ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

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Summary

遺伝的コード化ルシフェラーゼは、遺伝子発現の人気のある非侵襲的なレポーターです。ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを使用できます、条件の広い範囲の下で発光細胞から長手記録です。ワニ、概日リズム研究のコンテキストで使用される方法を紹介します。

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Crosby, P., Hoyle, N. P., O'Neill, J. S. Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR). J. Vis. Exp. (130), e56623, doi:10.3791/56623 (2017).

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Abstract

細胞の遺伝子発現のレポーターをルシフェラーゼ ベースは、縦方向の両方の広範な使用とエンドポイントを生物学的活性の試金。概日リズム研究のたとえば、ホタルのルシフェラーゼと時計遺伝子の融合を生じさせる堅牢なリズムで数日間保持細胞生物発光。技術的な制限は、光電子増倍管 (PMT) に関連付けられているまたは発光定量化のため従来の顕微鏡ベースの方法は通常の間にかなり非生理的条件下で細胞や組織が維持されることを要求しています。感度とスループットのトレードオフで録音。ここで、異なる高感度可変ガス ・湿度制御を含む培養条件の広い範囲をサポートする、受け入れる多くのスループットと長期的な生物発光イメージングを可能にする従来の方法の改良を報告します。組織培養プレートと料理。またガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージングこの自動縦ルシフェラーゼ単層細胞またはティッシュ、従来容易に観察することはできません間ルシフェラーゼ発現の空間変動の観測が可能します。メソッド。我々 はワニがルシフェラーゼ活性既存手法と比較した場合の検出の非常に高い柔軟性を実現する方法を強調表示します。

Introduction

ルシフェラーゼ遺伝子の発現と蛋白質の活動の記者としての分子細胞生物学研究の一般的な手法となっています。これはホタルのルシフェラーゼの合成と触媒不活性化の速度が約 24 h の概日サイクルにわたって発生する遺伝子発現の変化をレポートに特に適して概において当てはまります。など、ルシフェラーゼは有機体、菌類、植物、ハエ、哺乳類1,2,34などの広い範囲にわたって概記者として採用されています。

概日遺伝子発現の in vitroの定量化、光電子増倍管 (PMT) は発光信号を記録する通常使用されます。光電子増倍管を用いた測定柔軟性が限られてしかし、通常、あらかじめ決められた版か皿サイズに制限されています。じゃはまたイメージングのルシフェラーゼ発現のばらつきを示すサンプル情報の損失につながることができる光電子増倍管を使用して監視のサンプルから空間情報を収集することが可能ではないです。また、光電子増倍管と関連する電子工学標準細胞文化のインキュベーターの加湿環境にさらされたときに誤動作しやすいが、光電子増倍管を用いた縦ルシフェラーゼ記録は非加湿インキュベーターで常に実行されます。その結果、細胞培養皿の気密性の高い蒸発による水分の損失を防ぐために密封されなければならないし、文化メディアは 3-したがってバッファーする必要があります (Nmorpholino) propanesulfonic 酸 (モップ) または 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) ではなく、生体内で機能し、哺乳類の組織培養で日常的に使用されているシステムをバッファリング CO2/bicarbonate。

これらの制限の結果として光電子増倍管による生物発光の測定は通常細胞、実験間は保持される条件に制約を配置します。我々 が、標準的な CO2/N2 170 L 培養インキュベーター、水・低温電子-乗算の添加により適応したを使用してこれらの問題を克服するために、また可能な実験条件の範囲を拡大するには曇らない光学およびデジタル制御温度やガスの電荷結合素子 (EMCCD) カメラ。これは縦ルシフェラーゼ イメージング ガスの自動化や Temperature-Optimized レコーダー、ワニと呼ばれています。ワニ生物発光イメージング、両方標準的な組織培養プレートの高速イメージングのための大幅に高められた柔軟性を可能 (最大 6 x 96 または 384-ウェル プレート同時に) およびまた標準培養システム、そのような灌流セルとしてマイクロ流体デバイスで栽培。この楽器も両方 CO2 O2分圧と温度可変制御と加湿条件下で発生するイメージングできます。

以下のプロトコルでは、哺乳類の細胞の培養システム (今後 '発光インキュベーター' というワニを使用して発光記録する方法について説明します。しかし、システム生物発光イメージング、また、いくつかの変更は、他の生物学的システムとコンテキストの数でのイメージングに適してこと、注意すべきであります。

Protocol

1. 播種とセルの温度同調

注: このプロトコルが厳格にテスト4PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) の融合蛋白質を表現するプライマリおよび不死化マウス線維芽細胞を使用しています。調整は他の細胞株を用いた実験のために作られる必要があります。

  1. 細胞培養を開始する前に、37 ° C の水浴を暖めるために次を配置: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (pH 7.4)、PBS 0.68 mM エチレンジアミン四酢酸、pH 7.2 (PBS + EDTA)、適切な細胞培養媒体、例えばと補足ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25% トリプシン溶液を添加しました。
  2. トリプシン 1:3 に予め温めておいた PBS + EDTA 溶液で希釈し、風呂の水に戻ります。
  3. 70-90% にあるルシフェラーゼ発現細胞の 125 cm2フラスコを合流。メディアを吸い出しなさい。10 mL に予め温めておいた PBS を追加します。
  4. PBS を吸い出しなさい。2.5 mL に予め温めておいたトリプシン-EDTA を追加し、5 分の 37 ° C の定温器にフラスコを戻ります。
  5. インキュベーターと顕微鏡下でビューからセルを削除します。細胞の大半は、フラスコの底からデタッチが、一度は、次の手順に進みます。ほとんどの細胞がフラスコの底に残っている場合は、ほとんどの細胞が懸濁液になるまでインキュベーターに戻ります。
  6. 標準的な細胞培養液のさらに 7.5 mL をフラスコに追加します。必要に応じて、さらに必要に応じて、細胞の通過のためこの 1 mL を削除します。
  7. 検定とトリパン ブルー色素を使用して残りの細胞密度をカウントします。さらに、そのセルの行の適切な細胞を希釈します。
    注: 以下の実験 PERIOD2::LUC 線維芽細胞は 6 × 103セル/cm2と 1 × 104セル/cm2 96 ウェル プレート 35 mm 料理やチャネルのスライドに播種しました。
  8. 種細胞ティッシュの培養皿または記録に使用するプレートの上に。
    注: 文化健康記録中ウェル間の干渉を低減しながら録音を開始する前に評価することができます、黒の両面クリア底板の使用は推奨します。発光レベルの非常に低いところが燐光性につながることができます注意がいくつかの時間のために保持するバック グラウンド信号を増加してください白い皿/プレートが光検出を最大限に使用ください。
  9. プレートをインキュベーターに戻り、100% 合流点 (約 7 日) に到達する単分子膜を許可します。
    注: 一度合流、接触を阻害する細胞で保守できるまで 3 週間実験前にメディアが定期的に更新される (5-7 日ごと)。
  10. 合流、実験5,6の直前に 72 時間の最低の温度サイクル (32 ° C、37 ° C で 12 h の 12 h) を使用して携帯電話のリズムと同期させる (によってあらかじめプログラムされたサイクリング インキュベーターを使用して、コンピューターに接続されているシリアル rs-232 ポートを介してインキュベーター)。
    メモ: 細胞のリズムの同期に必要な温度サイクル数のセル行の間で異なる場合があります、したがって他の細胞のために最適化する必要があります。フォルスコリンまたはデキサメタゾンを使用して急性の薬理学的刺激は、細胞のリズム78を同期する以前も使用されています。

2. NS21 準備

注: NS21 は培養神経細胞と他の細胞の維持のため血清無添加のサプリメントです。B27 は市販されており概発光録音9中血清代替として使用することができますと呼ばれる同じような補足の絞り込みです。どちらのサプリメントは下記実験技術記録媒体のどちらも使用できます。それがかなり可能とコスト効果的 NS21 を陳のように、社内に10、ここで説明したと。

  1. 開始する前に 1 時間室温で表 1に示すすべてのコンポーネントを平衡します。
  2. 氷の上 50 g 牛アルブミン 324 mL 基礎培地 (例えばneurobasal) を解散します。可能な限り少しの混合物をかき混ぜなさい。
  3. すべての他のコンポーネント、各コンポーネントの後最小攪拌しますが、まだ完全な混合の確保を追加します。開始の 90 分以内のすべてのコンポーネントを解消を目指してください。
  4. 最終混合物の約数と-20 ° c まで必要なストア。凍結融解の繰り返しは避けてください。
    注意: 混合物はこの段階でフィルターにも粘性が滅菌フィルターされますそれをセルに追加する前にメディアで希釈したとき。

3 記録メディアの準備

注: 縦断的生物発光の記録その他の機器を発光インキュベーターの主な利点は、インキュベーターを加湿し、O2 ・ CO2分圧を変化できることのおかげでそれはメディア記録発光条件の広い範囲を使用することが可能-生体内で種類別の細胞によって占められる生理学的なニッチを近づけるより条件を含みます。以下記録メディア ヘイスティングスから適応の定式化について述べる9、私達は日常的に培養線維芽細胞や他の細胞型を使用しました。最初は密閉培養条件 (ガス交換)、なし、2 つ目は、生理学的に関連する条件と 5% CO2加湿条件下で使用する必要があります。他の多くのバリエーションが可能かつ正確なアプリケーションおよび細胞型によって、ことをお勧めします。

  1. 高グルコースの MOPS バッファー メディアの準備
    注: 貯蔵液 (1 L): DMEM パウダー (8.3 g/L)、0.35 mg/mL 炭酸水素ナトリウム, 5 mg/mL ブドウ糖, 0.02 M のモップ、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン。
    1. 8.3 g DMEM 粉 1,000 mL メスシリンダーで 900 mL の純水で溶解する、すべての粒子が溶解するまで 30 分間かき混ぜます。
    2. ペン/連鎖球菌性ソリューション、x 100 の 10 mL グルコース溶液 (100 g/L)、モップ (1 M, pH 7.6) の 20 mL の 50 mL を加え、さらに 10 分間かき混ぜます。
    3. 4.7 mL 7.5% 重炭酸ナトリウム溶液を加え、さらに 5 分間かき混ぜます。
    4. (室温) で 7.6 または HCl/NaOH で 7.4 (37 ° C) メディアの pH を調整します。
    5. 1,000 mL の最終巻を生産する純水を追加します。
    6. 0.22 μ m のフィルターと 4 ° c まで必要なストアを介してろ過滅菌します。
    7. 実験前に原液 10% 血清, 2 mM L-アラニル-L-グルタミン, 2%、NS21 と 1 mM ルシフェリン作業在庫を作るための適切なボリュームを補います。この株式を 0.22 μ m の滅菌フィルターを通過します。
    8. Osmometer を使用してメディアの浸透圧を測定します。
      1. Osmometer をオンにします。
      2. 純水で最初の osmometer を調整します。測定容器の底に 50 μ L の水を追加します。液体に気泡がないことを確認します。プローブを容器をクリップします。'ゼロ' を押して、慎重に最低点に osmometer 腕を下ろします。読み取りが完了してアームの持ち上げおよび容器を除去する前に緑色の '結果' ライトが点灯するまで待ちます。
      3. 300 mOsmol/kg 50 μ L 校正標準を使用して osmometer を調整する手順を繰り返します。アームを下げる前に 'Cal' を押します。
      4. 測定容器と上記のメジャーの下にメディアの 50 μ L を追加することによってサンプルの浸透圧を測定します。Osmometer アームを下げる前に ' サンプル' を押してください。
    9. 350 mOsmol 5 M の NaCl を使用する浸透圧を調整します。
  2. HCO3-低血糖メディア (灌流中) の準備をバッファリング
    注: 貯蔵液 (1 L): DMEM パウダー (8.3 g/L)、重炭酸ナトリウム 3.7 mg/mL、1 mg/mL のブドウ糖、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン。
    1. 8.3 g DMEM 粉 1,000 mL メスシリンダーで 900 mL の純水で溶解する、すべての粒子が溶解するまで 30 分間かき混ぜます。
    2. 50 mL のブドウ糖溶液 (100 g/L)、100 x ペン/連鎖球菌性溶液 10 mL を加え、さらに 10 分間かき混ぜます。
    3. 49.4 mL 7.5% 重炭酸ナトリウム溶液を加え、さらに 5 分間かき混ぜます。
    4. (常温) 7.6 または HCl/NaOH で 7.4 (37 ° C) へのメディアの pH を調整します。
    5. 1,000 mL の最終的なボリュームを与えるため純水を追加します。
    6. 使用するまで 0.22 μ m 滅菌フィルターと 4 ° C でストアを通じてソリューションを渡します。
    7. 実験前に 2% 血清、2 mM L-アラニル-L-グルタミン, 2 %ns21 作業在庫を作るため 1 mM ルシフェリンと原液の適切なボリュームを補います。この株式を 0.22 μ m の滅菌フィルターを通過します。
    8. 測定し、350 mOsmol モップ バッファー メディアに関しては、5 M の NaCl を使用する浸透圧を調整します。

注: ルシフェリン濃度は、細胞タイプおよびコンテキストごとに経験的決定必要があります。詳細については、フィーニー氏を参照してください。11血清と NS21 (または B27 使用される場合) 濃度は、アプリケーションに応じて変えることができます。これらは細胞の生存と添付ファイルを促進するようしかし、我々 は、しない限り、それ以外の場合を見るには経験的にテスト、血清および NS21 (または代替無血清サプリメント) を使用することを助言を行います。連絡すれば細胞の抑制も、交絡、また血清によって促進される増殖を防ぐために記録媒体の血中濃度を下げる必要があります。

4. 記録

  1. 録音を開始する前に暖かい 37 ° C の水浴に (手順 3.1 または実験によって 3.2) から適切なメディア在庫を配置します。
  2. ながら、メディアは、温暖化、生物発光のインキュベーターでカメラを焦点します。
    1. 水不透過性、加熱中性密度フィルターを外し、脇を設定します。
    2. 高レートでビデオを記録するソフトウェアを設定します。クリックして"取得 |集録のセットアップ"。「露出時間」を設定すると、0.2 s と運動サイクル時間を 0.3 秒。EM ゲインがオフになっていることを確認します。
    3. ' 取得設定」ウィンドウを閉じるし、「ビデオを取る」アイコンをクリックします。
    4. 記録される高さで棚の上のアイテムは、ビデオにフォーカスされている明確にまでカメラのレンズを回転させるフォーカシングのシリンダーを使用すると。
    5. ビデオは停止] アイコンをクリックして、ビデオを停止します。
    6. 温水中性密度フィルターのネジ位置に戻します。そう失敗は EM CCD カメラおよび/または凝縮による目的の曇りにダメージになります。
  3. O2CO2、および温度を発光インキュベーターの前面にコントロール パネルを使用して目的の実験条件に設定します。
    注: 場合灌流を行う細胞培養進んでくださいセクション 5 に直接この段階で。
  4. 組織培養の定温器およびメディアから吸引からセルを削除します。予め温めておいた在庫でメディアを交換してください。
  5. 生物発光のインキュベーターを実験中に加湿をしない場合は、皿とプレートで封印ガス不透過性シール。
発光インキュベーターを加湿したい場合は、それ厳密にする必要はありません料理をシール 96 ウェル プレート、少量の蒸発することができますそれ以外の場合、ガス透過性のシールを使用してなどの少量の料理をシールすることが望ましいがまだ、加湿の定温器で発生します。
注: 加湿インキュベーターの基部に水トレイを埋めることで達成されます。
  • 生物発光インキュベーター、すぐインキュベーター ドアと安全なインキュベータ カバーを定位置にフォーム ライト タイトなシールにセルを転送します。
  • アプリケーションに適した記録パラメーターを選択します。
    1. クリックして"取得 |集録のセットアップ"。
    2. [カメラ設定] パネルで設定: '取得モード' '運動';「露出時間」に希望露光時間の秒 (下のメモを参照してください)。1 に「蓄積」「キネティック シリーズ長さ」の取得サイクル数に必要な'運動サイクル時間' イメージング間隔 (これが露光時間よりも大きいことを確認)。'シフト速度' 4.33 µsecs;'得る' 1;利得射撃 ' 希望するレベルの (下のメモを参照)
    3. '自動' パネルの .sif または .tif ファイルの種類を設定します。ファイル名を入力し、保存場所の適切な。
    4. 「スプール」パネルで tiff にファイルの種類を設定します。ファイル名を入力し、保存場所の適切な。集録のセットアップ ウィンドウを閉じます。
  • '取る信号' ボタンをクリックして録音を開始します。
    注: 別の細胞と生物発光のさまざまなレベルを持っている、すべての組織の種類の多数の生物発光インキュベーターを使用ことができます適切な発光信号を収集するために必要な露光時間によって異なります実験。また、収集された信号の大きさを高めるためにイメージングの電子乗算 (EM) ゲインを変化させることが可能です。不明な明るさの新しいアプリケーションは、私達は提案する最初 EM ゲインなし比較的短い露光時間 (約 10 分) と単一画像を撮影し、その後露光時間と EM を調整を得る目的の記録条件まで達した。ほとんどの場合、カメラの最大可能なピクセル強度の 10-20% の平均信号を目指して良いレベルです。一度記録パラメーターの適切なセットに達している、前述のよう、画像の縦の集録を開始します。
  • 5. 灌流培養 (オプション)

    注: 前述の導入で、発光インキュベーターは標準培養システムの撮影に適した。灌流培養システムの開発その最たるものが。

    1. シード単一チャネル上にセルのチャネル深さ 0.6 か 0.8 mm、10 %fbs とペン/連鎖球菌、DMEM のルアーロック コネクタ付きスライド セクション 1 で説明したよう。灌流メディアをように 3.2 の手順で説明します。
    2. 記録、前に内部直径 1 mm (内径) を使用して必要な灌流システムのチューブを準備します。ETFE チューブ内径 1 mm シリコン チューブ、肘、オスとメスのルアー継手、図 2 aに示すように。
      注: 管の長さの大半は ETFE チューブ、シリコン チューブ ルアーロックの付属品は、その後チャンネル スライドにリンクに ETFE チューブを接続するための 2 cm のセクションです。
    3. 滅菌 PBS に続いて、70% エタノールで洗浄チューブを滅菌します。
    4. チャネルのスライドでインキュベーターから培養細胞を削除します。メディアを吸引し、予め温めておいた灌流メディアに置き換えます。
    5. 予め温めておいた灌流メディアで 20 mL の注射器を満たしなさい。
    6. バッファーにチューブを接続 (図 2参照) をスライド セルを含むスライドではなく、チューブと灌流メディア (3-5 mL) を使用してスライドをフラッシュします。
    7. セルを含むスライドを接続し、さらに 1 ml の空気の泡を削除するメディアのシステム全体をフラッシュします。
    8. 生物発光のインキュベーターにシステム全体を転送します。
    9. システムには、メディアで満たされた注射器シリンジに抜かずにチューブからポンプし、ありますように、ポンプを使用してシステム全体を通してメディアのさらに 1 mL をフラッシュ フィットの気泡がありません。
    10. 使用されている注射器のポンプの直径を設定します。
      注: ここで使用される 20 mL 注射器、直径は 19.13 mm です。
    11. 50 μ L/h ポンプの流量を設定し、実行を開始します。
    12. これらが影響をルシフェラーゼ発現細胞膜を通過するとき、スライドまたは録音の開始前にチューブに気泡がないことを確認します。必要に応じて、フラッシュさらにメディアこれを達成するために細胞の間で。
    13. 生物発光インキュベーター扉を閉じて、録音を開始するステップ 4.7 のように続けます。

    6. 記録中に治療

    注: 時々 それ扱うことが望ましい細胞記録、途中薬理学的またはホルモン剤とします。このような場合、細胞が治療中にリセットするから携帯電話の振動を防ぐために注意を払って処理されることが不可欠です。このため、だ特に重要な細胞が一定温度に維持されている、細胞の概日リズム5,6の主要な entraining キュー。

    1. 記録を停止する前に治療のすべてのコンポーネントを準備します。
    2. 37 ° C で化学等温パッドを準備します。
    3. デバイス録音を停止、削除配置し、扱われるため料理等温熱パッドの上。
    4. 前に、と同じ場所に生物発光インキュベーターに必要と戻りとして文化を扱います。
    5. 再録音を開始します。

    7. 分析

    メモ: 発光インキュベーターは、一連の個々 のイメージの形式でデータを生成します。我々 はそれぞれの関心領域 (ROI) の詳細な分析の平均ピクセル強度データをエクスポートし、主にフィジー12を使用してこれらのイメージを管理します。

    1. フィジーで画像のスタックを開きをクリックして明るさとコントラストを調整」の画像 |調整 |明るさ/コントラスト」と画像と発光信号を表示するための適切な範囲内で、スライド バーを調整します。
    2. ROI マネージャーの下で利用可能なを使用して関心のある分野を選択して「分析 |ツール |ROI マネージャー"。
    3. エクスポートをクリックすると、選択した領域の平均信号"ROI マネージャー ||Multimeasure"。
    4. 結果として得られるデータを解析ソフトにコピーします。
    5. フィジーによって提供されるイメージの数のではなく、イメージング、(すなわち、15、30 または 60 分間隔、0.25、0.5、1 h と記載されている) の期間にデータの時間軸を手動で調整します。
      注: さらなる分析今実行できます、期間の決定など。このため、次の式を使用して、非線型回帰分析を実行します。
      Equation
      yは、信号x対応する時間、 mは傾向線のグラデーション、 cはトレンド ラインの y 切片、振幅はトレンド ラインの上の波形のピークの高さ、 kは崩壊定数または減衰率 (その 1/kは半減期)、位相は x の余弦波のシフト、期間は13に発生する完全なサイクルの所要時間。R2値は、適合度を示すインジケーターとして使用されます。 その他の分析方法も可能です。取得の最初の 24 時間は、携帯電話 bioluminesence は、この時間の間に非概、一時的な変更を示すことができると分析から除外すべき。これは、メディアの変更する急性の反応の結果です。

    Representative Results

    この記事では、生物発光イメージング ワニ (発光インキュベーター) を使用して哺乳類セルのためのプロトコルについて説明します。この手法により物理的なセットアップおよび細胞外の条件の柔軟生物発光システムをイメージングするとき。単純な静的培養 (図 1補助ビデオ 1) と灌流培養 (図 2附則のビデオ 2) の両方の方法を説明しますがこのシステムを使用して他の多くのセットアップを描出できた。すべてのデータは、セクション 7 に記載されている方法を使用して定量化されました。

    図 1 aは、生物発光 PER2::LUC 線維芽細胞4を含む 6 x 96 ウェルのプレートからの録音のビデオの例を示します。最も外側の井戸は、細胞を含まない、これらがこの実験のために必要ではなかった。セル録音のため一定の 37 ° C で開催されている前に後 12 h 72 h または (12 h、12 h、72 h 32 ° C で続いて 37 ° c)、コンバースの 37 ° C に 32 ° c、12 時間のいずれかの温度サイクルを受けるという温度差同調してきました。 60 分エクスポー ジャーは、すべての時間を撮影されました。これらの条件の 2 つが図 1 bで定量化しました。

    図 2 aは、灌流培養システムのセットアップの概略を示しています。これは、チューブで接続されている 2 つのチャネルのスライドで構成されています。メディアは、シリンジ ポンプによってセルを介して駆動されます。これらのスライドの最初のガス透過性バブル トラップ (バッファー スライド) として機能し、2 番目のセルが含まれていない生物発光の記録から細胞を含みます。このシステムからビデオを録画代表を図 2 bに示します。15 分のエクスポー ジャーは、15 分毎に撮影されました。標準灌流条件下またはカゼインのキナーゼ阻害剤を概日周期を長くして、培養における時計遺伝子発現リズムの振幅を低減以前示されている PF670462 の存在下での細胞の維持、ここで哺乳類セル14。PER2::LUC 発現に及ぼす影響は期間の定量化 (底板)、図 2に示す標準的な静的な細胞培養条件下での薬物の濃度が同じ細胞に対して図 2 (最上位のパネル) に示すように図 2 Dで表示されます。PF670462 による治療条件の両方のセットの下で PER2::LUC 式に影響を与えることこれから明らかです。ただし、灌流条件のショー期間延長約 3 h (3 発熱量 h) の下で PF670462 で処理した細胞、間薬剤と扱われる静的な条件のセル表示の期間により大幅に期間延長 > 48 h。これは、減衰のコサインが第 7 節で説明するように適合 (余分な二乗和 F テスト直線 p < 0.0001)。興味深いことに、灌流の下で期間延長の大きさは、生体内で14を観察にかなり近いです。

    Figure 1
    図 1: データの例です。6 x 96 で不死化 PER2::LUC の生物発光のビデオ スナップ ショットはよく発光インキュベーターのプレート (A) の例。定量化する井戸は、附則のビデオ 1で黄色で強調されています。(B) A からの発光の定量化逆 PER2 タンパク質発現相を生成する互いに反一過性だった温度サイクル (12 h は、32 ° c; 12 h、37 ° C で) を使用してセルの 3 プレートの 2 セットが噴流床 (n = 6, ± SEM を意味する)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

    Figure 2
    図 2: CK1δ 阻害剤による血液灌流します。(A) 灌流システムの模式図。(B) 例 PER2::LUC から記録生物発光のビデオ スナップ ショットの灌流下のセルします。定量化のサンプル領域が黄色で強調表示されます。(C) PER2::LUC 線維芽細胞灌流の下で、3 μ M CK1 阻害剤 PF670462 と静的条件下での発光の定量化 (n = 3、± SEM を意味する)。生物発光は、最小値と最大値に正規化されています。期間 (双方向分散分析, ホルム Sidak の多重比較検定) の (D) 分析。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。

    コンポーネント 最終的な中濃度 (μ M) 株式 (mg/mL) 400 mL NS21 の
    牛のアルブミン 37 - 50 g
    カタラーゼ 0.01 - 50 mg
    グルタチオン 3.2 - 20 mg
    インスリン 0.6 10 8 mL
    スーパーオキシドジスムターゼ 0.077 - 50 mg
    ホロ トランスフェリン 0.062 - 100 mg
    T3 (triiodo L サイロニン) 0.0026 2 20 Μ L
    L カルニチン 12 - 40 mg
    エタノールアミン 16 液体 (1 g/ml) 20 Μ L
    D-(+)-ガラクトース 83 - 300 mg
    プトレシン 183 - 322 mg
    亜セレン酸ナトリウム 0.083 1 280 Μ
    コルチコステロン 0.058 2 0.2 mL
    リノール酸 3.5 100 0.2 mL
    リノレン酸 3.5 100 0.2 mL
    リポ酸 0.2 4.7 0.2 mL
    プロゲステロン 0.02 3.2 0.04 mL
    レチノール アセテート 0.2 20 0.1 mL
    レチノール、すべてトランス 0.3 10 0.2 mL
    D、L-α-トコフェ ロール 2.3 100 0.2 mL
    D、L-α-トコフェ ロール酢酸 2.1 100 0.2 mL

    表 1: NS21 準備。

    補助ビデオ 1: ウェル プレートの生物発光例ビデオ。生物発光のインキュベーターで 6 x 96 ウェル プレートで不死化 PER2::LUC の生物発光例ビデオ スナップ ショット。定量化する井戸は、黄色で強調表示されます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

    補助ビデオ 2: PER2::LUC から記録生物発光の例ビデオ スナップ ショットの灌流下のセルします。定量化のサンプル領域が黄色で強調表示されます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

    Discussion

    ここで説明されているプロトコルは、哺乳類細胞培養、灌流および静的な条件の下で両方のです。しかし、ワニは簡単に他のモデル システムに適応できます。確かに、それが運動、睡眠とキイロショウジョウバエ暗黒15.の下で維持される周辺遺伝子発現リズムの同時監視するための優れたプラットフォームを提供するために示されて既にいます。ここに記載されている以外のカメラの種類のアプリケーションによっては、適切にする可能性がありますをまた指摘しました。我々 は、適切なフィルターで変更されたバージョンの現在のセットアップされる可能性がありますプリンシパルの蛍光定量を想定します。

    ワニできない可能性があります適切な唯一のアプリケーションは、特に高空間分解能は、哺乳類の脊髄スライスにおける PER2::LUC 発現の時空間組織のイメージングなど、必要です視交叉上核やその他の小さな切片。

    ワニは、これまでの従来の録音技術によって容易に達成されていない実行する多くの実験できます。生物発光の測定に対する現在の方法と比べると、ワニは、細胞培養ディッシュまたは使用できるスライド、外部メディア条件、感度、およびドメインの両方のタイプの柔軟性の向上を提供します。

    これは特に関連して同時に 3 D organoid 文化システムに向けて標準的な 2次元細胞モデルから移動がある場合。など、ワニが多くの幾日および週の条件の広い範囲の下に、生物発光を測定できます適応メソッドを提供すると予想されます。

    Disclosures

    利益相反は存在しません。

    Acknowledgments

    我々 は特にマーク ・ ヘンソン、ジェレミー ・ グラハムとジョアン ・ コレイア、このシステムの開発に協力してくださった、ケアン研究を感謝したいです。我々 もありがとうデイヴィッド ウェールズ語とアクヒレシュ ・ レディ (旧浜松市) のピーター ・ ラスキーと同様、設計段階の間に貴重な議論のための原稿に彼の重要な入力デモ カメラとデビッド ・ ウォンのローンの手配します。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM (1x) + GlutaMAX Gibco 31966-021
    Hyclone FetalClone III Serum GE Healthcare SH30109.03
    Neurobasal medium Thermofisher 21103049 basal medium
    Bovine Serum Albumin Sigma A4919
    Catalase Sigma C40
    Glutathione Sigma G6013
    Insulin Sigma I1882
    Superoxide Dismutase Sigma S5395
    Holo-transferrin Calbiochem 616424
    T3 (triiodo-L-thyronine Sigma T6397
    L-Carnitine Sigma C7518
    Ethanolamine Sigma E9508
    D (+)-Galactose Sigma G0625
    Putrescine Sigma P5780
    Sodium Selenite Sigma S9133
    Corticosterone Sigma C2505
    Linoleic Acid Sigma L1012
    Linolenic Acid Sigma L2376
    Lipoic Acid Sigma T1395
    Progesterone Sigma P8783
    Retinol Acetate Sigma R7882
    Retinol, all trans Sigma 95144
    D,L-alpha-Tocopherol Sigma 95240
    D,L-alpha-Tocopherol acetate Sigma T3001
    Sodium Bicarbonate Solution Sigma S8761-100ML
    GlutaMAX (100x) Gibco 35050-038
    Penicillin-Streptomycin Sigma P4333
    Galaxy 170R incubator  Eppendorf CO17301001
    Luciferin Biosynth L-8220
    D -(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML
    DMEM powder Sigma D5030
    MOPS Sigma PHG0007
    1 mm I.D. silicone tubing  GE Healthcare 19-4692-01
    Elbow luer connector Ibidi 10802
    Male luer fittings Ibidi 10826
    Female luer fittings Ibidi 10825
    µ-slide luer I 0.6 Ibidi 80196
    BD plastipak 20ml syringe Becton Dickinson 300613
    1mm I.D. ETFE tubing GE Healthcare 18-1142-38
    PF670462 Sigma SML0795
    B27 Supplement (50x) ThermoFisher 17504044
    iXon Ultra EMCCD camera Andor iXon 888
    Fiji ImageJ N/A
    Prism 7.0 Graphpad Software N/A
    Trypan blue Sigma T8154
    Deltaphase Isothermal Pad Braintree Scientific 39DP
    Heated neutral density filter  Cairn Research Custom item
    Osmomat 030 Gonotech Discontinued
    300 mOsmol/kg calibration standard Gonotech 30.9.0020
    Measuring vessel Gonotech 30.9.0010
    Focusing cylinder Cairn Research Custom item
    NE-1600 programmable syringe pump Pump Systems inc. NE-1600
    Andor Solis Software Andor N/A

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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