RGB och spektrala Root Imaging för växt fenotypning och fysiologisk forskning: experiment och Imaging protokoll

Environment
 

Summary

Ett experimentellt protokoll presenteras för bedömning av marken odlas växter rotsystem med RGB och Hyperspektrala imaging. Kombination av RGB-bild, tid serien med chemometric information från Hyperspektrala File optimerar insikter i växten rot dynamics.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. J. Vis. Exp. (126), e56251, doi:10.3791/56251 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bättre förståelse av växten rot dynamics är nödvändigt att förbättra resurseffektiviteten användning av jordbrukssystem och öka motståndet av gröda sorter mot miljöpåfrestningar. Ett experimentellt protokoll presenteras för RGB och Hyperspektrala avbildning av rotsystem. Metoden används rhizoboxes där växter växer i naturlig jord över en längre tid att observera fullt utvecklade rotsystem. Experimentella inställningarna exemplifieras för att bedöma rhizobox växter under vattenstress och studerar roll för rötter. En RGB-imaging installation beskrivs för billig och snabb kvantifiering av roten utveckling över tid. Hyperspektrala imaging förbättrar rot segmentering från jord bakgrunden jämfört med RGB-färg baserat tröskelvärde. Hyperspektrala imaging viss styrka är förvärvet av chemometric information om rot-smutsa systemet för funktionell förståelse. Detta visas med hög upplösning vatten innehåll kartläggning. Spectral imaging är emellertid mer komplex bild förvärvandet, bearbetning och analys jämfört med metoden RGB. En kombination av båda metoderna kan optimera en omfattande bedömning av rotsystemet. Applikationsexempel integrera rot och aboveground egenskaper ges för ramen för fenotypning och växters fysiologiska växtforskning. Ytterligare förbättring av roten imaging kan erhållas genom att optimera RGB bildkvalitet med bättre belysning med olika ljuskällor och i förlängningen av bild analysmetoder att sluta på roten zonegenskaper från spektrala data.

Introduction

Rötterna ger flera viktiga funktioner för växter såsom lagring av assimilerar, ankringen av landlevande växter i jord, och upptag och transport av vatten och näringsämnen1. Ur en evolutionär synvinkel anses bildandet av roten axlar vara en grundläggande förutsättning för beskärningen av mark växter2. Trots denna viktiga roll har historiskt rötter ockuperat endast en marginell position inom biologisk forskning. I nyare tider, men ökar det vetenskapliga intresset växt rotsystem som framgår i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Betydelsen av roten studier i botanik.
Antal root relaterade studier som en procentandel av alla publicerade växt studier i SCI tidskrifter under de senaste årtiondena. Sökresultat från Scopus med sökord ”anläggning” och ”planterar och rot”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Två anledningar kan vara hypotesen att ligger bakom de senaste framstegen inom rot forskning. Första, terrestrial vegetationen utsätts oftare yttre påfrestningar till följd av globala förändringar3. I samband med vegetabiliska jordbruksprodukter produktion uppskattas det att globalt cirka 30% av jordbruksarealen begränsas av vatten och fosfor4,5. Stressreducering av skördarna är en huvudorsak för betydande avkastning luckor som är globalt uppskattas lägre 50 procent av potentiell produktivitet för rainfed jordbruksekosystemen6. Förutom låg resurstillgänglighet, är detta också relaterat till dålig resurseffektivitet användning, dvs otillräcklig kapacitet av en växt att utnyttja tillgängliga resurser7. Detta resulterar i förluster av mobila resurser såsom nitrat som kan inverka negativt på andra ekosystem. Den nuvarande globala kväve effektiviteten beräknas till exempel till 47%8. Bättre resursanvändning effektivitet via metoder för förbättrad hantering och sorter är därför av stor betydelse för både uthållig tillväxt av jordbruks utgångar samt när det gäller miljömässig hållbarhet. I detta sammanhang växten anses rötter vara ett huvudmål för förbättrade grödor och beskärning system9,10.

En andra viktig bakgrund för det senaste intresset för växternas rötter är tekniska framsteg i mätmetoder. Root metoder har länge begränsats av två viktiga utmaningar: för mätning av rötter från växter som växer i jord som de hade att vara isolerad för kvantifiering, mestadels genom att tvätta11, därmed störa det arkitektoniska arrangemanget av roten axlar. In situ - roten observation med utgrävning metoder, därmed bevara den naturliga platsen för rötter i jord, har använts för botaniska Beskrivning12. Fortfarande de är mycket tidskrävande och därmed att kraven inte genomströmning av jämförande strukturella-funktionella rotsystem analys. Å andra sidan var hög genomströmning metoder för roten arkitekturen mätning mestadels gjort på konstgjord medier och för plantor växter13 där en extrapolering av växter naturliga tillväxt miljön är tvivelaktiga14.

Den senaste högkonjunkturen rot forskning är tätt knuten till förskottet i imaging metoder15. Imaging metoder i roten studier kan grovt grupperas i tre typer. Först finns det högupplösta 3D metoder såsom CT och Mr16. Dessa metoder är mest lämpade att studera interaktion processer av växternas rötter med jord, såsom torka inducerad xylem embolism17. Vanligtvis används de på jämförelsevis små prover där de tillåter detaljerade observationer. En jämförelse av CT och MRT för olika stora krukor och fina rot avbildning finns i18. För det andra finns det hög genomströmning bildgivande metoder19,20. Dessa metoder är mestadels baserade på gemensamma 2D RGB avbildning av rötter växa på konstgjorda media (gel, grobarhet papper) där hög kontrast gör jämförelsevis enkel dissektion mellan rötter och bakgrund. De är lämpliga för hög genomströmning jämförelse bland fröplanta rot drag av olika grödor genotyper enligt standardiserade artificiella växande villkor13. Mellan dessa två metoder är metoder som rhizobox: de använder 2D avbildning av rötter som växer i jord under längre tidsperiod och har medelstora genomströmning21,22. En senaste utmaning till (2D) roten imaging är att fånga även indikatorer på roten funktionalitet förutom Beskrivning av struktur23.

I detta dokument presenterar vi de experimentella protokoll för imaging rhizobox växt rot-system som använder en billig och enkel skräddarsydda RGB imaging installationsprogrammet och (ii) en mer komplex NIR imaging. Exempel resultat från dessa två inställningar är visas och diskuteras i samband med anläggningen fenotypning och fysiologiska växtforskning.

Discussion

Protokollen ger två kompletterande metoder för jord odlas rotsystem imaging. Ett kritiskt steg för tillförlitlig experimentella resultat är att fylla i den rhizoboxes som har att säkerställa en jämn och homogen substrat lager på frontglaset att ge snäva rot-smutsa kontakten på fönstret observation och undvika luftspalter. Detta är den främsta anledningen att använda jämförelsevis fina sållen jord av < 2 mm: större aggregat resultera i högre ytan morfologi på fönstret observation med håligheter mellan aggregat. Förutom en högre risk för roten tip uttorkning kräver detta också mer komplex bild bearbetning tekniker för vatten mappning31.

Ändringar av protokollet därför fokusera på förbättrad och snabb fyllning av rhizoboxes. För närvarande påfyllningstid är cirka 30 minuter per låda. Vidare användning av rhizoboxes med två glas windows för avbildning från båda sidor och ändringar att optimera belysning homogenitet för bättre RGB-bilder är testade. Ytterligare maskinvara förlängning också överväga integrering av planar optodes32 samt kapacitans imaging33 in i rhizobox-systemet. Detta är dock utöver nuvarande uppgradering verksamhet.

Programvaruändringar fokusera på automatisk bildregistrering till säkring toppen och botten RBG bilder34. För Hyperspektrala metoder imaging avancerad oövervakade funktion utvinning28 samt känsligare övervakade mål identifieringsmetoder såsom SVMs35 testas. De Hyperspektrala data tillåter därmed potentiellt för bedömning av flera jord, odlingsbädden och rot boenden36. Dessutom är avsikten att utveckla en (halv) automatiserade programvara för rhizobox rot bilder baserat på en modifierad version av rotsystemet Analyzer37 att kvantifiera morfologiska (längd, diameter, yta) samt arkitektoniskt drag (förgrening frekvens, förgrening vinklar).

Den största begränsningen av protokollet jämfört 3D imaging tillvägagångssätt är begränsningen till ytan synliga rot och odlingsbädden boenden. Det har dock visats att de synliga rot drag är en pålitlig proxy för den hela rotsystem21. Den rhizobox tekniken är enkelt kombineras med traditionella destruktiva provtagning (tvättning) i slutet av dynamisk tillväxt imaging för att validera förhållandet av synliga vs. totala rotsystem drag. Som denna relation kan variera bland arter21, rekommenderas destruktiva provtagning att garantera tillförlitlig inferens från synliga egenskaper för de nya fenotypning med en annan gröda arter.

Den viktigaste fördelen med av protokollet som presenteras här är kombinationen av realistiska odlingsförhållanden (jord), relativt höga potentiella genomflödet för temporally löst RGB-imaging och inferens på roten funktionalitet (t.ex. upptag av vatten) via chemometric rot och odlingsbädden data från Hyperspektrala imaging. Därmed metoderna som övervinner inferens begränsningar i hög genomströmning plantan och icke-smutsa rot imaging metoder14, medan det kan delvis djupa fenotypning insikter i funktionella processer med mindre experimentella komplexitet och högre dataflöde jämfört med avancerade 3D metoder15.

I kommande experiment protokollet används för att studera effekten av mykorrhiza på rotsystemet utveckling och funktionalitet av baljväxter samt när det gäller fenotypning rot kännetecken för täcka grödan arter i förhållande till markens struktur, kväve och kol cykling.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner finansiering från österrikiska Science fond FWF via den projekt nummer P 25190-B16 (rötterna torka motstånd). Etablering av Hyperspektrala tänkbar infrastruktur stöddes ekonomiskt av den federala regeringen Niederösterreich (Land Niederösterreich) via projektet K3-F-282/001-2012. Ytterligare finansiering för sockerbetor experimentet mottogs från AGRANA forskning & Innovation Center GmbH (Ulf). Författarna tackar Craig Jackson för teknisk support under experimentet och engelska korrigering av manuskriptet. Vi erkänner också Markus Freudhofmaier som bidragit till etableringen inställningen för RGB-imaging och Josef Schodl för byggandet av rhizobox montering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhizobox Technisches Büro für Bodenkultur Experimental builder
LED Lamps ATUM HORTI 600 Klutronic AHI10600F
Fluorescent light tube HiLite T5 Day Juwel Aquarium 86324
UV light tube Eurolite 45cm slim 15 W Conrad 593384 - 62
Canon EOS 6D Canon Austria GmbH 8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32 Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013 Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR camera Xenics XEN-000105
Spectrograph Imspector N25E Specim
Hyperspectral imaging scanner Carinthian Tech Research AG Experimental builder Design and assemblage of Hyperspectral Imaging Scanner and software
Matlab R2106a Mathworks Including Toolboxes for Image Processing, Signal Processing and Statistics and Machine Learning
AP4 Poromoeter Delta-T-Devices
LI-3100C Area Meter LI-COR
BASF Styradur polystyrene sheets Obi Baumarkt 9706318 Different types of polystyrene sheets or other material separating differently moistured soil can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
  2. Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
  3. Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
  4. MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
  5. Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. Global water resources: vulnerability from climate change and population growth. Science. 289, 284 (2000).
  6. Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes. Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).
  7. Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat. Agron. J. 93, 290-298 (2001).
  8. Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environ. Res. Lett. 9, (10), 105011 (2014).
  9. Lynch, J. P. Roots of the second green revolution. Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).
  10. Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front. Plant Sci. 4, 442 (2013).
  11. Metcalfe, D. B., et al. A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy. New Phytol. 174, 697-703 (2007).
  12. Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues. DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).
  13. Gioia, T., et al. GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply. Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).
  14. Watt, M., et al. A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites. Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).
  15. Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
  16. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1 (2015).
  17. Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).
  18. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1 (2015).
  19. Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis. Plant Methods. 10, 1 (2014).
  20. Bengough, A. G., et al. Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings. Plant Soil. 262, 63-70 (2004).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).
  22. Price, A. H., et al. Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status. Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).
  23. Vadez, V. Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation. Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).
  24. Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods. Dane, J. H., Topp, G. C. SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).
  25. Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics. J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).
  26. Passioura, J. B. The perils of pot experiments. Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).
  27. Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. Tutorial: Time series hyperspectral image analysis. J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).
  28. Kim, D. M., et al. Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis. Scie rep. 5, (2015).
  29. Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review. Plant Methods. 11, 29 (2015).
  30. Lobell, D. B., Asner, G. P. Moisture effects on soil reflectance. Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).
  31. Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments. Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).
  32. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).
  33. Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize. Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Automatic panoramic image stitching using invariant features. Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).
  35. Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging. Scientific Reports. 6, 35679 (2016).
  36. Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).
  37. Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine. Plant Physiol. 164, (1), 24-35 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics