Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Immunology and Infection

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Summary

Cette communication décrit les méthodes d’isolement et culture des macrophages alvéolaires, des humains et des modèles murins à des fins expérimentales.

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Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

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Abstract

Les macrophages alvéolaires sont des macrophages différenciés en phase terminale, poumon-résident d’origine prénatale. Les macrophages alvéolaires sont uniques dans leur longévité et leur rôle important dans le développement pulmonaire et la fonction, ainsi que leurs réponses pulmonaire localisée à l’infection et l’inflammation. A ce jour, n’existe aucune méthode unifiée pour identification, isolement et manipulation des macrophages alvéolaires chez l’homme et de la souris. Une telle méthode est nécessaire pour les études sur ces cellules immunitaires innées importants dans divers contextes expérimentaux. La méthode décrite ici, qui peut être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire, est une approche simplifiée pour la récolte des macrophages alvéolaires de lavage bronchoalvéolaire ou de tissu pulmonaire et leur maintien in vitro. Parce que les macrophages alvéolaires se produisent principalement comme des cellules adhérentes dans les alvéoles, cette méthode porte sur les déloger avant la récolte et l’identification. Le poumon est un organe très vascularisé, et divers types de cellules d’origine myéloïde et lymphoïde habitent, d’interagissent et sont influencés par le microenvironnement de poumon. En utilisant l’ensemble des marqueurs de surface décrit ici, chercheurs peuvent facilement et de manière univoque distinguer les macrophages alvéolaires d’autres leucocytes et les purifier pour applications en aval. La méthode de culture élaborée dans cet article prend en charge les deux homme et macrophages alvéolaires pour la croissance in vitro de la souris est compatible avec les études cellulaires et moléculaires.

Introduction

Le microenvironnement pulmonaire est un écosystème complexe unique avec un conduit d’air élaborée et le système vasculaire. L’air inhalé se déplace à travers la trachée et à travers de nombreuses branches des bronches et des bronchioles avant d’atteindre les alvéoles, où l’échange de gaz du sang-air se produit. En raison d’une interaction directe avec l’atmosphère, la surface respiratoire requiert une protection contre les effets potentiellement nocifs de polluants et de particules en suspension dans. Un certain nombre de barrières physiques, chimiques et immunologiques protéger les poumons. Notamment, le déploiement des phagocytes à la surface respiratoire sert un système de défense de première ligne importante. Les macrophages alvéolaires (AMs) sont un type de phagocytes poumon-résident, et ils représentent la grande majorité de la piscine de macrophages pulmonaires. Comme leur nom l’indique, AMs sont principalement localisés dans la lumière alvéolaire et se produisent comme des cellules sessiles qui constamment goûter l’atmosphère ambiante et de communiquent avec l' épithélium alvéolaire1. Dans les poumons de l’état d’équilibre, plus de 95 % des phagocytes dans l’espace alvéolaire sont AMs2, dont la composition peut changer en raison d’une inflammation, une infection ou une exposition chronique aux polluants.

AMs participent à un large éventail de fonctions qui peuvent être locales vers les poumons et/ou d’importance systémique. Par exemple, AMs sont essentiels dans le développement et le fonctionnement optimal des poumons ; surveillance du système immunitaire ; et l’enlèvement des débris cellulaires, invasion de pathogènes et les particules inhalées3,4,5,6,7. Déplétion ciblée d’AMs est connue pour nuire apurement des virus respiratoires et bactéries4,8. Outre leur rôle de phagocytes et une première ligne de défenseurs de l’homéostasie pulmonaire, AMs sont connus pour fonctionner comme des cellules présentatrices d’antigène en incitant T cell immunité9, potentialiser l’efficacité du vaccin intranasal10 et qui influent sur l’auto-immunité restriction pulmonaire après transplantation de poumon11,12. Carence en fonction de l’AM a été liée à la protéinose alvéolaire pulmonaire (PAP), une condition résultant d’une mutation génétique, une tumeur maligne ou une infection qui altère le dégagement de surfactants pulmonaires13,14. Transplantation d’AMs est maintenant à l’étude comme une approche thérapeutique pour le traitement du PAP 15,16.

AMs sont connus sont créés au cours de l’embryogenèse et persister dans les poumons tout au long de la vie sans être remplacé par circulant leucocytes2,17. Bien que le chiffre d’affaires AM est indétectable dans les poumons homéostatiques, différents niveaux de chiffre d’affaires de AM ont été signalés dans certaines conditions cliniques, y compris l’infection influenza virus4, myéloablatif irradiation18, exposition d’endotoxine 19et20de la vieillesse. AMs sont censés se renouveler par une prolifération de bas grade17,21, mais des études récentes affirment que les monocytes peuvent donner lieu à une population d’intravasculaire pulmonaire macrophages22,23 sous les conditions expérimentales, mais les fonctionnalités de ces macrophages pulmonaires nouvellement convertis doivent encore être définis dans les maladies pulmonaires. En outre, comprendre le seuil de stimulation dans le contexte d’activation AM est un potentiellement intéressant, car le poumon tente de préserver un équilibre entre les signaux inflammatoires et la machinerie immunorégulatrices.

Les altérations physiologiques ou pathologiques qui mènent à la perte de la régulation immunitaire sont importantes pour évaluer dans divers contextes cliniques (p. ex., les infections respiratoires, la pneumopathie inflammatoire et fibreuse de la pneumopathie). Néanmoins, AMs sont plus en plus reconnues comme indicateurs ou même déterminants de la santé pulmonaire11,24. Actuellement, il n’existe aucun protocole unifié pour la récolte, qui caractérisent, et/ou maintien AMs chez l’homme et des modèles murins précliniques. Absence de consensus sur les phénotypes et les précurseurs de l’AM et l’absence d’une méthodologie détaillée avaient été l’obstacle majeur à déchiffrer les rôles d’AM dans la maladie et la santé pulmonaire. Le protocole suivant propose une identification définitive, isolement et in vitro culture stratégie qui sera grandement avancer la compréhension du comportement de l’AM et faciliter les études diagnostiques et thérapeutiques ciblées AM.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) et l’Institutional Review Board (IRB) à St-Joseph hôpital et centre médical.

1. isolement de l’AMs de fluide Murine lavage broncho-alvéolaire (LBA)

  1. Anesthésier une souris C57BL/6 de huit semaines avec la kétamine (87,5 mg/kg de poids corporel) et cocktail par une injection intrapéritonéale de xylazine (12,5 mg/kg de poids corporel). Aller de l’avant lorsque la souris atteint anesthésie chirurgicale avec perte des réflexes et de la relaxation des muscles.
  2. Placez la souris sur une surface de dissection avec la face ventrale vers le haut. Pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour éviter la déshydratation et essuyez toute la surface ventrale de la souris avec des tampons de préparation alcool stérile saturés avec de l’isopropanol 70 % pour désinfecter.
  3. Montez la souris avec les quatre pattes maîtrisés.
  4. Ouvrir délicatement la cavité abdominale avec outils de dissection micro. Il faut pour ouvrir zone aussi bien que possible sans endommager les organes viscéraux ou la création de tissus surplombante.
  5. Ouvrir délicatement la cavité thoracique par incision lentement la cage thoracique dans le médiastin. Idéalement, la cage thoracique peut être excisée du côté à côté. Il faut en extrême ne pas de blesser la plèvre des poumons lors de l’ouverture de la cavité thoracique.
  6. Recherchez la veine cave inférieure et faites une incision à saigner la souris. Tampons de coton hydrophile permet d’absorber du sang.
  7. Injecter 10 mL glacee tamponné phosphate salin (PBS) dans le ventricule droit (à l’aide de la seringue de 10 mL et une aiguille 25G) pour vider les cellules circulantes du sang. Absorber l’écoulement du sang avec des tampons de coton hydrophile. Une fois complètement perfusé, les poumons apparaîtront blanchies et sont alors prêtes pour le lavage.
  8. Doucement fend la peau et des muscles du cou pour exposer les voies respiratoires. L’accise soigneusement les muscles adjacents, les cartilages et les tissus adipeux sans endommager la trachée.
  9. Faire une petite incision (< 2 mm) sur la trachée postérieure au larynx. Cette incision doit être juste assez pour insérer un cathéter en tandis que la trachée est encore attachée au larynx. Insérer un cathéter de 22G 1 pouce sans aiguille dans la trachée vers les poumons. Le cathéter avec une suture tressée en soie (4-0 ; non résorbable) avec un noeud carré.
    Remarque : Le cathéter doit être coupé basé sur la taille de la souris. Cathéters extrêmement courts ou longs ont tendance à fuir ou déchirer les voies aériennes pendant le lavage. Longueur du cathéter doit être telle qu’une fois inséré à fond la pointe reste bien en deçà de la trachée et n’atteignent pas les bronches primaires.
  10. Fixer une seringue de 1 mL remplie avec le tampon de BAL glacé (Ca2 + et Mg2 + gratuit PBS + 1 mM de l’acide éthylènediaminetétraacétique, EDTA) au cathéter et instiller lentement la mémoire tampon dans les poumons. Il se gonfle les poumons. Conserver la seringue jointe au cathéter pendant cinq secondes et puis aspirer le liquide de lavage en tirant doucement sur le piston. Cela se dégonfle les poumons. Recueillir le liquide dans un tube conique de 15 mL, mis dans la glace.
  11. Répétez l’étape 1.10 pour neuf fois plus et le liquide de lavage de piscine. Ne pas dépasser 1 mL de tampon par chasse d’eau, qui peut dépasser la capacité pulmonaire et conduire à sa rupture.
  12. Euthanasier la souris avec CO2 surdosage par protocole IACUC approuvé.
  13. Centrifuger le liquide 10 mL BAL à 250 x g à 4 ° C pendant 10 minutes. Le culot cellulaire contient des cellules de BAL.
    Mise en garde : Le plomb peut être très petit, donc faire preuve de prudence quand aspirer le surnageant.
  14. Remettre en suspension les cellules BAL de 100 μL de tampon (PBS + 2 % chaleur inactivé sérum fœtal (SVF) + EDTA 1 mM + 25 mM acide N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)) de tri/débit.
  15. Bloquer la liaison de l’anticorps non spécifique aux récepteurs Fc par adjonction de ce bloc de souris Fc (cloner 2.4G2, 10 μg/mL) et en incubant pendant 20 minutes sur la glace.
  16. Effectuer des anticorps coloration avec fluorescence moins un (FMO) et single-tache contrôle11,25. Évaluer le BAL des cellules par un analyseur de cellules (voir Table des matières) suivie par analyse en cytométrie en flux d’unicellulaires logiciel d’analyse approprié (voir la Table des matières).
  17. Isoler les AMs par une cellule activée par fluorescence trieuse (voir Table des matières) directement dans la souris 1 mL suis milieu de culture quand AMs sont destinés à la culture in vitro ou in vivo transfert de cellule. Par ailleurs, tri AMs dans le tampon de lyse de 1 mL (voir Table des matières) additionné de 10 μL/mL β-mercaptoéthanol pour extraction de l’ARN.

2. isolement du MAM souris poumon, Suspension monocellulaire

  1. Anesthésier une souris C57BL/6 de huit semaines avec la kétamine (87,5 mg/kg de poids corporel) et cocktail par une injection intrapéritonéale de xylazine (12,5 mg/kg de poids corporel). Aller de l’avant lorsque la souris atteint anesthésie chirurgicale avec perte des réflexes et de la relaxation des muscles.
  2. Placez la souris sur une surface de dissection avec la face ventrale vers le haut. Pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour éviter la déshydratation et essuyez toute la surface ventrale de la souris avec des tampons d’alcool stérile saturés avec de l’isopropanol 70 % pour désinfecter.
  3. Montez la souris avec les quatre pattes maîtrisés.
  4. Ouvrir délicatement la cavité abdominale avec outils de dissection micro. Il faut pour ouvrir zone aussi bien que possible sans endommager les organes viscéraux ou la création de tissus surplombante.
  5. Ouvrir délicatement la cavité thoracique par incision lentement la cage thoracique dans le médiastin. Idéalement, la cage thoracique peut être excisée du côté à côté. Il faut en extrême ne pas de blesser la plèvre des poumons lors de l’ouverture de la cavité thoracique.
  6. Recherchez la veine cave inférieure et faites une incision à saigner la souris. Tampons de coton hydrophile permet d’absorber du sang.
  7. Injecter 10 mL de PBS glacée dans le ventricule droit (à l’aide de la seringue de 10 mL et une aiguille 25G) pour vider les cellules circulantes du sang. Une fois complètement perfusé, les poumons paraîtra blanchies et sont prêtes à être récoltées.
  8. Disséquer les poumons en coupant la trachée, des vaisseaux sanguins et des ligaments dans un tube conique de 15 mL à 5 mL de froid moyen d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Maintenir sur la glace jusqu’au niveau suivant.
  9. Euthanasier la souris avec CO2 surdosage par protocole IACUC approuvé.
  10. Transférer les poumons perfusés dans une boîte de Petri stérile et apyrogène de 60 mm avec 3 mL DMEM. Avec l’aide de pinces de dissection taquiner les voies respiratoires et autre matériel de tissu de poumon non dur, s’il est présent. Émincer le tissu pulmonaire avec un scalpel pour < taille de 1 mm.
  11. Ajouter 300 µg/mL Liberase TL et 5 U/mL DNase I, de la composition de pipetage et incuber à 37° C dans un incubateur pendant 25 minutes. Mélanger doucement une fois en pipettant également, au bout de 10 minutes.
  12. Passer les poumons dissociés à travers un tamis de cellule 100 µm installé sur un tube conique de 50 mL. Utilisez le dos d’un piston de la seringue de 1 mL pour écraser des amas de cellules sur le filtre. Laver le filtre avec 20 mL de tampon de lavage (PBS + 2 % chauffer inactivé FBS + 2 mM EDTA).
  13. Centrifuger à 500 g à 4 ° C pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 20 mL de tampon de lavage.
  14. Répétez les étapes 2.12 et 2.13 deux fois, changer le filtre et le tube chaque fois. Trempage préalable le filtre dans le tampon de lavage pendant plus de cinq minutes augmente le rendement de l’AM. Préparer la suspension monocellulaire en ajoutant 100 μL de tampon pour le culot de flux/tri.
  15. Bloquer la liaison de l’anticorps non spécifique au récepteur Fc en ajoutant souris Fc bloc (cloner 2.4G2, 10 μg/mL) et en incubant pendant 20 minutes sur la glace.
  16. Effectuer des anticorps coloration ainsi que de la FMO et single-tache contrôles11,25. Évaluer le poumon cellules par un analyseur de cellules (voir Table des matières) suivi d’unicellulaires écoulement cytometry analyse par logiciel.
  17. AMs de la sorte par un trieur de cellules (voir Table des matières) directement dans la souris 1 mL suis milieu de culture quand AMs sont destinés à la culture in vitro ou in vivo transfert de cellule. Vous pouvez également trier AMs dans 1 mL de tampon de lyse additionné de 10 μL/mL β-mercaptoéthanol pour extraction de l’ARN.

3. isolement de l’AMs de LBA humaine

  1. Organiser le transfert du fluide humain BAL de la clinique au laboratoire à 4 ° C.
  2. Centrifuger le liquide BAL (10-50 mL) à 250 g à 4 ° C pendant 10 minutes. Le culot cellulaire contient BAL cellules11.
  3. Laver le culot avec 20 mL de tampon de lavage (PBS + 2 % chauffer inactivé FBS + 2 mM EDTA) et centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 minutes.
  4. Remettre les cellules de BAL sont en 100 μL de tampon de flux/tri (PBS + 2 % chauffer inactivé FBS, EDTA 1 mM + 25 mM HEPES).
  5. Bloquer la liaison de l’anticorps non spécifique au récepteur Fc en ajoutant humaine Fc bloc (clone, Fc1.3070, 25 μg/mL) et en incubant pendant 20 minutes sur la glace.
  6. Effectuer des anticorps coloration ainsi que de la FMO et single-tache contrôles11,24. Évaluer la BAL cellules par un analyseur de cellules (voir Table des matières) suivi d’unicellulaires écoulement cytometry analyse par logiciel.
  7. AMs de la sorte par un trieur de cellules (voir Table des matières) directement dans le milieu de culture de 1 mL AM humaine ou tampon de lyse 1 mL additionné de 10 μL/mL β-mercaptoéthanol.

4. in vitro Culture d’AMs

  1. Après le tri cellulaire, récolter les cellules par centrifugation à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
  2. Remettre en suspension AMs humaines dans 1 mL de milieu de culture humaine AM [Roswell Park Memorial Institute moyen FBS (RPMI) 1640 additionné de 10 %, 20 % surnageant (comme source de facteur (M-CSF), concentration finale de 100 U/mL stimulant des colonies de macrophages), de la culture L-929 pyruvate de sodium 1 mM, 10 mM de l’acide N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) et 1 x pénicilline/streptomycine (facultatif)]. De même, resuspendre souris AMs dans 1 mL souris milieu de culture AM [DMEM additionné de 10 % FBS, 20 % L-929 culture surnageante (comme source de M-CSF, concentration finale de 100 U/mL), 1 mM de Pyruvate de Sodium, 10 mM HEPES et 1 x pénicilline/streptomycine (facultatif )].
  3. Énumérer les trypan bleu-à l’exclusion des cellules viables à un compteur de cellules et ajuster la concentration en cellules viables à 1 x 106/ml.
    Remarque : Dans l’idéal, vers le haut à 5 x 105 AMs peuvent être isolés dans LBA prélevé dans une souris mâle de 8 à 10 semaine vieux C57BL/6. Le rendement de l’AM depuis le digest de poumons de souris est variable et peut être légèrement inférieure à celle du fluide souris BAL. Rendement d’AM de LBA humaine dépend du volume de la LBA, le volume total de solution saline utilisée dans le lavage et l’état clinique du patient.
  4. Basé sur le rendement et la nécessité expérimentale, les semences les cellules en chambre diapositives, des récipients de culture ou des flacons de culture. Idéalement, graines de l’AMs à 1 x 105/ml avec 10 mL de milieu dans une fiole de vitroplants T25.
  5. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C humidifié avec une atmosphère 5 % CO2 .
    NOTE : AMs augmentera comme les cellules adhérentes et sont à croissance extrêmement lente (temps de doublement > 7 jours).
  6. 24 heures après l’ensemencement, l’AMs devraient être adhérent et ne sera pas détaché par un doux changement de milieu de culture. Enlever le milieu par aspiration d’un bout et de reconstituer avec un milieu frais préchauffé à 37 ° C.
    Remarque : Les cellules peuvent maintenant servir à évaluer les effets des stimuli ou la physiologie AM. AMs cultivés dans les diapositives de la chambre peuvent être commodément colorées avec les anticorps appropriés et sont idéales pour la visualisation microscopique. Pour l’évaluation de cytométrie en flux, AMs sont récoltées par incubation avec cellule non enzymatique se dissociant de solution.
  7. Aspirer le milieu de culture et ajouter la dissociation solution suffisamment pour couvrir la surface de culture (environ 2 mL par flacon T25) et incuber à 37 ° C pendant 5-10 minutes. Aucun grattage ne sera nécessaire, et il n’est pas recommandé pour gratter les cellules mécaniquement. Tapoter légèrement les côtés, ajouter 1 à 2 mL de tampon de flux/tri et Pipetez doucement de haut en bas pour détacher la majorité des cellules adhérentes.
  8. Pour les études de RNA, lyser les cellules directement sur la boîte de Pétri par adjonction de tampon de lyse.

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Representative Results

L’approche de cytométrie en flux pour identifier les souris AMs est illustré à la Figure 1. Cela comprend l’analyse d’un ensemble minimal de marqueurs de surface nécessaires en distinguant AMs des autres phagocytes poumon-résident ou poumon-infiltrant. Analyse différentielle est nécessaire pour identifier avec certitude l’AMs d’interstitielles macrophages, cellules dendritiques, les neutrophiles, monocytes et macrophages dérivés de monocytes macrophages pulmonaires qui se produisent dans les poumons. Le schéma suivant de marqueurs de surface peut être employé pour distinguer aisément ces types de cellules entre eux où AMs sont CD45+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+, I-Ab +/-, F4/80-, CD11b- ; Macrophages interstitielles sont CD45+, CD11b+, I-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Les cellules dendritiques sont CD45+, CD11b+, CD11c+, I-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Les cellules dendritiques sont CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+, I-Ab +, CD11b-; Cellules plasmacytoides Dendritic sont CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6C+, I-Ab -, neutrophiles sont CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- , I-Ab -, Ly - 6Cet les Monocytes sont CD45+, CD64+/-, Ly - 6C+/-, I-Ab -. Les populations AM surlignées en rouge (CD11cSalut et Siglec-FSalut) et teal (CD11cSalut, Siglec-Fint), respectivement, représentent AMs classiques (population importante) et les macrophages dérivés de monocytes pulmonaires) mineure de la population) qui se produisent dans l’espace alvéolaire. Flux de tri de CD45+, CD11cSalut, Siglec-FSalut cellules rendements souris purifié AMs. La figure 2 illustre les marqueurs de surface de cellules nécessaires pour une identification précise et l’isolement des AMs humaines. La MGS humaine sont formellement identifiée comme étant CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+et CD206+ BAL de cellules et peuvent être trié pour applications en aval de flux.

Figure 1
Figure 1 : Cytométrie représentatif de souris AMs. (A) emplacement anatomique de l’AMs dans une section de tissu de poumon mouse (hématoxyline et éosine). AMs sont indiqués par des flèches et la barre d’échelle est 60 μm. (B) représentant écoulement cytometry gating stratégie pour identifier les souris AMs dans les cellules de BAL. Échantillons ont été évalués par un analyseur de la cellule et données étaient bas échantillonnées à 500 événements pour la comparaison par le logiciel d’analyse. Rouge (CD11cSalut et Siglec-FSalut) et Sarcelles (CD11cSalut, Siglec-Fint), respectivement, sont classiques AMs (population importante) et les macrophages pulmonaires macrophages dérivés de monocytes (population mineure). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Cytométrie représentant des humains AMs. (A) Gating stratégie pour identifier les humains AMs de liquide de BAL d’un bénéficiaire de transplantation de poumon humain. Micrographie de champ lumineux (B) de l’AMs humaines aux sept journées de la culture. La barre d’échelle est 400 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

AMs sont des macrophages pulmonaires-résident de longue durée de vie qui peuplent les poumons commence à la naissance et qui persiste au cours de la durée de vie entière26. Leur rôle dans la physiologie pulmonaire7 et pathologie12 et leur capacité à prédire d’auto-immunité pulmonaire24 ont été reconnus. Parce qu’AMs ont une présence à long terme dans les poumons11,27 et qu’ils sont impliqués dans l’activation et la progression des réponses immunitaires11,24, leurs rôles dans d’autres chroniques pulmonaires inflammatoires et fibreuses maladies doit être évaluée. Historiquement, AMs avaient une identité confuse et étaient souvent mal identifiés. Avec des marqueurs phénotypiques récemment adopté25,28, il est maintenant possible de distinguer les humains et de souris AMs d’autres phagocytes pulmonaires (p. ex., interstitielle macrophages, cellules dendritiques pulmonaires et monocytes dérivée des macrophages pulmonaires). Les méthodes décrites ici ont été optimisés pour l’isolement et pour la culture in vitro de souris et humains AMs. Bien que ces protocoles peuvent être largement adoptés pour l’AMs d’autres espèces, la détermination phénotypique appropriées devrait être menée afin d’établir un ensemble de marqueurs de surface « au minimum requis » pour la caractérisation complète.

Pour l’isolation du murins AMs par lavage, inclusion de chélateur (c.-à-d., EDTA) et pré réfrigération le tampon BAL trouvées semble importante dans la présente étude. Parce que l’AMs sont adhérentes à la paroi alvéolaire, utilisation de PBS seul était inefficace pour déloger les cellules et produit un rendement nettement inférieur. Sécurisation d’installation du cathéter à la trachée est une autre étape critique. Il faut pour assurer une fixation étanche qui minimise la perte de liquide BAL. Redoublez de prudence est nécessaire tout en lavaging une souris plus jeune (< 6 semaines), car la délicatesse structurelle de la trachée peut entraîner des déchirures ou une fuite pendant le lavage. Installer deux sutures consécutives de non-cumul souvent assure une bonne fixation de la sonde et empêche les fuites. Bien que dissociation non enzymatique (i.e., avec un tampon de chélateur complétée) a été seulement effectuée pour l’isolation d’AM dans cette étude, il est possible que la dissociation enzymatique avec la collagénase pendant le lavage du poumon peut produire un meilleur rendement de AM.

Le rendement humain AM de LBA est variable. AMs constituent près de 10 % de toutes les cellules de BAL provenant des receveurs de transplantation de poumon humain à l’Institut thoracique de Norton au cours du suivi systématique pulmonaire après transplantation, et le rendement total de AM dépend de plusieurs variables. Ces variables comprennent l’état clinique du patient, le volume de solution saline utilisée dans le lavage et le volume de liquide BAL traité pour l’isolement de l’AM. Procédures de lavage préalable (par exemple, biopsies à l’aiguille) qui donnent lieu à microhemorrhage modifient la composition cellulaire de cellules de BAL ; Néanmoins, la mise en place de marqueurs phénotypiques permet une détection sans ambiguïté et la caractérisation du bassin humain AM (Figure 2).

Utilisation du milieu conditionné de L-929 (une source de M-CSF) était nécessaire pour le maintien in vitro d’AMs. Nous sommes convaincus que la supplémentation de M-CSF purifiée serait suffisante pour maintenir l’AMs dans la culture ; Toutefois, une concentration optimisée doit être établi pour les deux homme et souris AMs. La boîte de cellules cultivées utilisée pour les études sur l’endocytose, réponse à l’inflammation, présentation des antigènes, statut de maturation/activation ou tout autre essai qui nécessite entretien de cellules vivantes pour une analyse temporelle11,24 . Dans le cadre de cette étude, il ne était pas tenté de maintenir AMs comme une ligne continuellement cultivée et des études de bornes seulement à court terme (< 30 jours depuis la récolte) ont été effectuées. Une limitation évidente à cette méthode est donc manque d’une données de culture à long terme, particulièrement sur la stabilité des cellules (p. ex., si AMs peuvent se développer comme un corps fini ou continue la gamme, la réponse de l’AMs à cryoprotecteurs et cryoconservation, et la dérive phénotypique et génotypique) après la culture en cours. AMs sont longues vie cellules in vivo, et une certaine variation est prévue entre les cellules isolées de poumons en santé et de ceux qui subissent des infections des voies respiratoires ou des réponses inflammatoires/autoimmun.

Dans l’ensemble, la méthode présentée à ici les documents une approche simplifiée pour l’isolation, la caractérisation, entretien humaine et souris AMs dans un système de culture cellulaire. Bien que ce protocole peut être optimalisé issu des différents besoins expérimentaux, elle peut servir de protocole du débutant à disséquer la pertinence fonctionnelle des AMs dans les maladies respiratoires et pneumologie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Nous remercions Clare Prendergast d’assistance avec l’édition du manuscrit. DKN est pris en charge par une recherche concession (#2095) de la Fondation Flinn et TM est pris en charge par des subventions du National Institutes of Health (R01HL056643 et R01HL092514). DKN mis au point des méthodes, destiné à l’étude et a écrit le manuscrit ; OM a aidé avec les études chez l’animal et l’approvisionnement de l’échantillon clinique ; SB a contribué à l’analyse en cytométrie en flux et tri de cellules ; TM a supervisé les études et ont examiné le manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

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References

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