RGB e Imaging spettrale radice per pianta Phenotyping e ricerca fisiologica: messa a punto sperimentale e protocolli di Imaging

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Summary

Un protocollo sperimentale è presentato per la valutazione del terreno coltivato pianta radice sistemi con RGB e l'imaging iperspettrale. Combinazione di tempo di immagine RGB serie con chemiometrica informazioni da iperspettrale scansioni ottimizza intuizioni nelle dinamiche di radice di pianta.

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Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. J. Vis. Exp. (126), e56251, doi:10.3791/56251 (2017).

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Abstract

Migliore comprensione delle dinamiche di radice di pianta è essenziale per migliorare l'efficienza di utilizzo delle risorse dei sistemi agricoli e aumentare la resistenza delle cultivar di raccolto contro stress ambientali. Un protocollo sperimentale è presentato per RGB e l'imaging iperspettrale degli apparati radicali. L'approccio utilizza rizobox dove le piante crescono in terreno naturale sopra un tempo maggiore per osservare completamente sviluppati sistemi della radice. Impostazioni sperimentali sono esemplificate per valutare rhizobox piante sotto stress idrico e studiare il ruolo delle radici. Un'installazione di imaging RGB è descritto per quantificazione economico e veloce lo sviluppo delle radici nel tempo. L'imaging iperspettrale migliora la segmentazione radice dallo sfondo del suolo rispetto alla soglia di colore basata RGB. Il punto di forza dell'imaging iperspettrale è l'acquisizione di chemiometrica informazioni sul sistema suolo-radice per comprensione funzionale. Questo è dimostrato con mapping contenuto di acqua di alta risoluzione. Formazione immagine spettrale, tuttavia, è più complessa in immagine acquisizione, elaborazione ed analisi rispetto all'approccio RGB. Una combinazione di entrambi i metodi in grado di ottimizzare una valutazione completa dell'apparato radicale. Per il contesto della ricerca fisiologica phenotyping e pianta della pianta sono riportati esempi di applicazione l'integrazione di radice e tratti fuori terra. Ulteriore miglioramento dell'imaging di radice può essere ottenuto ottimizzando la qualità di immagine RGB con un'illuminazione migliore utilizzando diverse fonti di luce e di estensione dei metodi di analisi di immagine per dedurre il proprietà di zona di radice da dati spettrali.

Introduction

Le radici forniscono diverse funzioni essenziali per piante come deposito di assimila, ancoraggio delle piante terrestri nel suolo e l'assorbimento e il trasporto di acqua e sostanze nutritive1. Da un punto di vista evolutivo, la formazione degli assi di radice è considerata un presupposto fondamentale per l'origine della terra piante2. Nonostante questo ruolo importante, storicamente le radici hanno occupato solo una posizione marginale nella ricerca biologica. In tempi più recenti, tuttavia, vi è crescente interesse scientifico nei sistemi di radice di pianta come evidenziato nella Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Rilevanza degli studi radice in scienze botaniche.
Numero di radice studi collegati come percentuale di tutti gli studi di pianta pubblicati in riviste SCI negli ultimi decenni. Risultato da Scopus utilizzando parole chiave "impianto" e "pianta e radice" della ricerca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Due motivi principali possono essere ipotizzati per sottendono i recenti progressi nella ricerca di radice. Prima vegetazione terrestre è esposta a stress ambientali più frequenti a seguito di cambiamenti globali3. Nel contesto della produzione agricola si stima che globalmente circa il 30% della superficie agricola sono limitati dall'acqua e fosforo4,5. Riduzione dello stress di resa delle colture sono delle ragioni principali per le lacune di rendimento significativo che ammontano globalmente a più basso 50% di produttività potenziale per rainfed agro-ecosistemi6. Oltre alla disponibilità di risorse in esaurimento, questo è anche legato all'efficienza di uso di risorsa scarsa, cioè insufficiente capacità di una pianta di sfruttare le risorse disponibili7. Questo si traduce in perdite di risorse mobili quali nitrati che possono influenzare negativamente altri ecosistemi. L'efficienza di uso corrente di azoto globale, ad esempio, è stimato a 47%8. Uso migliore delle risorse efficienza tramite i metodi di miglioramento della gestione e cultivar è pertanto di grande importanza per entrambi sostenuta crescita dei prodotti agricoli, anche per quanto riguarda la sostenibilità ambientale. In questa pianta contesto radici sono considerate di essere un obiettivo chiave per colture migliorate e ritaglio sistemi9,10.

Una seconda importante background per il recente interesse nelle radici della pianta è progresso tecnologico nei metodi di misurazione. Metodi di radice lunga sono stati limitati da due sfide chiave: per la misurazione delle radici da piante che crescono nel terreno dovevano essere isolato per quantificazione, principalmente mediante lavaggio11, perturbi la disposizione architettonica degli assi di radice. Osservazione di radice in situ mediante scavo metodi, quindi conservare la naturale posizione delle radici nel terreno, sono stati utilizzati per Descrizione botanica12. Ancora sono molto che richiede tempo e quindi non soddisfano i requisiti di velocità effettiva del sistema della radice strutturale-funzionale comparativa analisi. D'altra parte metodi ad alta resa per la radice architettura misura principalmente sono state fatte su diete artificiali e per semenzale piante13 dove l'estrapolazione all'ambiente naturale crescita delle piante è discutibile14.

Il recente boom di ricerca principale è collegato strettamente all'anticipo del metodi15di imaging. Approcci in studi di radice di imaging possono essere approssimativamente raggruppati in tre tipi. Prima ci sono metodi 3D ad alta risoluzione come il CT e MRI16. Questi metodi sono più adatti per lo studio dei processi di interazione delle radici delle piante con il suolo, come siccità indotta xilema embolia17. In genere vengono applicati a comparativamente piccoli campioni dove permettono osservazioni dettagliate. Viene fornito un confronto del CT e di MRI per vasi di dimensioni diverse e l'imaging di radice bene in18. In secondo luogo, ci sono di alto-rendimento imaging metodi19,20. Questi metodi sono per lo più basata su comuni RGB imaging 2D di radici che crescono su diete artificiali (gel, carta di germinazione) dove il contrasto elevato consente una dissezione comparativamente semplice tra radici e sfondo. Essi sono adatti per il confronto di throughput elevato tra tratti di radice semenzale di genotipi differenti colture sotto crescente artificiale standardizzata circostanze13. Tra questi due approcci sono metodi rhizobox: usano imaging 2D di radici che crescono nel terreno nel più lungo periodo di tempo ed hanno velocità effettiva media21,22. Una sfida risale all'imaging di radice (2D) è quello di catturare anche indicatori di funzionalità principale oltre a descrizione della struttura23.

Nel presente documento presentiamo i protocolli sperimentali per l'imaging rhizobox cresciuto sistemi della radice mediante (i) una semplice ed economico su misura RGB imaging installazione e (ii) una configurazione più complessa di imaging NIR. Risultati di esempio ottenuti da queste due configurazioni sono mostrati e discussi nel contesto della pianta phenotyping e ricerca fisiologica della pianta.

Discussion

I protocolli prevedono due approcci complementari terreno coltivato imaging system di root. Un passaggio fondamentale per ottenere risultati sperimentali affidabili si sta riempiendo di rizobox che deve garantire un livello di substrato uniforme ed omogeneo nel vetro anteriore per offrire suolo-radice stretto contatto nella finestra di osservazione ed evitare vuoti d'aria. Questo è il motivo principale per utilizzare terra comparativamente fine setacciata di < 2 mm: più grandi aggregati provocare la morfologia superficiale superiore alla finestra di osservazione con i vuoti tra gli aggregati. Oltre ad un elevato rischio di disidratazione di punta di radice, questo richiede anche più complesse tecniche di elaborazione di immagini per acqua mappatura31.

Modifiche del protocollo, pertanto concentrano sul migliore e rapido riempimento di rizobox. Attualmente il tempo di riempimento è circa 30 minuti per scatola. Inoltre l'uso di rizobox con due finestre di vetro per l'imaging da entrambi i lati e modifiche per ottimizzare l'omogeneità di illuminazione per ottenere immagini migliori RGB vengono testati. Ulteriore estensione hardware anche considerare l'integrazione di planare optodi32 , nonché capacità di imaging33 nel sistema rhizobox. Si tratta tuttavia oltre le attività di aggiornamento corrente.

Modifiche del software di concentrano sulla registrazione automatica dell'immagine per fondere la parte superiore e inferiore RBG immagini34. Hyperspectral imaging avanzate funzione senza supervisione di estrazione si avvicina per28 , nonché metodi di rilevazione più sensibile obiettivo sorvegliato come SVMs35 sono testati. Quindi i dati iperspettrali potenzialmente consentono per la valutazione di più terreno, rizosfera e radice di proprietà36. Inoltre si intende sviluppare un (semi) automatizzato software per rhizobox radice immagini basato su una versione modificata di radice sistema analizzatore37 quantificare morfologiche (lunghezza, diametro, superficie) e tratti architettonici (frequenza ramificazione, ramificazione angoli).

La principale limitazione del protocollo rispetto ad approcci di imaging 3D è la restrizione per la superficie visibile radice e la proprietà di rizosfera. Tuttavia è stato dimostrato che i tratti visibili radice sono un proxy affidabile per l' intero sistema della radice21. La tecnica di rhizobox è facilmente combinato con campionamento distruttivo tradizionale (lavatrice) alla fine di una crescita dinamica imaging al fine di convalidare la relazione di visibile vs totale radice sistema tratti. Come questa relazione potrebbe variare tra specie21, campionamento distruttivo è consigliabile per garantire affidabile inferenza dai tratti visibili per qualsiasi nuova serie fenotipizzazione con una specie di colture diverse.

Il vantaggio fondamentale del protocollo presentato qui è la combinazione di condizioni di crescita realistiche (suolo), potenziale relativamente alto throughput per la temporaneamente risolto dell'imaging RGB e inferenza sulla funzionalità di radice (ad esempio l'assorbimento di acqua) tramite i dati di radice e rizosfera chemiometrica da imaging iperspettrale. Quindi i metodi supera le restrizioni di inferenza in semenzale elevato throughput e fuori suolo radice imaging metodi14, mentre permette parzialmente intuizioni profonde che phenotyping processi funzionali con complessità meno sperimentale e un throughput più elevato rispetto ai metodi avanzati 3D15.

Nei prossimi esperimenti utilizzerà il protocollo per studiare l'effetto di Micorriza sullo sviluppo del sistema della radice e funzionalità dei legumi anche per quanto riguarda le caratteristiche di radice fenotipizzazione di coltura di copertura specie in relazione alla struttura del suolo, di azoto e di carbonio in bicicletta.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono finanziamenti dal fondo austriaco scienza FWF tramite il progetto numero P 25190-B16 (le radici della resistenza alla siccità). Istituzione dell'infrastruttura imaging iperspettrale è stato sostenuto finanziariamente dal federale governo della Bassa Austria (Land Niederösterreich) tramite il progetto K3-F-282/001-2012. Finanziamenti supplementari per l'esperimento di barbabietola da zucchero è stato ricevuto dalla ricerca AGRANA & Innovation Center GmbH (ARIC). Gli autori ringraziano Craig Jackson per il supporto tecnico durante l'esperimento e inglese correzione del manoscritto. Riconosciamo anche Markus Freudhofmaier che hanno contribuito alla istituzione l'installazione di immagini RGB e Josef Schodl per la costruzione del supporto del rhizobox.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhizobox Technisches Büro für Bodenkultur Experimental builder
LED Lamps ATUM HORTI 600 Klutronic AHI10600F
Fluorescent light tube HiLite T5 Day Juwel Aquarium 86324
UV light tube Eurolite 45cm slim 15 W Conrad 593384 - 62
Canon EOS 6D Canon Austria GmbH 8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32 Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013 Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR camera Xenics XEN-000105
Spectrograph Imspector N25E Specim
Hyperspectral imaging scanner Carinthian Tech Research AG Experimental builder Design and assemblage of Hyperspectral Imaging Scanner and software
Matlab R2106a Mathworks Including Toolboxes for Image Processing, Signal Processing and Statistics and Machine Learning
AP4 Poromoeter Delta-T-Devices
LI-3100C Area Meter LI-COR
BASF Styradur polystyrene sheets Obi Baumarkt 9706318 Different types of polystyrene sheets or other material separating differently moistured soil can be used

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