जी के एकल अणु हेरफेर-चुंबकीय चिमटी द्वारा quadruplexes

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Biochemistry

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Summary

जी-quadruplexes में हेरफेर करने के लिए एक एकल अणु चुंबकीय चिमटी मंच की रिपोर्ट है, जो विभिन्न प्रोटीन द्वारा G4 स्थिरता और विनियमन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।

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You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).

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Abstract

गैर विहित न्यूक्लिक अम्ल माध्यमिक संरचना जी quadruplexes (G4) विविध सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल हैं, जैसे डीएनए प्रतिकृति, प्रतिलेखन, आरएनए प्रसंस्करण, और telomere बढ़ाव. इन प्रक्रियाओं के दौरान, विभिंन प्रोटीन बांध और G4 संरचनाओं को हल करने के लिए अपने कार्य प्रदर्शन । के रूप में g4 के समारोह अक्सर अपनी तह संरचना की स्थिरता पर निर्भर करता है, यह जांच महत्वपूर्ण है कि कैसे g4 बाध्यकारी प्रोटीन g4 की स्थिरता को विनियमित । यह काम एक विधि के लिए एक-g4 अणु चुंबकीय चिमटी, जो वास्तविक समय में एक एकल g4 अणु पर g4 बाध्यकारी प्रोटीन के विनियमन के अध्ययन में सक्षम बनाता है का उपयोग कर में हेरफेर करने के लिए प्रस्तुत करता है । सामांय में, यह विधि प्रोटीन/लाइगैंडों बातचीत और विभिंन डीएनए या आरएनए माध्यमिक संरचनाओं पर नियमों के लिए अध्ययन में आवेदनों की एक विस्तृत गुंजाइश के लिए उपयुक्त है ।

Introduction

चार-असहाय डीएनए या आरएनए G4 संरचनाएं कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1. कई प्रोटीन G4 बाइंडिंग और नियमन में शामिल हैं, जिनमें telomere बाइंडिंग प्रोटीन (टेलोमिरेज, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, प्रतिलेखन कारक (nucleolin, PARP1)3, आरएनए प्रोसेसिंग प्रोटीन (hnRNP A1, hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, २१औ, WRN, Dna2, Pif1)5, और डीएनए प्रतिकृति संबंधित प्रोटीन (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. प्रोटीन बाध्यकारी G4 संरचनाओं को स्थिर या अस्थिर कर सकते हैं; इस प्रकार बाद में जैविक कार्यों को विनियमित । G4 की स्थिरता थर्मल पिघलने से पराबैंगनी (यूवी) या परिपत्र dichroism (सीडी) तरीकों7का उपयोग करके मापा गया था । हालांकि, ऐसी स्थितियों शारीरिक और प्रासंगिक नहीं है बाध्यकारी प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू करने के लिए मुश्किल है7

एकल अणु हेरफेर प्रौद्योगिकियों में तेजी से विकास की तह और एक डीएनए या एक प्रोटीन के रूप में एक परमाणु, के खुलासा के अध्ययन सक्षम है, एक एकल-नैनोमीटर संकल्प के साथ एक अणु स्तर पर वास्तविक समय में8। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM), ऑप्टिकल चिमटी, और चुंबकीय चिमटी सबसे अधिक इस्तेमाल किया एकल अणु हेरफेर तरीके हैं । AFM और ऑप्टिकल चिमटी9की तुलना में, चुंबकीय चिमटी एक विरोधी बहाव तकनीक10,11का उपयोग करके दिनों में एक ही अणु की तह-खुलासा गतिशीलता के स्थिर माप की अनुमति देते हैं ।

यहाँ, एक एकल अणु हेरफेर मंच चुंबकीय चिमटी का उपयोग करने के लिए बंधन प्रोटीन द्वारा G4 स्थिरता के विनियमन का अध्ययन12,13सूचना दी है । इस काम के बुनियादी दृष्टिकोण, नमूना और प्रवाह चैनल तैयारी, चुंबकीय चिमटी के सेटअप, और बल अंशांकन सहित रूपरेखा । बल नियंत्रण और विरोधी बहाव प्रोटोकॉल चरण 3 में वर्णित के रूप में विभिन्न बल नियंत्रण, जैसे निरंतर बल (बल दबाना) और निरंतर लोडिंग दर (बल-रैंप), और बल-कूद माप के तहत लंबे समय तक माप के लिए अनुमति देते हैं । बल अंशांकन प्रोटोकॉल चरण 4 में वर्णित सक्षम करता है के लिए बल अंशांकन & #60; 1 µm एक व्यापक बल पर लघु tethers अप करने के लिए सीमा १०० pN, 10% के भीतर एक रिश्तेदार त्रुटि के साथ. आरएनए-Helicase का समाधान करने में आवश्यक भूमिका निभाने वाले AU-अमीर तत्व (२१औ) Helicase (उपनाम DHX36, G4R1) के साथ जुड़े हुए शाहीन की स्थिरता के विनियमन का एक उदाहरण इस मंच के13आवेदनों के प्रदर्शन के लिए प्रयोग किया जाता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. एकल अणु खींचने के लिए G4 DNA की तैयारी

  1. तैयार 5 & #39;-thiol लेबल और 5 & #39;-बायोटिन लेबल dsDNA पीसीआर द्वारा हैंडल DDNA पोलीमरेज़ पर एक लैंब्डा फेज डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करके 5 & #39;-thiol और 5 & #39;-बायोटिन प्राइमर < सुप क्लास = "xref" > 14 (< मजबूत क्लास = "xfig" > फिगर 1 ). दोनों dsDNA हैंडल उच्च GC सामग्री है (& #62; ६०%) डीएनए पिघलने को रोकने के लिए जब डीएनए उच्च बलों में आयोजित किया जाता है या डीएनए के दौरान खिंचाव संक्रमण < सुप वर्ग = "xref" > १५ .
  2. एक वाणिज्यिक शोधन किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों को शुद्ध और निर्माता & #39 के अनुसार BstXI प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा; एस प्रोटोकॉल.
  3. Ligate G4 बनाने ssDNA, और पार्श्व ssDNA और dsDNA के निर्माता & #39; एस प्रोटोकॉल के अनुसार टी-4 डीएनए ligase का उपयोग संभालती है । जेल निष्कर्षण द्वारा ligated उत्पाद शुद्ध निर्माता & #39 के अनुसार एक वाणिज्यिक शुद्धीकरण किट का उपयोग कर; s प्रोटोकॉल.
< p class = "jove_title" > 2. फ्लो चैनल की तैयारी

  1. Coverslip सफाई और सतह functionalization
    1. जगह नीचे coverslips (#1 .5, 22 मिमी & #215; ३२ मिमी) और शीर्ष coverslips (#1 .5, 20 मिमी x 20 मिमी) कवर ग्लास धुंधला जार में (प्रत्येक जार coverslips के 7 टुकड़े पकड़ कर सकते हैं, मात्रा ~ 20 मिलीलीटर) है । आसुत जल के साथ जार में coverslips कुल्ला 2-5 बार ।
    2. जोड़ें ~ एक जार में 5-40% डिटर्जेंट समाधान के 20 मिलीलीटर, और फिर 30 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक सफाई स्नान में जगह है । & #62 के लिए आसुत जल के साथ कुल्ला; 10 बार डिटर्जेंट निकालने के लिए ।
    3. ओवन में जार में coverslips सूखी (~ १५० & #176; C; सावधानी , गरम), या N 2 गैस के द्वारा । सूखे शीर्ष coverslips एक सूखी कैबिनेट में स्टोर ।
    4. 10 मिनट के लिए जार में coverslips को साफ करने के लिए प्लाज्मा (O 2 गैस) का उपयोग करें । 10 मिनट के दौरान, 1% की 20 मिलीलीटर तैयार (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) मेथनॉल में समाधान ( सावधानी , विषैले/ मेथनॉल.
      में APTES भंग करने के लिए एक रासायनिक धुएं डाकू का प्रयोग करें नोट: APTES समाधान भंडारण जब आर्द्रता से बचें । पुराने APTES अक्सर coverslips की सतह functionalizing में समस्या का कारण बनता है ।
    5. तुरंत प्लाज्मा सफाई के बाद, जार में 1% APTES समाधान के सभी जोड़ने और 1 घंटे के लिए 1% APTES मेथनॉल के लिए विशिष्ट अपशिष्ट बोतल में अपशिष्ट डालो । ज्वलनशील रसायनों के लिए धुएं डाकू में मेथनॉल से संबंधित कदम प्रदर्शन ।
    6. कुल्ला के साथ एक बार जार मेथनॉल और & #62; आसुत जल के साथ 10 बार, और फिर ओवन द्वारा सूखी (~ १५० & #176; C; सावधानी , गरम) । एक सूखी कैबिनेट में APTES-लेपित नीचे coverslips स्टोर करने के लिए दो सप्ताह के लिए उपयोग में नहीं तो ।
      नोट: प्रत्येक उप के बाद 2.1.1 से 2.1.4 के लिए कदम, सफाई की प्रक्रिया अगले कदम से पहले रोका जा सकता है ।
  2. इकट्ठा द फ्लो चैनल
    1. तैयार दो & #34; स्पेसर्स & #34;, यानी , parafilm या डबल साइड टेप (~ 4 mm & #215; 20 mm) प्रत्येक चैनल के लिए । लंबी बढ़त के साथ एक नीचे coverslip पर स्पेसर के दो टुकड़े प्लेस । स्पेसर पर एक शीर्ष coverslip प्लेस, बीच में एक फ्लो सेल बनाने (~ 10 मिमी & #215; 20 मिमी क्षेत्र, < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a , बी ).
    2. यदि parafilm एक स्पेसर के रूप में प्रयोग किया जाता है, एक हीटर पर प्रवाह चैनल प्लेस (60-120 & #176; सी; सावधानी , गर्म) के लिए 5-10 s जबकि धीरे शीर्ष coverslip के पक्षों को दबाने के लिए दो coverslips एक साथ छड़ी parafilm । परिणामी प्रवाह चैनल की ऊंचाई है ~ १०० & #181; m, और जिससे चैनल की मात्रा ~ 20 & #181; L.
    3. रिसाव से बचने के लिए सिलिकॉन गोंद के साथ चैनल के लंबे किनारे सील । प्रवाह चैनल के प्रत्येक खुले किनारे पर एक छोटे से सिंक की तरह संरचना बनाने के लिए सिलिकॉन गोंद का प्रयोग करें, जो एक प्रवेश और समाधान के एक निकास के रूप में कार्य करता है ।
      नोट: प्रवेश और निकास भी अन्य तरीकों से बनाया जा सकता है, जैसे , मोम का उपयोग कर छोटे प्लास्टिक के छल्ले का पालन करके.
    4. एक सूखी कैबिनेट में स्टोर चैनलों के लिए 4 हफ्तों के लिए ।
  3. प्रवाह चैनल के नीचे की सतह पर तार डीएनए
    1. एमिनो कोटेड polystyrene मोती (व्यास: 3 & #181; m) 200X द्वारा आसुत 1x फास्फेट में खारा (पंजाब) बफर पतला । भंवर मनका समाधान और फिर चैनलों में प्रवाह । के लिए चैनलों में मनका समाधान की मशीन ~ 30 मिनट के साथ धोने से किसी भी अटक मोती निकालें २०० & #181; 1x पंजाबन बफर के एल.
    2. समायोजित करें (वृद्धि/कमी) मशीन समय ५० mm x ५० mm क्षेत्र प्रति 1-5 मोतियों की सतह घनत्व को प्राप्त करने के लिए । 3 दिनों तक संदर्भ मोतियों के साथ जमा किए गए चैनलों को स्टोर करें ।
    3. पतला sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC) पाउडर 1x पंजाब समाधान (~ ०.५ मिलीग्राम/एमएल) में । समाधान भंवर और फिर चैनल में प्रवाह ।
      नोट: उपयोग करने से पहले ताजा Sulfo-SMCC समाधान तैयार करें और SMCC के hydrolyzation से बचने के लिए उसे तुरंत चैनल पर जोड़ें.
    4. के लिए चैनल में SMCC समाधान मशीन 30 मिनट के लिए एक बड़ी राशि (1 मिलीलीटर, ~ 50X चैनल मात्रा के साथ धुलाई द्वारा SMCC समाधान निकालें 1x पंजाब समाधान के) ।
      नोट: अतिरिक्त SMCC को ध्यान से धोएं । coverslip पर डीएनए की बाइंडिंग के लिए यह कदम बहुत जरूरी है ।
    5. डीएनए tethering
      1. पतला thiol-बायोटिन 1x पंजाब में डीएनए लेबल, एक जिसके परिणामस्वरूप डीएनए एकाग्रता के साथ ~ ०.३ एनएम । धीरे पिपेट समाधान मिश्रण करने के लिए, SMCC-लेपित चैनल में डीएनए समाधान प्रवाह, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन (~ 23 & #176; C).
    6. लिएर नि: शुल्क डीएनए के साथ २०० & #181 से दूर धोने; अवरुद्ध समाधान का L जिसमें 10 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और ०.०१% 2-Mercaptoethanol.
    7. के साथ 1x पंजाबन शामिल है
    8. अवरुद्ध समाधान में चैनल मशीन द्वारा चैनल सतह ब्लॉक (10 मिलीग्राम/एमएल BSA, ०.०१% 2-Mercaptoethanol) के लिए & #62; 2 ज; इस कदम के बाद चैनल प्रयोगों के लिए तैयार है । तैयार चैनल 4 & #176; C के लिए ~ 1 दिन रखा जा सकता है ।
      नोट: अवरुद्ध कदम डीएनए और चुंबकीय मोतियों की गैर विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है coverslips.
< p class = "jove_title" > 3. चुंबकीय चिमटी सेटअप और एकल dsDNA तार की पहचान

  1. चुंबकीय चिमटी सेटअप
    1. चुंबकीय चिमटी नियंत्रण कार्यक्रम शुरू करते हैं । यहां, चुंबकीय चिमटी एक घर में लिखा LabVIEW कार्यक्रम द्वारा नियंत्रित किया गया ।
    2. चैनल बढ़ते से पहले चुंबक केंद्रों संरेखित करें । माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल अक्ष में मैग्नेट के एक्स-और वाई-अक्ष को समायोजित करने के लिए एक 4x उद्देश्य लेंस का उपयोग करें ।
    3. z-दिशा (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ) के साथ मैग्नेट स्थानांतरित करने के लिए एक कंप्यूटर नियंत्रित मोटर चालित जोड़तोड़ का उपयोग करें और डी = 0 ( डी : मैग्नेट और coverslip के बीच दूरी) के रूप में दूरी निर्धारित जब मैग्नेट करने के लिए देते हैं माइक्रोस्कोप पर एक coverslip.
    4. का कार्यक्रम बल के नियंत्रण को प्राप्त करने के लिए जोड़तोड़ के माध्यम से मैग्नेटो की आवाजाही निरंतर बल सहित ( अर्थात , स्थिरांक d ) और समय बदलती बल F ( t ) ( अर्थात , समय बदलती d ( t )).
    5. उपयोग उज्ज्वल एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) पीठ के लिए प्रकाश स्रोत-उद्देश्य के माध्यम से मनका के बिखरे हुए रोशनी । एक आरोप-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा द्वारा १०० हर्ट्ज के एक नमूना दर पर मनका छवियों को इकट्ठा.
  2. नमूना सेटअप और एकल dsDNA तार की पहचान
    1. तार गठन
      1. धीरे 200X में प्रवाह पतला एम-२८०, परख समाधान में paramagnetic मोती (१०० mm KCl, 2 मिमी MgCl 2 , 10 मिमी Tris-पीएच ७.४ ) एक चैनल में । 10 मिनट के लिए मशीन के लिए मोती बायोटिन को बांध करने की अनुमति-डीएनए SMCC-thiol के माध्यम से लेपित सतह पर स्थिर-लेबल अंत के अणुओं लेबल । धीरे दूर संयुक्त राष्ट्र के सीमित मोती का उपयोग कर धो २०० & #181; मानक प्रतिक्रिया समाधान के एल.
        नोट: एम-२८० मोती इस तरह के एम-२७० के रूप में अन्य वाणिज्यिक चुंबकीय मोतियों की तुलना में सतह के लिए कम गैर विशिष्ट बंधन दिखा.
    2. सूक्ष्मदर्शी मंच पर चैनल माउंट । 100X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर नीचे की सतह पर मोतियों के लिए खोजें ।
    3. सतह और एक चलती सीमित मनका पर एक संदर्भ मनका चुनें । दोनों संदर्भ मनका और अलग infocus विमानों पर सीमित मनका के प्रारंभिक छवि पुस्तकालयों का निर्माण ।
    4. मोतियों की अंशांकन छवि
      1. प्रयोगों से पहले, एक उद्देश्य पीजो दो अलग मनका छवि के रूप में संग्रहीत कर रहे हैं, जो 20-50 एनएम द्वारा स्थान पर अलग infocus विमानों में दोनों संदर्भ और सीमित मोतियों की छवियों को प्राप्त करने के लिए का उपयोग करें पुस्तकालयों और क्रमशः infocus दूरी के साथ अनुक्रमित रहे है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d ).
    5. x, y, z स्थिति निर्धारण
      1. प्रयोगों के दौरान, मनका केन्द्रक द्वारा एक्स-वाई विमान में मनका की स्थिति का निर्धारण. निर्धारित पुस्तकालय में संग्रहीत उन लोगों के साथ वर्तमान मनका छवि की तुलना द्वारा सीमित मनका की ऊंचाई बदल जाते हैं । का प्रयोग करें स्वत: सहसंबंध समारोह के विद्युत स्पेक्ट्रम का रूपान्तर रूपांतर के मनका छवियां < सुप वर्ग = "xref" > १६ .
    6. विरोधी बहाव प्रतिक्रिया संदर्भ मनका
      1. प्रयोग के दौरान, पीजो का प्रयोग करें & #34; लॉक & #34; उद्देश्य और एक विशिष्ट संदर्भ मनका छवि के बीच की दूरी एक कम आवृत्ति के माध्यम से पुस्तकालय में संग्रहीत प्रतिक्रिया नियंत्रण, ताकि अटक मनका छवि एक विशिष्ट पुस्तकालय में संग्रहीत छवि के साथ सबसे अच्छा संबंध है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d ).
    7. निर्धारित करें कि क्या तार ~ ६५ pN बल लागू करने के द्वारा एक एकल dsDNA अणु है एक एकल dsDNA अणु निर्धारित यदि तार की विशेषता से गुजरना संक्रमण विस्तार डीएनए < सुप वर्ग = "xref" > १७ , < सुप वर्ग = "xref" > १८ , < सुप वर्ग = "xref" > १९ . एक एकल dsDNA तार पाया जाता है जब तक प्रक्रिया को दोहराएँ. (कृपया बल अंशांकन और डीएनए खिंचाव संक्रमण के लिए अगले अनुभाग को देखें) ।
< p class = "jove_title" > 4. चुंबकीय चिमटी बल अंशांकन

  1. सीधे निर्धारित बल (अप करने के लिए १०० pN) लंबे डीएनए के लिए (४८,५०२ bp & #955;-डीएनए) के माध्यम से मनका अस्थिरता का उपयोग अणुओं:
    < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudflare2.jove.com/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg"/>
    , जहां k B लैटिस स्थिरांक है, T केल्विन स्केल में तापमान है, & #948; 2 y इस दिशा में मनका अस्थिरता का विचरण चुंबकीय क्षेत्र को सीधा और बल दिशा. इस दिशा में मनका के प्रस्ताव की लंबाई के साथ एक पेंडुलम अस्थिरता के रूप में वर्णित किया जा सकता है l + r 0 , जहां l है अंत करने के लिए अंत दूरी के साथ-साथ डीएनए के बल दिशा (विस्तार), और आर 0 है मनका < सुप वर्ग की त्रिज्या = "xref" > १० (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ए ).
  2. के लिए अंशांकन वक्र का निर्धारण f के लिए एक समारोह के रूप में मनका दूरी डी , और f ( d ) अलग मोतियों के लिए लंबे & #955 का उपयोग कर;-डीएनए. आमतौर पर, चुंबक और coverslip के बीच की दूरी डीएनए तार की लंबाई के रूप में प्रयोग किया जाता है नजरअंदाज कर दिया जा सकता है । डबल-घातीय क्षय समारोह द्वारा F - d वक्र फ़िट:
    < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudflare2.jove.com/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg"/>
    , जहाँ फिटिंग पैरामीटर्स & #945; 1, & #945; 2, & #947; 1, & #947; 2 से निर्धारित होते हैं चुंबकीय चिमटी और पैरामीटर सी चुंबकीय मोतियों की विषम संपत्ति से निर्धारित होता है । C को बदलने से F - d वक्र भि मोतियों से प्राप्त किया जा सकता है छा < सुप class = "xref" > 10 (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा बी सी ).
  3. छोटे डीएनए प्रयोगों के लिए व्यक्तिगत चुंबकीय मोतियों के लिए पैरामीटर सी का अंशांकन.
    1. अस्थिरता के आधार पर बल का निर्धारण कोने आवृत्ति की तुलना में एक आवृत्ति उच्च पर मनका स्थिति रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है:
      < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudflare2.jove.com/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg"/>
      , जहां & #947; ड्रैग है मनका के गुणांक । उच्च बल पर कम डीएनए के लिए, यह रिकॉर्डिंग आवृत्ति तेजी से १०० हर्ट्ज की आवश्यकता है, इसलिए, बल सीधे कैमरे के साथ अस्थिरता के आधार पर मापा नहीं जा सकता. हालांकि, पैरामीटर C कम बल सीमा पर बल को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है (& #60; 15 pN) के उतार-चढ़ाव का उपयोग और डाटा फिटिंग के साथ एक नपे F - d वक्र पैरामीटर प्राप्त करने के लिए C < सुप class = "xref" > 20 .
    2. वैकल्पिक रूप से, dsDNA के साथ प्रयोगों के लिए, निर्धारित पैरामीटर सी के एक बल पर डीएनए में खिंचाव संक्रमण का उपयोग कर ~ ६५ pN (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 सी ) < सुप वर्ग = "xref" > 21 , < सुप क्लास = "xref" > २२ , < सुप वर्ग = "xref" > 23 डी स्थिति है जिस पर dsDNA विस्तार कूद (समोच्च लंबाई के 0.6 x लंबाई वृद्धि) दिखाया । पैरामीटर सी निर्धारित करने के बाद, सीमित मोतियों के लिए बल की गणना.
  4. एफ ( डी ) के व्युत्क्रम समारोह के माध्यम से मैग्नेट के आंदोलन प्रोग्रामिंग द्वारा लोडिंग दर को नियंत्रित करते हैं । चुंबक नमूना तेजी से डबल दृष्टिकोण चाहिए ।
    नोट: इस तरह के एक एक्सट्रपलेशन विधि द्वारा निर्धारित बल के सापेक्ष त्रुटि ~ 10% है, और मुख्य रूप से मनका त्रिज्या के कारण होता है विविधता < सुप वर्ग = "xref" > २० .
< p class = "jove_title" > 5. उपस्थिति और बंधन प्रोटीन की अनुपस्थिति में G4 के एकल अणु हेरफेर

  1. बल-रैंप प्रयोग
    1. dsDNA तार की पहचान करने के बाद, एक बल-वृद्धि स्कैन ०.२ pN के एक लोडिंग दर पर प्रदर्शन/ बल-आठवा at स्कैन-०.२ pN/ प्रत्येक खींच चक्र के बाद, 30 एस के लिए 1 pN पर डीएनए अणु पकड़ करने के लिए ssDNA G4.
    2. करने के लिए गुना करने की अनुमति
  2. बल-कूद उपाययोजना
    1. सायकल ३० एस के लिए ५४ pN के बीच बल है जिसके तहत एक जोड़ g4 सामने आ सकता है, और 60 के लिए 1 pN, जिसके तहत एक जोड़ g4-15T मोड़ सकता है ।
  3. बह प्रोटीन समाधान
    1. जब ~ 20 pN के लिए मोतियों की कुर्की से बचने के लिए coverslip में प्रोटीन समाधान प्रवाह । DEAH-box २१औ helicase, जिसने G4 संरचना में उच्च विशिष्टता दिखाई थी, < सुप क्लास = "xref" > 24 का इस्तेमाल किया था । संयोजक Drosophila melanogaster २१औ (DmRHAU) helicase में व्यक्त किया गया था ई कोलाई और पहले वर्णित के रूप में शुद्ध < सुप वर्ग = "xref" > २५ . DmRHAU की g4 unwinding गतिविधि एक tetramolecular G4 डीएनए सब्सट्रेट पर परख की गई थी < सुप वर्ग = "xref" > १३ .
  4. विश्लेषण एक इन-हाउस लिखित Matlab प्रोग्राम का उपयोग करते हुए बल का विश्लेषन < सुप class = "xref" > 14 .

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Representative Results

एक G4 अणु खींच के लिए प्रयोग सेटअप चित्रा 4में दिखाया गया है । एक एकल-किनारा G4 बनाने अनुक्रम दो dsDNA संभालती के बीच फैले एक coverslip और एक paramagnetic मनका के बीच सीमित किया गया था । एक एकल dsDNA सीमित मनका खोजने के लिए, एक तेज परख लगातार लदान दरों पर बल बढ़ाने के द्वारा किया गया था । माप के तीन प्रकार अक्सर के लिए इस्तेमाल किया गया तह और अणुओं का खुलासा: (i) निरंतर बल माप, (ii) बल-रैंप माप, और (iii) बल-कूद माप. इस G4 संरचना की अत्यंत धीमी गति से खुलासा दरों के कारण, संतुलन तह-खुलासा संक्रमण केवल दिनों से अधिक समय के लिए हो सकता है, तो बल-रैंप और बल-कूद माप निस्र्पक का खुलासा कैनेटीक्स और G4 की स्थिरता के लिए इस्तेमाल किया गया संरचनाओं.

२१औ प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में G4 खुलासा करने के लिए बल-रैंप माप:

चित्रा 4B से पता चलता है ठेठ बल-विस्तार एक बल-वृद्धि स्कैन द्वारा प्राप्त ०.२ pN/एस के एक लोडिंग दर पर बल-मृतक स्कैन द्वारा पीछा किया-०.२ pN/ प्रत्येक खींच चक्र के बाद, डीएनए अणु 30 एस के लिए 1 pN में आयोजित किया गया था ssDNA के लिए जी-4 के लिए अनुमति देते हैं । बल-वृद्धि स्कैन में विस्तार कूद G4 के एक खुलासा संक्रमण संकेत दिया । जब एक गैर-G4 बनाने अनुक्रम का उपयोग कर, अचानक विस्तार कूद नहीं देखा जा सकता है । खुलासा बल वितरण बलों है जिस पर खुलासा हुआ रिकॉर्डिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । G4-15T ०.२ pN/एस में प्राप्त की सेना वितरण का खुलासा ~ ५२ pN पर एक भी चोटी दिखाया । हालांकि, 10 एनएम २१औ की उपस्थिति में, g4-15T बल-बढ़ाने के लिए स्कैन के दौरान जोड़ रह ६० pN, २१औ बंधन द्वारा G4 स्थिरीकरण का संकेत है । 10 एनएम २१औ और 1 मिमी एटीपी की उपस्थिति में, खुलासा बल वितरण एक कम बल में स्थानांतरित कर दिया गया था, २१औ द्वारा G4 के एक एटीपी निर्भर स्थिरीकरण का संकेत है ।

बल-जी-4 की उपस्थिति या २१औ प्रोटीन की अनुपस्थिति में खुलासा-कूद माप:

चित्रा 5 चार बल-कूद चक्र (चित्रा 5, बाएँ पैनल) के दौरान मनका ऊंचाई का एक प्रतिनिधि ट्रेस से पता चलता है; अणु के लिए लागू बल ५४ pN के बीच 30 एस जिसके तहत एक जोड़ g4 सामने आया हो सकता है के लिए चक्रित किया गया था, और ६० एस के लिए 1 pN जिसके तहत एक जोड़ g4-15T मोड़ सकता है । जोड़ G4-15T ५४ pN पर का औसत जीवनकाल ~ ६.४ एस, एक घातीय क्षय समारोह के साथ जीवन भर हिस्टोग्राम फिटिंग द्वारा अनुमानित था13। एटीपी के बिना 10 एनएम २१औ helicase के एक समाधान में बहने के बाद, सीमित डीएनए के विस्तार ५४ pN पर 30 एस पकड़े समय भर में एक जोड़ स्तर पर बनी हुई है, यह दर्शाता है कि २१औ दृढ़ता से जी-4 में यांत्रिक खुलासा के खिलाफ 15T संरचना स्थिर एटीपी की अनुपस्थिति । 10 एनएम २१औ और 1 मिमी एटीपी में बहने के बाद, 1 pN से ५४ pN से कूदने के बाद एक ही अणु के अधिकार का विस्तार ssDNA के स्तर पर हुआ, यह दर्शाता है कि २१औ एटीपी की उपस्थिति में G4 संरचना को अस्थिर करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एकल अणु खींच प्रयोगों के लिए G4 डीएनए की तैयारी ।
dsDNA हैंडल 5 '-thiol और 5 '-बायोटिन प्राइमर का उपयोग कर पीसीआर द्वारा तैयार किए गए थे । पीसीआर उत्पादों शुद्ध और BstXI प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा रहे थे और जेल निष्कर्षण द्वारा शुद्ध थे । G4 बनाने ssDNA, दो पार्श्व ssDNA और dsDNA संभाल टी-4 डीएनए ligase का उपयोग ligated थे । ligated उत्पाद जेल निष्कर्षण द्वारा शुद्ध किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बुनियादी चुंबकीय चिमटी तंत्र के रेखाचित्र ।
() ऊपर रखा मैग्नेट की एक जोड़ी के साथ एक प्रवाह चैनल के स्केच और एक सूक्ष्म उद्देश्य के नीचे रखा । () एक इकट्ठे प्रवाह चैनल के स्केच जहां नीले रंग का आयत शीर्ष और नीचे coverslips का प्रतिनिधित्व करते हैं, और ग्रे एलिप्टिकल लाइंस फ्लो चैनल के प्रवेश और निकास का प्रतिनिधित्व करते हैं । () बल पीढ़ी और चुंबकीय चिमटी सेटअप के अंशांकन का स्केच । (D) दोनों संदर्भ मनका और मनका छवि पुस्तकालयों में संग्रहित विभिंन de-फोकस पदों पर चलती मनका की छवियों के उदाहरण । लाल हस्ताक्षर संदर्भ मनका छवि एक विशेष de-फोकस फोकल विमान लॉकिंग के लिए इस्तेमाल किया विमान में प्राप्त की अर्थ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: चुंबकीय चिमटी के अंशांकन बल ।
() बल के अंशांकन एक रोटेशन से मुक्त y दिशा के साथ मनका के उतार चढ़ाव का उपयोग कर । X-अक्ष चुंबकीय क्षेत्र के रूप में एक ही दिशा के साथ है । बल z-अक्ष के साथ है और दूरी का समायोजन द्वारा नियंत्रित किया जाता है, डी, स्थाई चुंबक जोड़ी और coverslip के बीच । () एक लंबे ४८,५०२ बीपी-डीएनए का उपयोग करने का अंशांकन । विषम चुंबकीय मनका संपत्ति एक एकल पैरामीटर सी द्वारा वर्णित किया जा सकता है यह आंकड़ा10से संशोधित किया गया है । () एक चुंबकीय मनका के एक 2 केबी पर संलग्न के पैरामीटर सी अंशांकन-डीएनए बी का उपयोग कर संक्रमण फैला एस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक G4 के एकल अणु हेरफेर ।
() एक खींच एकल G4 संरचना के स्केच और खुलासा घटनाओं को मापने । () बल-वृद्धि (सियान) और बल-एक सीमित G4 के वक्र कमी का विशिष्ट उदाहरण । यह आंकड़ा12से संशोधित किया जा चुका है । () २१औ प्रोटीन के अभाव (ग्रे) या उपस्थिति (गुलाबी) में G4 के बल-विस्तार वक्र । (D) अनुपस्थिति में G4 के बल वितरण का खुलासा (धूसर) (n = १४०) या २१औ और एटीपी (n = ११७) की उपस्थिति (लाल) । यह आंकड़ा13से संशोधित किया गया है । कृपया क्लिक करेंयहां इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: G4 का खुलासा बल-कूद माप ।
(A) प्रतिनिधि समय का पता लगाने के बीच बल कूद चक्र के दौरान मनका ऊंचाई परिवर्तन 1 pN और ५४ pN बिना DmRHAU मापा, 10 एनएम DmRHAU के साथ लेकिन एटीपी के बिना, और दोनों के साथ 10 एनएम DmRHAU और 1 मिमी एटीपी, के रूप में चित्रा पैनल में संकेत दिया । (B) एक G4 अणु के विस्तार परिवर्तन के प्रतिनिधि समय का पता लगाने (ग्रे डेटा) के कई बल-jump () में डेटा से लिया चक्र में ५४ pN के कूदने के बाद । जोड़ (F) और खुलासा (यू) G4 के लिए इसी एक्सटेंशन भी संकेत कर रहे हैं; G4 खुलासा घटनाओं तीर से संकेत कर रहे हैं । यह आंकड़ा13से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जैसा कि ऊपर वर्णित है, g4 डीएनए की यांत्रिक स्थिरता और एक अणु चुंबकीय चिमटी का उपयोग कर g4 के लिए प्रोटीन की बातचीत के अध्ययन के लिए एक मंच की सूचना है । मंच के साथ, g4 डीएनए तार खोजने के अत्यधिक कुशल प्रोटोकॉल, और तह-खुलासा गतिशीलता और nanometers विशेष संकल्प के साथ जी-4 संरचना की स्थिरता की माप विकसित कर रहे हैं । फोकल विमान लॉकिंग अत्यधिक स्थिर विरोधी बहाव नियंत्रण है, जो जैसे जी-4 (चरण आकार ~ 7 एनएम) और बफर एक्सचेंज प्रयोगों में प्रोटीन के साथ बातचीत के रूप में एक छोटी सी संरचना संक्रमण का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है सक्षम बनाता है । यह मंच हाल ही में telomeric g414 और सी-Myc प्रमोटर g412की तह और खुलासा गतिशीलता के अध्ययन के लिए कार्यरत है, साथ ही g4 बाइंडिंग प्रोटीन २१औ helicase13के अध्ययन के रूप में ।

एक ठेठ प्रयोग त्रुटि coverslip या एकाधिक DNAs बांध पर डीएनए और मोतियों की गैर विशिष्ट बंधन चुंबकीय मोतियों के लिए है । गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को कम करने के लिए, सबसे पहले, APTES और SMCC जैसे रसायनों के भंडारण को नियमित रूप से जांचने की आवश्यकता है । दूसरा, यह चुंबकीय मनका का एक उचित प्रकार का चयन करें और गैर विशिष्ट बाध्यकारी ब्लॉक महत्वपूर्ण है । 10 मिलीग्राम/एमएल BSA बफर या जैसे पाली टी के रूप में छोटे डीएनए oligo, मोतियों की hydrophobic सतह को ब्लॉक करने के लिए काफी गैर विशिष्ट बाध्यकारी कम कर सकते है का उपयोग करना । अंत में, एक भी डीएनए तार आसानी से विशेषता संक्रमण17,18,19फैलाने डीएनए द्वारा कई डीएनए tethers से प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।

वर्तमान में, मंच के स्थान निर्धारण मनका इमेजिंग विश्लेषण है, जो ~ 2 एनएम के एक सीमित स्थानिक संकल्प किया है पर आधारित है । इसके अलावा, यह ~ १०० हर्ट्ज के एक सीमित नमूना दर है, मुख्य रूप से ठेठ सीसीडी कैमरों और छवियों के सहसंबंध विश्लेषण के सीमित अधिग्रहण दर के कारण । इन सीमाओं कुल आंतरिक प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (TIRF) रोशनी का उपयोग करके दूर किया जा सकता है । यह evanescent प्रकाश की एक पतली परत है कि सतह से ऊंचाई के साथ तेजी से क्षय पैदा करता है, जो एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात में छोटे अणुओं के विस्तार परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि मनका छवि अधिग्रहण और विश्लेषण से परहेज26 . एक और सीमा है कि यह सीधे सीमित अणु कल्पना या सीमित अणु ऊर्ध्वाधर डिजाइन खींच, जो फोकल विमान में अणुओं खींच द्वारा दूर किया जा सकता है प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करने के लिए बाध्य ligand visualizing है अनुप्रस्थ चुंबकीय चिमटी27। अंत में, प्रतिक्रिया चैनल के वर्तमान डिजाइन तेजी से समाधान परमाणु के प्रवाह गड़बड़ी के कारण विनिमय की अनुमति नहीं है । इसके अलावा, एक बड़े खींचें उच्च गति प्रवाह में उत्पंन बल भी tethers टूट सकता है । इस सीमा चैनल के नीचे की सतह पर रखा microwells के अंदर तार हेर-फेर से दूर किया जा सकता है28.

G4 स्थिर यौगिकों वर्तमान में कैंसर, वायरस से संबंधित रोगों, और neurodegeneration रोगों29,30,31सहित रोगों के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में माना जाता है । प्रोटोकॉल G4 बाध्यकारी प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है2 और छोटे लाइगैंडों३२। G4 अध्ययन में आवेदन के अलावा, इस मंच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटोकॉल, सिद्धांत रूप में, अंय न्यूक्लिक एसिड माध्यमिक संरचनाओं डीएनए और आरएनए hairpins, ट्रिपलेक्स सहित, के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और मैं-आकृति३३

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने पांडुलिपि को ठीक करने के लिए मेंग पैन का शुक्रिया अदा किया । यह काम सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय के अकादमिक अनुसंधान कोष टीयर 3 (MOE2012-T3-1-001) से J.Y. के लिए समर्थित है; Mechanobiology संस्थान सिंगापुर के माध्यम से नेशनल रिसर्च फाउंडेशन को J.Y.; नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, प्रधानमंत्री कार्यालय, सिंगापुर, इसके एनआरएफ Investigatorship कार्यक्रम के तहत (एनआरएफ Investigatorship अवार्ड सं. एनआरएफ-NRFI2016-03 to J.Y.; केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (2017KFYXJJ153) को एच. वाय.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis

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References

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