Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Neuroscience

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Summary

Ce protocole met l’accent sur l’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile, qui peut être utilisé pour l’étude de la morphogenèse dendritique.

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Wang, S., Tanzi, R. E., Li, A. Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila. J. Vis. Exp. (143), e57139, doi:10.3791/57139 (2019).

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Abstract

Dendrites sont les projections ramifiées d’un neurone et morphologie dendritique reflète une organisation synaptique au cours du développement du système nerveux. Drosophila larvaire arborisation dendritique neuronale (da) est un modèle idéal pour l’étude de la morphogénèse des dendrites neurales et la fonction des gènes dans le développement du système nerveux. Il existe quatre classes de neurones dopaminergiques. Classe IV est la plus complexe avec une ramification qui couvre presque toute la surface de la paroi corporelle larvaire. Précédemment, nous avons caractérisé l’effet de faire taire les orthologues de drosophile de SOX5 sur la classe de complexité d’arborisation dendritique neuronale IV (NDAC) à l’aide de quatre paramètres : la longueur des dendrites, la superficie de la couverture de la dendrite, le nombre total de branches et la structure de ramification. Ce protocole présente le flux de travail de l’analyse quantitative NDAC, composée de larve dissection, microscopie confocale et procédures d’analyse image à l’aide de logiciels ImageJ. Autre aperçu da développement neuronal et ses mécanismes sous-jacents améliorera la compréhension de la fonction neuronale et fournir des indices sur les causes fondamentales de neurologiques et de troubles du développement neurologique.

Introduction

Les dendrites, qui sont les projections ramifiées d’un neurone, couvrent le champ qui englobe sensoriel et synaptique apports le neurone des autres neurones1,2. Dendrites sont une composante importante de la formation des synapses et jouent un rôle essentiel dans l’intégration des entrées synaptiques, ainsi que la stimulation électrochimique dans un neurone de multiplication. Arborisation dendritique (da) est un processus par lequel les neurones forment de nouveaux arbres dendritiques et des branches pour créer de nouvelles synapses. Le développement et la morphologie des da, comme la densité de la branche et modes de regroupement, résultent de plusieurs étapes des processus biologiques et sont fortement corrélées à la fonction neuronale. Le but du présent protocole est de fournir une méthode d’analyse quantitative de la complexité de ces dendritric neuronale dans Drosophila.

La complexité des dendrites détermine les types synaptiques, la connectivité et apports des neurones de la partenaire. Patrons de ramification et la densité des dendrites sont impliqués dans le traitement des signaux qui convergent sur le champ dendritiques3,4. Dendrites ont la souplesse d’adaptation en développement. Par exemple, signalisation synaptique influe sur l’organisation de la dendrite dans le neurone somatosensoriel pendant la phase de développement et dans le système nerveux mature5. L’établissement de la connectivité neuronale s’appuie sur la morphogenèse et de la maturation des dendrites. Malformation des dendrites est liée à l’altération de la fonction neuronale. Des études ont montré que l’anomalie de la morphogénèse du neurone da pourrait contribuer aux étiologies de plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH) et la maladie de Gehrig / Sclérose latérale amyotrophique (SLA)6,7,8. Modifications synaptiques apparaissent dans les premiers stades de l’AD, de concert avec le déclin et l’altération de la fonction de neurone7,8. Toutefois, les détails de comment la pathologie dendrite contribue à la pathogenèse de ces maladies neurodégénératives reste insaisissable.

Le développement des dendrites est réglementé par les gènes qui codent pour un réseau complexe d’organismes de réglementation, comme la famille Wnt de ligands sur des récepteurs de surface cellulaire11,12, facteurs de transcription et protéines9,10 . Neurones dopaminergiques Drosophila consistent en quatre classes (classe I, II, III, IV), de quelle classe IV neurones dopaminergiques ont les patrons de ramification plus complexes et ont été employés comme un puissant système expérimental pour mieux comprendre la morphogenèse13, 14. Au cours de la morphogenèse au début, surexpression ou RNAi silencing des gènes dans les neurones dopaminergiques de classe IV provoquer des changements dans les patrons de ramification et dendrite élagage13. Il est important de développer une méthode pratique pour l’analyse quantitative de l’arborisation dendritique neuronale.

Nous avons déjà montré que faire taire des orthologues de drosophile de SOX5, Sox102F, a conduit à plus courts dendrites des neurones dopaminergiques et de complexité réduite en classe IV de neurones da15. Nous présentons ici la procédure d’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile. Ce protocole, adapté de la méthodologie décrite précédente, fournit une méthode brève pour analyser le développement des neurones sensoriels da. Elle illustre l’image robuste à l’étiquetage et le neurone de da dans le troisième stade larvaire paroi corporelle16,17,18,19. C’est un protocole précieux pour les chercheurs qui souhaitent étudier les NDAC et les différences de développement in vivo.

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Protocol

1. préparation expérimentale

  1. Préparer des réactifs suivants : phosphate de Dulbecco solution saline tamponnée (PBS) ; Triton X-100 ; 0,2 % PBST (PBS + 0,2 % Triton X-100) ; 32 % de paraformaldéhyde (PFA), dilué dans 4 % avant utilisation ; base d’élastomère de silicone et de salaison ; milieu de montage antifade (p. ex., prolonger or) ; et le vernis à ongle.
  2. Préparer le matériel suivant : microscope de dissection, deux tranchants forceps et une paire de ciseaux pour microdissection, un certain nombre de broches pour microdissection, une boîte de pétri pour faire le plat de dissection, les lames de microscope et les lamelles, un microscope confocal et un ordinateur avec ImageJ Fidji logiciel installé.

2. Collection de larves

  1. S’accouplent SAMU-Sox102F-Arni mouches avec SAMU-GFP, ppk-GAL4 ou W1118 mouches de type sauvage, respectivement. La culture vole dans des conditions standards à 25 ° C.
  2. ~ 5-6 jours, recueillir le troisième stade larvaire de l’UAS-Sox102F-Arni / ppk-GAL4, SAMU-GFP ou SAMU-GFP et ppk-GAL4 / + contrôle soigneusement avec une pince de dissection.

3. dissection des larves

Remarque : Toutes les procédures de cette section sont exploités sous un microscope de microdissection. Le grossissement est jusqu'à les enquêteurs. Essayer d’ajuster à l’affichage de la vue optimale. Grossissement X ~ 4-6 est recommandé.

  1. Placez une larve sur un plat de dissection en élastomère de silicone base et une boîte de pétri de culture de tissus.
  2. Épingler le crochet de bouche de larve pour permettre à la face dorsale à relever, et ensuite épingler la queue de la larve. Placer la face dorsale du milieu autant que possible d’exposer la ligne médiane, qui sera le marqueur d’ouvrir.
  3. Ajouter 200 µL de PBS à la larve de maintenir l’humidité du corps.
  4. Faites une coupe avec une paire de ciseaux le long de la ligne dorsale médiane entre les deux trachées, de caudale à rostrale. Faire une petite coupure à chacun des quatre coins du corps de la larve.
  5. Placez une épingle à chacun des quatre coins du corps afin que le corps repose à plat.
  6. Fixer la paroi du corps de la larve dans 4 % PFA pendant 25 min à température ambiante.
  7. Laver dans du PBST pendant 5 min. de répéter deux fois plus.
  8. Enlever les tiges du tissu. Transférer ensuite le tissu sur une lame de verre, couvrir avec le milieu de montage antifade et monter avec une lamelle couvre-objet. Laisser sécher pendant 1 h et sceller les bords avec le vernis à ongle.

4. traitement d’imagerie

Remarque : Les Images ont été prises en utilisant un système de microscope confocal inversé. L’utilisateur peut photographier l’échantillon à l’aide d’un objectif 20 X (recommandé).

  1. Capturer des images de la série Z. Ouvrez la boîte de dialogue « Capture série Z » dans le logiciel de microscope confocal. Déterminer la fourchette pour capturer les images de série Z.
    1. Cliquez sur le bouton « Haut et bas ». Déterminer le haut et le bas du poste et entrez les valeurs à « bas : » et « Top : » boîtes. Définir le « étape » dans « Capture Z-série » la boîte de dialogue comme 0,5 µm. Puis cliquez sur le bouton « Exécuter maintenant » pour acquérir les images de la série Z.
  2. Enregistrer les images obtenues sous forme de fichiers *.tiff ou *.nd2.
  3. Conservez les diapositives dans un support foncé à 4 ° C après l’imagerie.

5. dendrite évaluation

Remarque : Protéine GFP a été co-surexprimé dans les SAMU-GFP et ppk-GAL4 vole dans les neurones dopaminergiques pour l’analyse d’imagerie de fluorescence GFP. La longueur, ramification et la structure des neurones dopaminergiques dans le troisième stade larvaire ont été quantifiées. Paramètres d’analyse comprennent la longueur des dendrites (µm), superficie (µm2), le nombre total de branches et de structure de ramification (%). La figure 1 montre les paramètres de l’analyse en détail.

  1. Longueur des Dendrites
    Remarque : La longueur des dendrites est la somme de tous les dendrites étiqueté à traceurs plugin.
    1. Le programme d’installation et lancez le logiciel20 Fidji ImageJ (https://fiji.sc/). Puis diviser images en canaux séparés, s’il y a plusieurs chaînes d’images.
      Remarque : L’image dans le présent protocole n’est un canal de GFP.
    2. Exécutez « Image | Piles | Projet de Z » pour obtenir une projection de Z ; une nouvelle fenêtre s’affiche avec le nom « Z-projection. » Cliquez sur « intensité max » pour le type de projection et d’organiser les nombres entre tranche de démarrage et arrêt de tranche en fonction sur les préférences individuelles. Cliquez sur « OK ». Une image de Z-projection s’affiche présentant la projection de dendrite clairement.
    3. Tracer les neurites.
      1. Sélectionnez « Plugins | Segmentation | Traceur de Neurites simple » dans la fenêtre de retracer les dendrites. Trouver le soma des neurones et puis cliquez sur un point à une dendrite à partir du corps cellulaire et un autre point à l’extrémité de cette dendrite.
        NOTE : Le programme se connectera les deux points avec une ligne bleue.
      2. Appuyez sur « Y » dans la fenêtre du plug-in si la voie est libre ; le chemin de la dendrite est tracé jusqu'à ce que les points de terminaison de la voie choisie dans les images visibles. Cliquez sur « chemin d’accès complet » sur la même fenêtre de plugin ; le segment est terminé (Figure 2).
        NOTE : Certaines dendrites clos le plus éloigné des points de départ, où la voie a été divisée en segments plus petits. Les segments ont été combinées pour fournir un chemin d’accès complet pour le traceur.
    4. Une fois terminé, un chemin de retour vers un nouveau point où les branches sont. Le nouveau chemin d’accès peut être construit la zone de fenêtre « Tous les chemins » affiche les valeurs de longueur de tous les chemins (Figure 3). Enregistrez le fichier de traçage et continuer avec traces inachevés, comme illustré à la Figure 2.
    5. Exporter les données de longueur de dendrite en cliquant, « fichier | Exporter en *.cvs » dans la fenêtre « Plugin ». Puis résumer toutes les longueurs de chemin et exporter les données vers un logiciel d’analyse/tableau de données. (Figure 3).
  2. Superficie des neurones da
    1. Sélectionnez l’outil dessin à main levée dans la fenêtre « Fidji ImageJ ». Tracer le chemin et ensuite connecter les points de terminaison. Dans le menu « Analyser », sélectionnez « Set mesures | Domaine. » Cliquez sur « mesure » dans le menu « Analyser ». Le résultat s’affiche dans une nouvelle boîte avec la valeur de la zone sélectionnée (Figure 4). Copiez-le dans le logiciel d’analyse de données.
  3. Total nombre de Branches et de Structure de ramification des neurones da
    1. Calculer le nombre total des branches en ouvrant « Analyse », puis « Render | Analyser les chemins Skeletonized » dans la fenêtre du plugin de traçage (Figure 5).
      Remarque : La structure de l’arbre est la somme des niveaux des branches. Le chemin d’accès a été défini entre le corps cellulaire et les conseils de dendrite et un chemin d’accès peut inclure plusieurs branches, tels que les axes principaux sont les dendrites du neurone corps cellulaire. Les axes secondaires sont des branches de la primaire et ainsi de suite avec les axes de tertiaire, quaternaire, quinaire et de. La structure de dendrite ramification est séparée selon les niveaux des branches. Par exemple, le % primaire est le nombre de branches divisées par le nombre total de ramification et ainsi de suite.

