Måle effekten av kjemikalier på vekst og reproduksjon av Caenorhabditis elegans

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

En grunnleggende protokoll vurdere toksisitet av kjemikalier i en modell dyr, Caenorhabditis elegans, er beskrevet. Metoden er praktisk og nyttig for utviklingen av legemidler så vel som for risikovurdering av forskjellige miljøgifter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (128), e56437, doi:10.3791/56437 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Toksikologiske evaluering er avgjørende for å forstå effekten av kjemikalier på levende organismer i grunnleggende og anvendt biologiske vitenskap felt. En ikke-pattedyr jord rundt ormen, Caenorhabditis elegans, er en verdifull modell organisme for toksikologi studier på grunn av sin bekvemmelighet og mangel på dyreetikk problemer sammenlignet med pattedyr dyr systemer. En detaljert prosedyre av toksikologiske evaluering av kjemikalier i C. elegans er beskrevet i denne protokollen. En klinisk anticancer narkotika, etoposide, som mål menneskelige topoisomerase II og hemmer utryddelse av menneskelig kreftceller, ble valgt som modell testing kjemisk. Alder-synkroniserte C. elegans egg ble utsatt for dimethyl sulfoxide (DMSO) eller etoposide, og deretter vekst C. elegans var overvåkes hver dag i 4 dager av stereo mikroskop observasjon. Totalt antall egg lagt fra C. elegans behandlet med DMSO eller etoposide regnes også ved hjelp av stereo mikroskopet. Etoposide behandling i betydelig grad påvirket vekst og reproduksjon C.elegans. Sammenligning av antall egg lagt fra ormer med forskjellige treatment perioder av kjemikalier, kan det være bestemt at reproduktivtoksisitetsstudier av kjemikalier på C. elegans reproduksjon er reversibel eller irreversible. Disse protokollene kan være nyttig for både utviklingen av ulike stoffer og risikovurdering av miljømessige giftstoffer.

Introduction

Toksikologiske evaluering er viktig for utviklingen av legemidler, nutraceuticals, og cosmeceuticals, samt risikovurdering av forskjellige miljøgifter. Gnager modellen er en av de mest populære i vivo eksperimentelle systemene for denne undersøkelse; også er ikke-pattedyr organismer som C. elegans også mye brukt. Non-pattedyr toksikologiske evaluering modeller er gunstig på grunn av ikke bare dyr etiske spørsmål, men også deres bekvemmelighet og nytte vurderer kostnadseffektivitet, maintainability, hastighet og reproduserbarhet1,2 ,3,4.

C. elegans, en jord rundt ormen, har blitt utnyttet som en modell dyr i ulike grunnleggende anvendt biologi og kjemi forskning. Det er en 1 mm lang, gjennomsiktig nematode, som bare er vedlikeholdt i fast eller flytende Rundormer vekst medier (NGM) med bakterielle belastningen Escherichia coli OP50. C. elegans har en kort livssyklus, og vill-type N2 C. elegans ligger ca 300 eggeskall. Derfor overføres det lett brukes som experimental materialer3,4,5. C. elegans har også vært mye brukt i toksikologiske undersøkelsene av mange narkotika og miljøgifter6,7,8,9.

Fordi mange anticancer legemidler målet raskt dele celler, kan de også skade raskt dele normale celler som benmargen, intestinal epitel og hårsekken celler. For eksempel målrette topoisomerase hemmende anticancer narkotika DNA replikeringsprosessen med kreftceller. Derfor hemmer de også raskt dele normale celler. Hver levende organisme har topoisomerases og disse topoisomerase hemmere sannsynligvis innvirkning miljømessige økosystemer6,10,11. Dermed er en narkotika toksikologiske evaluering plattform ved hjelp av en modell dyr verdifulle for både utviklingen av legemidler og risikovurdering.

I denne artikkelen beskriver vi detaljerte protokoller for å teste toksisitet av etoposide, som er en klinisk anticancer agent som mål topoisomerase II, som en modell giftig kjemisk i C. elegans. For dette formålet, vil vi beskrive metoden måling kroppsstørrelse og antall egg lagt i C. elegans behandlet med etoposide.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: hele eksperimentet må utføres i en ren isolert laboratorium opprettholdt på 20 ° C med lav støv og minimering av forurensning orm og bakteriell håndtering. For dette formålet, må eksperimenter utføres under flammen i en alkohol lampen eller bruke en ren benk.

1. vedlikehold av C. elegans og Egg forberedelse for kjemisk Test

  1. vedlikeholde C. elegans N2 (var. Bristol) på en NGM agar plate med live E. coli OP50 ved 20 ° C 12 , 13.
  2. Forberede alder-synkroniserte egg enten bleike løsning behandling 5 eller tiden egg legging metode 6 , 14 , 15.
    Merk: før egg forberedelse, pels etoposide inneholder NGM platen med inaktivert E. coli OP50 som beskrevet nedenfor. Inaktivert E coli OP50 brukes til å minimere metabolske aktiviteten E. coli 6 , 16.

2. Utarbeidelse av inaktivert E. coli OP50 feed C. elegans under the toksisitet Test

  1. forberede 500 mL dobbel gjær tryptone (DYT) medium som beskrevet i tabell 1 og vaksinere en enkelt koloni av E. coli OP50 kultivert på en Luria-Bertani (LB) agar plate 5.
  2. Ruge E. coli OP50 i en risting inkubator 14 h 37 ° C og 150 rpm.
  3. Etter sentrifugering i 30 min på 3,220 x g og 20 ° C, fjerne alle supernatant DYT medium, og Legg en pre blanding av 25 mL av S-buffer, 250 µL av 1 M MgSO 4 og 25 µL av 5 mg/mL kolesterol (oppløst i etanol). Alle disse løsningene er sterile.
  4. Resuspend bakterier og overføre dem til en 50-mL disponibel plastrør.
  5. For varme-inaktivering, ruge den resuspended E. coli OP50 i et vannbad i 30 min på 65 ° C.
  6. Kul til romtemperatur og butikk på 4 ° C før bruk. Dette kan lagres i opptil én måneds.

3. Utarbeidelse av NGM plater som inneholder enten 1% DMSO eller 750 µM Etoposide

  1. forberede to rene 200 mL glassflasker. Legge til 0,6 g NaCl, 0,5 g pepton 3.4 g agar, og 195 mL destillert vann og en magnetisk rørestang i en flaske. Legge til en magnetisk rørestang andre tomme flasken.
  2. Autoclave disse to flasker i 15 min 121 ° C, og deretter avkjøles flasker i et vannbad i 30 min på 55 ° C.
  3. 0,2 mL 1 M CaCl 2, 0,2 mL 5 mg/mL kolesterol, 0,2 mL 1 M MgSO 4 og 5 mL 1 M KPO 4 (alle disse løsningene er sterilt) og bland dem av magnetiske stirring på en varm plate på 55 ° C.
  4. Del blandet NGM mediet i to flasker med samme volum (100 mL hver). Deretter legge til 1 mL av DMSO en flaske, bland det med magnetiske omrøring. Lagre andre flasken i et vannbad ved 55 ° C før neste trinn. Aliquot 3 mL DMSO inneholder mediet til hver 35 x 10 mm 2 Petriskål. Ca 33 DMSO inneholder NGM plater kan gjøres fra dette trinnet.
  5. Blande andre flasken bruker magnetisk omrøring, Legg 1 mL av 75 mM etoposide (stock oppløst i DMSO), bland igjen, og gjenta aliquot (trinn 3.4). Ca 33 etoposide (750 µM)-inneholder NGM plater kan gjøres fra dette trinnet.
    Merk: I korrelert forrige papir 6, vi testet 0, 250, 500 og 1000 µM av etoposide. Basert på disse dataene, vi valgte den 750 µM av etoposide dose i denne utredningen.
  6. Cool ned kjemiske inneholder NGM platene til romtemperatur ved å la dem ved romtemperatur for ca 3 timer, og lagre dem på 4 ° C før bruk.
    Merk: I lys-sensitive kjemikalier, blokkere lyset å minimere lys-indusert nedbryting.
    Merk: Kontroller eventuelt en normal NGM plate uten kjemikalier for egglegging analysen, som utføres med to forskjellige kjemiske rengjøringsmidler betingelser som beskrevet under.
  7. Legge til 100 µL av inaktivert E. coli OP50 (som beskrevet i Seksjon 2) og spredt på hver NGM plate. La tørr overnatting i en C. elegans inkubator ved 20 ° C for kjemisk test

4. Måling av C. elegans vekst

  1. overføring av alder-synkroniserte C. elegans egg til NGM plate med 1% DMSO eller 750 µM etoposide.
  2. Incubate C. elegans i en inkubator ved 20 ° C for 4 dager. Observere ormer bruke stereo mikroskop, og ta mikroskopiske bilder hver dag. Vanligvis er 20 X forstørrelse (1 X linsen, 2 X zoom forstørrelse og 10 X okularet linsen) egnet for vekst observasjon C. elegans. Også ta en mikroskopisk bilde av mikroskopet scenen mikrometer for ormen størrelse kalibrering.
    Merk: Sult påvirker toksisitet testen. Derfor feed med tilstrekkelig bakterier eller justere den overførte C. elegans egg tall i begynnelsen. Observere inntil 3 dager å utelukke muligheten for sult.
  3. Måle hvor kroppen C. elegans behandlet med DMSO eller etoposide på hver tidspunkt ImageJ programmvre.
    Merk: For hver eksempel måling 50 ormer er tilstrekkelig for den statistiske analysen.
    1. I ImageJ, åpne mikroskop scenen mikrometer bildet (' fil ' → ' åpne ').
      Merk: Mikrometer bildet og ormen bilder (trinn 4.2) må være den samme forstørrelsen.
    2. Dra en linje av 1000 µm mikrometer kalibrering bildet ved hjelp av ' lineær ' verktøyet.
    3. Klikk ' analyser ' → ' satt skala ' og 1000 og µm i den ' kjent avstand ' boksen og ' måleenhet ' boks, henholdsvis. Sjekk ' Global ' og klikk ' OK '.
    4. Åpne ormen (' fil ' → ' åpen '). Tegner en linje langs funksjonen hver orm ved hjelp av ' frihåndslinje ' verktøyet. Få kropp lengde dataene ved å klikke ' analyser ' → ' mål '.
    5. Gjenta for 50 ormer.

5. C. elegans Egg legging analysen

  1. Incubate alder-synkroniserte egg på NGM plate med DMSO eller etoposide 64 h (før første fødsel) til ung voksen scenen på 20 ° C.
    Merk: Det er valgfritt å bruke ormer fra måling Vekstforsøk. Det er praktisk å gjøre vekst måling og egg legging analysen sammen.
  2. Overføre 5 voksne ormene til den nye NGM plater uten kjemikalier (betingelse 1, kjemisk behandling innen en viss tid, fra egg til unge voksne stadiet) eller nye NGM plate inneholder den samme kjemisk forbehandling (betingelse 2, kontinuerlig eksponering av kjemikalier gjennom samlet eksperimentelle perioden), og deretter Inkuber dem for 24 h.
    Merk: Det anbefales å gjøre gjentak med 3-5 NGM plater for hver behandling; disse gjentak kan brukes til statistikkanalyse.
  3. Overføre til den nye NGM-platen som beskrevet ovenfor, og teller hvor mange egg hver dag. Telle ormene som kravlesøkes av døde og ble internt LukeEd.
  4. Gjenta disse trinnene til ormer lå ikke mer egg, vanligvis i 5 dager.
  5. Beregne antall egg lagt per ormen fra hver plate, og summere disse verdiene hver dag i 5 dager til å bestemme antall egg lagt.
    Merk: Ekskludere antall ormer som kravlesøkes av og internt klekket fra beregningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Behandling av etoposide (24-96 h) tilbakestående betydelig vekst C.elegans. Etter 96 h med inkubering vokste etoposide-behandlet ormer 0,86 mm i kroppens lengde, mens bilen-behandlet ormer vokste 1.04 mm (figur 1). Vekst retardasjon var også tydeligvis observert under stereo mikroskop observasjon (figur 2). Vi begynte å se egg fra bilen-behandlet ormer på 72 h med inkubering. På den annen side, ble egg observert etter 96 h etoposide behandling. Fra disse dataene spekulerte vi at etoposide behandling forsinket første fødselen gang C.elegans.

I tillegg til forsinkelsen av egglegging, redusert etoposide behandling betydelig antall egg lagt per ormen (Figur 3). Reproduktivtoksisitetsstudier, reduksjon av totale egg nummer av etoposide behandling, ble observert når ung voksen ormer ble dyrket i tilstedeværelse (figur 3B) eller fravær (figur 3A) kontinuerlig etoposide behandling. Det var ingen vesentlig forskjell mellom ormene kontroll-behandlet under både eksperimentelle forhold. Totalt antall egg fra ormer behandlet for en viss tid (fra egg til ung voksen scenen) var ikke signifikant forskjellig fra worms kontinuerlig behandlet med etoposide. For denne sammenligningen, var statistisk analyse utført av veis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys flere sammenligning test.

Figure 1
Figur 1: Måling av vekst i C. elegans behandlet med etoposide. Alder-synkroniserte C. elegans egg ble dyrket på NGM plater med DMSO (1%, kjøretøy kontroll) eller etoposide (750 µM) for 24-96 h. Photomicrographs (vist i figur 2) ble tatt hver dag, og hvor kroppen ble målt ved hjelp av ImageJ programvare. Dataene blir uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavviket (SD) (n = 50, 50 ormer per gruppe). p < 0.01, for betydelige forskjeller mellom kjøretøy kontroll og etoposide behandling på hvert tidspunkt. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Stereo mikroskop bilder C. elegans behandlet med etoposide. C. elegans ble behandlet som beskrevet i figur 1 (skala bar = 1 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Totalt antall egg lagt fra C. elegans behandlet med etoposide. Alder-synkroniserte C. elegans egg ble inkubert på NGM plater med DMSO (1%, kjøretøy kontroll) eller etoposide (750 µM) 64 h. Neste, antall egg lagt ble observert i fravær (A) eller tilstedeværelse (B) av kontinuerlig kjemisk behandling for 5 dager. Ormer ble overført hver dag til normal NGM plate (A) eller NGM plate med de samme kjemikaliene: 1% DMSO eller etoposide (750 µM) (B). Antall egg lagt ble talt og delt på totalt antall ormer hver dag for å beregne hvor mange egg lagt per ormen. Alle antall egg per ormen ble summert i 5 dager. Dataene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD fra quadruplicate eksperimenter. p < 0.01, for betydelige forskjeller mellom kjøretøy kontroll og etoposide behandling. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Normal NGM agar media-1000 mL for vedlikehold og egglegging analysen uten kontinuerlig kjemisk behandling
1. Legg 2.5 g pepton, 3 g av NaCl, 17 g agar og 975 mL destillert vann i en glassflaske.
2. autoclave i 15 min på 121 ° C.
3. kjøle ned i et vannbad i 30 min ved 55 ° C, og deretter legge 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol (oppløst i etanol), 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL KPO4.
4. bland med magnetiske omrøring og aliquot i Petri retter (90 x 15 mm retter for vedlikehold, 35 x 10 mm2 retter for egglegging analysen).
5. lagre NGM platene på 4 ° C før bruk.
DYT medier for dyrking av E. coli OP50-500 mL
1. Legg 2.5 g av NaCl, 5 g av gjær ekstra, 8 g pepton og 485 mL destillert vann til en Erlenmeyer kolbe.
2. autoclave i 15 min på 121 ° C.
3. kjøle ned og lagre ved romtemperatur før bruk.
S-buffer-1000 mL
1. Legg 5,85 g NaCl, 6 g KH2PO4, 1 g K2HPO4og 987 mL destillert vann i en glassflaske.
2. Juster pH av løsningen 6.0.
3. autoclave i 15 min på 121 ° C.
4. kjøle ned og lagre ved romtemperatur før bruk.

Tabell 1: Receipes kultur vekst medier og buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen beskrive vi toksisitet evalueringen av kjemikalier i C. elegans, en jord-nematode, med etoposide som et toxicant eksempel. For dette formålet brukte vi to eksperimentelle forhold. I det første settet, C. elegans ble dyrket på etoposide som inneholder plater fra egg til ung voksen scenen og deretter ormene fikk lov til å legge egg på normal NGM plater uten kjemikalier. I andre eksperimentelle sett, ble C. elegans kontinuerlig behandlet med etoposide gjennom hele eksperimentelle perioden. Sammenligning av egg tallene mellom to eksperimentelle forhold, kan vi avgjøre om reproduktivtoksisitetsstudier av testet forbindelser var reversibel eller irreversible. Etoposide betydelig redusert antall egg lagt under både eksperimentelle forhold (Figur 3). Disse dataene underforstått at forbehandling av etoposide under begynnelsen vekst stadium var tilstrekkelig til å indusere skader reproduktive organer, inkludert gonad bakterie celler6; basert på disse dataene, kan vi spekulere at etoposide behandling irreversibelt indusert reproduktivtoksisitetsstudier i C. elegans.

I tillegg til C. elegans eksperimenter beskrevet i denne metoden artikkelen, tester andre toksisitet som levetiden analysen14,15, mikroskopiske observasjon gonad bakterie celler6,17, måling av pharyngeal pumping pris, og bevegelse analyse18,19 kan også brukes for kjemiske giftighet evaluering i C. elegans. In vitro kultivert humane cellelinjer, primær celler, stamceller og 3D-formet kultur er andre mulige alternativer for å vurdere toksisitet av ulike kjemikalier øke begrensning av C. elegans eksperimenter1, 6,20,21.

Selv om det evolutional bevaring av viktige gener i C. elegans, ikke-pattedyr organismen er forskjellig fra mennesker i protein sekvenser, fordøyelseskanal og intestinal systemer, metabolisme, samt det mangler mange gener. Derfor er pattedyr dyreforsøk og kliniske studier nødvendig for fullstendig vurdering av toksisitet av kjemikalier. Men vurderer fordelene med bekvemmeligheten og dyr etiske spørsmål, vil en C. elegans toksisitet testing plattform være en nyttig og praktisk løsning for toksikologiske evaluering av ulike kjemikalier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av Korea Institute of Science and Technology intramural forskning tilskudd (2E27513) og det høy verdiøkende mat teknologi Development Program (IPET) finansiert av Landbruksdepartementet, Food and Rural Affairs (315067-03).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Affymetrix, USA 10906
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Wild type
Cholesterol Sigma, USA C3045
Dimethyl sulfoxide Sigma, USA D2650
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Etoposide Sigma, USA E1383
Image J software (ver 1.4) Natinoal Institute of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Microscope camera Jenopitk, Progress Gryphax, Germany
Peptone Merck, USA 107213
35 × 10 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10035
90 × 15 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10090
Stereo microscope Nikon, Japan SMZ800N
Yeast extract Becton Dickinson, USA 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29, (4), 473-504 (2016).
  2. Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82, (4), 211-236 (2008).
  3. Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. In Press (2017).
  4. Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37, (1), 50-59 (2017).
  5. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
  6. Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32, (6), 1836-1843 (2017).
  7. Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
  8. Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
  9. Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121, (6), 717-724 (2013).
  10. Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
  11. Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13, (11), 1043-1057 (2011).
  12. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
  13. Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15, (4), 451-465 (2012).
  14. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
  15. Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
  16. Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2, (2), 92-102 (2013).
  17. Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
  18. Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
  19. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
  20. Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91, (1), 1-33 (2017).
  21. Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127, (2), 403-411 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics