絞扼性損傷マウス自動歩行分析

Neuroscience

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Summary

動物モデルでは神経因性の痛みの反応の正確な評価は、痛みの病気の病態を調査し、新しい鎮痛薬の開発に不可欠です。後肢足自動歩行解析システムによって齧歯動物の感覚機能は、機密かつ客観的手法を提案します。

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Kang, D. W., Choi, J. G., Moon, J. Y., Kang, S. Y., Ryu, Y., Park, J. B., Kim, H. W. Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury. J. Vis. Exp. (128), e56402, doi:10.3791/56402 (2017).

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Abstract

Von Frey テストは、神経因性疼痛の動物の感覚の機能を調べるため広く使用されている古典的な方法です。ただし、熟練した、経験豊富な実験者の要件と主観的データなどいくつかの欠点があります。さまざまな変更まで、von frey 毛方法の改善が、それはまだいくつかの制限があります。最近の報告では、歩行分析が神経因性動物からより正確で客観的データを生成することを示唆しています。このプロトコルはマウスの神経因性疼痛の程度を判断する自動歩行分析を実行する方法を示します。馴化の数日後、マウスは自由に足跡を照らすためのガラスの床の上を歩くを許されました。足印刷、スイング時間足等の角部などの様々 な歩行パラメーターの自動解析とビデオ クリップを足跡と歩行の定量化を行ったし、

本研究の主な目的は、自動歩行分析の方法論を記述して、簡単に von Frey フィラメントを使用して古典的な感覚のテストからのデータを比較することです。

Introduction

外傷、代謝異常、炎症、感染症、虚血による神経系の病理学的変化や病変や疾患の直接的な結果として生じる痛みとして定義されている神経因性疼痛の時折発生する自己免疫疾患1体性感覚系に影響を与えます。神経因性疼痛は通常、我慢、残念なことに、従来の鎮痛薬一般的に生産しない十分な痛み救済2。神経因性疼痛の主要な機能には、自然と刺激に対する反応 (すなわちアロディニア、痛覚過敏) の痛みが含まれています。アロディニアは、軽いタッチや暖かい刺激などの通常非痛み刺激に発生した侵害受容応答です。痛覚過敏は、有害な機械および/または熱刺激3に強化された痛み応答を示します。これらの 2 症状の両方は非常に患者さんの生活の質を損なう、穏やかな触覚刺激により誘発される機械的アロディニアが最も悪化症状ソフト コンタクトは日常生活の中で避けにくいので。

調べるための基本的なメカニズムと神経因性疼痛の治療のための新しい鎮痛薬、痛み反応の精密測定が不可欠です。多数の神経因性疼痛モデル動物が開発した後肢に侵害受容反応その高いアクセシビリティ4,5,67のための地域の足。したがって、ほとんど痛み応答評価されてきた、後肢の足底または背側表面に von Frey フィラメントなどの特殊な器具を使用して機械的刺激を適用することによって。最もよく使用される方法の 1 つは、アップ、ダウン ・ ディクソンによって記述方法8と後変更バージョン9,10。しかし、非常に熟練した、経験豊富な実験者は von Frey テストを実行する必要が、結果は主観的な可能性があります。

自動歩行解析システムは、齧歯動物を自由に移動で歩くの様々 なパラメーターを測定することにより、神経疾患、神経筋疾患を調べることができます。神経損傷モデル動物の様々 な侵害受容性といくつかの治療の鎮痛効果は、痛み刺激11,12,13,を追加することがなく評価できます。14. この解析システムなど静的および動的歩行パラメーターの検出することができます: 印刷領域 (床と接触する完全な足印刷の領域) の足、足の強度 (足との接触面積の平均強度)、ストライド長 (同じ足の連続配置間の距離)、姿勢相 (単一の後肢の接地の期間)、ステップ シーケンス (順序で、4 つの足が床に配置されます)、(遊脚相の期間)、スイング、スイング速度 (計算ストライド長期間をスイングと 1 秒あたりのピクセル数で表されます)。本稿では、分析システムの使用方法を示し、絞扼性損傷 (CCI) 神経因性マウスを用いた von Frey テストとデータの簡単な比較を提供しています。

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Protocol

すべての実験痛み研究の国際交流協会の倫理指針に従い実施し、忠南大学校 (で機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。大田広域市, 韓国).

1 坐骨神経の誘導の CCI

  1. 家雄 ICR マウスの部屋温度 (20-25 ° C で維持される) と湿度 (40-60%) で 12 h 明暗周期下 20-25 g の重さで無料の食品へのアクセスと。水。手術する前に、少なくとも 1 週間の動物保育室でマウスの順応期間を許可します
    1. 住宅、外観とマウスの動作を見学し、異常行動を示すマウスを使用しないでください
      。 注: は、CCI 術前 1 日は von Frey フィラメントを適用することによって、後肢の機械的感度を測定し、通常のベースライン値を取得する自動歩行分析を実行します。その後、対照群と実験群にランダムにマウスを割り当てます
  2. 2,2,2 tribromoethanol (250 mg/kg、腹腔内 (IP)) を注入することによりマウスの麻酔手術の日
    。 注: 手術用ガウン、手袋、マスクなど保護具を着用します。
    1. は、2,2,2 tribromoethanol の 2.5 グラムの重量を量る、2-メチル-2-buthanol を 5 mL の最終的なボリュームに追加します。光をさえぎってを保つため (例えば、暗いコンテナーを使用して、ホイルで包む).
    2. 40 ° C で加熱と 10-30 分攪拌して完全に溶解する許可する試薬
    3. 200 mL の最終巻に蒸留水を追加し、よく混合されるまでかき混ぜる
    4. は、4 ° C で因数を格納し、暗闇の中で保管します。2 週間後、麻酔薬の新しい因数を置き換える必要があります
    5. は、1 g の体重ごと 20 μ L のボリュームを挿入します。たとえば、マウスの体重は 25 g、する場合は、500 μ L のソリューションを与えます。この麻酔の典型的な時間は 1 h.
      注: このソリューションはライトに露出されたとき有毒になるおよび/または熱、ライトおよび熱への暴露を避けるために注意してください。ルートの注入はお勧めします
  3. マウスは、深い麻酔に該当、する場合 (すなわち、腹臥位) を背側とオペレーティング テーブルの上に配置し、70% アルコール綿棒で右サイドの外側の半ば太もも領域を消毒します
    。 メモ: は、ピンチや後足は前足や尻尾に刺激の圧力への応答の欠如を確認することによって深い麻酔を確認します
  4. 誘発マウスの右の坐骨神経に CCI
    1. 1.0 〜 1.5 cm の長さの半ば太ももの領域の周りの皮膚にメス刃で切開を行います
    2. 坐骨神経を公開するマイクロ モスキート止血と太ももの筋肉を解剖ぶっきらぼう
    3. 4-0 クロム腸線縫合糸を使用して 1.0 〜 1.5 mm 間隔で 3 回の露出した坐骨神経の結紮します
      。 注: は、同側の後肢に表示される穏やかな揺れまで坐骨神経を結ぶことによって緩いを作る。マウスの偽のグループ受け取った神経結紮なしを除いて同様の条件で同じ外科的開口します
  5. 、5-0 絹糸を使用して 3-4 簡単な縫合と外科的開口を閉じて、手術の外側の領域の消毒をポビドン ヨードで消毒します
  6. 術後では、加熱パッドできれいなケージの中にマウスを置きます。動物が麻酔からリカバリされる場合、ホームのケージに戻ります
    。 注: この研究では、抗生物質使用されませんでした。肯定的な制御として 1 日 1 回 50 mg/kg の用量で CCI + ポンドを受け取ったグループ IP ガバペンチン (GBP).

2。機械的アロディニアの測定 (von Frey テスト)

注: 同側の後肢の足底の表面に von Frey フィラメントの 1 g を使用して撤退に対する機械的刺激の頻度を調べます

  1. それぞれの試験日に行動テスト部屋にマウスを持って来ると、テストする前に、少なくとも 30 分間自分のホーム ケージ内マウスを順応させる
    注: 手術用ガウン、手袋、マスクなど保護具を着用します
  2. 金属メッシュの床に透明なアクリル ボックスにマウスを置くし、30 分マウスを順応させる
  3. フィラメントが曲がるまで優しく、後肢の足底の表面に von Frey のフィラメントの 1 g を適用します
  4. 適用フィラメント刺激同側の後肢に少なくとも 10 秒間隔で 10 回足し、結果を記録します
    。 注: この研究では、10 試験から足回収回答数は前足撤退周波数 (PWF、%) の割合として表示されます。Von Frey テストは CCI 手術後は 2 日おきに行った

3。歩行分析の自動化を実行する

注: 動物が歩いている、自動的に様々 な歩行パラメーターを分析し、歩行解析システムは各足のプリントを可視化する、あしあと、足強度、歩幅のスタンス相、ステップ シーケンス、スイング、スイング スピード、 本研究で示した足印刷領域とデータを割合に変換後単一姿勢変更対側の左同右後肢対。したがって、50% の結果は、印刷の足のサイズと前足部左側と右側の間の床との接触期間が同じであることを示します。さらに、下位のデータ値が 0% に近づいている示す対側と比較すると同側の後肢ではサイズと接触時間の両方が減少する ( 図 2 の B のパネルと 図 3).

  1. 順化、10 分の歩行分析装置内でマウスに CCI 術前に、5 日から一日一回を維持します
    。 注: 馴化を含む歩行分析テストは暗闇の中で実行する必要があります
  2. 歩行解析のためのテスト部屋にマウスを持参しテストする前に、少なくとも 30 分間、ホームのケージに順応
    1. [プログラム] メニューの [設定] タブでは、設定、" 通路の長さ " 30 cm とセットに、" 最大期間を実行 " 5 s と " 最大のバリエーションを実行 " 50%
    2. から登録されているカメラを選択、' セットアップ ' のタブ、' プログラム ' メニュー
    3. 選択 " 買収を開く " から、' を取得 ' のタブ、' プログラム ' メニュー
    4. 次のステータス メッセージをクリックして、' スナップ背景 ' 空 (すなわち ブランク) 通路の背景写真を撮る] ボタンをクリックします
  3. クリックして、' 集録を開始 ' ボタンをクリックし、歩道にマウスを配置、マウスの動きに合わせて自動的に記録を開始
    。 注: マウスが明らかに通路を歩くとき、プログラムは自動的としてこの動きを分類 " 準拠を実行 " 緑のアイコンで。フット プリントを検出するソフトウェアが失敗した場合、実験者は赤いアイコンが表示され、記録を繰り返す必要があります。解析に必要な少なくとも 5 つの成功した準拠実行します
  4. テストの後、選択 ' の実行を分類する ' の取得] タブから、' プログラム ' メニュー
  5. は、分析とクリックのための実行を選択、' 自動分類 ' ボタン
    。 注: 分類、統計パラメーターはすべて自動的に保存され、実験者をクリックして、結果を見つけることができます " 実行統計を表示 " 分析のメニュー

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Representative Results

Von Frey テストを実行し、CCI 術後後 10 日目まで CCI マウスにおける歩行分析を自動化しました。統計解析、双方向分散分析 (ANOVA) の反復測定全体の効果が決まります、実験群 p 値を決定する Dunnett の事後分析を行った。

図 1に示すように示唆された古典的な von Frey テスト データの時間コース。CCI マウスの PWF (%) CCI 術後後 2 日目増加、Sham 群と比較して 10 日間持続します。CCI の肯定的な制御グループ、GBP (50 mg/kg、IP、開始 10 日手術後 1 日目に 1 日 1 回) で CCI が強化された PWF を大幅軽減。パネル A の偽のグループ、PWF (%) は 8.00 ± timepoint 前外科手術 (Pre) 6.00 ± 2.45 の日 2、4.00 ± 2.00 ± 2.00 当日、6、4、日に 2.45 5.83 4.00 ± 8、日 22.45 と 6.00 ± 2.45 10 日目。CCI グループで PWF (%) あった 2.86 ± 1.84 61.43 ± 5.95 68.57 ± 4.59 の日 4、72.86 ± 5.22 当日、6、2 日目より前に 10 日 75.71 日 8、6.49 と 75.71 ± ± 3.69。CCI + GBP 群、PWF (%) は 2.50 ± 143万 57.50 ± 5.22 50.00 ± 4.04 の日 4、45.00 ± 4.81 当日、6、2 日目より前に 46.25 ± 8、日目に 5.65 と 47.50 ± 4.88 10 日目。(AUC) 曲線下面積はパネル B、年偽の 23.00 ± 6.00、cci、317.86 ± 17.04 223.75 ± 17.05 CCI + GBP 群。

図 2に示す結果は、CCI 術後後足印刷領域の時間のコースの変更を示します。左と右後脚の足の間の足の印刷範囲の変化率のデータが表示されます。足の印刷範囲で通常の状態で左右同じですが、データは 50% になります。CCI は大幅減少の同側の後肢の足印刷領域手術後 2 日間、10 日間維持しました。GBP は著しく減らされた足の印刷領域を回復しました。パネル B のシャム群足印刷範囲 (%) あった 50.13 ± 2.13 50.30 ± 1.45 53.24 ± 0.80 の日 4、50.30 ± 1.68 当日、6、2 日目より前に 52.08 日 8、1.79 と 49.66 ± ± 10 日 2.24。CCI グループの足印刷範囲 (%) あった 50.71 ± 3.17 前、0 ± 0 0 ± 0 の日 4、8.86 ± 3.27 当日、6、2 日目に 6.6 ± 8、日 3.20 と 10.30 ± 5.60 10 日目。CCI + GBP 群足印刷範囲 (%) は前日 4、20.20 ± 4.00 の日 6、15.18±5.57 2 日目で 4.65±4.17 に 55.59 ± 2.01 26.01 日 8、5.53 と 28.40 ± ± 6.04 10 日目。

図 3に示す結果は、CCI 術後後単一姿勢の時間のコースの変更を示します。データは計算され、(足印刷範囲データに類似) パーセントの変化を示します。CCI が同側の歩幅の減少し、GBP は大幅に回復します。パネル B のシャム群、歩幅 (%) は 49.31 ± 2.15 50.71 ± 0.67 50.76 ± 0.44 の日 4、50.60 ± 1.11 当日、6、2 日目より前に 51.50 日 8、0.96 と 49.00 ± ± 10 日目 2.35。CCI グループで単一姿勢 (%) あった 50.36 ± 3.17 前、0 ± 0 0 ± 0 の日 4、11.5 ± 3.25 の日 6、2 日目の 10 日 13.61 日 8、5.04 と 12.94 ± ± 6.40。CCI + GBP 群歩幅 (%) は 52.35 ± 0.91 前、5.44 ± 4.87 18.66 ± 4.33 の日 4、25.48 ± 4.10 当日、6、2 日目に 30.26 ± 2.17、8 日目に、322.4億 ± 4.95 10 日目。

Figure 1
図 1: CCI マウスに von Frey テストによって評価機械的アロディニア。テストは CCI 術後後 2 日目増加され Sham 群と比較して 10 日間の持続的な von Frey の足撤退 (A) 周波数 (PWF、%)ガバペンチン (ポンド、50 mg/kg、IP) CCI による機械的アロディニア逆転させた。(B) 曲線下面積として PWF の累計データが表示されます。* * p < 0.01 と * * * p < CCI グループ対 0.001。誤差範囲を示す平均 ± SD.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: CCI マウス自動歩行分析による印刷範囲を前足します。(A) 解析ソフトウェアによってシャム、CCI、および CCI + GBP (ガバペンチン、50 mg/kg、IP) のグループから後足は前足の画像をキャプチャします。白い四角形は、分析システムによって検出された後肢のインジケーターです。CCI の最小の足のサイズに注意してください、この減少部分的 GBP 処理により回収されました。(B) 足印刷範囲 (%) の時間コース。左と右後脚の足の間の印刷領域の変化率と同様に、データを計算 (例えば50% 同じ左側と右側の足印刷領域を示します)。* p < 0.05 と * * p < CCI グループ対 0.01。誤差範囲を示す平均 ± SD.

Figure 3
図 3: CCI マウス自動歩行分析による単一姿勢。(A) キャプチャと各足ごとに異なる色で強調表示された 1 つの姿勢の変換画像。CCI グループで同側の後肢のピンクのトレースを短縮してガバペンチン (ポンド、50 mg/kg、IP) 大幅回復したことそれ同様に偽のレベルに注意してください。(B) 単一姿勢 (%) の時間コース。データの概要は線グラフとして左と右後脚の足の歩幅の割合の変化を計算した後 (例えば50% 左側と右側で同じ歩幅を示します)。* p < 0.05 * * p < 0.01 と * * * p < CCI グループ対 0.001。誤差範囲を示す平均 ± SD.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

現在、von Frey フィラメントを用いた機械的アロディニアの測定は、最も広く触覚過敏症を示す痛みの動物モデルでメソッドを使用です。神経因性疼痛の動物モデルが開発され続けている、よう改良された8,9,10,15感覚機能の評価の方法論もされています。これらのレポートに、これらの変更は、古いメソッドのより正確な高速、かつユーザーフレンドリーな交換を提供できるが示唆されています。ただし、これらのメソッドからのデータをまだその主観やメソッドを実行するスキルや経験の要件によって制限される可能性があります。また、von Frey テストを実行するとき避けるためことはできません動物を抑制、動物の拘束ストレスが痛み応答結果にどのような影響を与えるため。

自動歩行解析システムは自動的に (例えば床に足の印刷、立ち時間等の角度の足接触の総面積)、歩いて動物の様々 なパラメーターを測定し、実験者がのより客観的なデータを使用できるため分析12,13,14,16,17,18。さらに、このメソッドを任意の刺激; なく実行できます。したがって、それは低侵襲、自由行動の齧歯動物からのデータを得ることができます。本研究の結果のように、足はプリント サイズと同側の後肢の姿勢時の CCI 手術によって小さくなり、GBP 治療によって回復同様の結果にも、フォン ・ フライのテスト。以前観察14と同様に、神経因性疼痛の動物モデルにおける歩行分析の結果 CCI 関連変更したパラメーターが程度を反映可能性がありますを示す von frey 毛テストからすると肯定的な相関関係の高度があります。機械的アロディニア、神経因性疼痛の最も刺激症状の一つです。

ここでは、CCI 神経因性マウスにおける古典的 von Frey テスト詳細とデータの簡単な比較で自動歩行解析システムを動作する方法のメソッドを提供します。結論としては、それのための神経因性疼痛に関する研究の最も改善されたアクセス ツールは、ユーザーフレンドリーな客観的、かつ敏感な自動歩行分析があります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この研究は忠南大学、韓国研究所の東洋医学 (KIOM) と韓国健康技術総合研究所の助成金によって支持された & 開発プロジェクトを通じて、韓国保健産業開発研究所 (KHIDI)、厚生省によって資金を供給& 福祉、大韓民国 (許可番号: HI15C0007)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Saline JW Pharmaceutical N/A Vehicle for drugs
1ml syringe BD Plastipak 300013 Injecting device
2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity) Sigma T48402 Anesthetic
2-methyl-2-buthanol (99% purity) Sigma 152463 Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol
Catwalk Automated gait analysis system Noldus N/A Automatic analysis software of aniaml gait
Chromic catgut (4-0 thickness) AILEE C442 Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve
Gabapentin Sigma Y0001280 Analgeisc, Used as a positive control drug in this study
Graefe Forceps F.S.T 11051-10 Surgical instrument
Heating Pad DAESHIN ELECTRONICS M-303AT Regulation of body temperature
ICR Mouse Samtaco N/A Experimental animal
Mersilk (3-0 thickness) ETHICON W598H Suture material for surgical closure of skin
Micro-Mosquito F.S.T 13010-12 Surgical instrument
Micro-scissors F.S.T 14090-09 Surgical instrument
Needle holder F.S.T 12002-12 Surgical instrument
Povidone Iodine Firson N/A Disinfectant to prevent infection after surgery
Scalpel blade F.S.T 10010-00 (#10) Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle F.S.T 10003-12 (#3) Surgical instrument to make an incision
Von-Frey filaments North Coast NC12775-99 Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation

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References

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