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Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

Neuroscience

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Summary

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

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Ragauskas, S., Kielczewski, E., Vance, J., Kaja, S., Kalesnykas, G. In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model. J. Vis. Exp. (131), e56173, doi:10.3791/56173 (2018).

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Abstract

레이저 유도 안 neovascularization (CNV) 나이 관련 황 반 변성 (AMD)의 습식 모방을 잘 설립 모델입니다. 이 프로토콜에서 우리는 신생 프로세스, 하지만 오히려 multimodal 경도 에서에서 얻을 수 있는 강력한 정보에 초점을 방 아 쇠를 단순히 병 변 레이저 유도 생성의 기술적 고려 사항 통해 독자를 안내 하고자 vivo에서 후속 기간에 걸쳐 이미징.

레이저 유도 마우스 CNV 모델 다이오드 레이저 관리에 의해 생성 되었습니다. 이미징 기술은 복합 vivo에서 CNV 유도, 진행 및 회귀를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 첫 번째, 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 확인 Bruch의 막의 휴식 lasering 즉시 수행 했다. 후속 vivo에서 이미징 fluorescein angiography (FA)를 사용 하 여 직렬 이미지 안 수준에서 인수에서 Bruch의 막의 성공적인 손상 확인. CNV 확산 및 회귀는 lasering 후 5, 10, 및 14 일에의 경도 후속 SD 10 월 및 FA를 사용 하 여 수행 되었다. 간단 하 고 신뢰할 수 있는 FA 이미지에서 새 CNV leasions의 등급 표시 됩니다. CNV 사이트에서 망막 두께의 측정에 대 한 수동 구경 응용 프로그램과 결합 하는 총 망막 두께의 측정에 대 한 자동화 된 세분화 종의 존재의 중 정한 평가 하실 수 있습니다. 마지막으로, CNV의 조직학 확인 isolectin GS-IB4 안 flatmounts에 얼룩을 사용 하 여 수행 됩니다. 얼룩이 지는 thresholded, 그리고 isolectin-긍정적인 지역 ImageJ로 계산 됩니다.

이 프로토콜은 특히 복합, 빨리, 수 CNV 병리학의 높은 처리량 같은 심사를 요구 하는 치료제 연구 및 CNV 병리학과 망막 부 종의 신뢰할 수 있는 분류에 유용 합니다. 또한, 높은 해상도 SD 10 월 subretinal 또는 intraretinal 액체의 축적 등 다른 병 적인 특징의 녹음 수 있습니다. 그러나,이 메서드는 수동으로 수행 하는 SD 10 월 이미지, CNV 볼륨 분석을 자동화 하는 가능성을 제공 하지 않습니다.

Introduction

최초의 성공적인 시도가 설치류에 인간의 CNV의 병 리를 모방 긴 에반스 쥐1크립 톤 레이저와 거의 3 년 전을 시연 했다. 그 후, 크립 톤 레이저는 가장 인기 있는 마우스 스트레인, C57BL/6J2,,34에 Bruch의 멤브레인을 끊는 데 사용 됩니다. CNV 유도 FA와 조직학 얼룩 확인 했습니다. 10 월, 같은 비 침범 성 이미징 modalities의 급속 한 발전 설치류 전 임상 모델 분야의 성장을 육성 시켰다. 크게 여러 시간 시점에 같은 눈에 망막의 형태학 상 변화를 모니터링 하는 기능, 동물 사용의 감소에 기여 하 고 실험 연구에서 효율을 증가. CNV 변의 조직학 평가 오히려 간단 하며 레이저 관리, 이미지 수집 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 지역/볼륨 추정의 사이트 주위 비정상적인 혈관 성장의 라벨. 대조적으로, vivo에서 화상 진 찰 양식 CNV 병리학과 그 해석의 더 복잡 한 분석을 소개합니다.

여기 우리는 간단 하 고 비교적 빠른 방법을 제시 학년 유도, 진행, CNV의 회귀를 FA, SD-10 월를 사용 하 여 및 마우스에 자동된 분할 방법 레이저 유도 CNV 모델.

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Protocol

모든 동물 ARVO 문을 따라 동물에 대 한 사용의 안과 및 비전 연구 및 동물 실험에 대 한 EC 지침 86/609/EEC 승인 및 핀란드의 동물 실험 보드에 의해 모니터링 프로토콜을 사용 하 여 치료를 받았다.

1. 레이저 유도 마우스 CNV 모델 5

  1. 거시적 어떤 이상에 대 한 동물의 눈을 검사 합니다.
  2. 마우스 무게.
  3. 계산 하 고 동물, 예를 들면 medetomidine (1 mg/kg), 케 타 민 (75 mg/kg), 그리고 1:1.5:2.5, 또는 마 취 제 (40-75 mg/kg)의 비율 (0.9 %NaCl 용액) 증류수의 혼합물의 무게에 따라 사용, 마 취약의 적절 한 금액을 준비 xylazine (5 mg/kg), 그리고 1:2.; 5: 1의 비율로 증류수 (0.9 %NaCl 용액) 20 g 마우스에 대 한 혼합물의 0.1 mL를 주사.
  4. Intraperitoneally 마 취 제를 주사.
  5. 동물 마 취 때까지 감 금 소 및 대기에 다시 마우스를 놓습니다. 마우스는 제대로 페달 반사의 부족에 의해 anesthetized 확인 합니다.
  6. 레이저 안전 개인 보호 장비를 사용 하 여를 확인 합니다.
  7. 슬릿 램프와 532 nm 다이오드 레이저를 켭니다.
  8. 감 금 소 및 난방 패드에 장소에서 마우스를 제거 합니다.
  9. 동 공 팽창에 대 한 Tropicamide의 한 방울을 적용 합니다. 전체 (3 mm) 동 공 팽창에 대 한 3-5 분을 기다립니다.
  10. 슬릿 램프의 단계에 마우스를 놓습니다.
  11. Applanate 각 막에 coverslip에 opthalmic 액체 젤의 한 방울을 배치 합니다.
  12. 마우스 눈을 센터에 시 신경 머리의 방향을 정하십시오.
  13. 100 레이저 전원 설정 mW, 100 ms, 기간 및 50 μ m 스팟 사이즈.
  14. 망막 안료 상피 (RPE)에 레이저 빔을 초점.
  15. 각각 4, 8, 및 12 시 시 신경 주위에 위치에 이상적으로 망막 혈관을 피하 여 레이저 촬영 한 눈에 확인 합니다. 모든 레이저 망막 출혈의 부재에 대 한 촬영 후 눈의 저를 검사 합니다. Contralateral 눈 비에서 컨트롤 역할을 합니다.
  16. 다시가 열 패드에 coverslip 및 장소 마우스를 삭제 합니다.
  17. 두 눈에 한 방울 못 젤 방울을 적용 합니다.

2. SD-10 월 6,7

  1. 설치류 맞춤 단계에 마우스를 놓고 머리를 고정 합니다.
  2. Vivo에서 이미징 X 및 Y 단계 컨트롤러를 사용 하 여 SD 10 월 시스템 (예를 들어, Bioptigen/Leica Envisu R2200) 얼굴 눈의 렌즈를 맞춥니다.
  3. Bruch의 막의 휴식을 확인 하기 위해 SD 10 월 검사: 일단 SD-10 월 전체 눈 검사, 수동으로 이동할 참조 라인 lasered 사이트. Bruch의 막의 나누기에서 영역 ( 그림 1참조)에 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다.

3. fluorescein 제품은 7,,89

  1. 홀더, 마우스를 제거 하 고 (예를 들어, 하이델베르크 Spectralis HRA2) FA 시스템에 그것을 배치.
  2. 레이저에 초점 적외선 반사율 모드를 사용 하 여 보기 창 중간에 시 신경의 머리와 눈의 저 분야를 구울.
  3. 피하 또는 intraperitoneally 5 %fluorescein 나트륨 소금 20 g 마우스에 대 한 0.1 mL를 주사.
  4. 안 수준에 초점을.
  5. 안 초점 수준에서 이미지를 가져가 라.
  6. 다시 망막 수준에 집중 하 고 이미지를 가져가 라.
  7. 30 s 및 반복 단계 3.4-3.6 기다립니다.
  8. 소유자에서 마우스를 제거 하 고 난방 패드에 그것을 배치.
  9. Α2-medetomidine, atipamezole (0.5 mg/kg, i.p.), 또는 마 취에서 동물 복구에 대 한 대기에 대 한 적으로 마 취를 반대로.
  10. 반복 에서 vivo SD 10 월 및 FA 이미징 마 취 동물에 후속 일 5, 10, 14에.

4. CNV 등급

  1. 학년 10 월 이미지와 다음 날 0 lasering 직후 찍은 안 FA 이미지에서 Bruch의 막의 손상:
    0-Bruch의 멤브레인은 손상 되지
    1-Bruch의 막의 성공적인 손상
  2. 학년 누설 fluorescein 신호 다음으로 망막 FA 이미지의 일련에서의 역학을 비교 하 여 관찰 했다에서 관광 명소에서 CNV의 존재:
    0-망막의 정상적인 외관
    누설의 0.5-희미 한 얼룩
    1.0-새 CNV 영역
    참고: 사용 하 여 OCT 영상 CNV의 또는 의심 FA에서 추가 확인 10 월 이미지에 intraretinal 액체의 존재 CNV 등급 좋을 곳.

5. 망막 두께 측정

  1. 자동된 분할 소프트웨어를 사용 하 여 망막 두께 측정. RPE (건강 측정 사이트), 또는 RPE 손상 (레이저 사이트)의 사이트에 연결 하는 가상 선 신경 섬유 층에서 모든 층의 간격으로 총 망막 두께 간주 됩니다 확인 하십시오 ( 그림 7참조).

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Representative Results

거품 또는 subretinal lasering 직후 출혈은 항상 보이지 않는다입니다. 따라서, SD-10 월은 특히 Bruch의 막의 손상을 확인 하는 것이 중요. 그림 1 레이저 관리 후 다른 시간 지점에서 10 월 이미징의 예를 보여 줍니다.

Figure 1
그림 1 : 눈 저 (VIP 이미지)의 10 월 엔 얼굴 보기 흰색, 녹색, 빨간색 동그라미에 설명 된 세 가지에서 영역을 보여줍니다. 10 월 B-스캔 이미지 찍은 사전 lasering (초기), lasering Bruch의 막의 휴식을 확인 후 즉시 (0 일, 화살표 손상의 사이트를 가리킨), 5, 10 및 14 일 레이저 관리 후. 화이트에서 설명 하는 지역에서 볼 수 있듯이 (이미지의 첫 번째 행), CNV 나중 timepoints에서 개발 하지 않았다. 녹색과 적색으로 설명 하는 지역 개발 CNV, 후속 주 5에. 그러나, 10와 14 일 timepoints에서 이러한 CNV 병 변의 역행. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2와 3 직렬 이미징 남성 10 주 된 C57BL/6jRj 마우스에 하루 0에 모든 3 개의 관광 명소에 Bruch의 막의 성공적인 손상 확인 FA를 사용 하 여 표시 합니다.

Figure 2
그림 2 : 직렬 FA 이미징 모든 20 찍은 레이저 관리 후 바로 안 수준에서 s (이미지 1-18). 이미지에서 사이트 fluorescein 누설 나중 timepoints (흰색 화살표 이미지 18)에서 표시 하는 1 포인트에서 흰색 화살표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 직렬 FA 이미징 모든 20 찍은 레이저 관리 후 즉시 망막 수준에서 s (이미지 1-18). CNV 지역 fluorescein 누설 고 1 (새 CNV)의 정지 이미지 18에서에서 흰색 화살표에 의해 지적 이다. 참고 증가 강도 뿐만 아니라 FA (흰색 화살표 이미지 8, 11) 이미징 timecourse 동안 fluorescein 긍정적인 지역. 백인 이미지 18에서에서 설명 하는 두 가지 영역 데 희미 한 FA 신호 (0.5 등급)로 등급 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

CNV 병리학의 그레이 딩, 뿐만 아니라 SD-10 월도 유용 병 변 사이트, 예를 들어, 존재 subretinal 액체, 부 종, 그리고 CNV 회귀의 추가 정보를 공개 합니다. 그림 4 는 마우스에 레이저 유도 CNV의 주요 병 적인 특징을 보여준다.

Figure 4
그림 4 : 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 이미징의 CNV 병 리. SD-10 월 흉터 조직, CNV 형성과 액체 축적에 이러한 대표 이미지에서 볼 수 있듯이 망막 조직 내에서 자세한 CNV 병리학을 제공 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

황 반 부 종 인 간에 있는 습식 AMD의 주요 병 적인 특징 중 하나 이다. 레이저 유도 CNV 모델에서 망막 두께 자동된 조각화를 사용 하 여 평가 수 있습니다. 선택한에서 사이트의 수동 측정 CNV의 사이트에서 망막 두께 측정 하기 위해 필요 합니다. 그림 5 자동된 분할 후 생성 된 보고서의 예가 나와 있습니다.

Figure 5
그림 5 : 망막 두께의 정량화. 자동화 된 세그먼트화 측정으로 망막 두께 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

자동화 된 세그먼트를 사용 하 여 망막 두께 (표 1)에 대 한 개요를 제공 하는 빠른 방법입니다. 그림 6A , 6B 건강 한 망막 영역에서 고 CNV 병 리와 망막 영역에서 자동된 분할의 대표적인 예를 각각 보여줍니다. 개별 망막 층, 전체, 구별에 약간 부정확에도 불구 하 고 소프트웨어는 안정적으로 안료 쥐에 총 망막 두께 인식 합니다.

Figure 6
그림 6 : 자동 망막 층의 세분화. 건강 한 망막 영역 (A)의 CNV (이미지 B에서 별표)를 포함 된 망막 영역 자동된 분할. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

제조 분야에서 망막 두께 평가 하기 위해 각 lasered 지역은 다음과 같이 수동으로 측정 되었다: 총 망막 두께 RPE의 사이트에 연결 하는 가상 선 신경 섬유 레이어에서 모든 레이어 두께 고려 되었다 손상 (그림 7표 1).

지역 5 일째 10 일 하루 14
총 망막 두께, μ m 218±7.8 220±7.2 221±9.8
지역 1 200 204 214
2 지역에서 226 217 220
지역 3 222 223 227
데이터는 mean±SD로 표시 됩니다.

표 1입니다. 총 망막 두께 고 CNV 사이트 (3.0.8) 대 inVivoDiver 소프트웨어를 사용 하 여 자동화 된 세그먼트화 결정 14 일 속 행 동안에 망막 두께.

Figure 7
그림 7 : CNV 병 리과에서 지역에서 망막 두께의 수동 측정. 노란색 라인 레이저 관리의 사이트에 가상 RPE 레이어 (검은 선) 신경 섬유 층에서 총 망막 두께 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

조직학, CNV 장애 isolectin GS-IB4 라벨 (그림 8A)를 사용 하 여 확인 되었다. 이미지 분석 소프트웨어 이미지 J CNV 병 변 (그림 8B)의 면적을 계산 하는 데 사용 되었습니다.

Figure 8
그림 8 : 조직학 분석. CNV (녹색, A)에 안 flatmount에서 병 변의 조직학 얼룩 이미지 J (B)에서 임계 처리를 사용 하 여 측정할 수 있습니다. A 에 대 한 눈금 막대 50 μ m 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
 

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Discussion

복합 영상 CNV 병리학 평가 위한 귀중 한 도구를 제공합니다. 여기 우리는 FA, 구성 된 이미징 프로토콜 제시 SD-10 월, 그리고 CNV 병 리의 재현, 빠르고 신뢰할 수 있는 평가 대 한 자동 세분화. Bruch의 막 레이저 관리가 확인 후의 휴식. 또한,이 단계에서 SD OCT를 사용 하 여도 해석 결과의 혼동 수 있습니다 가능한 intraretinal 및 subretinal 출혈의 즉각적인 시각화 허용. 망막 누수 FA 이미지에서 fluorescein 신호에 따라 등급이 있었다. SD-10 월의 사용 CNV 병 리에 대 한 더 자세한 설명을 제공합니다. 또한, 후속 기간에 걸쳐 다양 한 시간 지점에서 경도 SD 10 월 분석 FA 혼자 의존 하는 경우에 애매 하 게 남아 있을 것입니다 병리학 시간적 차이 강조 했다.

총 망막 두께 자동된 조각화를 사용 하 여 측정 했다. CNV 유도 되었다 사이트에서 망막 두께 측정 수동으로 했다. 안 flatmount의 조직학 평가 확인 되 고 neovascularization의 지역 이미지 분석 소프트웨어 이미지 제이 사용 하 여 측정

적절 한 투명도의 시각적 축이 제시 프로토콜의 성공적인 성능에 대 한 중요 합니다. 각 막의 건조와 백 내장의 형성 문제 해결에 관련 된 주요 요소가 됩니다. 따라서, 마우스 마 취 되 면, 일단 눈 해야 될 지속적으로 수 화 된 인공 눈물 또는 각 막의 적절 일 분을 유지 하기 위해 젤. 제안 된 프로토콜 마 취의 유도에서 10 분 이내에 우선적으로 수행 되어야 한다. 확장 된 마 취 시간 백 내장 형성 원인과 vivo에서 화상 진 찰을 방지 수 있습니다.

설명된 프로토콜은 망막의 수준에서 혈관 누수에 기반으로 CNV 진행의 관측 등급 제한 됩니다. 망막 누출의 양적 평가 하이델베르크 Spectralis 소프트웨어를 허용 하는 누설의 영역의 묘사 고 관심 영역에 정량적 데이터를 제공 합니다을 사용 하 여 추가할 수 있습니다. 또한, Sulaiman 및 동료 (2015) 최근 CNV 볼륨10둥글지 메서드 사용 하 여 10 월 이미지에 vivo에서 인수에서 계산을 제안 했다. 대부분의 경우에서 CNV는 불규칙 한 모양으로 둥글지 모델 대부분 변의 볼륨의과 쪽으로 바이어스를 소개 합니다. 그러나 조직학 샘플의 confocal 분석에서 볼륨 측정 및 10 월 이미지에서 제안 된 둥글지 정량화 사이의 높은 상관 관계 메서드 CNV 볼륨10의 정량적 평가 위한 귀중 한 도구입니다 증거를 제공 하는, .

결론, 우리 믿는 다른 비보에 이미징 형식 자동된 세분화 및 조직학 분석의 제시 조합 CNV 병리학 임상 연구에서의 재현성 및 신뢰성 평가 제공 합니다. 메서드는 개념 치료 적 개입 연구의 증거를 위해 특히 유용할 수 있었다.

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Disclosures

저자 Symantas Ragauskas 박사는 직원 (연구원) 및 제공 계약 연구 서비스 채용이 문서에서 사용 되는 전 임상 CNV 모델 Experimentica 회사의 주주.

저자에 바 Kielczewski는이 문서에 사용 되는 SD 10 월 시스템을 생산 하는 Leica 마이크로 시스템즈의 직원 (연구 응용 프로그램 엔지니어, 10 월).

저자 조셉 밴스는 직원 (나 10 월 판매 감독)이이 문서에 사용 되는 SD 10 월 시스템을 생산 하는 Leica 마이크로 시스템즈의. 요셉 밴스 대통령 그리고 Spective, LLC의 전무 이사 이기도합니다.

저자 사이먼 Kaja, 박사 컨설턴트 최고 과학 책임자와 Experimentica 주식 회사, 한 전 임상 계약 연구 조직 제공 계약 연구 서비스, 포함이이 문서에서 사용 되는 전 임상 CNV 모델의 주주입니다. 사이먼 Kaja, 박사 CEO의 K & P 과학, LLC는, 컨설팅 회사, 생명 과학 이며 또한 박사 존 P. 및 Loyola 대학 시카고, Stritch 학부의 안과 써 E. Mulcahy 부여 교수로. 이 계약의 용어를 검토 하 고 상충 방침에 따라 Loyola 대학 시카고에 의해 승인 되었습니다.

저자 Giedrius Kalesnykas 박사는 직원 (CEO) 및 제공 계약 연구 서비스 채용이 문서에서 사용 되는 전 임상 CNV 모델 Experimentica 회사의 주주.

Acknowledgments

저자 우수한 기술과 videographic 지원 율리야 Naumchuk (Loyola 대학 시카고)와 아 그네 Žiniauskaitė (Experimentica 주식 회사)를 감사 하 고 싶습니다. Kaja 박사 연구 프로그램 박사 존 P.와 써 리 E. Mulcahy 부여 교수 Loyola 대학 시카고에 안과에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medetomidine (commercial name Domitor) Orion Vnr 01 56 02 Anesthesia
Ketamine Intervet Vnr 51 14 85 Anesthesia
0,9% NaCl B Braun 357 0340 Anesthesia
Xylazine (commercial name Rompun vet) Bayer vnr 14 89 99 Anesthesia
Tropicamide Santen Vnr 04 12 36 Mydriatic agent
Viscotears Alcon Vnr 44 54 81 Lubricant
Systane Alcon  - Lubricant
5% Fluorescein sodium salt Sigma Aldrich F6377-100G Fluoresent agent
Atipamezole (commercial name Antisedan) Orion Vnr 47 19 53 Anesthesia

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References

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