 6en); og lime dem inn i et regneark eller statistisk programvare for analyse.
    2. Neste, Velg EdU-positive bildepunktene (gul fluorescerende piksler) og lagre antall piksler i boksen "histogrammet" (figur 6B).
    3. Beregning av EdU piksler ved å dele antall EdU-positive x antall DAPI-positive piksler og fått tallet multipliseres med 100.

Figure 6
Figur 6 . Representasjon av EdU kvantifisering. (A) Velg proliferativ regionen i MCC (den ytre lag av brusken). Velg DAPI-positive bildepunkter og lagre antall piksler. (B) Velg EdU-positive piksler (gul fluorescerende) og lagre antall piksler. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

8. kvantifisering av brusk tykkelse og Proteoglycan distribusjon

  1. Analysere brusk tykkelsen (avstand tilordning) og det toluidine blå-farget området med den Digimizer programvaren.
    Merk: Bruke baren skala histologiske bildet til å angi enheten (figur 7et).
  2. Utføre et avstandsmål kartlegging.
    Merk: Kartlegging avstandsmåling vil gi tykkelsen av brusken på mandibular condyle. I metoden beskrevet her, velges fem regioner av MCC som gir et gjennomsnitt av samlet tykkelsen på MCC. Forskeren kan velge å måle tre ulike regioner, eller enda en enkelt region i MCC.
    1. Bruke verktøyet "lengde", måle lengden av brusk fra den ytre overflaten på slutten av toluidine blå-farget området (figur 7B) i fem regioner eller i så mange plasseringer som foretrukket.
    2. Kopiere lengdemål fra "måling list."
      Merk: Programvaren inneholder også et gjennomsnitt av målinger (figur 7B).
  3. Måle toluidine blå-farget området.
    Merk: I måling av toluidine blå-farget området, proteoglycan området i MCC oppnås.
    1. Velg "området" og profilere toluidine blå-farget området (figur 7C).
    2. Kopiere området målinger fra "måling list."

Figure 7
Figur 7 : Representasjon av proteoglycan distribusjon kvantifisering. (A) bruke skala av histologiske bildet for å finne enheten ved å klikke på knappen "enhet" (sirkler i rødt, enheten som er valgt: 500 µm). (B) måle tykkelsen av brusken i ulike steder ved hjelp av verktøyet "lengde" (sirkler i rødt). Lagre målinger fra "måling list" i øvre høyre panel. Programvaren gir også "statistikk" i nedre høyre panel, så av mean og SD av målinger kan fås direkte. (C) mål toluidine blå-farget området ved hjelp av verktøyet "området" (sirkler i rødt). Sirkel området av interesse og lagre målenheten fra "måling list." Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deskriptiv statistikk ble utført for å undersøke fordelingen av morphometric mål (mandibular lengde, condylar lengde, condylar bredde) og histologiske analyser. Resultatene var forhold mellom gruppen lastet (dvs. mus underlegges kompresjons lasting med beta Titan våren) og kontrollgruppen (dvs. som matchet kontroll mus som ikke fikk noen prosedyre). Statistisk betydelige forskjeller mellom midler ble fastsatt av kortet t-test, og p-verdien < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.

Morphometric mål, som beskrevet i trinn 4 og Figur 3, ble utført i Accolade av den lastet og kontroll grupper. Gruppen lastet presentert med betydelig økt mandible lengde (lastet: 16.62 ± 0,23 mm versus kontroll: 16.21 ± 0.2 mm; p < 0,05) og condyle hodet lengde (lastet: 4.6 mm, SD 0,08 mm versus kontroll: 4.4 mm; SD 0,06; p < 0,05) sammenlignet med kontrollgruppen. Likevel, det var ingen signifikant forskjell i condyle bredde mellom grupper (lastet: 3,06 ± 0,12 mm versus kontroll: 2,9 ± 0,11, p = 0.09).

Kvantifisering av kollagen distribusjon ved hjelp av metoden beskrevet i trinn 8 avslørt betydelig økt Col10a1 uttrykk i MCC av Kondyler av gruppen lastet i forhold til kontrollen (lastet: 21% ± 4,46% versus kontroll: 7,50% ± 2.03, p < 0.005; Figur 8 A og D). På den annen side, det var ingen statistisk forskjell i Col2a1 uttrykk mellom den lastet og kontroll grupper (lastet: 4.85 ± 1,95% versus kontroll: 2,92% ± 1.89, p = 0,13; Figur 8 B og E). I tillegg analyse av FELLE aktivitet viste økt FELLE-positive regioner i subchondral regionen Kondyler lastet mus (lastet: 5,28 ± 1,45% versus kontroll: 2.41% ± 1.39; p < 0,05; Figur 8 C og F). Tilsvarende vi observerte økt celle spredning, som indikert av økt EdU-positive celler i MCC av gruppen lastet i forhold til kontroll mus (lastet: 6.23 ± 1.89% versus kontroll: 1,90% ± 1,03; p < 0,05; Figur 9 A og C).

Proteoglycan distribusjon i MCC av lastet og kontroll mus ble kvantifisert ved å evaluere toluidine blå-farget området og avstand kartet, som beskrevet i trinn 9 og figur 7. Vi fant betydelig økt avstand kartlegging i MCC av Kondyler av gruppen lastet i forhold til kontroll (lastet: 210.22 µm ± 4.11 µm versus kontroll: 187.36 µm ± 8,64 µm; p < 0.005; Figur 9 B og D). Men proteoglycan-farget området var ikke statistisk forskjellig mellom den lastet og kontroll grupper (lastet: 203,897.93 µm2 ± 10,171.00 µm2 versus kontroll: 202,875.09 µm2 ± 33,419.09 µm2, p = 0,94; Figur 9 B og E)

Figure 8
Figur 8 : Representant resultater: (A) Col10a1-positive celler i delen sagittal i MCC av Kondyler av kontroll og lastet musene. Det er økt antall Col10a1-positive celler i gruppen lastet (D). (B) Col2a1-positive celler i kontroll og lastet musene. Det er ingen forskjell i Col2a1-positive celler mellom grupper (E). (C) FELLE farging i Kondyler kontroll og lastet musene. Økt FELLE aktivitet i gruppen lastet i forhold til kontroll (F). Histogrammer (D-F) representerer betyr ± SD n = 4 per gruppe. ** Signifikant forskjell mellom kontrollen og lastet grupper (p < 0.005). Skala bar = 200µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9:representant resultater: (A) EdU farging i Kondyler kontroll og lastet musene. Økt celle spredning i gruppen lastet celler representert ved økt EdU-positive (C). (B) Toluidine blå flekker i Kondyler kontroll og lastet musene. Økt brusk tykkelse i lastet musene, som vist av økt avstand kartlegging i forsøksgruppen (D). Ingen forskjell i proteoglycan-farget området mellom kontrollen og lastet grupper (E). Histogrammer (C-E) representerer betyr ± SD n = 4 per gruppe. ** Signifikant forskjell mellom kontrollen og lastet grupper (p < 0.005). Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette manuskriptet beskrevet metoder for morphometric måling og mobilnettet analyse av murine mandibular Kondyler og Accolade. Røntgen morphometric målinger kan også brukes til å analysere andre bein fra experimental smådyr. I tillegg cellular analyse (celle kvantifisering og brusk avstand kartlegging) er ikke begrenset til den gnager mandibular condyle, men kan brukes å kvantifisere histologiske deler av mange vev.

Transgene musen modeller uttrykker fluorescerende journalister er gode verktøy å visuelt forstå endringer i genuttrykk. Dobbel-kollagen fluorescerende reporter musemodell (Col2a1XCol10a1) i denne rapporten var spesielt egnet for studiet av MCC, siden de effekter av transgener uttrykkes i prehypertrophic og hypertrofisk av MCC så at kollagen distribusjon kunne vurderes. Hvis hun ikke har tilgang til en transgene musemodell uttrykke fluorescerende journalister, kan andre metoder for histologiske protein uttrykk analyse, som immunofluorescence, brukes.

For morphometric-målinger er det kritiske trinnet før du tar regjeringen røntgenbilde bildene å fjerne alle myke vev mandible eller bein som skal analyseres. Overdreven muskel eller bløtvev knyttet til bein kan maskere virkelige målinger av strukturer. Det er viktig å være klar over begrensningene av skap røntgenbilde. Som hver x-ray, det er en 2-dimensjonal representasjon av en 3-dimensjonal struktur og overlapping av strukturer og gjenstander tolkes nøye. I tillegg bør plasseringen av bein i røntgen regjeringen være konsekvent.

Mobilnettet kvantifiseringen ved å telle antall positive piksler er en effektiv metode for histologiske kvantifisering i en celle-rik region som MCC, men begrensningen av denne tilnærmingen er at det ikke gir nøyaktig antall celler. I tillegg siden det kvantifiserer bare piksler valgt, anbefales det å kvantifisere alle bildene rundt bruker samme "samplet" pixel for å unngå kvantifisering av piksler på forskjellige intensiteter når analysere forskjellige bilder.

En generell råd når kvantifisere histologiske deler er å analysere flere serielle deler av hvert utvalg (i dette manuskriptet tre serielle deler ble analysert for hver condyle), siden variasjoner i hvert utvalg er vanligvis observert.

Metodene nevnt i vår eksperimenter er enkel, lett å bruke, og kan brukes i alle mineralholdig vev studie i som reporter mus brukes. Med eksisterende metodikk er det mulig å visualisere cellene som er farget for TRAP (Col2a1 eller Col10a1) eller EdU (Col1a1 eller Col2a1) ved å visualisere den co lokaliseringen av celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgements

Forfatterne vil gjerne takke Dr. David Rowe for vennlige gir transgene mus og Li Chen for histologiske hjelp.

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute for Dental & Craniofacial forskning av National Institutes of Health under prisen nummer K08DE025914 og av American Association for ortodontiske Foundation til Sumit Yadav.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MX20 Radiography System Faxitron X-Ray LLC 
Digimizer Image software  MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006
Manual microscope Axio Imager Z1 Carl Zeiss 208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP Chroma Technology Corp 49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP Chroma Technology Corp 49001
red fluoresecent protein filter - Cy5 Chroma Technology Corp 49009
sodium acetate anhydrous Sigma-Aldrich S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate  Sigma-Aldrich 228729
sodium nitrite  Sigma-Aldrich 237213
ELF97 substrate Thermo Fisher Scientific E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit Life Technologies C10339  includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Scientific D1306
Sodium phosphate dibasic  Sigma-Aldrich S3264
Sodium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich 71505
Toluidine Blue O  Sigma-Aldrich T3260
Adobe Photoshop  Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Research Products International P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism  GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8, (3), 291-305 (1997).
  2. Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17, (3), 354-361 (2009).
  3. Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26, (1), 1-5 (2004).
  4. Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15, (57), (2014).
  5. Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11, (10), 0164599 (2016).
  6. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
  7. Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84, (8), 691-699 (2005).
  8. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24, (2), 335-344 (2016).
  9. Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11, (7), 0160121 (2016).
  10. Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. e54468 (2016).
  11. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, (2), 123-143 (2003).
  12. Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41, (3), 218-223 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics