Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

Published 7/07/2017
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Developmental Biology

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Summary

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

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Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

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Abstract

Xeno-free 및 완전 정의 된 조건은 균질 한 사람 유도 pluripotent stem (hiPS) 세포의 강력하고 재현성있는 생성을위한 핵심 매개 변수입니다. 피더 세포 또는 정의되지 않은 매트릭스상의 hiPS 세포의 유지는 배치 차이, 병원성 오염 및 면역 원성의 위험에 취약하다. 제노 프리 및 정의 된 배지 배합물과 조합하여 정의 된 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스를 사용하면 변이가 감소하고 hiPS 세포의 일관된 생성이 가능해진다. 센다이 바이러스 (SeV) 벡터는 비 통합 RNA 기반 시스템이므로 벡터 통합 벡터가 가질 수있는 게놈 무결성에 대한 파괴적인 효과와 관련된 우려를 회피 할 수 있습니다. 또한, 이들 벡터는 진피 섬유 아세포의 재 프로그래밍에서 비교적 높은 효율을 입증 하였다. 또한, 세포의 효소 단일 세포 passaging은 줄기 세포의 실질적인 사전 경험없이 hiPS 세포의 균질 유지를 용이하게합니다문화. 여기서는 재현성과 사용 용이성에 중점을두고 광범위하게 시험하고 개발 한 프로토콜을 기술하여 섬유 아세포에서 정의되고 이종없는 인간 hiPS 세포를 생성하는 강력하고 실질적인 방법을 제공합니다.

Introduction

다카하시 (Takahashi) 등에 의한 hiPS 세포주의 일차 유도 이후, 1 , 2 , hiPS 세포는 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의학 3 에서 세포 치료법을 생성하기위한 원료 물질로서 유용한 도구를 제공합니다. hiPS 세포 배양은 오랫동안 섬유 모세포 피더 세포 4 , 5 또는 Matrigel 6 및 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 배지 배합물과 함께 공 배양에 의존 해왔다. 일괄 배치 (batch-to-batch) 편차는 이러한 배양 조건의 정의되지 않은 특성의 공통적 인 결과이며 예측할 수없는 변형을 가져 오며 이는 이러한 프로토콜의 신뢰성을 저해하는 주요 원인입니다. Essential 8 (E8) 8 및 정의 된 세포 배양 기질, 예를 들어 LN-521 9 와 같은 한정 배지의 개발은재현성있는 프로토콜을 확립하고 homogenous hiPS cell 7 , 8 , 9 , 10 의 강력한 생성 및 유지를 돕습니다.

통합 자유 재 프로그래밍 기술의 개발은 도약을 가져 왔습니다. 원래 재 프로그램은 레트로 바이러스 벡터에 의존하여 무작위로 게놈에 통합되어 게놈 무결성에 파괴적인 영향을 미쳤습니다. 리 프로그래밍 방법의 발전에는 RNA 기반 벡터의 개발이 포함됩니다. RNA 벡터는 게놈 재조합을 통한 의도하지 않은 통합이 가능하지 않기 때문에 DNA 기반 재 프로그램 방법보다 이점이 있습니다 12 . SeV 벡터는 DNA- 상 11 없이 단일 가닥 RNA를 통해 외인성 인자를 과도하게 높게 발현한다. SeV에 의해 전달 된 재 프로그래밍 벡터세포 배양 전반에 걸쳐 희석되고 궁극적으로 배양 물로부터 흘려 발판 인쇄 방법으로 재 프로그램 할 수 있습니다. 그 후, pluripotency의 유지는 pluripotency 유전자 2 의 내인성 발현에 의존합니다.

선구적인 hiPS 세포 기반 치료법이 임상 시험으로 옮기기 시작함에 따라 표준화 된 배치, 재현성 및 안전성에 대한 요구가 13을 해결하는 데 필수적인 문제입니다. 그러므로 동물 기원의 제품은 피해야한다. 예를 들어, 이종 생산물의 사용은 비인간 병원균 오염의 위험과 관련되어있다. 또한, 동물 유래 배양 성분의 존재 하에서 배양 된 세포는 비인간 실리아 산을 세포막 내로 도입시켜 유도 된 세포를 면역 원성으로 만드는 위험이있다. 따라서 이종 제품을 제거해야 할 필요성은 앞으로의 임상 적 진료에 필수적입니다. 이 프로토콜은 xe를 적용합니다.세포를 임상 순응에 더 가깝게 이동시키는 hiPS 세포의 유지에 자유롭고 정의 된 배양.

이 프로토콜은 섬유 아세포에서 표준화 된 hiPS 세포를 생성하는 일관되고 재현성 있고 사용하기 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 기존의 hiPS 세포를 유지 관리 할 수있는 친숙한 배양 시스템을 제공합니다. 이 프로토콜은 Karolinska Institutet의 스웨덴 국가 인체 iPS 코어 시설에서 300 줄 이상의 hiPS 세포주를 추출하는데 사용되어 왔으며이 중 일부 줄은 이미 15 , 16 에 기술되어있다.

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Protocol

환자 물질의 수집 및 hiPS 세포의 유도는 2012 년 3 월 28 일 스톡홀름 윤리 검토위원회 (Statics Review Board)에서 승인합니다. 등록 번호 : 2012 / 208-31 / 3. 달리 명시되지 않는 한 세포 배양 단계는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행되어야합니다. 세포 작업시 항상 멸균 취급 기술을 연습하십시오. 시작하기 전에 미디어, 플레이트 및 시약이 실온에 도달하도록하십시오. 고습도에서 37 ° C, 5 % CO 2 에서 세포를 배양하십시오.

1. 피부 생검에서 인간 섬유 아세포의 분리

  1. 배양 배지, 소화 효소, 접시 코팅 및 해부 도구.
    1. Fibroblast 배지 준비 : Iscoove 수정 된 둘 베코 배지 (IMDM) 44.5 mL, 태아 소 혈청 (FBS) 5 mL 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEST) 500 μL ( 표 1 참조)를 4 ° C에서 보관하십시오.
    2. 1 mg / mL의 작업 농도에서 소화 효소를 준비하십시오 : wei4ml의 디스 페아 제 및 콜라게나 제 I 형 파우더를 별도의 15-mL 튜브에 분주하고 4 mL의 DMEM / F12 + 1 % PEST에 용해시켰다. 0.22 μm 여과기를 통과시켜 효소 용액을 소독합니다. 매번 신선한 효소 용액을 준비하십시오.
    3. 인산염 완충 식염수 (DPBS) 0.1 % 젤라틴 1 ML로 해부 당 6 잘 조직 배양 플레이트 (또는 35 mm 조직 문화 요리)에 하나 잘 코트. 실온에서 30 분 동안 품어 낸다.
    4. 해부를 위해 생검 당 1 세트의 외과 용 가위 및 집게를 고압 멸균합니다.
  2. 생검 처리
    참고 : 생검 후 가능한 한 빨리 생체 조직을 처리하십시오. 4 ° C에서 48 시간 동안 PBS + 1 % PEST에 보관하십시오. 생검은 크기가 2 - 4 mm이고 윤리적 허용 기준에 따라야합니다.
    1. 35 mm 접시에 생검을 옮깁니다. 생검을 새로운 35 mm 접시로 옮기고 30 초 동안 70 % 에탄올 2 mL에 생검을 잠수시킵니다.
    2. 생검을 세 번째 위치로 옮깁니다.35 mm 접시와 멸균 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 % 해소 보충 1 ML로 씻으십시오.
    3. 생검을 네 번째 35 mm 접시에 옮기고 새로 준비한 0.1 % 디스 페스 용액 1 mL를 넣으십시오.
    4. 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 접시에서 1 - 2 mm 3 조각으로 피부 생검을 잘라 낸 다음 dispase 용액을 포함한 생검 조각을 15 mL 튜브에 옮깁니다. 추가 2 mL의 디스펜서를 첨가한다.
    5. 35 mm 접시를 1 mL 디스펜스 용액으로 헹구고 15 mL 튜브로 옮긴다.
    6. 밤새 4 ° C에서 생검을 품어.
    7. 37 ℃에서 4 시간 동안 튜브에 0.1 % 콜라게나 아제 I 4 mL를 넣고 부화시킨다.
    8. 3 분 동안 300xg의 소화 세포를 원심 분리하고 상층 액을 흡인하고 섬유 아세포 2mL에 다이제스트를 resuspend.
    9. 6 잘 조직 문화 플레이트에서 젤라틴 솔루션을 제거합니다. 나머지 조각을 포함하여 세포 현탁액을 6 잘 조직 배양 플레이트 (또는 35mm 조직 배양 접시)를 DPBS 중의 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅 하였다.
    10. 3 일마다 매체를 교체하십시오.
  3. 인간 섬유 아세포의 팽창
    참고 : 80 % 합류 ( 그림 2B ) 때 섬유 아 세포는 T25 (25cm 2 ) 조직 배양 플라스크에 passaged 준비가되었습니다. 섬유 아세포는 일반적으로 7 일 이내에 80 %의 confluency에 도달합니다. 그러나 필요한 시간은 크게 다를 수 있지만 4 주를 넘지 않아야합니다.
    1. 매체를 기음과 2.5 ML의 DPBS로 한 번 씻으십시오.
    2. DPBS를 제거하고 Trypsin-EDTA (0.05 %) 1 mL를 첨가하고 37 ° C에서 5 분간 또는 세포가 둥근 모서리를 표시 할 때까지 배양하여 분리를 시작하십시오.
    3. 필요한 경우 세포의 적절한 분리를 보장 세포 씻어 섬유 아세포 2 ML을 추가합니다. 3 분 동안 300 XG에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 세포 솔루션을 전송합니다.
    4. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 5 mL의 섬유 아세포 배지 및 플레이트 섬유 아세포에코팅 된 세포 조직 배양 T25 플라스크. 이 단계 후에 섬유 아 세포를 확장하면 위에 설명한대로 해리하고 종자 12 X 10 3 셀 / cm 2 .
    5. 일단 융합 세포가 냉동 준비가되면 재 프로그램을 위해 팽창 시키거나 플레이트하십시오. 모든 재 프로그램이 시작되기 전에 섬유 아세포의 두 라운드를 동결하십시오 (동결 절차는 다음 섹션 참조). 재 프로그래밍 효율은 일반적으로 낮은 통과 섬유 아세포의 경우보다 높으며, 2-4의 세포가 최적이다. 그러나,이 프로토콜을 사용하여 10 번까지 섬유 아세포의 성공적인 재 프로그램 화가 수행되었다.
  4. 섬유 아세포의 동결 및 해동
    1. 신선한 fibroblast 냉동 매체를 준비하십시오 : 90 % FBS + 10 % dimethylsulfoxide (DMSO). 4 ° C에서 유지하십시오 ( 표 1 ). 일단 합류되면 T25 조직 배양 플라스크를 3 개의 냉동 보관실로 동결시킬 수 있습니다. 냉동 약병 당 섬유 아세포 냉동 매체 500 μL를 준비합니다.
    2. 세포를 동결시키기 위해 c단계 1.3에서 설명한대로 혈구 계수계를 사용하여 세포 수를 계산하고 3 x 105 세포의 일부를 15 mL 튜브로 옮긴다. 300xg에서 3 분간 튜브를 회전시킵니다. 뜨는을 대기음.
    3. 4 ˚C의 섬유 아세포 동결 배지 500 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 cryovials로 전송하십시오. 냉동 용기에 유리 병을 넣고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 24 시간 동안 -80 ° C에서 배양하십시오.
    4. 세포를 해동 시키려면 37 ° C의 물에 냉동고의 바닥 부분을 담그십시오. 액화되면 세포 현탁액을 15 mL 튜브에 옮기고 5 mL의 섬유 아세포 배지를 첨가하십시오. 세포를 300xg에서 3 분간 스핀.
    5. 뜨는을 제거하고 fibroblast 매체 5 ML에서 세포 펠렛을 resuspend. 비 코팅 T25 조직 배양 플라스크에 세포를 옮기고 37 ° C에 품어 라.

2. 섬유 아세포의 SeV 벡터 재 프로그램

  1. 벡터 분취 량의 준비 주의 : 바이오 안전성 레벨 2의 밀폐하에있는 SeV를 다루십시오. 제조업체의 프로토콜 및 현지 지침 17을 참조하십시오. 바이러스 역가는 배치마다 다릅니다.
    1. aliquots을 준비하기 전에 제조 업체의 프로토콜 ( 예 : CytoTune 2.0)에 따라 5 X 10 4 세포에 필요한 벡터의 양을 계산합니다. 바이러스 역가는 일반적으로 8 x 107 ~ 1.5 x 108 입니다. 벡터 5 : 5 : 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 및 hKlf4 = MOI 3) 벡터를 분해하고 결합하십시오. 오토 클레이브 1.5 ML 튜브에 5 X 10 4 세포의 재 프로그램을 위해 계산 된 금액. 재 프로그램을 위해 바이러스 부피를 섬유 아세포 배지로 희석하여 최종 부피 250 μL로 만듭니다.
      참고 : 각 유리 병은 5 x 10 4 섬유 아세포가있는 24- 웰 조직 배양 플레이트의 한 개의 웰을 다시 프로그래밍 할 때 유효합니다. 바이러스 분주를 -80 ° C에 보관하십시오.
  2. SeV 벡터 전달
    1. 흡인 세포 cu배지를 가하고 1 mL의 DPBS로 씻는다. DPBS를 대기음으로하고 트립신 - EDTA (0.05 %) 1 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 5 분간 또는 세포가 분리 될 때까지 인큐베이션한다.
    2. fibroblast 매체 2 ML을 추가하고 세포를 resuspend하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 3 분 동안 300 XG를 원심 분리하십시오.
    3. 뜨는을 기음과 fibrosblast 매체 2 ML에 펠렛을 resuspend.
    4. hemocytometer를 사용하여 섬유 아 세포를 계수하고 24 - 웰 조직 배양 판의 하나의 우물에 5 x 10 4 개의 세포를 시드하십시오. 하룻밤 37 ° C에서 세포를 품어.
    5. 세포 배양 배지를 대기음으로하여 SeV 용액 250 μL를 첨가하고 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.
    6. 매일 매체를 신선한 섬유 아세포로 바꿉니다. LN - 521 코팅 플레이트로 passaged하기 전에 transduced 세포가 7 일 동안 성장할 수 있습니다. 통과하기 하루 전 LN-521 판을 준비하십시오. 코팅 절차는 2.3.1을 참조하십시오.
  3. 형질 도입 된 섬유 아세포의 재조합
    1. LN-521 코팅 된 접시 : DPBS에서 LN-521을 최종 농도 0.63 μg / cm 2로 희석하십시오. 60mm 조직 배양 접시 당 LN - 521 솔루션 2 ML 피펫. parafilm을 사용하여 60mm 조직 배양 접시를 밀봉하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다.
    2. 보다 쉬운 취급을위한 Essential 8 medium (E8) 분취 량을 준비하십시오 : E8 배지 48.5 mL, E8 보충액 1 mL 및 PEST 500 μL ( 표 1 ).
    3. 형질 도입 7 일 후, 세포를 LN-521로 코팅 된 60mm 조직 배양 접시에 옮긴다. Trypsin-EDTA (0.05 %) 250 μL를 첨가하고 37 ° C에서 5 분간 또는 세포가 분리 될 때까지 배양하십시오. 300 x g에서 3 분간 섬유 아세포 배지 2 mL와 원심 분리 세포를 첨가한다.
    4. 뜨는을 대기음. hemocytometer에서 fibroblast 매체와 카운트 셀 2 ML의 Resuspend 펠렛. 사전 코팅 판에서 LN - 521 솔루션을 대기음과 LN - 521 precoated 60mm 요리에 섬유 아세포 매체의 5ml에 4 X 10 4 셀을 시드. Rho 키나아제 억제제 Y-27632를 첨가하십시오(ROCKi)를 5 μM의 최종 농도로 첨가 하였다. 37 ° C에서 밤새 품어 둡니다.
    5. 중요하게, 다음날, 매체를 E8 매체로 변경하십시오. 매일 E8 매체를 교체하십시오. hiPS 세포 콜로니가 2 ~ 3 주 이내에 나옵니다.

3. 콜로니 선택 및 hiPS 세포의 확대

참고 : 다음 단계는 스테레오 현미경으로 바이오 안전성 캐비닛 외부에서 수행됩니다. 헤어넷과 절차 마스크를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 배양 물을 오염시키지 않도록 조심스럽게 작업하십시오.

  1. 피킹하기 전날 LN-521 코팅 조직 배양 24- 웰 플레이트를 준비하십시오. DPBS 0.63 μg / cm 2 에서 LN-521 희석. 250 - LN - 521 솔루션의 피펫 24 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에 잘. parafilm을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다.
    참고 : 식민지는 직경이 1mm를 초과하면 집어 낼 준비가됩니다. 식민지는 날카로운 모서리를 나타내고 균질 한 mon으로 자라야한다.olayers ( 그림 2D ).
  2. LN - 521 솔루션을 대기음하고 24 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에 E8 500 μL를 추가합니다.
  3. stereomicroscope 아래 패턴과 같은 격자에 메스와 작은 조각으로 식민지를 잘라. 기계적으로 접시에서 세포 시트를 긁어 준비 잘 ( 그림 2D -2E ) 200 μL 피펫을 사용하여 시트를 전송할 수 있습니다. 콜로니를 별도의 우물로 선택하십시오.
  4. 48 시간 동안 배지를 바꾸지 않고 세포가 부착되도록하십시오. 그 후, 매일 E8 배지로 교환하십시오.
  5. 콜로니의 크기가 5 mm를 초과하면 LN-521 코팅 판의 새 우물에 단일 세포로서 효소 적으로 세포를 통과시킵니다.
  6. 세포에서 세포 배양 매체를 대기음과 DPBS 250 μL로 씻으십시오.
  7. DPBS를 기음. 해리 시약 250 μL를 추가하고 37에서 3 분 품어 ° C.
  8. 세포가 반올림되기 시작했는지 관찰하십시오. 떼다세포를 해리 시약으로 몇 번 헹구어 플레이트에서 제거한다.
  9. 15 ML 튜브에 E8 매체 500 μL를 추가합니다. 해리 시약의 세포를 튜브에 옮기고 300 x g에서 3 분간 원심 분리한다.
  10. LN - 521 precoated 우물에서 LN - 521 솔루션을 대기음과 500 μL 실내 온도 E8 매체를 추가합니다.
  11. 뜨는을 대기음과 E8 매체 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend.
  12. hemocytometer를 사용하여 세포를 계산하고 준비 LN - 521 precoated 잘 (1.25 X 10 4 - 2.5 X 10 4 셀 / cm 2 )에서 2.5 X 10 4 - 5 X 10 4 세포를 시드. 세포 배양 양식은 의도 한 목적에 맞게 쉽게 확대 할 수 있습니다.
  13. ROCKi를 10 μM의 최종 농도에 첨가하십시오. 37 ° C에서 세포를 품어.
  14. 매일 E8 매체를 교체하십시오. 세포는 보통 4-6 일 후에 통과 할 준비가됩니다. 상기에서 기술 한 바와 같이 단일 세포로서 효소 적으로 세포를 통과 시키며, 약 90 % 융합.
    참고 : 재 프로그램 벡터는 hiPS 세포 확장 도중 점진적으로 희석되고 통과 12 후에는 검출되지 않습니다. 공평하게 재 프로그램 된 세포는 일반적으로 6 ~ 10 번 통로에서 증식을 멈추거나 특징적인 다 능성 줄기 세포 형태를 잃습니다 ( 그림 3B ).
  15. hiPS 세포의 동결 및 해동
    1. 세포를 동결하려면, 위에서 설명한대로 효소로 단일 세포로 세포를 해리하고, hemocytometer에서 세포를 계산하고 E8 매체의 1 ML을 포함하는 15 ML 튜브에 2.5 X 10 5 세포를 전송합니다. 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리하십시오. 뜨는을 대기음.
    2. 4 μC PSC cryomedium 250 μL에 Resuspend 세포 펠렛과 cryovial로 전송합니다. 냉동 보관 용기에 유리 병을 놓고 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮기기 전에 24 시간 동안 -80 ° C에서 배양하십시오.
    3. 세포를 녹이기 위해서는 미리 코팅 한 24- 웰 조직 배양의 LN-521 웰을 준비하십시오플레이트를 LN-521 용액을 흡입하고 250 ㎕의 E8 배지를 첨가함으로써 배양 하였다. 작은 고드름이 남아있을 때까지 37 ° C의 물에서 냉동 보관함의 바닥 부분을 잠급니다.
    4. cryovial에 E8 매체 250 μL를 추가하고 세포 현탁액을 15 ML 튜브에 전송하고 E8 매체 1 ML을 추가합니다. 세포를 300xg에서 3 분간 스핀.
    5. 뜨는을 제거하고 상온 E8 매체 250 μL의 세포 펠렛을 resuspend. 준비된 우물에 세포 현탁액을 전송하고 1 % 세포 생존 보충 또는 10 μm의 록키를 추가합니다. 37에서 조직 문화 플레이트를 품어 ° C.

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Representative Results

생검에서 hiPS 세포로

생체 검사부터 확립 된 hiPS 세포에 이르는 전체 과정은 재 프로그램 벡터가 없으며 특성화를 위해 준비되며 약 16 주 소요됩니다 ( 그림 1 ). 보다 자세한 타임 라인은 그림 2A에 명시되어 있습니다. 섬유 아세포 배양을 확립하고 확장시키기 위해서는 약 4 주가 소요됩니다. 첫 번째 hiPS 세포 콜로니는 센다이 벡터 형질 도입 후 약 3 주 후에 나타났다. 콜로니는 첫 번째 통로에서 기계적으로 골라내어 효소 적으로 단일 세포로 퍼지게된다.

인간 섬유 아세포 배양 물의 확립

사람의 섬유 아세포 배양 물이 confluency로 성장하여 받아 들여진 형태를 나타낼 때, 그들은 처음에 두 개의 passag( 그림 2B ).

SeV 벡터를 이용한 인간 섬유 아세포의 재 프로그램

SeV 형질 도입 후 세포 죽음의 증가 된 수준이 발견되었고 섬유 아세포의 형태에 약간의 변화가 관찰되었다. 첫 번째 hiPS 콜로니의 출현은 형질 도입 후 12 일째부터 발견되었다 ( 그림 2A , 2C ). 집을 잡을 준비가 된 식민지는 형질 도입 후 약 3 ~ 4 주일이 걸릴 것으로 예상되었다 ( 그림 2A , 2D ). 이 프로토콜에 명시된 양의 세포를 시딩하면 풍부한 콜로니가 나타납니다 (<20). 유리한 형태를 나타내는 콜로니를 선택적으로 따는 것이 좋습니다. 식민지 특징 선호 평평한 소형 세포 질량, 균질 monolayers로 성장, 구별 indi 주변 섬유 모세포쪽으로 날카로운 가장자리를 가진 다발성 세포 ( 도 2D ). hiPS 세포 콜로니를 메스를 사용하여 그리드 형 패턴으로 절단하고 기계적으로 통과시켰다 ( 도 2E ). 픽업 된 hiPS 클론을 중간 정도의 변화없이 플레이트에 부착시키기 위해 48 시간 동안 두었다. hiPS 세포 클론은 매우 균질 하였지만, 재 프로그래밍 플레이트에서 유래 된 소수의 섬유 아세포는 처음 두 계대 동안 허용되었다 ( 도 2F ). 까다로운 국경과 큰 불균일 한 이종 세포 덩어리로 식민지를 선택하는 것은 피해야한다 ( 그림 2G ). 획득 된 hiPS 세포주는 핵 - 세포질 비율이 높고 발광 테두리를 정의한 고밀도 단일 층으로 자랐다. 대조적으로, 이러한 기준을 충족시키지 못한 부착 된 비 균질 콜로니는 버려졌으며 ( 그림 2H ), 혼합 세포 집단의 배양을 피했다.

p ": keep-together.within-page ="1 "> hiPS 세포 클론의 검증

파생 세포의 다 능성의 특성화는 SeV 벡터가 소실 된 후 수행되었으며 다 능성 상태의 유지는 내인성 인자의 발현에 의해 유도되었다. hiPS 세포 검증을 진행하기 전에 SeV 벡터 표현이 손실되었는지 확인하십시오. 이 프로토콜에 따라 SeV 벡터 RNA는 우리의 경험에 따라 12 번 통로에서 더 이상 검출 할 수 없으므로 특성화의 적절한 출발점이됩니다 ( 그림 3A ). 다 능성 마커에 대한 면역 세포 화학 염색 OCT4, SSEA4 및 NANOG는 균질 양성 결과를 가져와야합니다 ( 그림 3B ). 다 능성 인자를 발현하지 않은 부분적으로 재 프로그램 한 세포를 함유 한 세포 배양 물은 폐기되었다 ( 도 3C ). 내인성 다 분화 유전자의 mRNA 발현은 실시간 PC 도 3D의 R (RT-PCR).

Pluripotent 줄기 세포는 쉽게 3 개의 세균으로 분화 할 수 있어야합니다. hiPS 세포 분화 가능성은 배아 체 (EB) 18의 형성에 의해 평가되었다. hiPS 세포로부터 생성 된 자유 부동 EB를 도 3E에 나타내었고 21 일 후의 EB 분화 후 배아 층 특이 마커의 mRNA 발현을 도 3F에 나타내었다.

그림 1
그림 1 : 피부 생검에서 hiPS 세포까지의 흐름 차트.
프로토콜의 주요 단계 개요. 이 그림에는 생검 수집, 섬유 아세포의 분리, SeV 전달, 식민지 따기 및 hiPS 세포의 클론 성 확장이 포함됩니다.e.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : hiPS 세포 생성의 중요한 단계.
(A)
시간 선은 섬유 아세포, SeV 전달, 중간 변화 및 코팅을 포함하여 프로토콜에서 중요한 시점을 강조한다. hiPS 세포의 통로 12는 특성화 실험의 시작으로 강조 표시됩니다. (B) 일반적인 형태와 문화에서 합류 섬유 아 세포의 밝은 필드 이미지. (C) 형질 도입 된 섬유 아세포로부터의 hiPS 세포 콜로니의 출현. (D) 주위의 섬유 아세포 (날갯짓 0)쪽으로 날카로운 모서리를 가진 구별 가능한 개별 세포를 평평하게하는 우점 특징을 나타내는 식민지를 선택할 준비가 됨. (E) hiPS세포 콜로니는 그리드 형 패턴으로 절단되고 기계적으로 계승된다 . (F) 성장 며칠 후 식민지를 준수. 부착 된 hiPS 세포는 재 프로그램 염색 플레이트에서 기원 한 비정상적으로 많은 수의 섬유 아세포로 둘러싸여있다. 섬유 아세포는 플레이트를 긁어 낼 수 있으며 이후의 단일 세포 구절 (통로 1)에서 사라질 가능성이 큽니다. (G) 완전히 재 프로그램 된 세포를 연상시키지 않는 형태를 나타내는 콜로니; 까다로운 국경, 큰 비 압축 이종 세포 덩어리. (H) 밝기 필드 이미지는 매우 이질적인 세포주에 비해 균질 한 완전히 재 프로그램 된 hiPS 세포주를 조기 통과시키는 것을 예시한다. 스케일 바는 100 μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 그림 3 : hiPS 세포의 특성.
(A)
SeV 벡터 특정 마커의 RT-PCR. 통로 3에서의 hiPS 세포는 재 프로그래밍 벡터 1에 대한 양성 대조군으로서 사용된다. 12 번 관절에서 바이러스 특이 마커 Sendai specific backbone (SeV B), Sendai specific KLF4 (KLF4 SeV), 센다이 특이 cMYC (cMYC SeV), PCR control (GAPDH) 및 template 없음 (-) (B) 통로 12에서 완전히 재 프로그램 된 균일 한 hiPS 세포주의 대표적인 예. hiPS 세포의 명 시야 이미지는 날카로운 발광 단 가장자리 및 큰 핵 및 작은 세포질을 갖는 단단한 단일 층에서 세포가 자라는 것을 나타낸다. 다 능성 마커 OCT4, NANOG, SSEA4 및 핵 염색 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)의 면역 세포 화학 염색은 균질 양성 발현을 입증한다. (C) pluripotency 마커 NANOG에 대한 이질적인 표현을 전시 세포주. 문화e는 부분적으로 재 프로그램 된 셀을 포함하므로 폐기해야합니다. (D) 다 능성 마커의 발현을 나타내는 다 능성 마커 NANOG, OCT4, PCR 대조군 (GAPDH) 및 주형 (-)의 mRNA 발현의 RT-PCR. (E) hiPS 세포로부터 생성 된 자유 부동 배아 체. (F) 21 일 배아 체 차별화 후 RT-PCR은 파생 된 hiPS 세포가 3 개의 세균 층으로의 분화가 가능하다는 것을 보여준다. 내배엽 마커 AFP 및 GATA4, 중피종 마커 RUNX 및 HAND1, 외배엽 마커 NCAM 및 NESTIN, PCR 대조군 (GAPDH) 및 형판 없음 (-). 스케일 바는 100 μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜의 예상 결과는 여러 clonally derived hiPS 세포 라인의 성공적인 생성입니다. 중요하게, 여기에 기술 된 확립 된 hiPS 세포의 유지 및 확대를위한 방법은 신뢰성이 있고 줄기 세포 배양의 경험이 거의없이 수행 될 수있다. LN-521 매트릭스와 함께 ROCKi와 함께 효소 단클론 항체는 식민지 기반의 구강이 10 , 19 , 20을 자극 할 수있는 유도 이질성을 피하면서 핵형 적으로 정상, 다 능성 및 쉽게 분화 할 수있는 것으로 세포를 유지하는 것으로 알려져있다. LN-521에서 배양 된 hiPS 세포는 ROCKi 10을 첨가하지 않고 단일 세포로 계대 할 수 있지만, ROCKi를 첨가하면 경험이 적은 핸들러가 쉽게 프로토콜을 수행 할 수 있으며 hiPS 세포 유도에 필요한 시간이 단축됩니다.

재 프로그래밍 효율은 GE입니다.이 프로토콜에 대한 전반적인 문제는 아닙니다. SeV 벡터는 섬유 아세포 11에 대해> 1 %의 비교적 높은 재 프로그램 효율을 갖는다. 풍부한 식민지 출현 (<20)이 예상됩니다. 필요한 콜로니 수의 3 배를 선택하는 것이 좋습니다. 픽킹 된 클론 중 일부는 따기 후에 고착되지 않음이 관찰되었습니다. 부분적으로 재 프로그램 된 콜로니를 보충하기 위해서는 여분의 콜로니가 필요할 수도 있습니다. 부분적으로 재 프로그램 된 콜로니는 경우에 따라 SeV 벡터에 의한 다 능성 유전자의 외인성 발현에 의해지지 및 성장할 수있다. SeV 벡터가 희석됨에 따라이 세포들은 증식과 해리를 멈추게되며, 일반적으로 6-8 번 주변에서 명백해진다. 배양 물의 이질성 (heterogeneity)은 또한 부분 재 프로그램의 징조이며 이질적인 균주는 폐기되어야한다 ( 그림 2H ).

재 프로그램 벡터 및 배양 조건의 최적 선택은생성 된 세포의 목적. 그러나 결과에 영향을주는 배치 별 변동을 피하려면 정의 된 조건을 사용하는 것이 좋습니다. 재조합 세포의 게놈 무결성을 보존하기 위해 비 통합 벡터 시스템을 선택하는 것이 좋습니다. SeV 벡터는 견고성, 상대적으로 높은 효율 및 낮은 수위 시간으로 인해이 프로토콜에서 선택되었습니다. SeV 벡터는 세포 분열 동안 희석되고 통로 12 주위에서 검출되지 않으므로, 생성 된 데이터가 외인성 발현에 의해 영향을받지 않도록 보장한다. 임상 목적으로 의도 된 세포에 대한 세심한 요구 때문에 SeV 재 프로그램은 모든 벡터 물질의 완전한 제거가 어렵다는 것을 입증하기 때문에 임상 번역의 장벽이 될 수 있습니다. mRNA 매개 재 프로그램은 세포 치료 12 에서 의도 된 사용으로 세포를 도출하는 경우에 유리할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 훨씬 더 노동 집약적이며 21 을 사용하기가 더 복잡합니다. 여기 방법은 de섬유 아세포 배양에 대한 스크라이브 (scribe)는 또한 임상 적 적용에 부적합하다. FBS와 젤라틴 모두 이종이면서 정의되지 않았기 때문에 정의 된 이종 프리 제품 22로 바꾸는 것이 좋습니다.

어떤 형태의 세포 배양으로 작업하는 동안 멸균 처리 기술과 정기적 인 마이코 플라스마 감염 검사가 권장됩니다. 인간의 피부에는 제대로 처리되지 않으면 배양되는 환경에서 번식 할 수있는 많은 미생물이 포함되어 있습니다. 그러므로 피부 생검의 처리 및 생체 검사 과정을 거친 배양 첫 일 동안 특별한주의를 기울이는 것이 좋습니다. 피부 생검에서 섬유 아세포 배양 물의 수립은 실제로 시간이 많이 소요되는 과정입니다. 피부 생검을 처리 한 후 초기에는 섬유 아세포 세포의 약한 징후가 나타나기 때문에 문화에 예상되는 형태를 나타내는 소수의 섬유 아세포를 찾기 위해 적어도 일주일 정도 기다려야합니다. 섬유 아 세포의 형성에 필요한 시간생체 내 생체 외 체외 배양 검사는 생검의 크기, 기증자의 연령, 그리고 생검이 취해진 이후의 생체 내 검사 방법 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 최적의 재 프로그램 효율 23을 위해 조기 통과 섬유 아세포를 재 프로그램하는 것이 바람직합니다.

요약하면, 우리는 매우 균일 한 hiPS 세포를 생성하기 위해 확고하고 사용하기 쉬운 방법을 확립했습니다.

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Disclosures

저자는보고 할 이해 관계가 없습니다.

Acknowledgements

이 작품은 SSF (B13-0074)와 VINNOVA (2016-04134) 자금 지원 기관에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

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References

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