Интеграция свободной деривации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием матрицы Laminin 521

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Надежный вывод клеток, индуцированных человеком, с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS), был достигнут за счет использования неинтегрирующего вектора передачи вируса Сендай (SeV), опосредованного перепрограммированием дермальных фибробластов. Поддержание клеток hiPS и расширение клона было выполнено с использованием безсеносных и химически определенных условий культивирования с рекомбинантной матрицей ламинана человека 521 (LN-521) и средой Essential E8 (E8).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ксено-свободные и полностью определенные условия являются ключевыми параметрами для надежной и воспроизводимой генерации однородных человеческих клеток с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS). Обслуживание клеток hiPS на фидерных клетках или неопределенных матрицах восприимчиво к периодическим отклонениям, патогенному загрязнению и риску иммуногенности. Использование определенной рекомбинантной матрицы человеческого laminin 521 (LN-521) в сочетании с безсеноновыми и определенными рецептурами среды снижает вариабельность и позволяет обеспечить последовательную генерацию клеток hiPS. Вектор вируса Сендай (SeV) представляет собой неинтегрирующую систему на основе РНК, поэтому можно обойти проблемы, связанные с потенциальным разрушительным эффектом на интеграционные векторы целостности генома. Кроме того, эти векторы продемонстрировали относительно высокую эффективность в перепрограммировании дермальных фибробластов. Кроме того, ферментативный односегментный пассаж клеток облегчает гомогенное поддержание клеток hiPS без существенного предшествующего опыта стволовых клетокКультуру. Здесь мы описываем протокол, который был широко протестирован и разработан с акцентом на воспроизводимость и простоту использования, обеспечивая надежный и практичный способ создания определенных и безсеносных человеческих hiPS-клеток из фибробластов.

Introduction

Поскольку первый вывод клеточных линий hiPS по Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-клетки предоставили полезный инструмент для моделирования болезней, обнаружения лекарств и в качестве исходного материала для создания клеточной терапии в регенеративной медицине. 3 . Культура клеток hiPS уже давно зависит от совместной культивирования с фибробластовыми фидерными клетками 4 , 5 или Matrigel 6 и со средними препаратами, содержащими фетальную бычью сыворотку (FBS). Отклонения от партии к партии являются общим следствием неопределенного характера этих условий культуры, что приводит к непредсказуемым изменениям, что является основным фактором ненадежности этих протоколов 7 . Разработка определенной среды, такой как Essential 8 (E8) 8 и определенные матрицы клеточной культуры, например LN-521 9 , позволяютS для установления высоковоспроизводимых протоколов и помощи в надежной генерации и поддержании гомогенных клеток hiPS 7 , 8 , 9 , 10 .

Развитие методов бесплатного перепрограммирования интеграции было скачком вперед. Первоначально перепрограммирование зависело от ретровирусных векторов, которые случайным образом интегрировались в геном с разрушительным воздействием на геномную целостность 11 . Достижения в методологиях перепрограммирования включают разработку векторов на основе РНК. РНК-векторы имеют преимущество перед методом репрограммирования на основе ДНК, поскольку непреднамеренная интеграция через геномную рекомбинацию невозможна 12 . SEV-векторы обеспечивают высокую и временную экспрессию экзогенных факторов посредством одноцепочечной РНК без ДНК-фазы 11 . Перепрограммирующие векторы, поставляемые SeVРазводят по всему клеточному расширению и, в конце концов, избавляются от культуры, обеспечивая свободный способ перепрограммирования. После этого поддержание плюрипотентности зависит от эндогенной экспрессии плюрипотентных генов 2 .

Поскольку новаторские методы терапии на основе hiPS начинают переходить в клинические испытания, требования к стандартизованным партиям, воспроизводимости и безопасности являются важными проблемами для решения проблемы 13 . Поэтому следует избегать продуктов животного происхождения. Например, использование ксеногенных продуктов связано с риском заражения нечеловеческим патогеном. Было показано, что клетки, культивируемые в присутствии компонентов культуры животного происхождения, включают в себя нечеловеческие силикатные кислоты в клеточные мембраны, которые угрожают сделать производные клетки иммуногенными 14 . Следовательно, необходимость устранения ксеногенных продуктов необходима для любых будущих клинических занятий. Этот протокол применяется xeБесплодная и определенная культура в поддержании клеток hiPS, перемещающих клетки ближе к клиническому соблюдению.

Этот протокол описывает последовательный, очень воспроизводимый и простой в использовании метод, который генерирует стандартизованные клетки hiPS из фибробластов. Он также предлагает удобную систему культивирования для обслуживания установленных hiPS-камер. Этот протокол был использован для получения более 300 линий клеточных линий hiPS на шведском национальном объекте iPS Core человека в Каролинском институте, из которых некоторые линии ранее были описаны 15 , 16 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Сбор материала пациента и вывод клеток hiPS утверждается Советом по обзору этики, Стокгольм, 28 марта 2012 года, Регистрационный номер: 2012 / 208-31 / 3. Этапы клеточной культуры должны выполняться в шкафах биобезопасности, если не указано иное. При работе с клетками всегда применяйте методы стерильной обработки. Перед запуском дайте медикаментам, планшетам и реагентам достичь комнатной температуры. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 при высокой влажности.

1. Выделение фибробластов человека из дермальной биопсии

  1. Препараты культуральной среды, пищеварительные ферменты, покрытие посуды и инструменты для рассечения.
    1. Подготовьте среду фибробластов: 44,5 мл модифицированной среды Ивальсона (IMDM), 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 500 мкл пенициллина / стрептомицина (PEST) (см. Таблицу 1 ), хранят при 4 ° C.
    2. Подготовьте пищеварительные ферменты при рабочей концентрации 1 мг / мл: weiGh аликвоты 4 мг порошка и коллагеназы типа I в отдельных 15-мл пробирках и растворяют в 4 мл DMEM / F12 + 1% PEST. Стерилизуйте ферментативный раствор, пропустив его через фильтр 0,22 мкм. Подготавливайте свежие ферментные растворы каждый раз.
    3. Покройте одну лунку в 6-луночной планшете для культивирования ткани (или 35-миллиметровой чашке для культивирования ткани) на биопсию, которую разрезают 1 мл 0,1% желатина в забуференном фосфатом физиологическом растворе (DPBS). Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Автоклавируйте один набор хирургических ножниц и щипцов для биопсии для вскрытия.
  2. Биопсия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс биопсии как можно быстрее после взятия. Хранить в PBS + 1% PEST в течение 48 часов при температуре 4 ° C. Биопсия должна иметь диаметр 2-4 мм в диаметре и в соответствии с этическими разрешениями.
    1. Передайте биопсию в 35-миллиметровое блюдо. Переместите биопсию на новую 35-миллиметровую тарелку и погрузите биопсию в 2 мл 70% этанола в течение 30 с.
    2. Переместите биопсию на третью35-миллиметровую посуду и промыть 1 мл стерильного сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), дополненного 1% PEST.
    3. Перенесите биопсию на четвертую 35-миллиметровую чашку, добавьте 1 мл свежеприготовленного 0,1% раствора для дозирования.
    4. Вырежьте биопсию кожи на 1 - 2 мм 3 части в чашке, используя хирургические ножницы и щипцы, а затем передайте фрагменты биопсии, включая раствор для дозирования, в 15-мл пробирку. Добавьте еще 2 мл дозирования.
    5. Прополощите 35-миллиметровое блюдо с 1 мл раствора для дозирования и перенесите в 15-мл пробирку.
    6. Инкубируйте биопсию при 4 ° C в течение ночи.
    7. Добавьте 4 мл 0,1% коллагеназы I в пробирку и инкубируйте при 37 ° C в течение 4 часов.
    8. Центрифугировать расщепленные клетки 300 мкг в течение 3 мин, аспирировать супернатант и ресуспендировать переваривание в 2 мл фибробластной среды.
    9. Удалите раствор желатина из 6-луночного планшета для культивирования ткани. Перенесите клеточную суспензию, включая любые оставшиеся части, на 6-луночный планшет для культивирования тканей (или 35-метровыйM), предварительно покрытый 0,1% желатином в DPBS.
    10. Меняйте среду каждый третий день.
  3. Расширение человеческих фибробластов
    ПРИМЕЧАНИЕ. Фибробласты готовы к пассированию в колбу для тканевой культуры T25 (25 см 2 ), когда 80% конфлюентны ( рис. 2В ). Фибробласты обычно достигают 80% слияния в течение 7 дней. Однако требуемое время может сильно различаться, но должно быть не более 4 недель.
    1. Аспирируют среду и промывают один раз 2,5 мл DPBS.
    2. Удалите DPBS и добавьте 1 мл трипсина-EDTA (0,05%) и инкубируйте при 37 ° C в течение 5 минут или пока клетки не покажут закругленные края и не начнут отсоединяться.
    3. Добавьте 2 мл фибробластной среды, при необходимости промойте клетки, обеспечивающие надлежащую дезассоциацию клеток. Перенесите раствор клетки в 15-мл пробирку и центрифугируйте при 300 × g в течение 3 мин.
    4. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 5 мл фибробластной среды и пластинчатых фибробластах вНа колбасе T25 на клеточной ткани. При расширении фибробластов после этой стадии диссоциировать, как описано выше, и затравливать 12 × 10 3 клеток / см 2 .
    5. После того, как конфлюентные клетки готовы к замораживанию, расширьте или перепроверьте планшет. Заморозьте два раунда фибробласта до начала любого перепрограммирования (см. Следующий раздел для процедуры замораживания). Эффективность перепрограммирования, как правило, выше для фибробластов нижних проходов, клетки в проходе 2-4 являются оптимальными. Однако успешное перепрограммирование фибробластов до прохода 10 было проведено с использованием этого протокола.
  4. Замораживание и оттаивание фибробластов
    1. Подготовьте свежую среду для замораживания фибробластов: 90% FBS + 10% диметилсульфоксид (ДМСО). Хранить при температуре 4 ° C ( таблица 1 ). После конфлюэнта колбу для культивирования ткани T25 можно заморозить на три криолителя. Подготовьте 500 мкл среды для замораживания фибробластов на замороженный флакон.
    2. Чтобы заморозить клетки, диссоциировать cКак описано в шаге 1.3, подсчитывают клетки с использованием гемоцитометра и переносят порции 3 × 10 5 клеток в 15-миллилитровые пробирки. Спиновые трубки при 300 xg в течение 3 мин. Супернатант аспирата.
    3. Ресуспендируют клеточные гранулы в 500 мкл 4 ˚C фибробластов замерзающей среды и переносят в криогенные сосуды. Поместите флаконы в морозильный контейнер и инкубируйте клетки при -80 ° C в течение 24 часов, прежде чем переносить их в жидкий азот для длительного хранения.
    4. Чтобы оттереть клетки, погрузите нижнюю часть криовиальной воды в 37 ° C. После сжижения переносите суспензию клеток в 15-мл пробирку и добавьте 5 мл фибробластной среды. Спиновые клетки 300 мкг в течение 3 мин.
    5. Удаляют супернатант и ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл фибробластной среды. Перенесите клетки в непрозрачную колбу для культуры ткани T25 и инкубируйте при 37 ° C.

2. SeV Vector Перепрограммирование фибробластов

  1. Получение векторных аликвот ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Обращайтесь с SeV в соответствии с защитой уровня 2 биобезопасности. См. Протокол изготовителя и местные рекомендации 17 . Тираж вируса варьируется между партиями.
    1. Перед приготовлением аликвоты рассчитывают количество вектора, необходимого для 5 × 10 4 клеток в соответствии с протоколом производителя ( например , CytoTune 2.0). Титр вируса обычно изменяется от 8 × 10 7 - 1,5 × 10 8 . Оттепель и комбинированные векторы 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 и hKlf4 = MOI 3). Порцию количество, рассчитанное для перепрограммирования 5 × 10 4 клеток в автоклавированные трубки объемом 1,5 мл. Разбавьте аликвоты вируса с фибробласт-средой до конечного объема 250 мкл для перепрограммирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Каждый флакон действителен для перепрограммирования одной лунки 24-луночного планшета для культуры тканей с 5 × 10 4 фибробластами. Хранить аликвоты вируса при -80 ° C.
  2. SeV Векторная трансдукция
    1. Аспирируйте ячейку cuLt; lt; lt; lt; Аспирируйте DPBS и добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА (0,05%). Инкубируйте при 37 ° С в течение 5 мин или до отделения клеток.
    2. Добавьте 2 мл фибробластной среды и ресуспендируйте клетки и перенесите в 15-мл пробирку. Центрифуга 300 xg в течение 3 мин.
    3. Аспирируют супернатант и ресуспендируют гранулу в 2 мл фибробластной среды.
    4. Подсчитайте фибробласты, используя гемоцитометр и семена 5 × 10 4 клеток в одной лунке 24-луночного планшета для культуры тканей. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение ночи.
    5. Аспирирующую среду для культивирования клеток, добавьте 250 мкл раствора SeV и инкубируйте при 37 ° С в течение ночи.
    6. Ежедневно меняйте среду на свежий фибробласт. Разрешить трансдуцированным клеткам расти в течение 7 дней перед пассированием на покрытые LN-521 пластины. Подготовьте пластины LN-521 за день до прохода. См. 2.3.1 для процедуры нанесения покрытия.
  3. Репликация трансдуцированных фибробластов
    1. Получение LN-521: разбавить LN-521 в DPBS до конечной концентрации 0,63 мкг / см 2 . Пипетируют 2 мл раствора LN-521 на 60-миллиметровой чашке для культивирования ткани. Уплотните 60-миллиметровое блюдо для культивирования ткани, используя парафильм. Инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
    2. Подготовьте аликвоты Essential 8 medium (E8) для облегчения обработки: 48,5 мл среды E8, 1 мл добавки E8 и 500 мкл PEST ( таблица 1 ).
    3. Через 7 дней после трансдукции пропускают клетки в чашку для культивирования ткани размером 60 мм, покрытую LN-521. Добавить 250 мкл трипсина-ЭДТА (0,05%) и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин или до отделения клеток. Добавьте 2 мл фибробластной среды и центрифужных клеток в течение 3 мин при 300 × g.
    4. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют гранулу в 2 мл фибробластной среды и подсчитывают клетки в гемоцитометре. Аспирируйте раствор LN-521 из предварительно покрытой пластины и семян 4 × 10 4 клеток в 5 мл фибробластной среды в предварительно наготовленной 60-миллиметровой тарелке LN-521. Добавить ингибитор Rho-киназы Y-27632(ROCKi) до конечной концентрации 5 мкМ. Инкубируйте при 37 ° С в течение ночи.
    5. Важно отметить, что на следующий день измените среду на среду E8. Ежедневно меняйте E8. Колонии клеток hiPS появятся в течение 2 - 3 недель.

3. Сбор колоний и расширение клеток hiPS

ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги выполняются за пределами шкафа биобезопасности под стереомикроскопом. Рекомендуется использовать маски для волос и процедуры. Тщательно старайтесь не загрязнять клеточную культуру.

  1. Подготовьте 24-луночные планшеты с тканевой культурой, покрытые LN-521, за день до сбора. Разбавьте LN-521 в DPBS 0,63 мкг / см 2 . Пипетируют 250 мкл раствора LN-521 в одну лунку 24-луночного планшета для культивирования ткани. Уплотнения с использованием парафильма. Инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Колонии готовы к сборке, когда они достигают размера> 1 мм в диаметре. Колонии должны отображать острые края и расти в однородном( Рисунок 2D ).
  2. Аспирируйте раствор LN-521 и добавьте 500 мкл E8 в одну лунку 24-луночного планшета для культуры тканей.
  3. Сократите колонии на более мелкие кусочки с помощью скальпеля в сетке, подобной рисунку под стереомикроскопом. Механически очистите клеточные листы от тарелки и перенесите листы с помощью пипетки 200 мкл в подготовленную лунку ( рис. 2D -2E ). Выбирайте колонии в отдельные колодцы.
  4. Разрешить прикрепление ячеек без изменения среды в течение 48 часов. После этого ежедневно меняйте среду E8.
  5. Когда колонии достигли размера> 5 мм, ферментативно просачивают клетки в виде отдельных клеток в новую лунку покрытой LN-521 пластины.
  6. Аспирируют клеточную культуральную среду из клеток и промывают 250 мкл DPBS.
  7. Аспирируйте DPBS. Добавить 250 мкл диссоциативного реагента и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С.
  8. Обратите внимание, что клетки начали округлять. отрыватьКлеток из пластинки, промывая клетки реагентом диссоциации несколько раз.
  9. Добавить 500 мкл среды E8 в 15-мл пробирку. Перенесите клетки в реагент диссоциации в пробирку и центрифугируйте в течение 3 мин при 300 × g.
  10. Аспирируйте раствор LN-521 из предварительно залитой лунки LN-521 и добавьте 500 мкл комнатной температуры E8.
  11. Аспирируют супернатант и ресуспендируют клеточный осадок в 500 мкл среды E8.
  12. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и семян 2,5 × 10 4 - 5 × 10 4 клеток в подготовленной лунке с предварительным покрытием LN-521 (1,25 × 10 4 - 2,5 × 10 4 клеток / см 2 ). Формат культуры клеток можно легко масштабировать в соответствии с назначением.
  13. Добавить ROCKi до конечной концентрации 10 мкМ. Инкубируйте клетки при 37 ° C.
  14. Ежедневно меняйте E8. Клетки обычно готовы к прохождению через 4 - 6 дней. Ферментативно прохожущие клетки в виде отдельных клеток, как описано выше, когда около 90% конфлюентных,
    ПРИМЕЧАНИЕ: векторы перепрограммирования постепенно разводятся во время расширения ячейки hiPS и не обнаруживаются после прохождения 12. Ячейки, которые беспристрастно перепрограммируются, обычно перестают размножаться вокруг прохода 6-10 или теряют свою характерную полипотентную морфологию стволовых клеток ( рисунок 3B ).
  15. Замораживание и оттаивание hiPS-клеток
    1. Чтобы заморозить клетки, ферментативно диссоциировать клетки как отдельные клетки, как описано выше, подсчитать клетки в гемоцитометре и перенести 2,5 × 10 5 клеток в 15-мл пробирку, содержащую 1 мл среды E8. Центрифуга при 300 мкг в течение 3 мин. Аспирируйте супернатант.
    2. Ресуспендируют клеточный осадок в 250 мкл 4 ° C PSC криомедиума и переносят в криовальную. Поместите флакон в морозильный контейнер и инкубируйте клетки при -80 ° C в течение 24 часов, прежде чем переносить их в жидкий азот для длительного хранения.
    3. Для оттаивания клеток готовят предварительно окрашенную лунку LN-521 в 24-луночной тканиПластины путем аспирации раствора LN-521 и добавления 250 мкл среды E8. Погрузите нижнюю часть криовиальной воды в 37 ° C до тех пор, пока не останется только небольшая сосулька.
    4. Добавьте 250 мкл среды E8 в криовальную систему и перенесите суспензию клеток в 15-мл пробирку и добавьте 1 мл среды E8. Спиновые клетки 300 мкг в течение 3 мин.
    5. Удаляют супернатант и ресуспендируют клеточный осадок в 250 мкл среды E8 комнатной температуры. Перенесите суспензию клеток в подготовленную лунку и добавьте 1% -ную добавку жизнеспособности клеток или 10 мкМ ROCKi. Инкубируйте планшет для тканевой культуры при 37 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

От биопсии до клеток hiPS

Весь процесс от биопсии к установленным клеткам hiPS, свободный от вектора перепрограммирования и готовый к характеристике, занимает приблизительно 16 недель ( рис. 1 ). Более подробная временная шкала указана на рисунке 2A . Приблизительно 4 недели необходимо для создания и расширения культур фибробластов. Первые колонии клеток hiPS начали появляться примерно через три недели после трансдукции вектора Сендай. Колонии собирали механически для первого прохода, а затем пассировали ферментативно в виде отдельных клеток.

Создание человеческих фибробластов

Когда культуры фибробластов человека выросли до слияния и отобрали принятую морфологию, они были сначала расширены и заморожены для двух пассаговДо нанесения покрытия на трансдукцию ( рисунок 2B ).

Перепрограммирование человеческих фибробластов с использованием векторов СеВ

Повышенные уровни гибели клеток были обнаружены в дни после трансдукции СеВ и наблюдались незначительные изменения морфологии фибробластов. Появление первых колоний hiPS было обнаружено после 12-й послепоперечной передачи ( рис. 2A , 2C ). Колонии, готовые к отбору, ожидались примерно через три-четыре недели после трансдукции ( рис. 2А , 2D ). Сеяние клеток в количествах, указанных в этом протоколе, привело к обилию колоний, возникающих (<20). Рекомендуется выборочный сбор колоний с благоприятной морфологией. Предпочтительные функции колоний включают сплющенные компактные клетки, рост в виде гомогенных монослоев, различимые инди Vidual клетки с острым краем к окружающим фибробластам ( рис. 2D ). Колонии клеток hiPS были разрезаны в виде сетки, используя скальпель и механически пассированные ( рис. 2Е ). Выбранные клоны hiPS оставляли на 48 часов, чтобы придерживаться пластины без изменения среды. Клоны клеток hiPS были очень гомогенными, однако в течение первых двух проходов было допущено несколько фибробластов, происходящих из пластины перепрограммирования ( рис. 2F ). Следует избегать выбора колоний с суетливыми границами и большой некомпактной гетерогенной клеточной массы ( рис. 2G ). Полученные клеточные линии hiPS росли как плотные монослои с большим отношением ядра к цитоплазме и определяли люминесцентные границы. Напротив, приклеенные неоднородные колонии, которые не соответствовали этим критериям, были отброшены ( рис. 2H ), чтобы избежать культур смешанных популяций клеток.

P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Проверка клеточных клонов hiPS

Плурипотентная характеристика полученных клеток была выполнена после того, как вектор SeV был потерян, а поддержание плюрипотентного состояния было обусловлено экспрессией эндогенных факторов. Прежде чем продолжить проверку ячейки hiPS, убедитесь, что векторное выражение SeV потеряно. Следуя этому протоколу, векторная РНК SeV больше не обнаруживается по проходу 12 в соответствии с нашим опытом, что является подходящей начальной точкой характеристики ( рис. 3А ). Иммуноцитохимическое окрашивание маркеров плюрипотентности OCT4, SSEA4 и NANOG должно давать однородно положительный результат ( рисунок 3B ). Культуры клеток, содержащие частично перепрограммированные клетки, которые не выражали плюрипотентности, были отброшены ( фиг. 3С ). Экспрессия мРНК эндогенных плюрипотентных генов показана в реальном времени - ПК R (RT-PCR) на рисунке 3D .

Плюрепотентные стволовые клетки должны быть легко способны дифференцироваться в три зародышевых слоя. Потенциал дифференцировки клеток hiPS оценивали путем образования эмбриоидных тел (EB) 18 . Свободно плавающие EB, генерируемые из hiPS-клеток, показаны на рисунке 3E, а экспрессия мРНК маркеров, специфичных для зародышевого слоя, через 21 день дифференцировки EB представлена ​​на рисунке 3F .

Рисунок 1
Рисунок 1: Схема потока от биопсии кожи к клеткам hiPS.
Обзор основных этапов протокола. Иллюстрация включает сбор биопсии, выделение фибробластов, трансдукцию СеВ, сбор колоний и клональное расширение клеток hiPS.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg «target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Критические шаги в генерации клеток hiPS.
(A)
Временная шкала, выделяющая важные моменты времени в протоколе, включая фибробластовое покрытие, трансдукцию SeV, изменения среды и покрытия. Прохождение 12 клеток hiPS подсвечивается как начало экспериментов по характеристике. (B) Яркое изображение поля сливных фибробластов в культуре с типичной морфологией. (C) Появление колоний клеток hiPS из трансдуцированных фибробластов. (D) Готов к выбору колонии, демонстрирующей предпочтительные функции, сплюснутую компактную клеточную массу, различимые отдельные клетки с острыми краями к окружающим фибробластам (прохождение 0). (E) hiPSКолонии клеток разрезаются в виде сетки и механически пассируются . (F) Прикрепленная колония после нескольких дней роста. Прикрепленные клетки hiPS окружены необычно большим количеством фибробластов, происходящих из пластины перепрограммирования. Фибробласты могут быть очищены от пластины и, скорее всего, исчезнут с последующими проходами отдельных клеток (Пассаж 1). (G) Колонии, отображающие морфологию, не напоминающую полностью перепрограммированные клетки; Суетливые границы, большая некомпактная гетерогенная клеточная масса. (H) Яркое полевое изображение, иллюстрирующее гомогенную полностью перепрограммированную линию клеток hiPS с ранним проходом по сравнению с сильно гетерогенной клеточной линией. Шкалы шкалы указывают 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3 Рисунок 3: Характеризация клеток hiPS.
(A)
RT-ПЦР векторных специфических маркеров SeV. HiPS-клетки в проходе 3 используются в качестве положительного контроля для векторов перепрограммирования. При прохождении 12 клеток отрицательны для экспрессии специфических для вируса маркеров Сендай (SeV B), специфичных для Сендай KLF4 (KLF4 SeV), специфических cMYC сендай (cMYC SeV), ПЦР-контроля (GAPDH) и без шаблона (-). (B) Репрезентативный пример полностью перепрограммированной однородной линии клеток hiPS при прохождении 12. Яркое поле изображения клеток hiPS обнаруживает, что клетки растут в плотных монослоях с острыми люминесцирующими краями и большими ядрами и небольшой цитоплазмой. Иммуноцитохимия окрашивает маркеры плюрипотентности OCT4, NANOG, SSEA4 и ядерное окрашивание 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), демонстрируя гомогенную положительную экспрессию. (C) Клеточная линия, проявляющая гетерогенную экспрессию для маркера плюрипотентности NANOG. КультураE содержит частично перепрограммированные ячейки и должен быть отброшен. (D) RT-ПЦР экспрессии мРНК маркеров плюрипотентности NANOG, OCT4, контроль ПЦР (GAPDH) и отсутствие шаблона (-), указывающего выражение маркеров плюрипотентности. (E) Свободные плавающие эмбриоидные тела, созданные из клеток hiPS. (F) RT-PCR после 21 дня дифференциации эмбриоидного тела показывают, что полученные клетки hiPS способны дифференцироваться к трем зародышевым слоям. Эндодермальные маркеры AFP и GATA4, мезодермальные маркеры RUNX и HAND1, эктодермальные маркеры NCAM и NESTIN, ПЦР-контроль (GAPDH) и без шаблона (-). Шкалы шкалы указывают 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ожидаемым результатом этого протокола является успешное создание нескольких клонированных клеточных линий hiPS. Важно отметить, что способ поддержания и расширения установленных hiPS-клеток, описанный здесь, является надежным и может быть осуществлен с небольшим предварительным опытом культивирования стволовых клеток. Известно, что ферментативный односегментный пассаж с ROCKi вместе с матрицей LN-521 поддерживает клетки как кариотипически нормальные, плюрипотентные и легко способные дифференцироваться, избегая индуцированной гетерогенности, что колониальная пассировка может стимулировать 10 , 19 , 20 . HiPS-клетки, культивируемые на LN-521, могут пассироваться как отдельные клетки без добавления ROCKi 10 , добавление ROCKi делает протокол проще для менее опытных обработчиков и сокращает время, необходимое для деривации клеток hiPS.

Эффективность перепрограммированияNerally не проблема с этим протоколом; Селективные векторы имеют относительно высокую эффективность перепрограммирования> 1% для фибробластов 11 . Ожидается появление обилия колоний (<20). Рекомендуется выбрать в три раза больше колоний. Было замечено, что часть собранных клонов не может прилипать после сбора. Дополнительные колонии также могут потребоваться для компенсации частично перепрограммированных колоний. Частично перепрограммированные колонии в некоторых случаях способны прилипать и расти, поддерживаясь экзогенной экспрессией плюрипотентных генов векторами СеВ. По мере того, как векторы СеВ разводятся, эти клетки прекращают пролиферацию и диссоциацию, обычно проявляющуюся вокруг прохождения 6-8. Неоднородность культуры также является признаком частичного перепрограммирования, а гетерогенные линии следует отбрасывать ( рис. 2Н ).

Оптимальный выбор условий перепрограммирования вектора и культуры зависит отЦель генерируемых клеток. Однако, чтобы избежать отклонений между партиями, влияющих на результаты, рекомендуются определенные условия. Предлагается выбор неинтегрирующей векторной системы для сохранения геномной целостности перепрограммированных клеток. В этом протоколе были выбраны векторы SEV из-за надежности, относительно высокой эффективности и низкого времени работы. Векторы SeV разводятся во время делений клеток и не обнаруживаются вокруг прохода 12, тем самым гарантируя, что на генерируемые данные не влияет экзогенная экспрессия. Из-за тщательных требований, предъявляемых к клеткам, предназначенным для клинических целей, перепрограммирование СеВ может стать препятствием для клинического перевода, поскольку трудно полностью исключить весь векторный материал. МРНК-опосредованное перепрограммирование может быть выгодным, если вывести клетки с предполагаемым использованием в клеточной терапии 12 . Однако эти методы гораздо труднее и сложнее использовать 21 . Метод здесьОписанные для культуры фибробластов, также непригодны для клинических применений. Поскольку FBS и желатин являются ксеногенными и неопределенными, рассмотрите возможность их переключения на определенные безсеноновые продукты 22 .

Методы стерильной обработки и регулярное тестирование микоплазменной инфекции рекомендуется при работе с любой формой клеточной культуры. Кожа человека содержит много микроорганизмов, которые могут процветать в условиях, когда клетки культивируются в случае неправильной обработки. Поэтому рекомендуется проявлять особую бдительность при обращении с биопсией кожи и в первые дни культуры после биопсии. Установление культуры фибробластов из биопсий кожи, действительно, требует много времени. После обработки биопсии кожи сначала будут слабые признаки прикрепления фибробластов, поэтому подождите, по крайней мере, одну неделю, чтобы найти несколько фибробластных клеток, отображающих ожидаемую морфологию в культуре. Время, необходимое для создания фибробластовКультуры in vitro от биопсий зависят от множества факторов, включая размер биопсии, возраст донора и то, как биопсия была обработана с момента ее взятия. Предпочтительно перепрограммировать фибробласты раннего прохода для оптимальной эффективности перепрограммирования 23 .

Таким образом, здесь мы опишем установленный надежный и простой в использовании способ генерации высоко однородных hiPS-клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для сообщения.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана финансирующими агентами SSF (B13-0074) и VINNOVA (2016-04134).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1, (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17, (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18, (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3, (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28, (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17, (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11, (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17, (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6, (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33, (1), 58-63 (2015).
  22. Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15, (1), 254-262 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics