Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

Chemistry

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Summary

Aquí describimos una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano utilizando química dinámica imina. Se presentan métodos para ajustar la fuerza mecánica de hidrogel y su aplicación en cultivos celulares 3D.

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Li, Y., Zhang, Y., Wei, Y., Tao, L. Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (127), e56253, doi:10.3791/56253 (2017).

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Abstract

El protocolo presenta un método fácil, eficaz y versátil para preparar Hidrogeles basados en chitosán usando química dinámica imina. El hidrogel se prepara mezclando soluciones de glicol quitosano con un gelator de polímero sintetizado benzaldehído terminado y eficientemente se obtienen hidrogeles en varios minutos a temperatura ambiente. Por relaciones diferentes entre glicol quitosano, gelator de polímero y el contenido de agua, se obtienen hidrogeles versátiles con tiempos de congelación diferentes y rigidez. Cuando está dañada, el hidrogel puede recuperar sus apariciones y el módulo, debido a la reversibilidad de los bonos de imina dinámicos como crosslinkages. Esta propiedad la healable permite el hidrogel que inyectable puesto que puede ser auto curado de piezas exprimidas a un hidrogel a granel integral después del proceso de inyección. El hidrogel es también múltiple sensible a muchos estímulos bioactivos debido a Estados de equilibrio diferentes de los bonos de imina dinámico. Este hidrogel fue confirmado como bio-compatibles y células de fibroblasto de ratón de elución de L929 fueron integrados siguientes procedimientos estándar y fácilmente se evaluó la proliferación celular por un proceso de cultivo celular 3D. El hidrogel puede ofrecer una plataforma ajustable para diferentes investigaciones donde es beneficiado un imitador fisiológico de un entorno 3D para las células. Junto con sus propiedades múltiples de respuesta, uno mismo-healable e inyectables, los hidrogeles pueden aplicarse potencialmente como portadores de múltiples drogas y células en futuras aplicaciones de bio-médica.

Introduction

Los hidrogeles son materiales de polímero reticulado con grandes cantidades de agua y propiedades mecánicas, suaves, y se han utilizado en muchas aplicaciones biomédicas1,2. Los hidrogeles pueden ofrecer un ambiente suave y húmedo, que es muy similar al entorno fisiológico de las células en vivo. Por lo tanto, los hidrogeles se han convertido en uno de los más populares andamios para celular 3D cultura3,4. Comparado con el cultivo celular 2D de Petri, cultivo celular 3D ha avanzado rápidamente para ofrecer que una matriz extracelular (ECM) mímico el microambiente de las células en contacto con y ensamblar para propósitos de proliferación y diferenciación5. Además, los hidrogeles que contienen polímeros naturales podrían ofrecer ambientes bio-compatibles y promover para que las células proliferan y diferencian3. Hidrogeles derivados de polímeros sintéticos se prefieren para sus componentes simples y claras, que excluye influencias complejas como las proteínas de origen animal o virus. Entre todos los candidatos de hidrogel para el cultivo celular 3D, siempre se prefieren los hidrogeles que fácilmente están preparados y tienen una propiedad constante. La facilidad para ajustar propiedades de hidrogel para adaptarse a requisitos de la investigación es importante como bien6.

Aquí presentamos una fácil preparación de un hidrogel de glicol basados en quitosano utilizando química dinámica imina, que se convierte en una plataforma versátil de hidrogel para celular 3D cultura7. En este método, bien conocido de bio-compatibles de glicol quitosano se utilizan para establecer los marcos de las redes de hidrogel. Sus grupos aminos se reaccionaron con un polietilenglicol benzaldehído terminada como el gelator de polímero para formar la imina dinámica bonos como crosslinkages de hidrogeles8. Bonos de imina dinámica pueden formar y descomponer reversible y sensiblemente al entorno, dotando los hidrogeles con reticulado mecánicamente ajustable redes9,10,11. Debido a su contenido alto de agua, materiales bio-compatibles y fuerzas mecánicas ajustables, el hidrogel se aplica con éxito como un andamio para la elución de L929 células en 3D de la célula cultura12,13. El protocolo aquí detalles de los procedimientos, incluyendo la síntesis del polímero gelator hidrogel preparación, incrustación de célula y cultivo celular 3D.

El hidrogel también muestra varias otras características debido a su crosslinkages imina dinámico, incluyendo su múltiples sensibles a varios estímulos de bio (ácido/pH, piridoxal derivado de la vitamina B6, la papaína de la proteína, etc.), indicando que podría ser el hidrogel inducida que se descomponen bajo condiciones fisiológicas8. El hidrogel es también uno mismo-healable e inyectables, que significa el hidrogel podría ser administrado a través de un método de inyección invasiva mínima y obtener una ventaja en drogas y celulares entregas14,15. Mediante la adición de aditivos funcionales o gelators del polímero específico prediseñado, el hidrogel es compatible para obtener propiedades específicas como magnético, temperatura, pH de receptivo, etc.16,17, que podría satisfacer un amplia gama de necesidades de investigación. Esas propiedades revelan capacidad potencial de hidrogel que un inyectable múltiples portadores de drogas y células en investigación bio-médica en vitro y en vivo y aplicaciones.

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Protocol

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan experimentos de química, incluyendo el uso de una campana y equipo de protección personal (gafas, guantes, bata de laboratorio, etc.). El protocolo requiere célula estándar de manejo de técnicas (esterilización, recuperación de la célula, célula pases, congelación de células, tinción de células, etc.).

1. preparación de hidrogeles

  1. síntesis de benzaldehído terminaron di-functionalized polietilenglicol (PEG DF)
    1. previa desecación de PEG polímero
      1. peso 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), Transvasar a un matraz de fondo redondo (250 mL) y añadir tolueno (100 mL).
        Nota: Otras clavijas con distintos pesos moleculares puede trabajar para la formación del hidrogel pero conducirá a rigidez diferentes.
      2. Calentar la solución por una pistola de calor (o una placa alrededor de 40 ° C) suavemente para ayudar a disolver los polímeros. Después de disuelven todos los polímeros, utilizar un evaporador para eliminar todos los solventes. Repita este proceso seco y disolver dos veces para hacer la espiga seca polímeros.
        PRECAUCIÓN: Esto debe realizarse en una campana de humos con extremo cuidado. Tolueno es inflamable.
    2. Reacción de terminación benzaldehído de PEG
      1. añadir un agitador magnético y tetrahidrofurano (THF, 100 mL) al matraz y disolver con un agitador de PEG. Añadir 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) y 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) secuencialmente a las soluciones para todos los sólidos se disuelven completamente.
      2. Agregar N, N '-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) para la solución y añadir un tubo de secado que se llena con anhidro CaCl 2 al matraz. Mantener la reacción con agitación a temperatura ambiente (~ 20 ° C) para alrededor de 12 h.
    3. Proceso de la post-reacción
      1. filtrar los blancos sólidos generados en la solución de vacío después de que termine la reacción. Verter la solución en éter dietílico frío (500 mL), bajo agitación para precipitar los sólidos blancos. Reunir todos los sólidos blanco, filtro y secar los sólidos en una campana de humos.
      2. Disolver los sólidos blancos en THF otra vez, filtrar cualquier sólidos insolubles blanco, verter la solución en el éter dietílico frío fresco para precipitar los sólidos blancos y secarlo. Repita este proceso dos o tres veces y luego colocar los blancos sólidos en un horno de secado al vacío (20 ° C, 0.1 mbar) para secarlas totalmente. Recoger el polvo blanco como el producto final: benzaldehído terminada DF PEG.
  2. Preparación de hidrogeles
    1. pesar diferentes cantidades de DF PEG (0,11 g, 0.028 mmol; 0,22 g, 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) en un tubo (10 mL), añadir agua desionizada (5,0 mL) y utilizar un vórtice o un agitador magnético para ayudar a disolver el polímero.
    2. Glicol quitosano (0,495 g, 6.18 x 10 -3 mmol) en agua desionizada (15,0 mL) en un tubo (50 mL) se disuelven y utilice un vortex durante unos minutos para homogeneizar la solución de quitosano (3% en peso).
    3. Añadir la solución de quitosano de glicol (0,2 mL, 3% en peso) y soluciones de PEG DF (0,2 mL) secuencialmente en un tubo (2.0 mL). Use un vortex para mezclar las soluciones homogéneamente para los hidrogeles forma en varios minutos. Siga las proporciones en la tabla 1 para hidrogeles de fuerzas mecánicas diferentes.
      Nota: Utilice el método de inversión del tubo para determinar si el hidrogel ha formado ya.
  3. Análisis de reología
    1. llevar a cabo análisis de reología en un reómetro rotacional con una placa de acero paralelo (diámetro: 20 mm). Para la prueba de congelación, Difunda la solución de quitosano de glicol (0,2 mL, 3% en peso) en una placa inferior. Luego, añadir disoluciones acuosas de PEG DF (0.2 mL, 2% en peso) uniformemente gota a gota sobre la superficie de la solución de quitosano y mezclar rápidamente con una pipeta. Más bajo abajo de la placa superior y comenzar a test
    2. De hidrogel ' prueba de rigidez de s, cortar un hidrogel en un círculo (diámetro: 20 mm) y medir el módulo de almacenamiento (G ') valores versus análisis de frecuencia en la tensión del 1%. G típico ' valores en s rad 6,3 − 1 se enumeran en la tabla 1.
      Nota: Llevar a cabo los análisis reológicos de hidrogel 0.5 h después de la formación del hidrogel para estabilización de vínculo dinámico del hidrogel.
    3. Para el hidrogel ' s uno mismo-healable propiedad prueba, corta un hidrogel para piezas y juntar las piezas para self-heal a una pieza integral. Luego cortar el hidrogel para hacer un círculo (diámetro: 20 mm) y el Reómetro para llevar a cabo el análisis de la reología.

2. 3D cultivo celular en hidrogeles

  1. preparación de soluciones de gelificación de hidrogel
    1. pesar DF PEG (0,44 g, 0.11 mmol) en un tubo estéril (4,0 mL), añadir en medios de cultivo celular (RPMI-1640, 2.0 mL) y utilice un vortex o agitador para ayudar a disolver el polímero para obtener la solución de polímero (20% de peso). Cargar la solución en una jeringa (10,0 mL) y luego la esterilización haciéndola pasar por un filtro de retención de bacterias micrones (0,22 μm).
    2. Pesar del glicol quitosano (0,165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) en un tubo estéril (15,0 mL), añadir en medios de cultivo celular (RPMI-1640, 4,0 mL) y agitar para ayudar a disolver el polímero para obtener la solución de quitosano de glicol (4,0% en peso). Cargar la solución en una jeringa (10,0 mL) y filtrarla con un filtro de 0,22 μm bacterias retentiva.
  2. Cultivo de célula en hidrogeles
    PRECAUCIÓN: realizar todos los procedimientos relacionados en una campana de cultivo de tejidos de la célula. Se espera que los conocimientos básicos de la técnica estéril.
    1. Preparación de la suspensión celular
      1. cultura elución de L929 células en RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina 5% (10 mL) en una Petri dish (diámetro 10 cm) e incubar a 37 ° C, 5% CO 2. Cambiar el medio cada día antes de su uso.
      2. Cosechar las células de la elución de L929 con PBS con tripsina (0,025% de w/v) y EDTA (0.01% w/v), luego centrifugar (70 x g, 5 min) y resuspender las células en el Medio RPMI-1640 (1,0 mL). Realizar el recuento celular mediante operación estándar del tablero de conteo de sangre. Resuspenda las células para regular la concentración de células a ~ 3.75 x 10 6 células/mL.
    2. Encapsulación celular en hidrogeles
      1. mezclar las suspensiones celulares de elución de L929 (0,4 mL, 3.75 x 10 6 células mL -1) con solución de quitosano de glicol (0,4 mL) en un tubo (4,0 mL) en el vórtex. Pipetear la solución de quitosano de elución de L929 glicol (0,8 mL) en el centro de un plato de Petri confocal (diámetro 2,0 cm). Pipetear las soluciones PEG DF (0,2 mL) en el mismo plato y pipetee suavemente para mezclar la solución e inducir la formación de hidrogel.
        Nota: Evaluar la formación del hidrogel inclinando la caja Petri.
      2. Para el cultivo de celular directo, añadir cantidades adicionales de medio de cultivo RPMI-1640 (1,0 mL) sobre el hidrogel. Poner los célula encajado los hidrogeles (1,0 mL, 1,5 wt % glicol quitosano, 4,0% en DF PEG, 1,5 × 10 6 células mL -1) en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) y cambiar el medio cada día. Preparar para la proyección de imagen de la célula en día 1, 3, 5 y 7 después de la encapsulación de la célula.
    3. Para el cultivo posterior de celular 3D en hidrogeles después de la inyección, preparar celular cargado hidrogel (1,0 mL, consulte el paso 2.2.2) en una jeringa (10,0 mL, aguja de 48 G). Después de las formas de hidrogel, inyecte lentamente el hidrogel en una placa de Petri para la proyección de imagen confocal. Añadir una cantidad adicional de medios de cultivo (1,0 mL) sobre el hidrogel y cambiarlo todos los días. Poner el plato Petri en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) y prepararse para luego la proyección de imagen.
      PRECAUCIÓN: Por favor verificar y seguir el protocolo de operación de seguridad de una jeringa de.
  3. Análisis de la viabilidad celular
    1. observación Confocal
      1. Enjuague los hidrogeles con PBS (1,0 mL) dos veces. Mancha de los hidrogeles con fluoresceína diacetato (FDA, 0.5 mL, 0.05 mg/mL) y soluciones de (PI, 0.08 mg/mL y 0,5 mL) de yoduro de propidio durante 15 min. Después de la tinción, quite todos los solventes.
      2. Observar los hidrogeles utilizando un microscopio confocal en longitudes de onda de excitación de 488 nm y 543 nm para visualizar en vivo y muerto de las células, respectivamente. Tomar z-pilas a través de cada profundidad de 2 μm de los hidrogeles para validar una distribución uniforme de las células a lo largo de.
        Nota: FDA tiñe células vivas mientras las células muertas de las manchas de la PI.
    2. Degradar el hidrogel (1,0 mL) con ácido acético (HAc, 3% v, 1,0 mL) por 5 min y pipeta en un tubo (4,0 mL). Recoge las células de la centrífuga (70 x g, 5 min) y resuspender las células en el medio de cultivo RPMI-1640 celular (1,0 mL). Realizar la célula cuenta con un tablero de conteo de sangre.

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Representative Results

Una presentación esquemática de este protocolo en la preparación del hidrogel y su uso como cultivo celular 3D se ofrece en la figura 1. Información de contenidos y relaciones con diversas fuerzas mecánicas el hidrogel se resume en la tabla 1. El hidrogel de uno mismo-healable y propiedad de reología presenta rigidez de hidrogel por módulo de almacenamiento versus frecuencia de prueba en la figura 2. Las imágenes confocales celular y número de células con días de la cultura en los hidrogeles se presenta en la figura 3, confirmando la viabilidad celular y la proliferación celular mediante cultivo celular 3D. Figura 4 presenta la microscopia, imágenes confocales y análisis de las tasas de proliferación celular de células incrustadas en los hidrogeles que sufrieron la inyección y la cultura. Celular alta viabilidad y proliferación celular indican que las células encajadas el hidrogel no sufrieron ningún daño destructivo y podrían recuperar la cultura, indicando la inyectabilidad de hidrogel.

Figure 1
Figura 1 : Preparación del hidrogel y su uso como cultivo celular 3D. (A) hidrogel preparación; (B) célula de preparación de la suspensión; (C) cultivo de celular 3D en hidrogeles con o sin inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Hidrogel rigidez. Módulo de almacenamiento G' versus frecuencia de (A) original y (B) auto curados hidrogeles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Cultivo de celular 3D en el hidrogel. (A) 3D imágenes confocales de elución de L929 células incrustadas en resistencia tiesa del hidrogel (verde: vivir las células; Rojo: células muertas); (B) célula contando resultados de elución de L929 células incrustadas en el hidrogel después de encapsulación celular denota tiempo. Barra de escala = 300 μm. datos presentados como media ± SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Célula 3D post-cultura en hidrogel después de la inyección. (A) A la imagen esquemática de inyección y de la cultura de un hidrogel de célula de carga. Insertar: Imágenes de microscopía de células incrustan en los hidrogeles antes de la inyección (izquierda) y después posterior al cultivo celular por 7 días (centro y derecha). Barra de escala = 100 μm; Imágenes confocales (B) de las células de la elución de L929 incrustado en un hidrogel de fuerza dura y cultivadas después después de la inyección (verde: vivir las células; Rojo: células muertas), barra de escala = 300 μm; (C) A comparación de la tasa de proliferación de las células cultivadas en hidrogeles con o sin inyección después de la encapsulación. Datos presentados como media ± SD (adaptado de referencia12; Copyright © 2017 Elsevier). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Rigidez de hidrogel Suave Medio Tieso
Glicol quitosano (mg) 6.6 6.6 6.6
DF PEG (mg) 4.4 8.8 17.6
Contenido de polímero gelator (wt %) 1 2 4
Agua desionizada (mL) 0.4 0.4 0.4
Gelaion tiempo (min) 7.5 5 3.5
G' (Pa)* 900 2100 4700
* probado bajo frecuencia 6,3 rad s-1, cepa 1% utilizando una placa paralela (diámetro 20 mm) en un reómetro rotacional.

Tabla 1: Información de hidrogeles preparados con diferentes fuerzas mecánicas.

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Discussion

El hidrogel en este protocolo (figura 1) tiene dos componentes principales: el quitosano de glicol polímero natural y una sintética benzaldehído terminaron gelator polímero DF PEG, que son ambos materiales biocompatibles. Síntesis de DF PEG se presentan mediante una reacción de modificación de un solo paso. PEG de peso molecular 4.000 fue elegida en el presente Protocolo en preocupaciones de solubilidad, eficacia de la modificación, así como rigidez de hidrogel. Una serie de hidrogeles con diferentes fuerzas mecánicas se prepararon con diferentes contenidos de sólidos y proporciones de glicol quitosano y DF PEG. Hidrogeles homogéneos se formaron rápidamente en minutos mezclando soluciones de gelación bajo temperatura ambiente, aunque la velocidad de gelificación también podría desacelerarse por soluciones diluidas. Prueba de reología fue empleada para evaluar las fuerzas mecánicas de diferentes hidrogeles. Los módulos de almacenamiento (G') de los hidrogeles fueron encontrados aproximadamente difieran de 900 Pa (suave), 2.100 Pa (medio) a 4.700 Pa (tieso) (tabla 1 y figura 2A). Esto contribuyó a la mayor densidad de reticulación mediante la adición de más gelators de polímero en la red de hidrogel, dando por resultado más arriba módulo de almacenamiento (mayor rigidez). La propiedad auto-healable se confirma también por la recuperación del módulo de hidrogel (figura 2B). Se sabe que diferencia de rigidez de ECM para diversos tejidos, así el hidrogel podría ofrecer señales mecánicas ajustables y satisfacer requerimientos de investigación por diversas relaciones entre glicol quitosano y DF PEG polímero gelators18.

Células de elución de L929, una línea de células de fibroblasto de ratón típico con rigidez del tejido en vivo ambiente de ~ 5.600 pa19, fue utilizado como un modelo de célula para ser integrado en el hidrogel. Después de la encapsulación de la célula en hidrogeles, se puede fácilmente observar que las células en los hidrogeles mostraron viabilidad muy alta (> 99%) durante el proceso de cultivo, confirmando la excelente biocompatibilidad de la hidrogel quitosano-basado. Un notable incremento de la densidad celular en el hidrogel implícita que este hidrogel podría apoyar la proliferación de las células de la elución de L929 incluso sin factores de crecimiento adicional agregado (Figura 3A). Después de 7 días en cultivo en el hidrogel, el número de células aumenta 300% (figura 3B). Se ha informado que las células cultivadas en andamios podían distinguir siguiendo señales mecánicas20,21, que podría implicar más investigaciones utilizando este método de cultivo de hidrogel 3D.

Implantación de las células con hidrogeles inyectables ha ganado incomparables ventajas para mejorar grandemente la eficiencia de la entrega y la viabilidad de las células implantadas14. Dentro de una red dinámica de imina de reticulado, el hidrogel podría self-heal después de la inyección. La propiedad self-healable permite el hidrogel sea inyectable, que implica posibles aplicaciones de los hidrogeles como inyectable múltiples portadoras. Para evaluar este hidrogel como portador de celular inyectable, se realizó un experimento imitan a inyección y posterior cultivo. El hidrogel embebida de la célula fue cargada en una jeringa y exprimido hacia fuera a través de una aguja de 48 G en una placa Petri, seguido de un 7 día post cultivo proceso con tarifa de viabilidad y la proliferación de célula estudiado.

Como se muestra en la Figura 4A, los pedazos de hidrogel aplastado podrían self-heal para reformar un hydrogel integrado sobre 1 h después de la inyección, que es útil en la entrega de la célula. Para las células en el hidrogel, en comparación con la imagen tomó justo después de encapsulación (Figura 4A, inserto izquierdo), la densidad celular aumentada dramáticamente después de 7 días (Figura 4A, insertar media). En la visión ampliada, una más detallada celulares-fissional proceso en el que se encuentran algunas células que se dividirán en dos (Figura 4A, derecha insertar), directamente confirmada por proliferación celular 3D en el hidrogel. Figura 4B muestra las imágenes confocales de los ensayos de muerto vivo de la célula después de la inyección y el experimento de la cultura. La densidad de las células inyectadas aumentado obviamente con una viabilidad celular alta (> 99%), demostrando la proliferación acertado de la célula en el hidrogel 3D después de la inyección. Para saber que si la inyección afectó la tasa de proliferación celular, comparación de análisis de las estadísticas cuantitativos de las tasas de proliferación celular en los hidrogeles con o sin inyección fue realizado (figura 4). La tasa de proliferación celular después de la inyección, aunque disminuyó ligeramente, permaneció en un nivel alto (~ 75%) y el número de celular aumentó 145% relativamente después de 7 días en cultivo en el hidrogel, lo que indica que la fuerza de corte durante la inyección tiene un observable limitada influencia negativa sobre la proliferación celular.

Describe un procedimiento típico de esta aplicación de hidrogel pero los investigadores pueden modificar el protocolo para adaptarse a los requisitos específicos de investigación. Gelators de polímero tienen influencias significativas sobre el hidrogel y son fácilmente modificables. Por ejemplo, la rigidez de este hidrogel podría ser fácilmente manipulada por diferentes proporciones de glicol quitosano y DF PEG gelator. Mientras tanto, el uso DF PEG de otros pesos moleculares también podría cumplir con este objetivo. Utilizamos PEG 4K en este protocolo, pero PEG 2K a 10K también puede funcionar. Cuando se utilizan otras clavijas, es importante controlar el tiempo de gelificación y rigidez específicamente. Otros gelators polímero funcional también pueden funcionar si los investigadores tienen habilidades de síntesis para preparar polímeros terminada en benzaldehído funcionales específicos17.

Este protocolo tiene varias limitaciones. En primer lugar, debido a la dinámica de la estructura, la rigidez de este hidrogel es limitada en comparación con un hidrogel reticulado de enlace covalente. Uno puede encontrar fallas para preparar hidrogeles con demasiado de un diseño de módulo. En segundo lugar, este hidrogel es bio-degradable, lo que limita el cultivo de células a largo plazo en el hidrogel. En tercer lugar, el hidrogel ofrece un ambiente de cultivo 3D reticulado que tiene preocupaciones de difusión. Hasta la fecha, la mayoría de los bio-análisis se basa en cultura 2D. La estructura 3D pueda interferir con la célula más relacionados con en vivo estudios.

Cuando se utiliza este protocolo, hay varios pasos importantes a seguir. En primer lugar, durante la síntesis de la gelator polímero DF PEG, la deshidratación es muy importante. En segundo lugar, al realizar procedimientos relacionados con la célula, operación estéril es fundamental. En tercer lugar, el tiempo de tinción debe ser bien controlado en hidrogeles para obtener imágenes confocales agradables.

En Resumen, el protocolo introdujo una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano, que se aplican como una plataforma para el cultivo celular 3D y podrían ofrecer señales mecánicas ajustables para diversas investigaciones. Ya se ha aplicado en áreas con respecto a la administración de fármacos, terapia celular y quimioterapia del tumor, que no sólo es un testimonio de su desempeño, pero también aumenta su potencial para ap biomédicaplicaturas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por la nacional Science Foundation de China (21474057 y 21604076).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycol chitosan Wako Pure Chemical Industries 39280-86-9 90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 619-66-9 99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 538-75-0 99%
Calcium chloride anhydrous Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 10043-52-4 96%
4-dimethylamiopryidine Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 1122-58 99%
Polyethyleneglycol Sino-pharm Chemical Reagent 5254-43-7 99%
Tetrahydrofuran Sino-pharm Chemical Reagent 109-99-9 99%
Toluene Sino-pharm Chemical Reagent 108-88-3 99%
Ethyl ether Sino-pharm Chemical Reagent 60-29-7 99%
Acetic acid Sino-pharm Chemical Reagent 64-19-7 99%
Anhydrous CaCl2 Sino-pharm Chemical Reagent 10043-52-4 99%
Fluorescein diacetate Sigma 596-09-8 99%
Propidium iodide  Sigma 25535-16-4 94%
RPMI-1640 culture media Gibco
Fetal bovine serum Gibco
Trypsin-EDTA Gibco 0.25%
PBS Solarbio 0.01 M
Penicillin streptomycin solution Hyclone 10,000 U/mL
Rheometer TA Instrument AR-G2
Confocal microscope Zeiss 710-3channel
L929 Cells ATCC NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator EYELA N-1100
48 guage needle ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD 48-guage
Microscope Leica DM3000 B
Microscope software Imaris
Heat gun Confu KF-5843 
Petri dish NEST

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References

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