Pattedyr celledeling i 3D matricer via kvantitative Konfokal refleksion mikroskopi

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denne protokol effektivt undersøgelser pattedyr celledeling i 3D kollagen matricer ved at integrere synkronisering af celledeling, overvågning af division begivenheder i 3D matricer ved hjælp af live-celle imaging teknik, tidsopløst fluorescens refleksion mikroskopi og kvantitative imaging analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, L., Sneider, A., Chen, W., Karl, M., Prasath, V., Wu, P. H., Mattson, G., Wirtz, D. Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy. J. Vis. Exp. (129), e56364, doi:10.3791/56364 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Undersøgelse af hvordan pattedyr celledelingen reguleres i et 3D miljø forbliver stort set uudforskede trods dens fysiologiske relevans og terapeutiske betydning. Mulige årsager til manglen efterforskning er eksperimenterende begrænsninger og tekniske udfordringer at gør studiet af celledeling i 3D kultur ineffektive. Her, beskriver vi en imaging-baseret metode til effektivt studere pattedyr celledeling og celle-matrix interaktioner i 3D kollagen matricer. Celler mærket med fluorescerende H2B synkroniseres ved hjælp af en kombination af thymidine blokering og nocodazole behandling, efterfulgt af en mekanisk shake-off teknik. Synkroniseret celler er derefter indkapslet i en 3D kollagen matrix. Celledeling overvåges ved hjælp af live-celle mikroskopi. Deformation af kollagen fibre under og efter celledeling, som er en indikator for celle-matrix interaktion, kan overvåges og kvantificeres ved hjælp af kvantitative Konfokal refleksion mikroskopi. Metoden giver en effektiv og generel tilgang for at studere pattedyr celledeling og celle-matrix interaktioner i en fysiologisk relevante 3D miljø. Denne tilgang ikke blot giver ny indsigt i de molekylære grundlag for udviklingen af normale væv og sygdomme, men også mulighed for udformningen af nye diagnostiske og terapeutiske strategier.

Introduction

Celle mitosen er en afgørende begivenhed i cellulære liv, regulering af som spiller afgørende roller i væv og orgel udvikling. Unormal mitosen er impliceret i naturlige genetiske variationer, menneskelige aldringsprocesser og progression af kræft1,2,3,4,5. Den forhøjede sats af udbredelsen af tumorceller sammenlignet med normale celler er et af kendetegnene ved kræft, trods at celle adfærd er ganske heterogene blandt forskellige typer af tumorer, og selv blandt patienter. På trods af lovende prækliniske resultater, har nogle nyligt udviklede antimitotic lægemidler ikke vist sig for at være effektiv i kliniske forsøg6,7,8,9,10 ,11. Relevansen af eksperimentelle og prækliniske modeller må betragtes. Mange typer af normale pattedyr og kræft celler opdele i tre-dimensionelle (3D) matricer, såsom fibroblaster og fibrosarcoma celler i kollagen-rige 3D bindevæv og metastatisk kræftceller i den 3D stromale ekstracellulære matrix (ECM). Dog, har størstedelen af pattedyr celledeling eksperimenter og assays udført på celler dyrkes på todimensionelle (2D) substrater. En manipuleret 3D matrix kunne bedre sammenfatte mikrostruktur, mekaniske egenskaber og biokemiske signaler af 3D ECM af både normale og patologiske væv12,13,14, 15,16,17.

Undersøgelse af hvordan pattedyr celledeling er reguleret i 3D miljøer forbliver stort set uudforskede trods både den fysiologiske relevans og terapeutiske betydning18,19. Mulige årsager omfatter de tekniske vanskeligheder og eksperimenterende udfordringer forbundet med at studere celledeling i 3D matricer. Celle mitosen udgør en lille tidsmæssige brøkdel i hele cellecyklus20. Tidligere arbejde har vist, at spredning satsen af mange pattedyrceller, såsom menneskelige bryst adenocarcinom MCF-7, menneskelige osteosarkom U2OS og menneskelige leveren HepG2, er meget lavere i 3D matricer sammenlignet med deres modstykker på 2D substrater21, 22. Derudover flytte celler indlejret i 3D matricer ind og ud af fokus under live-celle billeddannelse. Alle disse faktorer bidrager til den ekstremt lav effektivitet indfange celledeling begivenheder i 3D kultur ved hjælp af Billeddannende teknikker.

Interaktioner mellem ECM og celler spiller en kritisk rolle i regulering celledelinger. Her, beskriver vi en fremgangsmåde til at effektivt studere pattedyr celledeling i 3D kollagen matricer. Metoden omfatter indarbejdelse af mitotiske markører til cellerne, synkronisering af celledeling, samt overvågning af division begivenheder i 3D matricer ved hjælp af live-celle imaging teknik, tidsopløst fluorescens refleksion mikroskopi, og kvantitative imaging analyse. Fluorescens-mærket histoneprotein H2B føres først ind i cellerne som en markør for at skelne mitotiske og interphase celler. Derefter cellerne synkroniseres ved hjælp af en kombination af thymidine blokering og nocodazole behandling, efterfulgt af en mekanisk shake-off teknik. Synkroniseret celler er derefter direkte indkapslet i 3D kollagen matricer. Celledeling begivenheder af flere celler overvåges effektivt ved hjælp af lav-forstørrelse time-lapse live-celle billeddannelse. Deformationen af kollagen fibre, som er en indikator for celle-matrix interaktion, overvåges ved hjælp af mikroskopi Konfokal refleksion på høj forstørrelse.

Vi har tidligere brugt denne teknik til at overvåge og kvantificere celle-matrix interaktion før, under og efter mitosen to metastatisk kræft cellelinjer, menneskelige invasive duktalt carcinom MDA-MB-231 og menneskelige fibrosarcoma HT1080 celler, i 3D kollagen matricer19. De metoder, der præsenteres her giver en effektiv og generel tilgang for at studere begge pattedyr celledeling i et 3D miljø og celle-matrix interaktioner. MDA-MB-231 cellelinie bruges som forbillede i hele papiret. Denne protokol giver ny indsigt i de molekylære grundlag for udviklingen af normale væv og sygdomme, og kan også give mulighed for udformningen af nye diagnostiske og terapeutiske strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen i henhold følger retningslinjerne for The Homewood institutionelle Review Board (HIRB).

1. stabil udtryk for H2B-mCherry som markør for celle mitose

  1. Generation af lentiviral partikler fra menneskelige embryonale nyre 293T (HEK 293T) celler
    1. Plade HEK 293T celler på en 10 cm celle kultur parabol med tæthed på 5 x 106 celler/parabol i cellekulturmedium (Dulbeccos modificerede Eagle's Medium (DMEM) indeholder høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% føtal bovin Serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Pen/Strep)). Der inkuberes i 24 timer ved 37 ° C og 5% kuldioxid (CO2). Den ønskede confluency af celler på dagen for Transfektion er omkring 70-80%.
      Bemærk: HEK 293T celler der bruges her til at producere viruspartikler, som vil blive brugt senere til transduce MDA-MB-231 celler for at generere en cellelinje stabilt udtrykker H2B-mCherry. Kontroller, at cellerne er jævnt fordelt over hele pladen. Tilsætning af cellerne drop kloge på pladen, og forsigtigt bevægelige plade frem og tilbage kan støtte i jævn fordeling. Celler kan også være seedet i plader eller kolber af andre størrelser, hvilket vil resultere i samlingen af forskellige mængder af virale partikler.
    2. Transfect HEK 293T celler ved hjælp af en Transfektion reagens med tre plasmider (lentiviral vektor, CMV ΔR 8.91 og pMDG-VSVG). Plasmid kodning H2B-mCherry er klonet i en lentiviral vektor med fosfoglycerat kinase promoter (PGK). CMV ΔR 8.91 indeholder tre nødvendige HIV gener, gag, polog rev. pMDG-VSVG indeholder VSV-G kuvert genet.
      Bemærk: Der er flere Transfektion agenter at vælge imellem.
      1. Tillad hætteglas Transfektion reagens at nå stuetemperatur (RT) før brug. Inverter eller vortex hætteglasset kort.
      2. Mix 16 µg af DNA, som består af 6 µg af H2B-mCherry plasmid, 8 µg af CMV ΔR 8.91 og 2 µg for pMDG-VSVG, i 1 mL af reducerede serum medier. Der inkuberes ved RT i 5 min.
        Bemærk: Mængden og forholdet mellem de tre vektorer er varierede og optimeret til forskellige lentiviral overførsel vektorer.
      3. Tilføje 48 µL (bruger 1:3 ratio af DNA: Transfektion reagens) Transfektion reagens i ovenstående DNA løsning, og derefter inkuberes ved RT i mindst 15 min.
        Bemærk: Forholdet mellem DNA vs Transfektion reagens er varieret og optimeret til forskellige lentiviral overførsel vektorer. Sørg for, at Transfektion reagens ikke kontakte side af 1,5 mL-centrifugerør.
      4. Tilføj den DNA-lipid komplekse løsning skabt taktfast 1.1.2.3 Dråbevist til cellerne. Forsigtigt swirl plade for at sikre en jævn fordeling af komplekset i pladen.
    3. Ca 6 h efter Transfektion, Aspirér medium og tilføje frisk cellekulturmedium (DMEM med høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS og 1% Pen/Strep).
    4. Høste de supernatanten 24, 48 og 72 h efter Transfektion. Udskift mediet efter hver høst (DMEM, 4,5 g/L glukose, natrium pyruvat, med 10% FBS, og 1% Pen/Strep).
    5. Filter lentiviral partikler gennem et 0,45 µm filter til at fjerne den celleaffald. Alternativt, spin ned supernatanten at adskille celle debris. Supernatanten kan bruges til transduktion lige væk, eller kan opbevares ved-80 ° C.
  2. Generation af celle linjer stabilt udtrykker H2B-mCherry
    Bemærk: Denne protokol er beskrevet i detaljer for MDA-MB-231 celler. Før brug i eksperimentet, human brystkræft karcinom celler MDA-MB-231 (fysiske videnskaber onkologiske Center, NIH) er kulturperler i DMEM der indeholder høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS og 1% Pen/Strep.
    1. Plade MDA-MB-231 cellerne i massefylden af 1 x 105 celler i en 35 mm kultur parabol.
      Bemærk: Tætheden af plating for forskellige cellelinjer bør optimeres, og derfor kan være forskellig fra den optimal tæthed for MDA-MB-231 celler.
    2. 24 timer efter plating cellerne, der tilsættes 1 mL af virus og 1 mL frisk medium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS, og 1% Pen/Strep).
    3. Inkuber cellerne i en periode af 6 h at overnatte.
      Bemærk: Begge mængden af virus og inkubationstiden skal være optimeret til forskellige cellelinjer. For eksempel, hvis cellerne ikke ser sundt et par timer efter tilsætning af virus, brug 1 mL af virus og 2 mL frisk medium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS, og 1% Pen/Strep) for trin 1.2.2. Længden af inkubationstiden taktfast 1.2.3 kan også reduceres.
    4. Opsug mediet og tilsættes 10 mL frisk medium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS og 1% Pen/Strep). Inkuber i mellem 24 til 72 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
    5. Kontrollere udtryk for H2B-mCherry i celler ved hjælp af et epifluorescensmikroskop.
      Bemærk: Hvis transduktion effektivitet er lav i cellerne, mængden af virus i trin 2.2 og inkubationstiden taktfast 2.3 kunne øges.

2. synkronisering af de celler, der stabilt udtrykker H2B-mCherry

  1. Plade celler på 50-60% confluency, dvs. plade 2 x 104 MDA-MB-231 celler i hver brønd med en 24-godt plade.
  2. Inkuber kultur ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
  3. Erstatte vækstmediet med 0,5 mL medium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS, og 1% Pen/Strep) indeholdende 2 mM thymidine og forlade i inkubator i 24 timer.
    Bemærk: Celler udsat for thymidine er arresteret i fasen af cellevækst (G1) / DNA syntese (S) overgang og hele S-fase på grund af hæmning af DNA-syntese. Længden af inkubationstiden bør varierede og optimeret til forskellige cellelinjer.
  4. Frigive celler fra thymidine eksponering ved at vaske dem med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) tre gange. Altså Ruger celler i normal cellekulturmedium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS og 1% Pen/Strep) for 5 h.
    Bemærk: Frigivelse af celler fra thymidine eksponering giver cellerne til at komme videre til cellevækst (G2) / mitotiske (M) fase for celler tidligere anholdt på G1/S fase, og G1-fasen for celler tidligere anholdt på S fase. Længden af frigøre tid bør varierede og optimeret til forskellige cellelinjer.
  5. Blokere cellerne med 250 ng/mL af nocodazole for 12 timer.
    Bemærk: Alle celler udsat for nocodazole er anholdt på G2/M fase. Nocodazole er cytotoksisk. Langvarig udsættelse for nocodazole kan forårsage apoptose. Justere periode eller koncentration af eksponering for forskellige cellelinjer, hvis cellen døde er observeret. Celler, der er blevet synkroniseret vil udstille en sfærisk morfologi.
  6. Ryst celler for 45 s til 1 min bruger en orbitalryster på 150 til 200 rpm.
    Bemærk: Mitotiske celler, som har lidt overholdelsen til underlaget, vil blive rystet i løbet af processen.
  7. Fjern mediet for at udtrække celler, når der afpipetteres medium i et centrifugeglas, og derefter tilsættes 0,5 mL frisk medium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS, og 1% Pen/Strep) til hvert hul i pladen.
  8. Gentag trin 2.6 og 2.7 tre gange.
  9. Der centrifugeres indsamlede medium indeholdende de mitotiske celler ved 800 x g i 3 min.
    Bemærk: Dette trin bruges til at fjerne nocodazole fra celle medium.

3. indarbejdelse af den synkroniserede celler i kollagen matricer

Bemærk: Type I kollagen er den mest rigelige protein i den menneskelige krop og i ECM af bindevæv, og dermed er almindeligt anvendt til at undersøge hvordan eukaryote celle funktioner er moduleret af et 3D miljø17,23,24 . Kollagen er opløseligt i eddikesyre. Efter neutralisering og opvarmning kollagen løsning til 20-37 ° C, polymerisere kollagen monomerer i en meshwork af kollagen fibriller.

  1. Forberede den 10 x DMEM løsning ved at opløse en pakke af DMEM pulver, 3,7 g natriumbicarbonat (NaHCO3) og 1 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) i 50 mL destilleret vand. Opløsningen filtreres, og klargør derefter 1 M natriumhydroxid (NaOH) ved at opløse 2 g NaOH pellets i 50 mL destilleret vand. Filter og alikvot løsning til 1,5 mL centrifugeglas.
    Bemærk: Normale DMEM løsning bør ikke anvendes i dette trin. Tilsætning af betydelig mængde af kollagen løsning vil udvande mediet. Derfor er koncentrerede DMEM løsningen parat til at sikre, at den endelige koncentration af DMEM i kollagen matrix vil være den samme som den normale DMEM.
  2. Fortsætte med at arbejde med de celler, der er indsamlet fra trin 2.9. Opsug medium og genopslæmmes celler i omkring 0,25 - 0,5 mL frisk cellekulturmedium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS, og 1% Pen/Strep).
    Bemærk: For at nå en bestemt celle tæthed i kollagen matrix, ikke den oprindelige tæthed af celler i suspension være for lavt. Således er vil mængden af mediet bruges til cellerne genopslæmmes afhænge af det samlede antal ledige celler.
  3. Sted 10 µL af re suspenderede celle løsning fra trin 3.2 på en hemocytometer og Grev tætheden af celler i løsningen.
  4. Bestemme de mængder, der er nødvendige for alle komponenter til at gøre 3D kollagen matrix. 500 µL af 2 µg/µL kollagen gel bruges her som eksempel.
    1. Beregning af volumen af den celle løsning nødvendig for at opnå 40.000 celler/mL (eller 20.000 celler for de 500 µL af kollagen gel). Dette nummer i µL er X. 50 µL af 10 x DMEM vil være nødvendig. 50 µL af FBS vil være nødvendig.
    2. Beregne mængden af kollagen jeg lagerfører behov. Koncentrationen af kollagen jeg er omkring 4 µg/µL. Mængden af kollagen i µL er Y.
    3. Beregning af volumen af natriumhydroxid skal neutralisere eddikesyre i kollagen løsning: Y µL kollagen * 0,023 * 1000 = Z µL NaOH behov.
    4. Bestemme mængden af fyldstof løsning: (500 µL samlede gel - X µL celler - 50 µL 10 X DMEM - 50 µL af FBS - Y µL kollagen - Z µL NaOH) = R µL
      Bemærk: Filler-løsning er destilleret vand. Hvis den beregnede mængden af fyldstof løsning er et negativt tal, er den oprindelige celle tæthed i cellesuspension for lavt. Cellerne skal være spundet ned igen og igen suspenderet i en mindre mængde af medium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS, og 1% Pen/Strep).
  5. Tilføj komponenterne i følgende rækkefølge til en ren 1,5 mL centrifugeglas: celler i medium, 10 x DMEM, FBS, deioniseret vand (DI) vand, kollagen, NaOH. Placere alle komponenterne på isen for at bremse gellation af kollagen løsning. Brug ordentlig pipettering teknikker til at forhindre dannelsen af boblerne.
  6. Efter tilsætning af NaOH, bland løsningen omhyggeligt med en 1 mL pipette.
    Bemærk: Gellation af kollagen vil starter lige umiddelbart efter tilsætning af NaOH. Blanding bør ske omhyggeligt og hurtigt.
  7. Når løsningen er godt blandet, tilføje 500 µL af opløsningen til hver brønd af 24-godt plade. 24-godt pladen anbringes i 37 ° C inkubator. Placer frisk cellekulturmedium i 37 ° C vandbad.
    Bemærk: Plast bundplade bruges til lav-forstørrelse live-celle microcopy, hvor arbejde afstand af linsen er over 1 mm. glas bund plader anvendes til høj forstørrelse live-celle mikroskopi på grund af den korte arbejdstid afstand af høj forstørrelse lens.
  8. Tilsættes 500 µL af pre varmede medium (DMEM, høje glukose (4,5 g/L), natrium pyruvat, 10% FBS og 1% Pen/Strep) til toppen af gel 30 min efter endt trin 3.7.

4. levende celle billeddannelse af celler dividere i 3D kollagen matricer (lav forstørrelse)

Bemærk: Billeder af celler er indsamlet med 2 min mellemrum ved hjælp af en afgift koblede enhed (CCD) kamera monteret på en fase-kontrast mikroskop, der er udstyret med en 10 X mål og kontrolleret af imaging software.

  1. Tænd levende celle-enhed monteret på toppen af formålet objektivet. Vent, indtil temperaturen stabiliserer ved 37 ° C, koncentrationen af CO2 er på 5% og luftfugtigheden er på 75%.
  2. Sat 24-godt plade af geler i den levende celle enhed på mikroskopet. Finde i bunden af pladen og derefter flytte den objektive linse indtil mikroskopet fokuserer på omkring 500 µm fra bunden af pladen.
    Bemærk: Celler i kollagen matrix, der er for tæt på bunden af pladen ikke er fuldstændig integreret i 3D matrix. Imaging celler, der er 500 µm fra bunden af pladen vil sikre, at cellerne ikke er påvirket af kant effekter16,17,25.
  3. Bevæge bordet rundt for at finde cellerne, og vælg flere positioner for billeddannelse.
  4. Oprettet den time-lapse eksperiment med 2 min mellemrum.
    Bemærk: Det maksimale antal positioner, der kan træffes under 2 min interval er begrænset af den bevægelige hastighed af den motoriserede stadium, og længden af eksponeringstiden til at indfange billeder.

5. kollagen netværk Deformation under celledeling (høj forstørrelse mikroskopi)

  1. Tænd levende celle-enhed monteret på toppen af formålet objektivet. Vent, indtil temperaturen stabiliserer ved 37 ° C, koncentrationen af CO2 er på 5% og luftfugtigheden er på 75%.
  2. For at visualisere kollagen fibre i unstained 3D kollagen matricer, konfigurere en Konfokal mikroskop for at fange kun reflekterede lys (488-nm) fra 488 nm laser bruges til at belyse prøven. Laseren bruger en 60 X vand-fordybelse mål, NA = 1,2, WD = 200 µm, og er kontrolleret af imaging software.
  3. Lagt prøve (celler i kollagen matricer) i den levende celle enhed. Finde i bunden af pladen og derefter flytte den objektive linse indtil mikroskopet fokuserer på omkring 100 µm fra bunden af pladen. Imaging celler, der er 100 µm fra bunden af pladen vil sikre, at cellerne ikke er påvirket af kant effekter.
    Bemærk: Her en vand-fordybelse mål bruges i stedet for en oliebestan linse fordi arbejde afstand af oliebestan linse er kun omkring 100 µm. Brugen af oliebestan linsen udgør et problem som tykkelsen af glas i bunden af pladen er normalt omkring 100 µm.
  4. Bevæge bordet rundt for at finde cellerne, og vælg flere positioner for billeddannelse.
    Bemærk: Konfokalmikroskopi sektioner optisk prøven og kun opfanger signaler fra brændplanet. Levende celler kan være at flytte ind og ud af fokus under time-lapse eksperimentet. Hvis du vil aktivere indfange af celle billeder over lange perioder, bruges Z-stakken til at indsamle billeder fra successive udsnit på 5 µm intervaller. Ialt 5 skiver der spænder over 25 µm er afbildet.
  5. Oprettet den time-lapse eksperiment med 5 min. mellemrum.
    Bemærk: 5 minutter bruges her som interval i stedet for 2 min anvendes i afsnit 4, fordi flere scanning tilstande, herunder fluorescens scanning til H2B-mCherry, refleksion scanning for kollagen, og Z-stakken scanning, der anvendes til hver position. Brugen af flere scanning tilstande reducerer hastigheden på scanning en position i forhold til lav forstørrelse billeddannelse.
  6. Kvantificere deformationen af kollagen matrix i en celle på grund af de kræfter, der udøves af cellen ved hjælp af partikel imaging Velocimetri (PIV) med sub-pixel opløsning20. Udføre denne analyse på 2D billeder giver mulighed for klart visualisering af signalerne fra H2B-mCherry og kollagen fibre. Anvende Anisotropisk lav passet filtrering for at forbedre signal af kollagen network20.
  7. For at måle den lokale forskydning af en sub-image region af interesse ligger på (x,y) fra ramme k at ramme k+ 1, uddrag en regional vindue af 15 × 15 pixel centreret på (x,y) ved ramme k. Derefter identificere bedste matchende steder (x,y) * gennem de steder, der har en maksimal normaliseret cross-korrelationskoefficienten i billedet opnået på rammen k+ 1. Deformation vektor er beregnet som (x,y) *-(x,y).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne artikel er at fremlægge en imaging-baseret metode til at studere pattedyr celledeling processer i 3D matricer og kvantificere interaktioner mellem cellen og 3D ekstracellulære matrix, under og efter celledeling. For at lette billedbehandling i celle mitosen, indarbejdet vi H2B-mCherry i MDA-MB-231 celler ved hjælp af lentiviral transduktion. H2B konjugeret med fluorescerende proteiner er brugt som mitotiske markør til at skelne mitotiske celler fra interphase celler og definere forskellige stadier under celle mitosen19,20,26. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at overvåge den hele division proces af MDA-MB-231 celler stabilt udtrykker H2B-mCherry i 3D kollagen matricer (figur 1A). Mitotiske faser startede med opløsningen af Kernemembranen (prophase, billede 1, figur 1A); re-organisering af kromosomer (prometaphase: ramme 2); justeringen af kromosomer i midten af cellen kroppen (metafase; ramme 3); adskillelsen af kromosomer (anaphase; ramme 4); reorganisering af kromosomerne og Kernemembranen og adskillelse af ligene af de to datterceller (telophase/cytokinesis, ramme 5).

Spredning sats af celler i en 3D matrix er normalt meget lavere end deres kolleger på en 2D substrat, som gengiver overvågning af celledeling i 3D mindre effektive19. For at øge effektiviteten af studerer 3D celledeling, ansat vi en metode, der kombinerer thymidine, nocodazole og en shake-off teknik til at synkronisere og vælge MDA-MB-231 celler, der er på den mitotiske fase. Synkroniseret celler blev derefter indlejret i kollagen matricer. Division proces af flere celler blev overvåget i realtid ved hjælp af live-celle billeddannelse ved 10 X forstørrelse. Omkring 70% af celler opdelt inden for de første 2 timer efter dannelsen af kollagen matrix (figur 2), hvilket giver mulighed for effektiv overvågning i mitosen i 3D (figur 2).

For at overvåge samspillet mellem celler og deres omgivende kollagen matricer, kombineret vi Konfokal refleksion mikroskopi billede kollagen fibre og Fluorescens mikroskopi til billede cellerne. En 60 X linse giver mulighed for opsamling af høj kvalitet billeder af kollagen fibre. Imaging ved hjælp af en høj forstørrelse linsen, som indfanger færre celler i hver af synsfeltet, er meget lavere-throughput sammenlignet med brug af lav-forstørrelse på 10 X eller 20 X. Vellykket synkronisering af cellerne forbedrer høj grad effektiviteten og overførsel af sådan et eksperiment, da de fleste af de synkroniserede celler dividere inden for de første 2 timer efter dannelsen af kollagen matrix. Matrix deformationen under og efter celledeling er visualiseret (repræsentant snapshots er vist i figur 1B) og kvantificeres ved hjælp af en brugerdefineret PIV software. Vi kvantificeres og sammenlignet matrix deformation under interphase og mitotiske fase for celler synkroniseret den mitotiske fase. Vi observerede, at matrix deformation ændret sig meget lidt under den mitotiske fase (figur 3A), og er mindre end deformationen observeret i post mitotiske faser (figur 3B). Dette resultat viser, at pattedyrceller har minimal udlæg og samspil med den omkringliggende matrix, mens de er i den mitotiske fase.

Figure 1
Figur 1: repræsentative micrographs fremstillet af en høj forstørrelse live-celle imaging video af en MDA-MB-231 celle indlejret i en kollagen matrix, der stabilt udtrykker H2B-mCherry. (A) forskellige faser af den mitotiske progression af cellen MDA-MB-231 er defineret af H2B-mCherry, som er mærket med rødt. (B) kollagen fibre (hvid) under den mitotiske proces er visualiseret ved tidsafhængig Konfokal refleksion mikroskopi. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: fordeling af de synkroniserede celler i 3D kollagen matricer. Celler var synkroniseret til G2/M fase og indlejret i et kollagen matrix. Omkring 70% af synkroniserede celler dividere inden for de første 2 timer, mens kontrol celler uden synkronisering kløft tilfældigt. Fejllinje = SEM (standard fejl af middelværdien). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvantificering af matrix deformation for MDA-MB-231 celler under interphase og mitose. (A) ændringen i omfanget af matrix deformation for matrix-embedded MDA-MB-231 celler. Den grønne pil angiver prophase og rød pil angiver telophase. (B) kvantificering af matrix deformation for MDA-MB-231 celler under interphase og mitotiske fase, der angiver, at matrix deformation er minimal i celledeling. Fejllinje = SEM (standard fejl af middelværdien). * p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den forrige undersøgelse af celledeling i 3D var ikke effektivt på grund af eksperimentelle begrænsninger og tekniske udfordringer18,19. De kritiske trin for effektiv undersøgelse af pattedyr celledeling i 3D kollagen matricer er: (1) indarbejdelsen af fluorescens-mærket mitotiske markører til celler; (2) synkroniseringen af celledeling; og (3) overvågning af division begivenheder i 3D matricer ved hjælp af live-celle imaging teknik, tidsopløst fluorescens refleksion mikroskopi og kvantitative imaging analyse.

Mitotiske celler på 2D substrater kan skelnes fra interphase cellerne baseret på deres morfologi, dvs mitotiske celler er runde og knap tillægger substratet interphase celler spredes ud og Vedhæft fast til underlaget. I 3D matricer, men celle morfologi er ikke en pålidelig markør for mitotiske celler siden nogle celler knap spredt ud og forblive runde i matrix27,28. Det er således vigtigt at indføre en mitotiske markør til cellerne for studiet af celledeling i 3D matricer. Vi udtrykte stabilt H2B-mCherry i MDA-MB-231 celler, der fungerede som en pålidelig markør for forskellige mitotiske faser, herunder prophase, prometaphase, metafase, anaphase og telophase/cytokinesis. Vi har tidligere anvendt denne tilgang for at skelne mitotiske celler fra interphase celler i 3D matricer. Med hjælp fra dette mærke var vi også i stand til at måle længden af den mitotiske fase til en anden cellelinje, HT1080 celler, dividere på substrater til 2D og i 3D matricer19.

Der er flere måder at synkronisere celler, herunder serum sult29, mitotiske shake-off30,31, dobbelt thymidine blokerer32og nocodazole32. Vi har kombineret thymidine behandling og nocodazole behandling effektivt synkronisere MDA-MB-231 celler G2/M-fasen. Celler udsat for thymidine er anholdt på G1/S overgangen og hele S fase på grund af hæmning af DNA syntese af thymidine. Frigivelse af celler fra thymidine eksponering lade celler fremskridt til G2/M fase for celler anholdt på G1/S fase, og at G1 for celler anholdt på S fase. Alle celler udsat for nocodazole er anholdt på G2/M fase. Rundet op celler ind mitotiske fase var så rystet-off fra pladen og direkte indkapslet i kollagen matricer. Vi viste, at omkring 70% af cellerne deler inden for 2 timer efter de er indarbejdet i kollagen matricer (figur 2). Alternativt, celler kan være indlejret i kollagen matricer før synkronisering, men de krydsrefererede netværk af kollagen matrix præsenterer en fysisk barriere og reducerer antallet af Biomolekylær diffusion og konvektion33, 34., vi har forsøgt at synkronisere celler i kollagen matricer ved hjælp af thymidine og nocodazole, men mislykkedes at opnå effektiv synkronisering. Dette resultat kan være på grund af ineffektive diffusion og konvektion af narkotika gennem kollagen matrix.

Refleksion er en iboende optisk egenskab af mange Biopolymerer, herunder kollagen. Konfokal refleksion mikroskopi teknik visualiserer og quantitates microtopography af porøse biomaterialer fremstillet af syntetiske polymerer og 3D kollagen matricer23,24,35,36 ,37. I vores laboratorium, har vi etableret teknikker til at overvåge ændringer i kollagen fiber polaritet, som koncentrationen af kollagen varierer38. Her beskriver vi metoden for at overvåge deformationen af kollagen fibre baseret på time-lapse video af de reflekterende Konfokal billeder til at betegne den celle-matrix interaktion. De repræsentative resultater præsenteret her viser, at matrix deformation for mitotiske MDA-MB-231 cellerne er væsentligt mindre end cellerne i interfase, hvilket tyder på, at pattedyrceller har minimal udlæg og interaktioner med de omkringliggende matrix, når de indtaster den mitotiske fase19.

Tidligere brugte vi Konfokal refleksion mikroskopi til at overvåge og kvantificere celle-matrix interaktion før, under og efter mitosen af HT1080 celler. Vi overvåges også matrix deformation af B1-integrin knock-down HT1080 celler under både interphase og mitotiske fase. Nedbryder B1-integrin betydeligt reducerer matrix deformation af cellen under interfasen. Men der er ingen forskel i matrix deformation under den mitotiske fase af runde B1-integrin knockdown (KD) celler og HT1080 vilde type celler19.

En alternativ tilgang til at visualisere kollagen fibre er at ansætte fluorescens-konjugeret type I-kollagen. Vi har tidligere anvendt denne tilgang til billede spor i kollagen matricer genereret af celler19. Denne tilgang kræver imidlertid, at mærkningen af kollagen med fluorescerende farvestof som fluorescein isothiocyanat (FITC), som er både tidskrævende og mindre effektiv. På den anden side kan Konfokal refleksion mikroskopi anvendes direkte på uændrede kollagen til at spare tid og ressourcer, og udelukke de spørgsmål i forbindelse med fluorescens photobleaching. Desuden, denne metode kræver ikke en individuel fluorescerende kanal, og derfor er kompatibel med alle fluorescerende farvestoffer.

Metoden fremlægges i dette papir kan potentielt anvendes til nogen form for mammale celler, der deler sig i en 3D kollagen matrix. Indarbejdelse af H2B-mCherry markør i andre pattedyrceller ved lentiviral transduktion vil følge præcis de samme procedurer, som beskrevet i papiret, selv om forskellige typer af celler kan har varieret effektivitetsgevinster for transduktion af lentivirus 39. både tætheden af celler ved transduktion og titer af virus kan være optimeret til effektivitet. Hvis høje transduktion effektivitet ikke opnås, kunne celler vælges af fluorescens assisteret celle sortering (FACS). Blokering af thymidine og nocodazole anvendes for at kunne synkronisere flere andre typer af mammale celler, såsom HeLa40. Mekanisk shake-off kunne anvendes på enhver celletyper, at runde op og knap tillægger bærematerialet under mitotiske fase30,31. Derudover kan billeddannelse af kollagen fibre ved hjælp af Konfokal refleksion mikroskopi og kvantificering af matrix deformationen anvendes direkte til alle andre typer af dividere pattedyrsceller.

Den metode, der præsenteres her er en effektiv og generel tilgang til at studere pattedyr celledeling og celle-matrix interaktioner i et 3D-miljø. Metoden letter vores sonde ind det molekylære grundlag for udviklingen af normale væv og sygdomme, og potentiates designet af roman diagnostiske og terapeutiske tilgange i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH grants R01CA174388 og U54CA143868. Forfatterne vil gerne anerkende PURA award fra Johns Hopkins University for støtte af Wei-tong Chen. Dette materiale er baseret på arbejde støttes af de National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No. 1232825.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney 293T ATCC
MDA-MB-231 Physical Sciences Oncology Center, NIH
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM powder ThermoFisher Scientific 12100-046
Fetal bovine serum Hyclone SH30910.03
Penicillin-Streptomycin 100X Sigma-Aldrich P0781
Fugene HD Promega E2311
Lipofectamine 2000 Life technologies 11668-07
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector Addgene plasmid 21217
Thymidine Sigma-Aldrich T1895
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Opti-MEM Life Technologies 31985-070
Sodium bicarbonate GibcoBRL 11810-025
HEPES Sigma-Aldrich 113375-100
Collagen Corning 354236
NaOH J.T. Bake 3722-01
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm Millipore SLHVM33RS
Nikon TE2000E epifluorescence microscope Nikon TE2000E
Cascade 1K CCD camera Roper Scientific
NIS-Elements AR imaging software Nikon
Nikon A1 confocal microscope Nikon A1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287, (5462), 2486-2492 (2000).
  2. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122, (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  3. Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11, (1), 18-21 (2001).
  4. Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
  5. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  6. Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68, (15), 6251-6259 (2008).
  7. Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25, (5), 471-477 (2007).
  8. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18, (1), 51-63 (2012).
  9. Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28, (18), 3015-3022 (2010).
  10. Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127, (1), 63-69 (2012).
  11. Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22, (2), 431-437 (2011).
  12. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (3), 211-224 (2006).
  13. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, (5547), 1708-1712 (2001).
  14. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196, (4), 395-406 (2012).
  15. Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27, (10), 4089-4099 (2013).
  16. Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
  17. Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12, (6), 598-604 (2010).
  18. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205, (2), 155-162 (2014).
  19. He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7, (6), 6994-7011 (2016).
  20. Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, (9), 747-754 (2010).
  21. Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7, (10), e48024 (2012).
  22. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33, (35), 9087-9096 (2012).
  23. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
  24. Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
  25. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
  26. Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187, (4), 481-496 (2009).
  27. Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (5), 1943-1948 (2011).
  28. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33, (16), 4157-4165 (2012).
  29. Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
  30. Jackman, J., O'Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
  31. Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120, (2-3), 151-159 (1983).
  32. Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
  33. Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8, (11), e82382 (2013).
  34. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  35. Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6, (9), e24891 (2011).
  36. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20, (8), 931-941 (2009).
  37. Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28, (6), 305-310 (2006).
  38. Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
  39. Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9, (14), 932-938 (2002).
  40. Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics