Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

Chemistry

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Summary

Ein Protokoll für die Synthese, Aufreinigung und Charakterisierung von einer Ruthenium-basierte Inhibitor der mitochondrialen Calciumaufnahme wird vorgestellt. Ein Verfahren zur Bewertung ihrer Wirksamkeit in permeabilized Säugerzellen wird demonstriert.

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Nathan, S. R., Wilson, J. J. Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor. J. Vis. Exp. (128), e56527, doi:10.3791/56527 (2017).

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Abstract

Wir beschreiben die Synthese und Reinigung von eine mitochondriale Kalzium-Aufnahme-Hemmer, [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)]5 +. Die optimierte Synthese dieser Verbindung beginnt ab [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1 M NH4OH in einem geschlossenen Behälter, wodurch eine umweltfreundliche Lösung. Reinigung erfolgt mit Kationenaustausch Chromatographie. Diese Verbindung ist gekennzeichnet und rein sein von IR und UV-Vis Spektroskopie überprüft. Die mitochondriale Kalzium-Aufnahme hemmenden Eigenschaften sind in permeabilized HeLa-Zellen von Fluoreszenz-Spektroskopie bewertet.

Introduction

Mitochondriale Calcium ist ein wichtiger Regulator für eine Reihe von Prozessen, die entscheidend für die normale Zellfunktion, einschließlich Energieerzeugung und Apoptose sind. 1 , 2 , 3 die mitochondriale Kalzium Uniporter (MCU), ein Ion-Transporter-Protein, das auf der inneren mitochondrialen Membran befindet regelt den Zustrom von Calcium-Ionen in die Mitochondrien. 4 , 5 , 6 chemische Inhibitoren der MCU sind wertvolle Werkzeuge für die Fortsetzung der Bemühungen, die Funktion und die zellulären Funktionen dieses Transportprotein und mitochondriale Kalzium zu studieren. Die zusammengesetzten [(HCO2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, gehört der einzige bekannteren selektive Inhibitoren für die MCU mit einem gemeldeten K-d -Wert von 24 µM.7 ,8,9,10 dieser Komplex eine gemeinsame Verunreinigung gefunden in kommerzielle Formulierungen von Ruthenium rot (RuRed), eine Triruthenium di-µ-Oxo ist überbrückt Hexacation der Formel [(NH3) 5 RU (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, die auch als ein Kalzium-Aufnahme-Hemmer verwendet wurde. Obwohl Ru360 im Handel erhältlich ist, ist es sehr kostspielig. Darüber hinaus wird die Synthese und die Isolierung von Ru360 durch schwierige Reinigung Verfahren und mehrdeutige Charakterisierungsmethoden herausgefordert.

Vor kurzem haben wir alternative Verfahren eine Ru360 analog, [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5Zugriff auf berichtet. 11 diese Verbindung hemmt die MCU mit hoher Affinität, ähnlich wie bei Ru360. In diesem Protokoll beschreiben wir unsere effektivsten Synthese dieser Verbindung, die von [Ru (NH3)5Cl] Cl2beginnt. Reinigung des Produkts verwenden stark saure Kationenaustauschermembran Harz ist zusammen mit gemeinsamen Fallstricke für dieses Verfahren detailliert. Wir auch Methoden zur Charakterisierung und Beurteilung der zusammengesetzte Reinheit zu präsentieren und einen einfachen Ansatz, um seine Wirksamkeit zu testen, bei der Blockierung der mitochondrialen Calciumaufnahme abzugrenzen.

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Protocol

Hinweis: konzentrierte Säuren und Basen sind in dieser Synthese verwendet. Verwenden Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung der Reaktion, einschließlich des Einsatzes von technischen Kontrollen (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe.

1. Vorbereitung der [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5

  1. Synthese von [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
    1. auflösen 1,00 g RuCl 3 · n H 2 O (40 % Ru nach Gewicht, 4,1 Mmol) in 5 mL H 2 O. Cool die dunkle braune Lösung auf 0 ° C im Eisbad. 11 mL (0,23 Mol) von 80 % Hydrazin Hydrat Lösung in gewissem Sinne tropfenweise hinzugeben. Die erste Reaktion wird kräftig mit der Evolution Gas, wodurch eine braune Lösung sein. Lassen Sie die resultierende Lösung bei Raumtemperatur für 16 h rühren; die endgültige Lösung werden dunkel rot
      Achtung: Hydrazin ist akut giftig und karzinogen. Darüber hinaus sind wasserfreie Formen von diesem Reagens explosiv. Verwenden Sie geeignete PSA und Rauch Hauben wie immer beim Umgang mit. Nicht konzentrieren, diese Lösungen zu Trockenheit.
    2. Dieser Projektmappe hinzufügen etwa 5-10 mL konzentrierter HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 2. An dieser Stelle werden die Lösung gelb-braune Farbe.
    3. Erhitzen dieser Lösung bei 105 ° C unter ständigem Rühren ca. 1-2 h. Eine gelbliche Lösung wird aus der Lösung ausgefällt. Wenn nicht mehr sichtbare Formen Niederschlag, vom Herd nehmen.
    4. Ermöglichen dem Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen lassen, und dann in ein Eisbad 0 ° C für 10 min. sammeln die gelbliche Lösung durch Vakuumfiltration und waschen mit 5 mL Ethanol und Diethylether.
    5. Lösen sich vollständig auf das Rohprodukt in 15-25 mL heißem Wasser. Chill-10 mL einer konzentrierten HCl-Lösung in einem Filter Kolben indem man sie in ein Eisbad. Filtern Sie die gelbe Lösung in die gekühlte HCl-Lösung Niederschlag eines blass gelbe reinen Feststoffs zu induzieren. Dieser Niederschlag zu filtern und mit 5 mL von 0,5 M HCl, Ethanol und Ether waschen.
    6. Characterize Verbindung mit IR-Spektroskopie. Durch die Identifizierung der Dehnung Frequenzen bei 3226 cm -1, 1604 cm -1 und 1297 cm -1 801 cm -1 Reinheit überprüft. Eine gemeinsame kleine Verunreinigung bei 2069 cm -1 zugewiesen [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
  2. Synthese von [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5
    1. auflösen 100 mg (0,34 Mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 in 50 mL 1 M NH 4 OH in einem 200 mL schwere Wand Runde Talsohle Druckbehälter. Lose den Kolben mit einem Stopfen verschließen und Wärme der Reaktionsmischung bei 75 ° C für 6 h entfernen vom Herd nehmen und rühren bei Raumtemperatur für 4 Tage um eine dunkle grüne Lösung zu erzielen.
      Vorsicht! Heizung eines versiegelten Behälter führt zu einen Druckaufbau. Achten Sie darauf, entsprechenden Druck spülmaschinenfest Glaswaren. Für diese Reaktion dient der Abdichtung des Schiffes zu Verlust von gasförmigen NH 3 zu minimieren. Legen Sie daher den Stopfen lose, um Freisetzung von Überdruck zu ermöglichen.
  3. Reinigung durch Kationenaustausch Chromatographie
    1. In ein 25 mL Becherglas aussetzen 5 g Kationenaustausch Harz (z. B. Dowex 50WX2 200-400 Mesh (H + Form) in 10 mL 0,1 M HCl.
    2. Laden diese Gülle in einer 10 mL-Spalte (10 mm Durchmesser, Höhe 15 cm) mit 50 mL Lösungsmittel Reservoir angebracht. Das Harz mit ca. 20-30 mL 0,1 M HCl zu waschen, bis das Eluat farblos ist.
    3. Rückkehr zum Grün Reaktionslösung in Schritt 1.2.1 isoliert. Diese Projektmappe hinzufügen konzentrierte HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 2, an welcher Stelle die Lösung braun verfärbt.
    4. Laden diese gesäuerte Lösung der Kationenaustausch Harz-Spalte im Schritt 1.3.2 durch pipettieren sie sanft auf das Harz vorbereitet. Lassen Sie das Eluat vollständig entleeren, und laden die Lösung fortsetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gesamte Projektmappe hinzugefügt wurden. Die Oberkante des Harzes wird dunkelbraun/schwarz sein. Das Harz wird in Volumen leicht zurückgehen.
    5. Verwendung Glasperlen, die Abdeckung des Harzes. Dies werden verhindert, dass das Harz gestört zu werden wenn neue Lösungen hinzugefügt werden.
    6. Die Spalte mit 20 mL 1 M HCl eluieren.
    7. Eluieren die Spalte mit einer erhöhten HCl-Konzentration von 1,5 M (≈ 50 mL). Eine gelbe Lösung beginnen, aus der Spalte zu kommen. Die HCl-Konzentration bis zu 2 M zu erhöhen und weiter eluierenden bis das Eluat farblos ist oder ein sehr blasses Grün-Gelb. Einem Gesamtvolumen von 150-200 mL werden für diesen Prozess erforderlich.
    8. Erhöhen die HCl-Konzentration bis 2,5 M (20-50 mL). Das Eluat als Brüche im Reagenzglas zu sammeln. Bis 3 M HCl erhöhen. Das Produkt wird aus der Spalte als eine grün-braune Lösung eluieren. Eine rot-braune Bruch kann auch damit beginnen, kommen aus der Spalte. Da diese Fraktionen rot oxidierte Ruthenium Verunreinigungen sind, nicht mit den grün-braune Brüchen zu bündeln.
  4. Charakterisierung und Prüfung der Reinheit von [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5
    1. Testen aller Fraktionen aus Schritt 1.3.8. durch UV-Vis-Spektroskopie. Um diese Aufgabe auszuführen, fügen Sie 100 µL einer bestimmten Fraktion in 2 mL 3 M NH3 und analysieren von UV-Vis-Spektroskopie. Brüche, enthält reines Produkt haben eine große Absorption-Band bei 360 nm und eine weniger intensive Extinktion bei 600 nm. Extinktion bei 480 oder 533 nm ist bezeichnend für rot oxidierte Ruthenium und Ruthenium rote Verunreinigungen bzw..
    2. Fraktionen enthält reines Produkt bündeln und verdunsten der Lösung für Trockenheit durch rotary verdampfen. Das Produkt wird als grün-braune Feststoff isoliert werden. Die Erträge sind in der Regel in der Größenordnung von 5-15 mg (10-20 % Ausbeute). Single-Kristalle, geeignet für x-ray Diffraction, von der Dampf-Diffusion von Ethanol in wässrigen Lösungen der Verbindung abgerufen werden können.
    3. Zur Überprüfung der Reinheit, analysieren die Verbindung mittels UV-Vis Spektroskopie in einer Lösung von pH 7.4 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Reinheit kann beurteilt werden, indem man das Verhältnis der Intensität der 360 nm und 600 nm Gipfeln. Dieses Verhältnis ist 31 für reine Verbindung. Für unreine Verbindungen wird das Verhältnis kleiner sein.
    4. Analyse die Probe in der Solid-State-durch IR-Spektroskopie. Diagnose-Bänder sind 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 und 815 cm -1. Gemeinsamen Unreinheit Bands sind auf 1762 cm -1 und 1400 cm -1, charakteristisch für NH 4 CL Ruthenium rot erkennen Sie an Bands bei 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 und 800 cm -1.
  5. Bewertung der mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmung durch Fluoreszenz-Spektroskopie
    Vorsicht! Die folgenden Verfahren verwenden Säugerzellen. Arbeiten sollten in entsprechenden Laminar-Flow-Hauben, die zertifiziert sind, biologische Sicherheit Level 2 (BSL2) Forschung durchgeführt werden.
    ​ Hinweis: [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 wird als bezeichnet werden [RU] in diesem Abschnitt
    1. machen gepuffert Glukose-haltigen Kochsalzlösung (BGSS) der Assay-Medien. BGSS ist eine Lösung, bestehend aus 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 5 mM Natrium Succinat, 30 µM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-Tetraacetic Säure (EGTA). Kombinieren Sie alles außer der EGTA, einstellen Sie pH auf 7,4. EGTA hinzufügen und pH-Wert 7,4 nachjustieren. Für 50 mL Assay Medien hinzufügen 0,5 mL 1 mg/mL Glukose.
    2. Kultur HeLa-Zellen in 500 cm 2 Petrischalen in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 ° c verstärken HeLa-Zellen, die durch Aussaat in ein 100 mm Petrischale wachsen Sie in einer Petrischale 500 cm 2. Der gesamte Datenträger in die große Schüssel beträgt 115 mL. Jeder große Schüssel ergibt etwa 18 Millionen Zellen, genug für zwei Fluoreszenz-Spektroskopie-Experimenten.
      1. Die Zellen wachsen bis sie 90-95 erreichen % confluency. Entfernen Sie die Medien, und spülen Sie die Zellen mit 15 mL pH 7.4 PBS. Fügen Sie 15 mL 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) mit PBS-Puffer und inkubieren Sie für 10 Minuten, die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen auf 14 mL Falcon Rundrohre unten
    3. Zellen mit Trypan blau und ein Hemocytometer mit einem inversen Mikroskop zählen, und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Lautstärke der Medien benötigt um 7,5 Millionen Zellen pro 1,8 mL Volumen zu erreichen des Mediums. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 min bei 5310 × g. Dekantieren des Überstandes und fügen Sie das berechnete Volumen der BGSS. Aufschwemmen Sie Zellen sanft.
      1. Für diese Probe bereiten Stammlösungen von 40 mM Digitonin in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 1 mM Calcium Green-5N in H 2 O und 10 mM CaCl 2 in H 2 O. [Ru]-Stammlösungen, in reinem Wasser zubereitet, können reichen von 1-3 mM.
        ​ Hinweis: Calcium Green-5N ist lichtempfindlich. Im Dunkeln lagern und Lichteinfall minimieren.
    4. Setup die Fluorimeter zur Anregung im 506 nm und lesen die Emission bei 532 nm mit der Küvettenhalter kontrolliert bei 37 ° C. Prepare eine Acryl Küvette mit einer Stir Bar oder Rad, 1,8 mL Zellsuspension aus 1.5.2 über 1,8 µL Digitonin Lösung, 3.6 & #181; L-Calcium Green-5N (Lösung) und 9 µL [Ru] (für Stammlösung 1 mM, 5 µM Endkonzentration). Inkubieren Sie Zellen für 15 min in die Fluorimeter.
      1. Lesen die Daten als Anregung/Emission Verhältnis statt der rohen Absorption. Diese Praxis minimiert Fehler mit Schwankungen in der Intensität der Lichtquelle verbunden.
      2. Die erste Probenanalyse in Ermangelung [Ru] die Wirkung des Zusatzes von CaCl 2 auf die Reaktion der Zellen Messen durchführen.
      3. Begin Analyse auf die Fluorimeter mit den Einstellungen in 1.5.4 beschrieben. Warten Sie ca. 2 Minuten um eine stabile Emission Baseline festlegen, und fügen Sie 1,8 µL CaCl 2 (10 µM Endkonzentration). Die Emissionsintensität steigen sofort auf die Zugabe von CaCl 2 und wird dann im Laufe von Minuten vergehen, wie die Kalzium-Ionen die Mitochondrien geben. Warten Sie, bis der Zerfall beendet hat (≈ 5 min). Fügen Sie zusätzliche Kalzium Dunkleosteus an die mitochondriale Kalzium Aufnahme Antwort von Zellen, die nicht mit [Ru] behandelt bestimmen.
    5. In einem anderen Küvette mit 5 µM [Ru], wiederholen Sie den Versuch wie oben beschrieben in 1.5.4.3. Im Beisein der Inhibitor Emissionsintensität erhöhen, aber nicht zerfallen. Diese Feststellung bedeutet mitochondriale Calciumaufnahme blockiert.

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Representative Results

Diese Methode beschreibt, eine Synthese der mitochondrialen Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 ab [Ru (NH3)5Cl] Cl2, eine bekannte ruthenium(III) Ausgangsmaterial. [Ru (NH3)5Cl] CL2 zeichnet sich durch IR-Spektroskopie mit Schwingungs-Modi bei 3200 cm-1, 1608 cm-1und 1298 cm-1798 cm-1 (Abbildung 1). Eine kleine Verunreinigung bei 2069 cm-1 kann [Ru (NH3)5N2] Cl3zugeschrieben werden. Die Reaktion dieser Ru(III) Art mit 1 M NH4OH bietet [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5. Das Voranschreiten dieser Reaktion zeigt sich eine dramatische Veränderung in der Farbe der Lösung von gelb auf grün. Die endgültige Reaktionslösung ist dunkelgrün in der Farbe. Versauerung dieser Lösung mit konzentrierter HCl führt zu einer Farbänderung bis braun; ein Nebenprodukt dieser Neutralisation ist Ammoniumchlorid, die das Endprodukt verunreinigen können, wenn Pflege nicht ausgeübt wird. Reinigung der Verbindung erfolgt über Kationenaustausch Chromatographie mit stark sauren Mesh (H+ Form) Harz. Das Harz wird zuerst mit 0,10 M HCl equilibriert, und die Lösung von [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 wird in der Spalte geladen. Das Ammoniumchlorid Nebenprodukt elutes mit 1 M HCl Waschungen. Ruthenium-haltigen Verbindungen eluieren bei höheren Konzentrationen von HCl. Eine Reihe von gelben Fraktionen, die nicht umgesetztes [Ru (NH3)5Cl] Cl2 Ausgangsmaterial enthalten, kommen aus der Spalte, wenn die HCl-Konzentration beträgt 1,5 M. Das gewünschte Produkt elutes zwischen 2,5 bis 3,0 M HCl und die daraus resultierenden Brüche erscheinen grün, grün-braune Farbe.

Vor der Zusammenlegung der Fraktionen des Produkts, sollte ihre Reinheit überprüft werden. Weil der gewünschte Verbindung einige pH-Abhängigkeit der UV-Vis-Spektrum aufweist, empfiehlt es sich, kleine Aliquote der Fraktionen zu hoch 3 M NH3 Basislösungen um sicherzustellen, dass die spektralen Eigenschaften für alle Fraktionen gleich hinzufügen. Sortenreine Fraktionen sollten nur anzeigen einen intensiven Höhepunkt bei 360 nm und einer schwachen Peak bei 600 nm (Abbildung 2). Gipfel in der Nähe von 480 und 533 nm deuten auf das Vorhandensein von Ruthenium braun und rot, bzw., und eine erhebliche Peak bei 260 nm mit einer Schulter bei 290 nm, bedeutet das Vorhandensein von [Ru (NH3)5Cl] Cl2 Ausgangsmaterial (Abbildung 3 ). Rotierende Verdunstung der sortenreine Fraktionen bietet der gewünschte Verbindung als grün-braune Feststoff.

Die isolierte Verbindung kann weiter von IR und UV-Vis Spektroskopie charakterisiert werden. Die UV-Vis-Spektrum (Abbildung 2) zeigt die 360 nm und 600 nm Absorption Bands wie oben beschrieben. Der vom Aussterben bedroht-Koeffizient für die 600 nm-Band ist 850 M-1cm-1 und für die 360 nm-Band 27000 M-1cm-1. Das Verhältnis von der Intensität der 360 nm Band im Vergleich zu den 600 nm-Band sollte 31 in pH 7.4 PBS, und diese Metrik kann effektiv verwendet werden, um die Reinheit der Verbindung zu messen. IR-Spektrum sollte angezeigt werden, wie in Abbildung 4dargestellt. Die Ru-O-Ru-stretching-Frequenz ist zum Beispiel bei 850 cm-1diagnostische. IR-Spektrum wurde eingesetzt, um die Ru-O-Ru-Strecke zu bestimmen und um sicherzustellen, dass keine Ammoniumchlorid in das Endprodukt vorhanden war. Ammoniumchlorid, eine gemeinsame Verunreinigung hat Schwingungs-Modi 1762 cm-1 (sehr schwach) und 1400 cm-1 (stark), die aus dem IR-Spektrum (Abbildung 5) leicht auszumachen sind. Ruthenium rot ist eine gemeinsame Nebenprodukt der Reaktion und im IR-Spektrum mit Strecken bei 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 und 800 cm-1identifiziert werden kann, obwohl einige Überschneidungen mit dem gewünschten Produkt treten) ( Abbildung 6).

Die Kalzium-Aufnahme-Reaktion in Digitonin-permeabilized HeLa-Zellen ist (Abbildung 7) beobachtet. Die Sternchen zeigen die Zugabe eines CaCl2 Bolus. In der Gegenwart [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] wird Cl5 eine Erhöhung der Emissionsintensität auf Kalzium Ergänzung, aber kein Verfall aufgrund von mitochondrialen Kalzium beobachtet. Aufnahme wird beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1 : Infrarot-Spektren von [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Die Infrarot-Spektren von [Ru (NH3)5Cl] Cl2 mit einer sehr kleinen [Ru (NH3)5N2] Cl3 Unreinheit. Der rote Pfeil zeigt die Verunreinigung bei 2.069 cm-1Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Vertreter UV-Vis-Spektren für reines Material. [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] CL5 UV-Vis Absorption Spektren und nahes Infrarot (kleines Foto) in pH 7.4 PBS aufgenommen. Die vom Aussterben bedroht-Koeffizient für die großen Extinktion bei 360 nm ist 27.000 M-1 cm-1Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : UV-Vis-Spektren der rohen Reaktionsmischung. [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] CL5 UV-Vis Absorption Spektren der rohen Reaktionsmischung vor Reinigung mit PBS-Puffer pH 7.4 getroffen. Die roten Pfeile zeigen häufige Verunreinigungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Repräsentative Infrarot-Spektren für reines Material. Die Infrarot-Spektren von [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5. Die Ru-O-Ru-Strecke ist bei 850 cm-1, die anderen Strecken sind von den NH3 Oszillatoren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5/>
Abbildung 5 : Infrarot-Spektren, die NH4Cl Verunreinigungen enthalten. Die Infrarot-Spektren von [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 mit Ammoniumchlorid Unreinheit. Der rote Pfeil zeigt Ammoniumchlorid bei 1.400 cm-1Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Infrarot-Spektren von kommerziellen Ruthenium rot Das Infrarot-Spektrum [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 (schwarze Spur) und kommerzielle Ruthenium rot (rote Spur). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Repräsentative Kalzium Aufnahme Ergebnisse. Die Fluoreszenz-Erhöhung durch den Zusatz von Calcium zu einem Cocktail aus Digitonin-permeabilized HeLa-Zellen, Calcium Green-5N und [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 in BGSS. Der Rohling enthält keine [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 und Fluoreszenz Rückgang aufgrund Ca2 + Aufnahme in die Mitochondrien zu sehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die mitochondriale Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 kann synthetisiert [Ru (NH3)5Cl] Cl2, ein bekannter ruthenium(III) Ausgangsmaterial, wie in diesem Verfahren beschrieben. Die Synthese von [Ru (NH3)5Cl] Cl2 gelingt leicht mit wenig Schwierigkeiten. Nach dem Rühren RuCl3 für 16 h in Hydrazin Hydrat, der pH-Wert der Lösung sollte auf einen Wert von 2 mit HCl eingestellt werden. Der pH-Wert ist entscheidend für das gewünschte Produkt zu erreichen. Falls gewünscht, kann diese Synthese durch zurückfließt in HBr anstelle von HCl Form [Ru (NH3)5Br] Br2 geändert werden.

Wir beobachten einige Strategien zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte bei der Synthese von mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer zu minimieren. Bemerkenswert ist es entscheidend für den Erfolg dieser Reaktion, die Flasche verschlossen zu halten; Wenn die Flasche geöffnet ist, werden eine Reihe von anderen Nebenprodukten, einschließlich Ruthenium rot (RuRed), in nennenswerten Mengen gebildet. Vermutlich ist gasförmigen Ammoniak aus dem geöffneten Reaktionsgefäß und dieses Ereignis Kompromisse Bildung des gewünschten Produktes verloren. Die Größe des Kolbens und das Volumen der wässrigen Ammoniak sind ebenfalls wichtige Parameter, die nicht wesentlich von den in diesem Protokoll beschriebenen geändert werden sollten wie wir bemerkt haben, dass die Effizienz dieser Reaktion in kleinere Flaschen verringert wird. Diese Methode erhöht nicht drastisch die Ausbeute dieser Verbindung im Vergleich zu den anderen beiden Methoden, die wir zuvor veröffentlicht hatte. Es jedoch weniger Schritte enthalten und ergeben sich weniger Seite Produktbildung, z. B. RuRed. Die geringe Ausbeute kann zurückgeführt werden auf die Anwesenheit einer kleinen Menge von nicht umgesetztes [Ru (NH3)5Cl] Cl2 sowie unbekannte stark aufgeladen Verunreinigungen, die am oberen Rand der Spalte beibehalten werden. Obwohl wir nicht viele zusätzliche Reaktionsbedingungen erforscht haben, ist es möglich, dass Verbesserungen realisiert werden können, indem man die Reaktionszeit und die Reaktionspartner Konzentrationen, um höhere Erträge zu erzielen.

Die Reinigung des [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 ist mühsam und schwierig Teil dieses Protokolls. Eine gut gepackte Säule wird bei der Trennung sehr unterstützen; Laden das Harz als Gülle ist ein effektives Vorgehen, die Spalte zu packen. Es sei darauf hingewiesen, dass mit zunehmender die HCl-Konzentration im Laufe der Spalte Elution das Harz in der Größe schrumpfen wird. Um erfolgreich reines Material zu erhalten, sollte die Rate, mit der die Säurekonzentration erhöht wird, nicht aus dem angegebenen Verfahren abweichen. Das Endprodukt wird eine grün-braune solide sein; eine einfache Lösung wird dunkelgrün aber saure Lösungen werden braun. Wenn eine leuchtende rosa-rot-Lösung beobachtet wird, sind Ruthenium rote Verunreinigungen vorhanden. Die Höhe der RuRed ermittelt werden, mithilfe der vom Aussterben bedroht-Koeffizient (62.000 M-1·cm-1 533 nm). Dieser Reinigungsprozess ist relativ allgemein für starke Kationenaustauschermembran Harz Spalten.

Die mitochondriale Kalzium-Aufnahme-Hemmung kann mit permeabilized HeLa-Zellen, die fluoreszierende Kalzium Sensor Calcium Green-5N und ein Spectrofluorimeter getestet werden. 13 , 14 dieser Test erfordert eine große Menge an Zellen und erfordern daher Verstärkung der Kultur in einem sehr großen 500 cm2 Petrischale. Diese große Kulturflaschen verhindern Zusatzaufgaben mikrobiellen Kontamination zu minimieren, da die exponierten Flächen sehr groß sind. Arbeit sollte in einem Laminar-Flow Kabinett zu Sterilität durchgeführt werden. Die Fluoreszenz-Reaktion von Calcium Green-5N in permeabilized HeLa-Zellen wird durch Fluoreszenz-Spektroskopie überwacht. Die Zugabe von einem externen Bolus von Kalzium in die Küvette löst eine sofortige Erhöhung der Fluoreszenz, die Kalzium-Ionen, die Interaktion mit dem Sensor aus. Im Laufe von mehreren Minuten in Ermangelung eines Inhibitors zerfällt die Intensität durch Aufnahme von diese Calcium-Ionen in den Mitochondrien eine Organelle, die durch den Farbstoff nicht zugegriffen werden kann. Wenn dieser Assay durchgeführt wird im Beisein eines Inhibitors die Zugabe eines Bolus von Calcium-Ionen ergibt sich eine Erhöhung in Emissionsintensität. Der Zerfall durch mitochondriale Calciumaufnahme, ist jedoch nicht vorhanden, überprüfen die mitochondriale Kalzium Aufnahme hemmenden Eigenschaften dieser Verbindung. Dieser Prozess kann als ein Bildschirm "Allgemein" für die Kalzium-Aufnahme-Hemmer verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren auf andere eukaryotischen Zellen von Interesse angewendet werden. Dieser Assay hängt die Permeabilisierung der äußeren Zellmembran so liefert keine Informationen über die zelluläre Aufnahme-Fähigkeit eines Komplexes.

Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll beschreiben die Synthese und Reinigung von ein neuartigen Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer. Diese Verbindung ist von erheblichem Wert für das Studium der Biologie der mitochondrialen Kalzium und seine Rolle in der Physiologie der Säugetier-Zelle. Die relativ einfache Assay mitochondriale Calciumaufnahme zu Testzwecken ist auch für das Screening und Untersuchung von neuen Inhibitoren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben

Acknowledgments

Diese Forschung wurde von der Cornell University unterstützt. Diese Arbeit von der Cornell-Center für Materialien geteilt Forschungseinrichtungen, Gebrauch gemacht, durch das NSF-MRSEC-Programm (Grant DMR-1120296) unterstützt werden. S.R.N. räumt Unterstützung durch eine NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) und Dr. Dave Holowka für die Unterstützung bei der Kalzium-Experimente. Jede Meinung, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen ausgedrückt in diesem Material sind diejenigen der Autoren (s) und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten von der National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruthenium Trichloride hydrate Pressure Chemical 3750
Concentrated hydrochloric acid J.T. Baker 9535
Concentrated ammonium hydroxide Mallinckrodt Chemical Works A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh Alfa Aesar 13945
Calcium Green 5N Invitrogen C3737
Digitonin Aldrich 260746
DMSO Aldrich 471267
EGTA Aldrich E3889
KCl USB 20598
KH2PO4 Aldrich P3786
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
HEPES Fluka 54466
Sodium Succinate Alfa Aesar 33386
EDTA J.T. Baker 8993-01
Glucose Aldrich G5000
200 Round bottom flask ChemGlass CG-1506-14
Glass stopper ChemGlass CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs Custom - similar to Chemglass columns Similar to CG-1203-20
DMEM Corning 10-017-CV
FBS Gibco 10437028
PBS Corning 21-040-CV
Round bottom Falcon tubes Fisher Scientific 14-959-11B 
500 cm2 petri dishes Corning 431110
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Hemacytometer Aldrich Z359629
Acrylic Cuvettes VWR  58017-875
UV-Vis spectrometer Agilent Model Cary 8454 
Spectrofluorimeter SLM Model 8100C
IR spectrometer Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge ALC Model PM140R
Inverted light microscope VWR  89404-462

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References

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797, (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12, (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30, (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115, (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273, (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533, (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56, (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45, (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

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