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Representative Results

Les dendrites des neurones dopaminergiques ont été marquées par la co-surexprimant GFP (SAMU-GFP ; ppk-GAL4) dans le da soma neuronaux et les arbres dendritiques pour l’analyse d’imagerie de fluorescence GFP. La morphologie des dendrites des neurones da a été photographiée par un microscope confocal inversé (Figure 2).

Les dendrites des neurones dopaminergiques ont été tracés à l’aide de logiciels de Fidji ImageJ. Le fichier a été utilisé pour estimer la longueur de la dendrite (Figure 3). Silence des Sox102F dans les neurones dopaminergiques (N = 21) (SAMU-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4 ; UAS-GFP) conduit à une réduction significative du nombre de dendrites et d’une longueur plus courte de la branche avec une structure plus simple par rapport aux témoins (N = 20) (SAMU-GFP ; ppk-GAL4 / +) dans la troisième larve de stade (Figure 6). Plus précisément, mouches dans lequel Sox102F a été réduit au silence présentaient une réduction de longueur moyenne dendrite à 127 µm, comparativement à 249 µm chez les témoins (p = 0,02), et a une superficie plus petite moyenne arbor 552 476 µm2 par rapport aux 847 571 µm2 dans contrôles (p = 0,04). Par ailleurs, faire taire de Sox102F a permis un plus petit nombre de branches et une structure plus simple branchement de tonnelles avec des branches totales de 17 (17,3 ± 6,7), comparée à 28 (28,4 ± 9.5) chez les témoins (p = 0,04). Student t-tests ont été effectués pour comparer les différences entre les groupes, et a été fixé le niveau de signification à 0,05.

Figure 1
Figure 1 : Schémas des paramètres d’analyse de dendrite du neurone da Drosophila . Panneau (A) est l’image d’origine d’un neurone de da. (B) durée de Dendrite était la moyenne de toutes les longueurs de dendrite dans tous les neurones da mesurée. (C) la surface de la dendrite du neurone da a été définie manuellement par l’outil dessin à main levée ImageJ. (D) ce schéma montre comment compter le nombre total des branches et analyser la structure de ramification d’un neurone de da. 1 : arbre primaire. 2 : arbre secondaire. 3 : arbor tertiaire. 4 : arbre quaternaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Traçage représentatif des dendrites d’un neurone da. Un neurone de da a été photographié avec un système de microscope confocal fluorescence. (A) le premier traçage a été créé avec un point de départ depuis le corps cellulaire et le point final d’une dendrite en utilisant l’outil plugin/segmentation. La ligne bleue (flèche blanche) représente le chemin d’accès défini. Après avoir cliquer sur « Yes » (flèche rouge), la ligne change de couleur du bleu au rouge. (B) en cliquant sur « Terminer le chemin » il apparaîtra violet (C). (A-C) Montre le processus de traçage d’une dendrite unique ; (D) l’image vectorisée complet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Mesure des tracés. L’image de gauche montre comment mesurer les chemins de trace après avoir exécuté le « analyse | Mesurer les chemins ». Exporter les valeurs de longueur de chemin d’accès dans un fichier de feuille de calcul et calculer la somme de la longueur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Un exemple de définition de la surface de la dendrite manuelle. Une image définie a été obtenue à l’aide de l’outil dessin à main levée dans le menu de fenêtre ImageJ (indiqué par la flèche rouge). Définir les mesures en sélectionnant la zone. Exécutez la fonction de « Mesure » pour obtenir la zone affichée dans la zone rouge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Un exemple d’analyse de ramification. Exécutez « Analysis_Render | Analyser les chemins Skeletonized » dans la fenêtre du plugin « Segmentation ». Les chemins rendus et leur nombre ont été obtenus en sélectionnant « afficher tous les chemins | Obtenir le résumé ». Le chemin d’accès a été défini entre le corps cellulaire et les conseils de dendrite et un chemin d’accès peut inclure plusieurs branches ; par exemple, les axes principaux ont été les dendrites du corps cellulaire du neurone ; les axes secondaires étaient des branches de la primaire et ainsi de suite avec les axes de tertiaire, quaternaire, quinaire et de. La structure de dendrite ramification a été séparée selon les niveaux des branches. Par exemple, % primaire était le nombre de branches divisées par le nombre total de ramification et ainsi de suite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Des résultats représentatifs de faire taire des Sox102F dans les neurones dopaminergiques. Silence des Sox102F dans les neurones dopaminergiques (SAMU-Sox102F-RNAi/UAS-GFP ; ppk-GAL4) a conduit à beaucoup réduit la longueur de dendrite et plus courte ramification avec une structure plus simple chez la larve de stade troisième comparée aux témoins. Les différences entre les mouches Sox102F-Arni (SAMU-Sox102F-RNAi/UAS-GFP ; ppk-GAL4, N = 21) et de contrôle (SAMU-GFP ; ppk-GAL4 / +, N = 20) mouches étaient sur (A) dendrite longueur (B) arbor superficie (C) nombre de branches et (D, E ) structure de ramification des neurones da. Test T de Student a été réalisée pour l’analyse statistique. * indique la signification statistique (p < 0,05). Les barres d’erreur sont moyenne ± écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les dendrites qui innervent l’épiderme sont les régions d’entrée des neurones et leurs morphologies déterminent comment est reçue et traitée par des neurones individuels. Morphologie dendritique développement reflète la modulation de gène d’organisation de dendrite. La drosophile da larvaire neurone du système nerveux périphérique est un modèle important pour étudier le développement de la dendrite en raison de : 1) la similitude fonctionnelle avec mammifères11,12; 2) les distinctions de classe quatre fondées sur la dendrite structure11,12; et 3) les facteurs génétiques qui contrôlent la morphogenèse. Dans ce protocole, nous présentons le flux de travail de préparation des larves à l’analyse d’image des neurones dopaminergiques de drosophile . Les méthodes décrivent les quatre paramètres importants pour l’analyse des dendrites en neurones dopaminergiques dans le détail, qui sont la longueur des dendrites, la superficie, le nombre total des branches et la structure de ramification. L’étape critique devait retirer la paroi du corps larve tissus autant que possible d’exposer pleinement les neurones dopaminergiques pour l’imagerie et des analyses. Il pourrait y avoir quelques courts rameaux coupés en raison du nombre limité d’images Z-projection. Comme cette méthode est la mesure relative de la longueur des dendrites en comparaison avec les contrôles, un grand nombre d’images pour chaque groupe de neurones dopaminergiques il faut augmenter les zones de couverture d’images Z-projection.

Neurones dopaminergiques de Drosophila classe IV ont fait l’objet de recherches concernant la dendrite arbor morphologie15,21,22,23. Morphogenèse du développement de l’arbre dendritique pourrait être perturbée par la perte ou le gain de la fonction du gène, démontrant que le développement de neurones da est sensible aux modifications génétiques24. Pour des études génétiques, il est important d’analyser la morphologie avec précision afin de comprendre son impact sur les neurones dopaminergiques. Neurones dopaminergiques de classe IV sont complexes, mais toujours accessible d’imagerie de haute qualité car ils sont situés juste sous la paroi semi-transparente et, presque entièrement dans l’espace à deux dimensions. La fluorescence de GFP dynamique étiquetée neurones dopaminergiques (ppk-GAL4 ; UAS-GFP) fournissent un modèle facilement visualisé afin d’étudier le développement neuronal. La direction du changement de morphologie varie, tonnelles peuvent devenir overbranched ou simplifiés. Ici, nous avons classé ces morphologiques change par quantitative des paramètres, par exemple , la longueur de la dendrite, la superficie, le nombre total des branches et la structure de ramification des neurones dopaminergiques. Les résultats reflètent la réaction dans l’expression Sox102F réglementer le développement neuronal, tel qu’indiqué dans la présente étude.

Notre protocole a été utilisé pour montrer les changements morphologiques des neurones dopaminergiques de classe IV chez les mouches en qui les orthologues de drosophile de SOX5, Sox102F, a été réduite au silence, indiquant un rôle fonctionnel important de SOX5 dans le développement de la dendrite et la morphogenèse. Les protéines Wnt forment une famille de glycoprotéines sécrétées qui ont été impliqués dans la régulation morphogeneis de dendrite. Wnt2 et Wnt7b promouvoir da et complexité neuronale9,10. Dans la signalisation WNT canonique, cette activation est suivie de l’activation de GSK3β, une sérine-thréonine kinase, qui à son tour active β-caténine mediated transcription10,25. Nous avons déjà identifié que silence des SOX5 dans les cellules humaines de neuroblastome SH-SY5Y a entraîné une importante répression de l’activité de signalisation Wnt et régulation de l’expression de plusieurs gènes de Wnt, y compris une surexpression de GSK3β 15. Une expression accrue de GSK3β a été associée à des caractéristiques de poinçon de AD, y compris perte de mémoire et fléaux de β-amyloïde est hyperphosphorylée anormale de tau26. Silencieux d’échappement de SOX5 a augmenté l’expression de β GSK3, qui peut-être indiquer un lien fonctionnel entre SOX5 et GSK3β.

Les neurones dopaminergiques classe IV ont les plupart dendrites très complexes de tous les neurones sensoriels. Dans ce protocole, nous avons développé une méthode pour analyser la complexité de l’arbre et les branches à abstraire les propriétés de da de IV classe neurones chez la drosophile basés sur les logiciels et plugins disponibles conventionnellement. Les images qui ont été empruntés à un microscope confocal ont été analysés, et la plugin segmentation d’un traceur de neurites simple fourni un outil idéal pour retracer la dendrite branches27,28. En outre, cette méthode de quantification permet l’analyse détaillée de la complexité de la dendrite en présentant les rapports de divers niveaux de ramification de la soma de la dendrite plus éloignée. En outre, cette méthode pourrait servir pour analyser les autres classes de neurones dopaminergiques. Par exemple, la classe I neurones dopaminergiques s’étendent des dendrites secondaires d’un côté de la paroi du corps ; classe II a branches bifurquent symétriquement ; et les neurones dopaminergiques de classe III ont plus de complexité de la ramification et les pointes. En résumé, nous avons fourni un protocole d’imagerie et d’analyse des neurones dopaminergiques de classe IV pour les analyses de dendrite neuronale chez la drosophile.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier William A. Eimer pour l’assistance technique d’imagerie. Ce travail a été soutenu par fonds la Cure Alzheimer [à R.E.T], le National Institute of Health [R01AG014713 et R01MH60009 à R.E.T ; R03AR063271 et R15EB019704 à A.L.] et la National Science Foundation [NSF1455613 à A.L.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline(PBS) Gibco Life Sciences 10010-023
TritonX-100 Fisher Scientific 9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA) Electron Microscopy Sciences 15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent Dow Corning Corportation 3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36931
Fingernail polish  CVS 72180
Stereo microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Petri dish Falcon 353001
Forceps Dumont 11255-20
Scissors  Roboz Surgical Instrument Co RS-5611
Insect Pins  Roboz Surgical Instrument Co RS-6082-25
Microscope slides and cover slips Fisher Scientific 15-188-52

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References

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