Morphometric ושיטת ניתוח הסלולר עבור המפרקתי הנמוך מאתר הלסת

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

כתב יד זה מציג שיטות לניתוח morphometric, שינויים סלולריים בתוך בעצם הלסת של מכרסמים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dutra, E. H., O'Brien, M. H., Lima, A., Nanda, R., Yadav, S. A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle. J. Vis. Exp. (131), e55998, doi:10.3791/55998 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מפרק לסתי-רקתי (TMJ) יש את היכולת להסתגל לגירויים חיצוניים, טעינת שינויים יכול להשפיע על המיקום של condyles, כמו גם את הרכיבים הסלולר מבניים של הסחוס condylar mandibular (MCC). כתב יד זה מתאר שיטות לניתוח שינויים אלה, שיטה לסירוס ועיקור הטעינה של למפרק לסתי-רקתי בעכברים (קרי, compressive סטטי TMJ טעינה). ההערכה מבניים מאויר כאן היא גישה פשוטה morphometric משתמשת התוכנה Digimizer, מבוצע במסגרת צילומי רנטגן של עצמות קטנות. בנוסף, הניתוח של הסלולר משתנה מובילים שינויים בביטוי קולגן, עצם שיפוץ, חלוקת התא, הפצה פרוטאוגליקן MCC מתואר. כימות של שינויים אלה בסעיפים היסטולוגית - על ידי ספירת הפיקסלים פלורסנט חיובי באמצעות תמונה תוכנה ומדידת מרחק המיפוי והמוכתמות אזור עם Digimizer - גם הוכח. השיטות המוצגות כאן אינם מוגבלים למפרק לסתי-רקתי מאתר, אך יכול לשמש על נוספים עצמות של חיות ניסוי קטן ובאזורים אחרים של התקשות endochondral.

Introduction

למפרק לסתי-רקתי ג'וינט-נושאת ייחודי הממוקם באזור ואסטתיים, בנוי fibrocartilage. MCC של למפרק לסתי-רקתי הוא חיוני עבור תפקוד המפרקים, כולל תנועת הלסת בוויטנברג באין מפריע תוך כדי דיבור, masticating, אבל זה מושפע בדרך כלל מחלות ניווניות, כולל דלקת מפרקים ניוונית1. למפרק לסתי-רקתי יש את היכולת להסתגל לגירויים חיצוניים והשינויים הטעינה, מובילים לשינויים מבניים הסלולר הרכיבים של4,53,2,MCC. מאפייני-נושאת MCC יכולה להיות מוסברת על ידי האינטראקציות בין המרכיבים שלה, כולל מים, הרשת קולגן, וארזו בצפיפות proteoglycans. MCC ה יש ארבעה אזורי הסלולר ברורים המבטאים סוגים שונים של קולגן, הלא-קולגן חלבונים: 1) לאזור שטחית או במפרק; 2) אזור המקדימות, מורכב של תאים mesenchymal מובחן זה מגיב טעינת דרישותיהם; 3) אזור prehypertrophic, המורכבת chondrocytes בוגרת לבטא קולגן מסוג 2; . ו-4) הסתיידות באזור, האזור בו chondrocytes היפרטרופית לבטא קולגן להקליד 10 אמות ומבצעת היפרטרופית. האזור הלא-על בסיס מינרלים מן הוא עשיר proteoglycans המספקים עמידות בפני כוחות compressive6.

. יש רציף מינרליזציה באיזור היפרטרופית של מפקד צוות משימה, שבו מתרחש המעבר chondrogenesis פרכת, המבטיח המבנה מינרל עמיד של עצם subchondral של בעצם הלסת7. שינויים סלולריים באזורים unmineralized, על בסיס מינרלים מן בסופו של דבר להוביל שינויים מבניים מורפולוגיים בעצם הלסת, לסת תחתונה. תחזוקת הומאוסטזיס בכל אזורי הסלולר MCC, את מינרליזציה של החלק subchondral חיוניים לבריאות, תומך קיבולת ותקינות למפרק לסתי-רקתי.

המודל העכבר הטרנסגניים מרובים קולגן (כמתואר על-ידי. Utreja et al.) 8 הוא כלי נהדר לשימוש להבין שינויים בביטוי קולגן כי כל transgenes באים לידי ביטוי MCC. עבור הערכה היסטולוגית מעמיק, כתמי היסטולוגית משמשים ללמוד מטריקס התצהיר, מינרליזציה, התפשטות תאים, אפופטוזיס, וכן ביטוי חלבון שכבות תאים שונים MCC.

זה כתב היד, היסטולוגית וניתוחים morphometric משמשים להעריך את השינויים תאיות בעצם MCC ו- subchondral של בעצם הלסת של עכברים. בנוסף, שיטת כימות תא, עבור ניתוח תמונות היסטולוגית פלורסנט, מיפוי שקופיות מיקרוסקופ אור, מתואר. לסתי סטטי compressive העמסת שיטה, אשר גורמת שינויים מורפולוגיים הסלולר MCC ו- subchondral עצם9, מומחש גם כדי לאמת את השיטות שלנו.

ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי לקבוע morphometric ושינויים היסטולוגית בעצם הלסת, לסת תחתונה של מכרסמים או כדי לנתח את האזורים האחרים של התקשות endochondral ואת המורפולוגיה של רקמות על בסיס מינרלים מן נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים של מרכז הבריאות באוניברסיטת קונטיקט אישר כל ההליכים בבעלי חיים.

1. compressive לסתי-רקתי סטטי טעינה: הפה פרץ

הערה: בת שבוע-ארבע העכברים הטרנסגניים מחסה פלורסנט כתבים של קולגן (Col2a1XCol10a1), יצר לנוחיותנו מאת ד ר דוד רואו (מאוניברסיטת קונטיקט), שימשו את הניסויים המתוארים בכתב היד (n = 8; 4 זכרים ונקבות 4). Transgene (כחול) Col2a1 ציאן מתבטא בתאים באיזור prehypertrophic של MCC, תוך Col10a1 תאים (אדום) דובדבן נמצאים באזור היפרטרופית8 (איור 1). עכברים באותה מידה היו מחולקים לשתי קבוצות: קבוצה 1) טעון, שבו היו נתונים עכברים compressive לסתי סטטי טעינה (שמתואר שלב 2) ו-2) קבוצת הביקורת, איפה עכברים התקבל ללא התערבות.

Figure 1
איור 1. נציג הווריד של המפרקתי הנמוך של עכבר כתב פלורסנט כפול-קולגן (Col2a1XCol10a1). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. לפברק מעיינות usingbeta טיטניום סגסוגת archwires (in 0.017 x 0.025) (איור 2א).
  2. עזים ומתנגד של חיות ניסוי על ידי זריקה בקרום הבטן של תערובת של קטאמין (90 מ"ג/ק"ג משקל גוף) חריגות השירותים הווטרינריים (13 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
  3. בעדינות פתח את הפה של העכברים והכנס המעיינות, וישתתפו הלולאות בלסת העליונה והתחתונה (איור 2-B ו- C).
  4. לגרום compressive טעינה TMJ סטטי על ידי שמירה על המעיינות ב החותכות של העכברים anesthetized עבור ה 1 חזור על הליך זה עבור 5 ימים.
  5. מזריקים העכברים 5-ethnyl-2'-deoxyuridine (אדו; 30 מ"ג/ק"ג משקל גוף) intraperitoneally לניתוח התפשטות תא 2 ימים ויום אחד לפני המתת חסד.

Figure 2
באיור 2. Compressive טעינה TMJ סטטי: הפה בכוח דגם פתוח. (א) האביב מפוברק של 0.017 x 0.025 archwire סגסוגת של טיטניום בטא. (B) עכבר טעון עם האביב. (ג) Radiograph של טעון, בקרת עכברים מציג הבדלים במיקום של הלסת התחתונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. מנדיבל לנתיחה, קיבוע

  1. על נקודת הקצה של ההליכים כפה פעור הפה, המתת חסד של חיות ניסוי על ידי שיטה שאושרו.
  2. לנתח את הלסת על ידי חיתוך המצורף שרירים ללא גירוד את הסחוס של המפרקתי הנמוך.
  3. מקם את הלסת נקי בפורמלין 10% במשך 24 שעות ביממה עבור קיבעון.
    התראה: פורמלין הוא מטרד; ללבוש ציוד מגן אישי המתאים.

3. רנטגן הדמיה ומדידות Morphometric

  1. למקם את הלסת במיכל שטוח (למשל, 55 מ"מ x 16 מ"מ פטרי), לקחת צילומי רנטגן של הדגימות באמצעות מערכת רנטגן ארון-26 kV עבור 5 s.
    הערה: הנח סרגל קנה מידה לפני שמירת התמונות.
  2. לבצע מדידות morphometric הלסת באמצעות תוכנת ניתוח של התמונה (ראה את הטבלה של חומרים).
    הערה: לפני ביצוע המדידות הקיימות, להשתמש בקנה מידה בפס-radiograph כדי לקבוע את היחידה. השלב זה חשוב למדוד כראוי את מבנים אנטומיים. לחץ על לחצן "יחידה" (איור 3א).
  3. בחר את נקודות אנטומיות בעזרת "סמן סגנון 2" תוכנת הדמיה (איור 3ב). כדי להשתמש בשיטה המתוארת במאמר זה, בחר את הנקודות הבאות (איור 3ב):
    1. בחר את condylion (נקודה 1), נקודת האחורי ביותר של בעצם הלסת;
    2. בחר את התהליך החותכת (נקודה 2);
    3. בחירת הנקודה העמוקה ביותר על החריץ סיגמואידי (נקודת 3);
    4. בחר הנקודה העמוקה ביותר השקערורית של ramus הלסת (נקודת 4);
    5. בחר בנקודת הקדמי ביותר של המשטח במפרק condylar (נקודת 5); ו
    6. בחר בנקודת האחורי ביותר של המשטח במפרק condylar (נקודה 6).
  4. לאחר בחירת נקודות אנטומיות, לבצע מדידות morphometric באמצעות הכלי "משך", אך אורך הראש המפרקתי הנמוך, השתמש בכלי "קו אנכי" של נקודות (3) ו- (4) (איור 3ג').
    1. למדוד את אורך הלסת, מ condylion (1) את תהליך החותכת (2).
    2. למדוד את אורך הראש המפרקתי הנמוך - המרחק בניצב condylion (1) קו לייחס מן הנקודה העמוקה ביותר על החריץ סיגמואידי (3) עד לנקודה העמוקה ביותר בתוך השקערורית של ramus הלסת (4).
    3. למדוד את רוחב הראש המפרקתי הנמוך - המרחק בין הכי והשתרשה עמוק בלבה הנקודה האחורי ביותר של המשטח במפרק condylar (5-6).
    4. העתק את המידות מהרשימה"מדידה" בצד ימין של המסך (איור 3ג').

Figure 3
איור 3 . ייצוג של מדידות morphometric של הלסת התחתונה. (א) להשתמש בסרגל בקנה מידה של radiograph כדי לקבוע את יחידת (בעיגול אדום, סרגל קנה מידה: 10 מ מ). (B) בחר את נקודות אנטומיות בעזרת "סמן סגנון 2" (בעיגול אדום). 1) Condylion; 2) השן החותכת תהליך; 3) נקודת העמוק החריץ סיגמואיד; 4) העמוק טעם השקערורית של ramus הלסת; 5) רוב נקודת הקדמי של המשטח במפרק condylar; 6) רוב הצבע האחורי של המשטח במפרק condylar. סרגל קנה מידה: 10 מ מ. מידות(ג) בצע את "משך" והכלים "אנכי" (בעיגול אדום). מדידות מנקודה 1 עד 2: אורך הלסת; מנקודה 5 עד 6: רוחב condylar; אנך מן הצבע 1 עד 4 - 3: אורך הראש condylar. להציל את המידות מרשימת"מדידה". סרגל קנה מידה = 10 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. בעצם הטבעה

הערה: לאחר נטילת הדימויים רדיוגרפי, הלסת יכול להיות מוטבע, למחלקה לבדיקה היסטולוגית.

  1. מקם הלסת undecalcified (זה תוקנו בשלב 2.3) ב- 30% סוכרוז ב- PBS בן לילה לפני הטבעה.
  2. לנתח כל עודף רקמות רכות, לחתוך בזהירות את בעצם הלסת.
  3. יוצקים מעט שרף ההטבעה (מספיק כדי לכסות את הדגימה) בתבניות פלסטיק חד פעמיות ומניחים השטח המדיאלי של בעצם נגד הבסיס של העובש, מיקום הדגימה מקבילים לתחתית התבנית.
  4. לתקן את הדגימה במקום הנכון עם חתיכת קרח יבש.
  5. למלא את התבנית עם הטבעה שרף ומניחים את התבנית עם דגימת קבוע תוך קר 2-מתיל-בוטאן, אשר יכול להיות טרום מקורר במקפיא-20 ° C או -80 ° C או בתוך קרח יבש.
  6. לאחסן את דגימות ב-20 ° C או ב- 80 ° C עד חלוקתה.

5. בעצם הסאגיטלי חלוקתה והכנת השקופיות

  1. ליצור מקטעי הסאגיטלי קפוא condyles (5-7 מיקרומטר) ולהעביר את הדגימות אל השקופית באמצעות10,11שיטת העברת הקלטת.
  2. דבקים הסעיפים היסטולוגית להעביר את הקלטת באמצעות שיטה לריפוי-UV10.

6. היסטולוגית מכתים והדמיה מיקרוסקופיים

הערה: רוב ההכתמה היסטולוגית מתבצע כמתואר בסעיף היסטולוגית של הנייר על-ידי Dyment et al10.

  1. עבור סריקה בסיסית, הצעד הראשון הוא תמונה עבור Col2a1 ו- Col10a1 transgenes, כפי שתואר על ידי Dyment et al10 .
    1. מקום coverslips על השקופיות גליצרול 30% ו- PBS. מבצעים ofthesectionswitha הדמיה בסיסית מיקרוסקופ פלואורסצנטי המסננים המתאימים.
  2. לבצע צביעת פוספטאז פלורסנט tartrate חסיני חומצה (השמנה).
    הערה: מלכודת מבוטא על ידי תאים hematopoietic, כולל העצם resorbing תאים, osteoclasts12. המטרה של הכתם הזה הוא לנתח MCC ובניה עצם subchondral.
    1. הסר את coverslip של השקופיות בהשריה ב- PBS. לשטוף את השקופיות ב- PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.
    2. להכין מאגר מלכודת 1 על ידי המסת סודיום אצטט נטול מים (גרם 9.2), נתרן L-tartrate dibasic וגופרית והרכבו (11.4 גרם) ב- 1 ליטר של מים מזוקקים. להתאים את ה-pH ל 4.2 עם חומצה אצטית ולאחסן את מאגר מלכודת 1-4 מעלות צלזיוס.
    3. להכין מאגר מלכודת 2 על ידי המסת טרי נתרן חנקיתי (40 מ ג) ב 1 מ"ל של מים מזוקקים.
    4. להכין מלכודת המצע מאגר (רק לפני צביעת) על ידי ערבוב 7.5 mL של מאגר 1 ו- 150 µL מאגר 2. פתרון זה (200 µL) חלות על כל שקופית 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. להכין מאגר התגובה מלכודת על ידי ערבוב mL 1.840 המצע מאגר ו- µL 23 של מצע פלורסנט (ראה את הטבלה של חומרים).
      הערה: substrategeneratesayellowfluorescentsignal פלורסנט לפעילות מלכודת.
    6. להסיר את עודף מאגר המצע מלכודת על ידי בעדינות pipetting את הפתרון.
    7. דגירה של השקופיות עם 200 µL מלכודת מאגר תגובה עבור 5 דקות תחת אור UV נורת מקור שחור.
    8. לשטוף את השקופיות ב- PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.
    9. מקום coverslips בשקופיות גליצרול 30% ב- PBS ולבצע הדמיה מיקרוסקופיים10.
  3. לבצע צביעת התפשטות תאים.
    הערה: ב- assay הזה, תימידין ששונה אנלוגי 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) הוא שולב עתה שתוקף: החלוקה תאים מסומנים בתווית של הפלורסנט.
    1. לאחר הדמיה של השמנה, להסיר את coverslips ולשטוף את השקופיות ב- PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות. בצע את השלבים הערכה התפשטות 5-ethynyl-2'-deoxyuridine תא כתם הסעיפים היסטולוגית.
    2. להכין תגובה קוקטייל על-ידי הוספת 430 µL 1 X תגובת מאגר, µL 20 CuSO4, µL 1.2 של הפלורסנט, µL 50 1 X מאגר תוסף (הנפח הכולל של 500 µL הוא מספיק עבור שקופית אחת).
      הערה: היצרן ממליץ על הוספת המרכיבים לפי הסדר המתואר כאן.
    3. דגירה של השקופיות עם הקוקטיילים מוכן במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
    4. לשטוף את השקופיות ב- PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.
    5. מקום coverslips על השקופיות גליצרול 30% ב- PBS עם 1:1,000 דאפי.
      הערה: דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole) הוא כתם כחול גרעיני פלורסנט המאגד AT-עשיר אזורים ב- DNA.
  4. לבצע צביעת טולדין כחול (TB).
    הערה: טרה-בתים מכתים מגלה את התפלגות פרוטאוגליקן-MCC.
    1. יש לשטוף את indistilledwater שקופיות כדי להסיר את coverslips.
    2. לאחר הסרת את coverslips, לשטוף את השקופיות במים מזוקקים שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחד כדי להסיר לחלוטין את המלחים מהערוץ.
    3. הכן מאגר עובדים טרה-בתים על ידי פתרון (התמוססות 28.4 גרם של סודיום פוספט dibasic ב 1 ליטר של מים מזוקקים) והפתרון B (התמוססות 27.6 g של סודיום פוספט monobasic ב 1 ליטר של מים מזוקקים). מיקס 94.7 מ של פתרון A מ ל 5.3 של פתרון Dilute B. פתרון זה 1:1 במים מזוקקים לעשות 200 מ של 0.1 M עובד מאגר. לתקן את ה-pH ל 8.0 על-ידי הוספת סודיום הידרוקסיד, עד ה-pH הוא קבוע.
    4. להכין מלאי 1% טרה-בתים: לערבב 1 g של טרה-בתים ב- 100 מ של מים מזוקקים.
    5. הכן הפתרון עובד טרה-בתים על ידי ערבוב 40 מ של 0.1 M מאגר עובדים ב- 3 מ"ל של 1% מניות טרה-בתים.
    6. דגירה השקופיות הפתרון עובד טרה-בתים עבור s 14-17.
      הערה: הכתם הזה הוא זמן מאוד רגיש; זמן הדגירה ייתכן שתצטרך להיות מותאם כדי למנוע overstaining.
    7. לשטוף את השקופיות במים מזוקקים שלוש פעמים למשך 5 דקות.
    8. מקם את coverslips על השקופיות גליצרול 30% במים מזוקקים. לבצע הדמיה10בסיוע מיקרוסקופ אור.
      הערה: לא coverslip השקופיות מוכתם טרה-בתים בגליצרול + PBS. PBS שוטף את זה סוג של כתם.

7. פלורסנט כימות היסטולוגית

  1. לבצע כימות היסטולוגית של פלורסנט תמונות באמצעות תוכנת ניתוח של התמונה (ראה את הטבלה של חומרים).
    הערה: העיקרון הבסיסי של כימות היסטולוגית בשיטה זו היא לחלק את מספר הפיקסלים פלואורסצנט עניין על ידי המספר הכולל של פיקסלים של האזור עניין ולהכפיל את מספר שהושג ב- 100, וכתוצאה מכך אחוז חיובי פיקסלים באזור הזה.
  2. ביצוע כימות של ביטוי Col10a1 MCC הסאגיטלי קטעים של condyles.
    1. כאשר לכימות כל סוגי התאים ושל כתמים באמצעות שיטה זו, בחר את האזור ניתן לכמת. פתח את התמונות היסטולוגית בתוכנת ניתוח התמונה ובחר את האזור באמצעות את לאסו כלי (L) (איור 4א). לניתוח שתואר כאן, בחר אזור MCC בלבד; לאחר בחירת האזור, המספר הכולל של פיקסלים יוצגו בתיבת "היסטוגרמה" על המסך של התוכנה (איור 4א). שמור את מספר הפיקסלים באזור של ריבית.
    2. בחר את הפיקסלים Col10a1 אדום באמצעות הכלי הדגימה. לחץ על "בחר" על החלונית העליונה ולאחר מכן 'טווח צבעים'. לחץ על "הכלי טפטפת," בחר דגימת צבע פיקסל עניין בתמונה ולחץ על "אישור." . חיובי על הצבע שבחרת פיקסל להיות בכל התחומים שנבחרו (איור 4B). להעתיק את מספר הפיקסלים פלורסנט (המוצג בתיבה 'היסטוגרמה' של המסך) ולהדביק אותם בגיליון אלקטרוני או תוכנה סטטיסטית לניתוח.
    3. מחלקים את מספר הפיקסלים פלורסנט מעל מספר הפיקסלים של האזור בעל עניין, להכפיל את המספר הזה ב- 100: פלורסנט פיקסלים / הפיקסלים באזור עניין * 100.
      הערה: ניתן לכמת סוג אחר של תאים, כמו Col2a1 כחול, עם שיטה זו, אך יש לבחור את הפיקסלים כחול במקום הפיקסלים Col10a1 אדום.

Figure 4
איור 4 . ייצוג transgene Col10a1 כמת. (א) לבחור את תחום העניין עם "הכלי לאסו" (L). תאים Col10a1-חיובית, בחר את הסחוס כל הלסת. שמור את מספר הפיקסלים מהתיבה 'היסטוגרמה'. (B) בחר את הפיקסל של עניין, במקרה זה, הפיקסלים Col10a1 ניאון אדום. שימו לב כי רק את הפיקסלים אדום בתוך אזור עניין ייבחרו. שמור את מספר הפיקסלים האדומים מהתיבה 'היסטוגרמה'. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. לבצע כימות של מלכודת פעילות MCC ו- subchondral העצם.
    1. בצע את ההליך המתואר בשלב 8.2, אך במקום רק לבחור את האזור MCC, בחר את subchondral סחוס העצם אזורים (איור 5א).
    2. לניתוח פעילות מלכודת, בחר את הפיקסלים צהוב שנוצר על ידי המצע ELF97, כפי שמתואר בשלב 8.2.2 (איור 5B); להעתיק את מספר הפיקסלים חיובי; ולהדביק אותם בגיליון אלקטרוני או תוכנה סטטיסטית לניתוח.
    3. לקבל את אחוזי השמנה-חיוביות פיקסלים על-ידי חלוקת מספר פיקסלים צהוב על המספר הכולל של פיקסלים באזור עצם subchondral והכפלתם במאה.

Figure 5
איור 5 . ייצוג של כימות מלכודת פלורסנט. (א) לבחור את תחום העניין (הלסת subchondral סחוס העצם) ולשמור את מספר הפיקסלים של האזור. (B) בחר הפיקסלים פלורסנט צהובות, המייצג פעילות מלכודת. שימו לב כי רק מלכודת-חיוביות פיקסלים תהיה בחירה. שמור את מספר הפיקסלים שנבחר. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. לבצע כימות של תאים אדו-חיוביות.
    1. שקופיות שהוכתמו אדו הם counterstained עם דאפי, אז במקום לספור את המספר הכולל של פיקסלים באזור של הריבית, בחר הפיקסלים דאפי-חיוביות לחישוב האחוז של פיקסלים אדו-חיוביות. בחר את האזור של עניין כפי שמתואר בשלב 8.2, אך לא לשמור את המספר הכולל של פיקסלים. בחר את הפיקסל דאפי כחול הצבע שנדגם, כפי שמתואר בשלב 8.2.2; להעתיק את מספר הפיקסלים דאפי-חיוביות (איור 6א); ולהדביק אותם בגיליון אלקטרוני או תוכנה סטטיסטית לניתוח.
    2. בשלב הבא, בחר את הפיקסלים אדו-חיוביות (פיקסלים פלורסנט צהובות) ולשמור את מספר הפיקסלים בתיבת "היסטוגרמה" (איור 6B).
    3. לחשב את אחוז אדו פיקסלים על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים אדו-חיוביות על-ידי מספר הפיקסלים דאפי-חיובית, הכפלת המספר שהושג ב- 100.

Figure 6
איור 6 . ייצוג של כימות אדו. (א) בחר את האזור המקדימות MCC (השכבה החיצונית של הסחוס). בחר דאפי-חיוביות פיקסלים ולשמור את מספר הפיקסלים. (B) בחר אדו-חיוביות פיקסלים (צהוב פלורסנט) ולשמור את מספר הפיקסלים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

8. כימות של עובי הסחוס והפצה פרוטאוגליקן

  1. לנתח את עובי הסחוס (מרחק מיפוי) ואזור טולדין blue מוכתמת שימוש בתוכנת Digimizer תמונה.
    הערה: השתמש בשורת סרגל בתמונה היסטולוגית כדי לקבוע את יחידת (איור 7א).
  2. מבצע מדידת מרחק מיפוי.
    הערה: המדידה מיפוי מרחק תספק את עובי הסחוס-בעצם הלסת. השיטה המתוארת כאן, נבחרו חמישה מחוזות MCC, נותן ממוצע של עובי הכוללת MCC. החוקר יכול לבחור למדוד שלושה אזורים שונים, או אזור בודד אחד אפילו באמצע MCC.
    1. באמצעות הכלי "משך", למדוד את האורך של הסחוס מפני השטח החיצוני עד לסוף טולדין מוכתם כחול באזור (איור 7ב') חמישה אזורים, או במקומות רבים לפי רצונכם.
    2. להעתיק את מידות אורך מרשימת"מדידה".
      הערה: התוכנה מספקת גם ממוצע של המדידות (איור 7ב').
  3. למדוד את השטח מוכתם כחול טולדין.
    הערה: במדידה של האזור מוכתם כחול טולדין, האזור פרוטאוגליקן MCC ניתן להשיג.
    1. בחרו בכלי "שטח", ליצור מתאר טולדין מוכתם כחול באזור (איור 7C).
    2. להעתיק את המידות אזור מרשימת"מדידה".

Figure 7
איור 7 : ייצוג פרוטאוגליקן הפצה כמת. (א) להשתמש בסרגל קנה המידה של התמונה היסטולוגית כדי לקבוע את היחידה על-ידי לחיצה על כפתור "יחידה" (בעיגול אדום, יחידה נבחרת: 500 מיקרומטר). (B) מודדים עובי הסחוס במיקומים שונים באמצעות הכלי "משך" (בעיגול אדום). שמור את המידות מהרשימה"מדידה" שבחלונית הימנית העליונה. התוכנה מספק גם "סטטיסטיקה" שבחלונית הימנית התחתונה, כך ניתן לקבל ישירות מתכוונת ו- SD של המדידות. (ג) למדוד את השטח מוכתם כחול טולדין על-ידי שימוש בכלי "שטח" (בעיגול אדום). מעגל את תחום העניין ולשמור את המדידה מרשימת"מדידה". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סטטיסטיקה תיאורית בוצעו כדי לבחון את חלוקת morphometric מידות (אורך הלסת, condylar אורך, רוחב condylar) וניתוחים היסטולוגית. התוצאות הושוו בין הקבוצה טעון (קרי, עכברים נתון טעינה compressive עם המעיין טיטניום בטא) קבוצת הביקורת (קרי, התאמת עכברים שליטה שלא קיבלו בכל הליך). הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין ממוצעי נקבעו על ידי אינטראקצית-t-test, ערך-p של < 0.05 הוערך להיות משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

מדידות Morphometric, כפי שמתואר בשלב 4, איור 3, בוצעו הלסת של הטעון ובקבוצות שליטה. הקבוצה טעון הציג עם אורך הלסת התחתונה גדל באופן משמעותי (טעון: 16.62 ± 0.23 מ"מ לעומת שליטה: 16.21 ± 0.2 מ"מ; p < 0.05) אורך הראש המפרקתי הנמוך (טעון: 4.6 מ מ, SD מ מ 0.08 לעומת שליטה: 4.4 מ מ; SD 0.06; p < 0.05) לעומת קבוצת הביקורת. למרות זאת, היה הבדל משמעותי ברוחב המפרקתי הנמוך בין קבוצות (טעון: 3.06 ± 0.12 מ"מ לעומת שליטה: 2.9 ± 0.11; p = 0.09).

כימות של ההתפלגות קולגן באמצעות השיטה המתוארת בשלב 8 גילה באופן משמעותי גדל ביטוי Col10a1 MCC של condyles של קבוצת טעון בהשוואה הפקד (טעון: 21% ± 4.46% לעומת שליטה: 7.50% ± 2.03%; p < 0.005; איור 8 A ו- D). מצד שני, מבחינה סטטיסטית לא היה הבדל בביטוי Col2a1 בין הטעון ולשלוט קבוצות (טעון: 4.85% ± 1.95% לעומת שליטה: 2.92% ± 1.89%; p = 0.13; איור 8 פריצות). בנוסף, הניתוח של פעילות מלכודת הראה אזורים השמנה-חיוביות מוגברת באזור subchondral condyles של עכברים טעון (טעון: 5.28% ± 1.45% לעומת שליטה: 2.41% ± 1.39%; p < 0.05; איור 8 C ו- F). באופן דומה, הבחנו התפשטות תאים מוגברת, כפי שמציין אדו-חיוביות מוגברת, בתאים MCC של קבוצת טעון לעומת בקרת עכברים (טעון: 6.23% ± 1.89% לעומת שליטה: 1.90% ± 1.03%; p < 0.05; איור 9 A ו- C).

פרוטאוגליקן הפצה MCC של טעון, בקרת עכברים הייתה לכמת על-ידי הערכת האזור מוכתם כחול טולדין ועל המפה מרחק, כפי שמתואר שלב 9 ואיור 7. מצאנו את מיפוי המרחק גדל באופן משמעותי MCC של condyles של קבוצת טעון לעומת שליטה (טעון: 210.22 ± 4.11 מיקרומטר מיקרומטר לעומת שליטה: 187.36 מיקרומטר ± 8.64 מיקרומטר; p < 0.005; איור 9 B ו- D). עם זאת, האזור שהוכתמו פרוטאוגליקן לא היה שונה סטטיסטית בין הטעון ולשלוט קבוצות (טעון: 203,897.93 מיקרומטר2 ± 10,171.00 מיקרומטר2 לעומת שליטה: מיקרומטר 202,875.092 ± 33,419.09 מיקרומטר2; p = 0.94; איור 9 פריצות)

Figure 8
איור 8 : תוצאות נציג: (א) Col10a1-חיוביות תאים בסעיפים הסאגיטלי MCC של condyles של שליטה ועכברים טעון. ישנם מספרים מוגברת בתאים Col10a1-חיובית בקבוצה טעון (D). תאים Col2a1-חיוביות (B) שליטה ועכברים טעון. אין שום הבדל בתאים Col2a1-חיובית בין קבוצות (E). (ג) השמנה מכתים ב condyles של שליטה ועכברים טעון. פעילות מוגברת השמנה בקבוצה טעון לעומת שליטה (נ). היסטוגרמות (D-F) מייצגים את ± באמצעים SD עבור n = 4 לכל קבוצה. * * הבדל משמעותי בין שליטה לבין קבוצות טעון (p < 0.005). סרגל קנה מידה = 200µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9:תוצאות נציג: (א) אדו מכתים ב condyles של שליטה ועכברים טעון. התפשטות תאים מוגברת בקבוצה טעונים, כמו מיוצג על ידי עידו מוגבר-חיוביות תאים (C). טולדין (B) כחול מכתים ב condyles של שליטה ושל עכברים טעון. גדל עובי הסחוס בעכברים הטעון, כפי שמוצג על ידי מיפוי המרחק גדל בקבוצת הניסוי (D). אין הבדל באזור שהוכתמו פרוטאוגליקן בין הפקד וטעונה קבוצות (E). היסטוגרמות (C-E) מייצגים את ± באמצעים SD עבור n = 4 לכל קבוצה. * * הבדל משמעותי בין שליטה לבין קבוצות טעון (p < 0.005). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כתב יד זה תיאר שיטות morphometric מדידה וניתוח הסלולר של מאתר condyles mandibular הלסת. המדידות morphometric רדיוגרפי יכול לשמש גם כדי לנתח אחרים עצמות של חיות ניסוי קטן. בנוסף, הניתוח הסלולר (כימות תא ומיפוי הסחוס מרחק) אינם מוגבלים מכרסם בעצם הלסת, אך יכול לשמש כדי לכמת מקטעים היסטולוגית של רקמות רבות.

מודלים מהונדס העכבר לבטא כתבים פלורסנט הן כלי מעולה להבין באופן חזותי שינויים בביטוי הגנים. המודל העכבר כתב פלורסנט כפול-קולגן (Col2a1XCol10a1) נעשה שימוש בדו ח זה היה מתאים במיוחד עבור חקר MCC, מאז transgenes מבוטאים באזור prehypertrophic היפרטרופית של MCC אז את התפלגות קולגן יכול להיות מוערך. אם החוקר אין גישה למודל בעכבר הטרנסגניים לבטא כתבים פלורסנט, ניתן להשתמש בשיטות אחרות של חלבונים ביטוי היסטולוגית, כגון immunofluorescence.

בשביל המדידות morphometric, השלב הקריטי לפני לקיחת תמונות radiograph בארון היא להסיר את כל הרקמות הרכות של הלסת התחתונה או העצמות כדי להיות מנותח. שריר מוגזמת או רקמות רכות מחוברים לעצמות יכול להסוות את המידות האמיתיות של המבנים. חשוב להיות מודעים למגבלות של מערכת radiograph בארון. כמו כל רנטגן, זהו ייצוג 2-ממדי של מבנה תלת-ממדי ולאחר החפיפה של מבנים וחפצים יש לפרש בזהירות. בנוסף, המיקום של העצמות בארון רדיוגרפי צריך להיות עקבי.

כימות הסלולר על-ידי ספירת מספר פיקסלים חיובי הוא שיטה יעילה על כימות היסטולוגית באזור עשיר התא כגון MCC, אבל המגבלה של גישה זו היא כי הוא אינו מספק מספרם המדויק של תאים. בנוסף, מאז זה מכמת את פיקסלים שנבחרו בלבד, מומלץ לכמת כל התמונות עניין שימוש באותו הפיקסל "לטעום" כדי להימנע כימות של פיקסלים של עוצמות שונות בעת ניתוח תמונות שונות.

כללי עצה כאשר לכימות מקטעים היסטולוגית הוא לנתח מספר טורי מקטעים של כל דגימה (כתב יד זה, שלושה חלקים טורי נותחו עבור כל המפרקתי הנמוך), מאז וריאציות בתוך כל מדגם בדרך כלל שנצפו.

המתודולוגיה הזכיר בניסויים שלנו היא פשוטה, קלה לשימוש, ניתן להשתמש בכל מחקר על בסיס מינרלים מן הרקמה ב כתב אשר משמשות עכברים. המתודולוגיה הקיים, זה אפשר לדמיין התאים מוכתמות השמנה (Col2a1 או Col10a1) או אדו (Col1a1 או Col2a1), להמחיש לוקליזציה שיתוף של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות ד ר דוד רואו מתבקשים לספק את העכברים הטרנסגניים Li Chen על הסיוע היסטולוגית.

המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי את נבחרת המכון של שיניים ותחקיר ואסטתיים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר K08DE025914 על ידי האמריקאי האגודה של אורתודונטי לקרן Sumit Yadav.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MX20 Radiography System Faxitron X-Ray LLC 
Digimizer Image software  MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006
Manual microscope Axio Imager Z1 Carl Zeiss 208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP Chroma Technology Corp 49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP Chroma Technology Corp 49001
red fluoresecent protein filter - Cy5 Chroma Technology Corp 49009
sodium acetate anhydrous Sigma-Aldrich S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate  Sigma-Aldrich 228729
sodium nitrite  Sigma-Aldrich 237213
ELF97 substrate Thermo Fisher Scientific E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit Life Technologies C10339  includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Scientific D1306
Sodium phosphate dibasic  Sigma-Aldrich S3264
Sodium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich 71505
Toluidine Blue O  Sigma-Aldrich T3260
Adobe Photoshop  Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Research Products International P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism  GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8, (3), 291-305 (1997).
  2. Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17, (3), 354-361 (2009).
  3. Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26, (1), 1-5 (2004).
  4. Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15, (57), (2014).
  5. Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11, (10), 0164599 (2016).
  6. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
  7. Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84, (8), 691-699 (2005).
  8. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24, (2), 335-344 (2016).
  9. Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11, (7), 0160121 (2016).
  10. Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. e54468 (2016).
  11. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, (2), 123-143 (2003).
  12. Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41, (3), 218-223 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics