RGB y la proyección de imagen espectral raíz planta Phenotyping y investigación fisiológica: montaje Experimental y protocolos de la proyección de imagen

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Summary

Se presenta un protocolo experimental para la evaluación de suelo cultivado planta raíz sistemas RGB y la proyección de imagen hyperspectral. Combinación de tiempo de imagen RGB serie con información quimiométricas de hyperspectral optimiza penetraciones en la dinámica de la raíz de planta.

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Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. J. Vis. Exp. (126), e56251, doi:10.3791/56251 (2017).

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Abstract

Mejor comprensión de la dinámica de raíz de planta es esencial para mejorar la eficiencia de uso de recursos de los sistemas agrícolas y aumentar la resistencia de variedades de cultivo contra tensiones ambientales. Se presenta un protocolo experimental para RGB y la proyección de imagen hyperspectral de sistemas de la raíz. El enfoque utiliza rhizoboxes donde las plantas crecen en el suelo natural sobre un tiempo más largo para observar completamente desarrollado sistema de raíces. Configuración experimental se ejemplifica para evaluar rhizobox plantas bajo estrés hídrico y estudiar el papel de las raíces. Una configuración de imagen RGB se describe para la cuantificación rápida y barata de desarrollo de las raíces en el tiempo. La proyección de imagen Hyperspectral mejora la segmentación de raíz desde el fondo de suelo en comparación con el umbral de color en RGB. La fuerza particular de la proyección de imagen hyperspectral es la adquisición de quimiométricas información sobre el sistema de la raíz y el suelo para comprensión funcional. Esto se demuestra con la asignación contenido de agua de alta resolución. La proyección de imagen espectral, sin embargo, es más compleja en la adquisición de imágenes, procesamiento y análisis en comparación con el enfoque RGB. Una combinación de ambos métodos puede optimizar una evaluación integral del sistema radicular. Ejemplos de aplicaciones integración de raíz y parte aérea rasgos se dan para el contexto de la investigación fisiológica phenotyping y planta de planta. Mejora de la imagen de la raíz puede obtenerse mediante la optimización de la calidad de imagen RGB con mejor iluminación utilizando diferentes fuentes de luz y por extensión de métodos de análisis de imagen para inferir propiedades de zona raíz de datos espectrales.

Introduction

Raíces proporcionan varias funciones esenciales para las plantas como el almacenamiento de asimilados, anclaje de las plantas terrestres en la tierra y la absorción y transporte de agua y nutrientes1. Desde un punto de vista evolutivo, la formación de ejes de la raíz se considera una condición previa fundamental para el origen de la tierra las plantas2. A pesar de esta importante función, históricamente las raíces han ocupado sólo una posición marginal en la investigación biológica. En tiempos más recientes, sin embargo, existe un creciente interés científico en los sistemas de raíz de planta como se evidencia en la figura 1.

Figure 1
Figura 1: Importancia de los estudios de raíz en las Ciencias de planta.
Número de raíz relacionado con estudios como porcentaje de todos los estudios de planta publicados en revistas SCI en las últimas décadas. Buscar resultado de Scopus utilizando palabras clave "planta" y "planta y raíz". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dos razones principales pueden ser presumidos para ser la base de los recientes avances en la investigación de la raíz. Vegetación terrestre, primero se expone a estrés ambiental más frecuentes como resultado del cambio global3. En el contexto de producción de cultivos agrícolas se estima que globalmente alrededor 30% de la superficie agrícola está limitado por agua y fósforo4,5. Reducción del estrés de rendimiento de las cosechas son una razón principal de las brechas de rendimiento significativas que a nivel mundial se estima en el inferior el 50% de productividad potencial de los ecosistemas agrícolas de secano6. Además de la disponibilidad de bajos recursos, esto está también relacionado con eficiencia de uso de recursos pobres, es decir, insuficiente capacidad de una planta de explotación de los recursos disponibles7. Esto resulta en pérdidas de recursos móviles tales como nitrato, que puede afectar negativamente a otros ecosistemas. Por ejemplo, la eficiencia de uso de nitrógeno global actual se estima en 47%8. Eficiencia mediante métodos de mejora de la gestión del uso del mejor recurso y cultivares, resulta de gran importancia tanto para crecimiento de salidas agrícolas así como en cuanto a sostenibilidad ambiental sostenido. En esta planta de contexto las raíces se consideran un objetivo clave para mejores cultivos y cultivo sistemas9,10.

Un segundo fondo importante para el reciente interés en las raíces de plantas es un avance tecnológico en los métodos de medición. Métodos de raíz durante mucho tiempo han sido restringidos por dos desafíos clave: para la medición de las raíces de plantas que crecen en el suelo tuvieron que ser aislados para la cuantificación, en su mayoría por lavado11, tal modo perturbar el arreglo arquitectónico de ejes de raíz. Observación de raíz "in situ" mediante excavación métodos, de tal modo conservando la ubicación natural de las raíces en el suelo, se han utilizado para la descripción botánica12. Todavía son muy desperdiciador de tiempo y por lo tanto no cumplen con los requisitos de rendimiento de análisis comparativo sistema estructural-funcional de la raíz. Por otra parte métodos de alto rendimiento para la medición de la arquitectura de raíz en su mayoría se realizaron en medios artificiales y plántulas plantas13 donde la extrapolación al entorno natural de crecimiento de las plantas es cuestionable14.

El reciente auge de la investigación de la raíz está estrechamente ligado al avance en métodos15la proyección de imagen. Enfoques en los estudios de raíz la proyección de imagen se puede agrupar áspero en tres tipos. En primer lugar hay métodos 3D de alta resolución como CT y MRI16. Estos métodos son los más adecuados para el estudio de procesos de interacción de las raíces de la planta con el suelo, tales como sequía inducida por xilema embolia17. Por lo general se aplican a muestras relativamente pequeñas donde permiten observaciones detalladas. Una comparación del CT y de MRI para macetas de diferente tamaños y proyección de imagen de bien raíz se encuentra en18. En segundo lugar, hay alto rendimiento imagen métodos19,20. Estos métodos son principalmente basada en común 2D RGB la proyección de imagen de las raíces que crecen en medios artificiales (gel, papel de germinación) donde de alto contraste permite disección relativamente sencilla entre las raíces y el fondo. Son apropiados para la comparación de alto rendimiento entre caracteres de raíz de la plántula de genotipos diferentes cultivos bajo condiciones cada vez más artificiales estandarizadas13. Entre estos dos enfoques son métodos rhizobox: se utiliza la proyección de imagen 2D de las raíces que crecen en el suelo durante largo período de tiempo y tienen rendimiento medio21,22. Un desafío reciente para la proyección de imagen (2D) de la raíz es también captar indicadores de funcionalidad de la raíz además de descripción de la estructura23.

En el presente trabajo presentamos los protocolos experimentales de rhizobox crecido sistemas radiculares mediante (i) una simple y barata por encargo RGB imagen instalación y (ii) una configuración proyección de imagen de NIR más compleja la proyección de imagen. Resultados de ejemplo de estas dos configuraciones se muestran y discuten en el contexto de planta phenotyping e investigación fisiológica de la planta.

Discussion

Los protocolos proporcionan dos enfoques complementarios para suelo crecido en proyección de imagen de sistema de la raíz. Un paso crítico para obtener resultados experimentales confiables se llena de la rhizoboxes que tiene que garantizar una capa uniforme y homogénea del sustrato en el vidrio delantero proporcionan el contacto de la raíz y el suelo firmemente en la ventana de observación y evitar espacios de aire. Esta es la razón principal para utilizar comparativamente finas del suelo tamizada de < mm 2: agregados más grandes resultan en mayor superficie morfología en la ventana de observación con espacios vacíos entre los agregados. Además de un mayor riesgo de deshidratación de punta de raíz, esto también requiere técnicas más complejas de procesamiento de imagen para la asignación de agua31.

Modificaciones del Protocolo por lo tanto se centran en mejorar y rápido llenado de rhizoboxes. Tiempo de relleno actualmente es cerca de 30 minutos por la caja. Además se analizan uso de rhizoboxes con dos ventanas de cristal para la proyección de imagen de ambos lados y modificaciones para optimizar la homogeneidad de iluminación para imágenes RGB mejor. Ampliación hardware también puede considerar la integración de optodes plana32 así como capacitancia33 la proyección de imagen en el sistema de rhizobox. Esto es sin embargo más allá de las actividades actuales de modernización.

Modificaciones del software se centran en el registro automático de la imagen a la parte superior del fusible y RBG imágenes34de fondo. Para hiperespectral imagen extracción de característica sin supervisión avanzada acerca28 y más sensibles métodos de detección de objetivo supervisados como MVS35 son probados. Tal modo los datos hiperespectrales potencialmente permitan la evaluación de múltiples propiedades suelo, rizosfera y raíz36. Además se pretende desarrollar un (semi) automatizadas de software para rhizobox raíz imágenes basadas en una versión modificada de raíz sistema analizador37 cuantificar morfológicas (longitud, diámetro, superficie) así como de rasgos arquitectónicos (frecuencia de ramificación, ángulos de ramificación).

La principal limitación del protocolo comparado con métodos de proyección de imagen 3D es la restricción a la raíz visible superficial y propiedades de la rizosfera. Sin embargo se ha demostrado que los rasgos visibles de raíz son un proxy confiable para el sistema entero de la raíz21. La técnica de rhizobox se combina fácilmente con el tradicional muestreo destructivo (lava) al final del crecimiento dinámico proyección de imagen con el fin de validar a la relación de visible vs total del sistema raíz rasgos. Esta relación puede variar entre especies21, muestreo destructivo se recomienda para inferencia confiable de rasgos visibles de cualquier nueva serie de fenotipado con una especie de cultivo diferentes.

La ventaja clave del protocolo presentado aquí es la combinación de las condiciones de crecimiento realista (suelo), relativamente alto rendimiento potencial para el temporal resolver la proyección de imagen RGB e inferencia en la funcionalidad de la raíz (por ejemplo, absorción de agua) a través de los datos de raíces y rizosfera quimiométricas de hyperspectral imaging. Así los métodos supera las restricciones de la inferencia en plántula de alto rendimiento y no suelo raíz de métodos14, mientras que parcialmente permite penetraciones profundas phenotyping en procesos funcionales con complejidad menos experimental y un mayor rendimiento en comparación con métodos avanzados de 3D15.

En próximos experimentos se utilizará el protocolo para estudiar el efecto de la micorriza en el desarrollo del sistema radicular y la funcionalidad de las legumbres así como en cuanto a características de raíz de fenotipado de las especies de cultivo de cobertura en relación con la estructura del suelo, el nitrógeno y el carbono bicicleta.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen que la financiación de la austríaca ciencia fondo FWF mediante el proyecto número P 25190-B16 (las raíces de la resistencia a la sequía). Establecimiento de la infraestructura de proyección de imagen hyperspectral fue apoyado financieramente por el Federal gobierno de Baja Austria (Niederösterreich tierra) vía el proyecto K3-F-282/001-2012. Financiación adicional para el experimento de la remolacha azucarera se recibió de AGRANA investigación & GmbH de centro de innovación (ARIC). Los autores agradecen a Craig Jackson para el soporte técnico durante el experimento y el inglés corrección del manuscrito. También reconocemos Markus Freudhofmaier que contribuyeron a la configuración de imagen RGB y Josef Schodl para la construcción del montaje rhizobox.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhizobox Technisches Büro für Bodenkultur Experimental builder
LED Lamps ATUM HORTI 600 Klutronic AHI10600F
Fluorescent light tube HiLite T5 Day Juwel Aquarium 86324
UV light tube Eurolite 45cm slim 15 W Conrad 593384 - 62
Canon EOS 6D Canon Austria GmbH 8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32 Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013 Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR camera Xenics XEN-000105
Spectrograph Imspector N25E Specim
Hyperspectral imaging scanner Carinthian Tech Research AG Experimental builder Design and assemblage of Hyperspectral Imaging Scanner and software
Matlab R2106a Mathworks Including Toolboxes for Image Processing, Signal Processing and Statistics and Machine Learning
AP4 Poromoeter Delta-T-Devices
LI-3100C Area Meter LI-COR
BASF Styradur polystyrene sheets Obi Baumarkt 9706318 Different types of polystyrene sheets or other material separating differently moistured soil can be used

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