Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Alveoler makrofajlar ölümcül farklılaştırılmış, akciğer yerleşik makrofajlar doğum öncesi kökeni vardır. Alveoler makrofajlar onların uzun ömürlü ve akciğerleri ve işlev yanı sıra onların akciğer lokalize yanıt enfeksiyon ve inflamasyon onların önemli rol içinde benzersizdir. Bugüne kadar tanıma, yalıtım ve alveoler makrofajlar insan ve fare kullanımı birleştirilmiş yöntem bulunmaktadır. Böyle bir yöntem çalışmaları bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üzerinde yapılan çeşitli deneysel ayarları için gereklidir. Alveoler makrofajlar bronchoalveolar lavaj sıvı veya Akciğer doku hasat ve onları içinde vitrokorumak için kolayca herhangi bir laboratuvar tarafından kabul edilebilir, burada açıklanan yöntemi basitleştirilmiş bir yaklaşımdır. Alveoler makrofajlar öncelikle alveoller yapışık hücreleri olarak meydana çünkü bu yöntemin önce hasat ve kimlik kekii üzerinde odaklanmıştır. Akciğer son derece bozukluklarına bir organdır ve çeşitli hücre tiplerinin myeloid ve lenfoid kökenli yaşamak, etkileşim ve akciğer microenvironment tarafından etkilenmiştir. Burada açıklanan yüzey işaretlerinin kümesini kullanarak, araştırmacılar kolayca belirsizliğe yer bırakmadan alveoler makrofajlar diğer lökositler tanımlanması, ayrıştırılması ve onları aşağı akım uygulamalarda arındırmak. Burada geliştirilen kültür yöntemi her iki insan destekler ve alveoler makrofajlar içinde vitro büyüme için fare ve hücresel ve moleküler çalışmalar ile uyumludur.

Introduction

Akciğer microenvironment bir ayrıntılı hava kanalı ve damarlara ile benzersiz olarak karmaşık bir ekosistem var. İnhale hava nefes borusunu delip geçmiş çok sayıda şube bronchioles ve bronşlar kan-hava gaz değişimi oluştuğu alveoller ulaşmadan önce geçecek. Atmosferi ile doğrudan etkileşim nedeniyle solunum yüzey havadaki parçacıklar ve kirleticilerin zararlı etkilerinden koruma gerektirir. Fiziksel, kimyasal ve immünolojik engeller bir takım akciğer korumak. Özellikle, solunum yüzeyde fagositler dağıtımını bir önemli ilk satır savunma sistemi hizmet vermektedir. Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer yerleşik fagositler bir türdür ve akciğer makrofaj havuzu büyük çoğunluğu kadar yapıyorlar. Onların adından da anlaşılacağı gibi AMs öncelikle alveoler Lümen yerelleştirilmiştir ve sürekli ortam atmosfer örnek ve alveoler epitel1ile iletişim kuran sesil hücreler olarak ortaya çikmaktadir. Kararlı duruma akciğerlerde AMs2olan kompozisyon iltihap, enfeksiyon ya da kronik kirleticiler maruz nedeniyle değiştirebilir, alveoler uzayda fagositler % 95'den fazla vardır.

AMs geniş bir akciğerlere yerel olabilir fonksiyonların ve/veya sistemik önemli alanda katılmak. Örneğin, AMs geliştirme ve en uygun akciğerler işleyişi ve gereklidir; immün gözetim; ve hücresel enkaz patojenler ve inhale parçacıklar3,4,5,6,7istila, boşluk. AMs hedeflenen tükenmesi izni solunum virüs ve bakteri4,8zarar olduğu bilinmektedir. Fagositler ve pulmoner homeostazı ilk satır savunucuları olarak onların rol yanı sıra, AMs alabilme T antijen sunan hücreler bağışıklık9, hücre gibi çalışmaya burunici aşı10 etkinliğini potentiating bilinen ve Akciğer tarafından kısıtlanmış otoimmünite akciğer nakli11,12sonra etkileyen. Eksikliği AM işlevindeki pulmoner alveoler proteinosis (PAP), bir genetik mutasyon, malignite veya pulmoner yüzey aktif maddeleri13,14Gümrükleme bozar enfeksiyon kaynaklanan bir durum bağlı. AMs nakli şimdi PAP 15,16tedavisi için bir tedavi yaklaşımı olarak keşfedilmeden.

AMs embriyogenez sırasında kaynaklanan ve hayatı boyunca akciğerlerde lökosit2,17dolaşan tarafından değiştirilen olmadan kalıcı olması için bilinir. AM ciro homeostatik akciğerlerde tespit edilemez olmasına rağmen çeşitli düzeylerde AM ciro enfeksiyon da dahil olmak üzere bazı klinik koşullarda bildirilmiştir grip virüsü4, myeloablative ışınlama18, endotoksin maruz 19ve yaşlılık20. AMs via düşük dereceli nükleer silahların yayılmasına karşı17,21kendini yenilemek inanılıyor, ama bazı yeni çalışmalar monosit intravasküler akciğer makrofajlar22,23 altında bir nüfusa çıkmasına neden olabilir olduğunu iddia Ama bu yeni dönüştürülmüş pulmoner makrofajlar işlevselliğini deneysel koşullar henüz akciğer hastalıklarında tanımlanması gerekir. Ayrıca, AM etkinleştirme içeriğinde uyarıcı eşik anlama akciğer iltihabi sinyalleri ve immunoregulatory makine arasında bir denge korumak çalışır gibi potansiyel olarak ilginç bir alan olduğunu.

Bağışıklık yönetmelik kaybına yol fizyolojik veya patolojik değişiklikler çeşitli klinik ayarları (Örneğin, solunum yolu enfeksiyonları, inflamatuar akciğer hastalığı ve fibrotik akciğer hastalığı) değerlendirmek önemlidir. Yine de, AMs giderek göstergeleri veya hatta akciğer sağlığı11,24belirleyicileri kabul edilmektedir. Şu anda, hasat, karakterize, ve/veya bakımını AMs insanlar ve preklinik fare modelleri için kullanılabilir birleştirilmiş iletişim kuralı vardır. AM öncüleri ve fenotipleri üzerinde bir fikir birliği olmaması ve detaylı bir metodoloji yokluğu AM deşifre rolleri büyük barikat akciğer sağlığı ve hastalıkları olmuştu. Aşağıdaki iletişim kuralı kesin kimlik, yalıtım ve büyük ölçüde AM davranış anlayışı ilerletmek ve tanı ve tedavi edici çalışmalar AM hedefli kolaylaştırmak vitro kültür strateji sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) ve St Joseph's Hastanesi ve Tıp Merkezi, kurumsal inceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır.

1. yalıtım AMs üzerinden fare Bronchoalveolar lavaj (BAL) sıvı

  1. Bir sekiz haftalık C57BL/6 fare ile ketamin (87,5 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (12.5 mg/kg vücut ağırlığı) mayi bir enjeksiyon kokteyl uyuşturan. Cerrahi anestezi Reflekslerin kaybı ve kas gevşeme ile fare attains devam.
  2. Fareyi bir diseksiyon yüzeye ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Oftalmik veteriner merhem gözleri su kaybı önlemek ve dezenfekte için % 70 isopropanol ile doymuş steril alkol hazırlık yastıkları ile fare tüm menfez yüzey silmek için uygulayın.
  3. Fare ölçülü tüm dört ayaklı bağlayın.
  4. Yavaşça karın boşluğu ile mikro diseksiyon Araçlar'ı açın. Herhangi bir visseral organlara zarar verme ya da çıkıntılı doku oluşturma olmadan mümkün olduğu kadar alan açmak için özen göstermelidir.
  5. Yavaşça göğüs boşluğuna yavaş yavaş mediasten aracılığıyla göğüs kafesi incising tarafından açın. İdeal olarak, göğüs kafesinin yan tarafına eksize. Aşırı akciğerler plevra göğüs boşluğuna açılırken değil incitmek özen göstermelidir.
  6. İnferior vena kava bulun ve fare kanamaya bir kesi yapmak. Kan emmek için emici pamuk tamponlarla kullanabilirsiniz.
  7. 10 mL buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) dolaşımdaki kan hücreleri temizlemek için (10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak) sağ ventrikül enjekte. Kan emici pamuklu ped ile akışını emer. Tamamen periosteum sonra akciğerler beyazlatılmış görünür ve sonra lavaj için hazırsınız.
  8. Nazikçe cildi kesip ve hava yolu ortaya çıkarmak için boyun kas. Dikkatle bitişik kaslar, kıkırdak ve yağlı doku nefes borusu zarar vermeden tüketim.
  9. Küçük bir kesi yapmak (< 2 mm) gırtlak için posterior Trakea üzerinde. Bu kesik nefes borusu hâlâ gırtlak için bağlı iken bir kateter içine eklemek yeterli olmalıdır. Trake akciğerlere doğru iğne olmadan 1-inç 22 G kateter takın. İpek örgülü dikiş sondayla güvenli (4-0; absorbe olmayan) bir Meydanı düğüm ile.
    Not: Kateter kesilmiş olabilir fare boyutu temelinde gerekiyor. Son derece kısa veya uzun Kateterler sızıntı ve/veya hava yolu Lavaj sırasında gözyaşı eğilimindedir. Kateter uzunluğu böyle olması gerektiğini iyi nefes borusu içinde o zaman tam olarak ipucu kalır eklenen ve birincil bronşlar ulaşmak değil.
  10. Buz gibi BAL arabelleğe (Ca2 + ve Mg2 + ücretsiz PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit, EDTA) kateter ile dolu bir 1-mL şırınga ekleyin ve yavaş yavaş arabellek akciğerleri aşılamak. Bu akciğerleri şişirmek. Beş saniyeliğine için kateter bağlı şırınga tutmak ve pistonu hafifçe çekerek lavaj sıvı Aspire edin. Bu akciğerler deflate. Buz üzerinde yerleştirilen bir 15 mL konik tüp sıvı toplamak.
  11. Adım 1,10 dokuz kez daha tekrarlayın ve lavaj sıvı havuz. Bu akciğer kapasitesini aşan ve onun kopmalara neden flush, başına 1 mL arabellek fazla olamaz.
  12. Fare ile CO2 doz onaylanan IACUC protokolü tarafından ötenazi.
  13. 10 mL BAL sıvısı 250 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet BAL hücreler içeriyor.
    Uyarı: Pelet olabilir çok küçük, çok süpernatant aspirating zaman dikkatli olun.
  14. Akışı sıralama/arabellek (PBS + % 2 inaktive ısı fetal sığır serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic asit (HEPES)) 100 μL BAL hücrelerinde resuspend.
  15. Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma fare Fc blok ekleyerek engellemek (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) ve 20 dakika boyunca buzda kuluçka.
  16. Floresans eksi bir (FMO) birlikte boyama antikor gerçekleştirmek ve tek-leke11,25denetler. BAL değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından uygun analiz yazılımı tarafından tek hücreli Akış Sitometresi Analizi ile takip ( Tablo malzemelerigörmek) ( Tablo malzemelerigörmek).
  17. AMs izole bir floresan aktif hücre tarafından sıralayıcısı ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL MOUSE'um kültür orta AMs içinde vitro kültür ve in vivo için amaçlanan hücre aktarımı. Alternatif olarak, sıralama 1 mL lizis arabellek AMs ( Tablo malzemelerigörmek) ile 10 μL/mL β-Mercaptoethanol RNA çıkarılması için takıma.

2. fare akciğer, tek hücreli süspansiyon gelen AMs yalıtım

  1. Bir sekiz haftalık C57BL/6 fare ile ketamin (87,5 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (12.5 mg/kg vücut ağırlığı) mayi bir enjeksiyon kokteyl uyuşturan. Cerrahi anestezi Reflekslerin kaybı ve kas gevşeme ile fare attains devam.
  2. Fareyi bir diseksiyon yüzeye ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Oftalmik veteriner merhem gözleri su kaybı önlemek ve dezenfekte için % 70 isopropanol ile doymuş steril alkol yastıkları ile fare tüm menfez yüzey silmek için uygulayın.
  3. Fare ölçülü tüm dört ayaklı bağlayın.
  4. Yavaşça karın boşluğu ile mikro diseksiyon Araçlar'ı açın. Herhangi bir visseral organlara zarar verme ya da çıkıntılı doku oluşturma olmadan mümkün olduğu kadar alan açmak için özen göstermelidir.
  5. Yavaşça göğüs boşluğuna yavaş yavaş mediasten aracılığıyla göğüs kafesi incising tarafından açın. İdeal olarak, göğüs kafesinin yan tarafına eksize. Aşırı akciğerler plevra göğüs boşluğuna açılırken değil incitmek özen göstermelidir.
  6. İnferior vena kava bulun ve fare kanamaya bir kesi yapmak. Kan emmek için emici pamuk tamponlarla kullanabilirsiniz.
  7. 10 mL buz gibi PBS dolaşımdaki kan hücreleri temizlemek için (10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak) sağ ventrikül enjekte. Tamamen periosteum sonra akciğerler beyazlatılmış görünür ve hasat için hazırız.
  8. 5 mL soğuk bir 15 mL konik boru içine nefes borusu, kan damarları ve kasları kesilmesinin tarafından ciğerlerini parçalayıp Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM). Sonraki adım kadar buza korumak.
  9. Fare ile CO2 doz onaylanan IACUC protokolü tarafından ötenazi.
  10. Perfused akciğer 3 mL DMEM ile steril ve pyrogen Ücretsiz 60 mm kültür çanak içine aktarın. Anatomi forseps yardımıyla varsa solunum yolları ve diğer sabit olmayan Akciğer doku malzeme alay. Bir neşter ile Akciğer doku kıyma < 1 mm boyut.
  11. 300 µg/mL Liberase TL ve 5 U/mL ekleyin Dnaz ben, mix pipetting tarafından ve bir kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya 25 dakikadır. Karışımı yavaşça bir kez 10 dakika sonra pipetting.
  12. 50 mL konik tüp üzerinde yüklü bir 100 µm hücre süzgeç Disosiye akciğerlere geçer. Bir dalgıç arkasından 1 mL şırınga mash up hücre kümeleri filtresini kullanın. 20 mL yıkama arabellek filtresiyle yıkayın (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 2 mM EDTA).
  13. Vasıl 500 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet 20 mL yıkama arabellekte resuspend.
  14. 2.12 ve iki kez, 2.13 filtre ve tüp her zaman değişen adımları yineleyin. Beş dakikadan fazla yıkama arabellekte filtre önceden iliklerine kadar AM verim artar. 100 ekleyerek tek hücre süspansiyon hazırlamak akışı sıralama/hücre Pelet arabelleğe μL.
  15. Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma fare Fc blok ekleyerek engellemek (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) ve 20 dakika boyunca buzda kuluçka.
  16. Antikor FMO ve tek-leke denetimleri11,25ile birlikte boyama gerçekleştirmek. Akciğer değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından yazılım tek hücreli Akış Sitometresi Analizi analiz tarafından takip ( Tablo malzemelerigörmek).
  17. Sıralama AMs hücre sıralayıcısı tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL MOUSE'um kültür orta AMs içinde vitro kültür ve in vivo için amaçlanan hücre aktarımı. Alternatif olarak, AMs 1 mL 10 μL/mL β-Mercaptoethanol RNA çıkarılması için ile takıma lizis arabellek içine sıralayın.

3. insan BAL sıvısı üzerinden AMs yalıtım

  1. Klinik laboratuvar 4 ° C'de insan BAL sıvı göndermek
  2. BAL sıvısı (10-50 mL) 250 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet BAL hücreleri11içerir.
  3. Pelet 20 mL yıkama arabelleği ile yıkayın (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 2 mM EDTA) ve santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.
  4. Resuspend BAL hücrelerdir 100 μL akışı/arabellek sıralama (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).
  5. İnsan Fc blok (Klon Fc1.3070, 25 μg/mL) ekleyip 20 dakika boyunca buzda kuluçka Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma engelleyin.
  6. Antikor FMO ve tek-leke denetimleri11,24ile birlikte boyama gerçekleştirmek. BAL değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından yazılım tek hücreli Akış Sitometresi Analizi analiz tarafından takip ( Tablo malzemelerigörmek).
  7. Sıralama AMs hücre sıralayıcısı tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL insan AM kültür orta veya 1 mL lizis arabellek 10 μL/mL β-Mercaptoethanol ile desteklenmiştir.

4. vitro kültür AMs

  1. Hücre sıralama aşağıdaki hücreleri 250 x g 10 dk 4 ° c de centrifuging tarafından hasat.
  2. 1 mL insan AM kültür orta [Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) % 10 ile desteklenmiş 1640 FBS, % 20 L-929 kültür (kaynağı makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF), 100 U/mL nihai toplama olarak), süpernatant insan AMs resuspend 1 mM sodyum pyruvate, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic asit (HEPES) ve 1 x penisilin/streptomisin (isteğe bağlı)]. Benzer şekilde, fare AMs 1 mL fare AM kültür orta [%10 FBS, % 20 L-929 kültür süpernatant (bir kaynak olarak M-CSF, 100 U/mL nihai toplama), 1 mM sodyum Pyruvate, 10 mM HEPES ve 1 x penisilin/streptomisin (isteğe bağlı DMEM resuspend )].
  3. Trypan mavi hariç hücrelerin hücre sayacı tarafından numaralandırmak ve 1 x 106/mL uygun hücre konsantrasyonu ayarlayın.
    Not: İdeal olarak, yukarı 5 x 10 için5 AMs 8-10 hafta eski bir C57BL/6 erkek fare toplanan BAL sıvısı üzerinden ayrılmış olabilir. Fare akciğer Özet dan AM verim değişkendir ve biraz daha az fare BAL sıvısı bundan olabilir. BAL sıvısı, lavaj ve hastanın klinik durumu kullanılan tuz çözeltisi hacmi hacmi AM verim insan BAL sıvısı üzerinden bağlıdır.
  4. Verim ve deneysel gerekliliği üzerinde bağlı olarak, hücre odası slaytlar, kültür yemekleri veya kültür şişeler tohum. İdeal olarak, 1 x 105/mL T25 doku kültürü şişeye 10 mL orta ile AMs tohum.
  5. 37 ° C oksijen kuluçka %5 CO2 atmosfere sahip hücreleri kuluçkaya.
    Not: AMs yapışık hücreleri olarak büyüyecek ve son derece yavaş büyüyen vardır (zaman iki katına > 7 gün).
  6. 24 saat sonrası Ekim tarihi, AMs olmalıdır yapışık ve kültür orta hafif bir değişiklik tarafından müstakil değil. Orta aspirasyon bir ucundan kaldırmak ve 37 ° C'ye önceden sıcak taze orta ile doldurmak
    Not: Hücreleri şimdi AM Fizyoloji veya uyaranlara etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. AMs odası slaytları yetiştirilen uygun uygun antikorlar ile Boyanabilen ve mikroskobik görselleştirme için idealdir. Akış sitometrik değerlendirme için AMs kuluçka tarafından çözüm dissociating enzimatik olmayan hücre ile hasat.
  7. Kültür orta Aspire edin ve kültür yüzey (T25 şişe başına yaklaşık 2 mL) kapak ve 37 ° C'de 5-10 dakika için kuluçkaya dissociating çözüm için yeterince ekleyin. Hiçbir kazıma gerekli olacak ve bu hücreleri mekanik kazımak için tavsiye edilmez. Kenarları hafifçe dokunun, 1-2 mL akışı/arabellek sıralama ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı yapışık hücreleri çoğunluğu ayırmak için pipet.
  8. RNA çalışmaları için kültür çanak üzerinde doğrudan hücre lizis arabelleği ekleyerek parçalayıcı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare AMs tanımlamak için akış sitometrik yaklaşım şekil 1' de gösterilen. Bu yüzey işaretlerinin diğer akciğer yerleşik veya akciğer infiltre fagositler AMs ayrım gerekli en az set analizini içerir. Fark analiz olumlu interstisyel makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller, monosit ve akciğerlerde oluşan monosit kaynaklı akciğer makrofajlar üzerinden AMs tanımlamak için gereklidir. Yüzey işaretlerinin aşağıdaki düzeni bu hücre türleri birbirinden AMs CD45 nerede kolayca ayırt etmek için istihdam edilebilir+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+, ı-A+ / b, F4/80-, CD11b- ; İnterstisyel makrofajlar vardır CD45+, CD11b+, ı-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Dendritik hücrelerdir CD45+, CD11b+, CD11c+, ı-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Dendritik hücrelerdir CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+, ı-Ab +, CD11b-; Plazmasitoid Dendritic hücrelerdir CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+, ı-Ab -, nötrofiller olan CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- , I-Ab -, Ly - 6 C-ve monosit vardır CD45+, CD64+/-, Ly - 6 C+ /ı-Ab -. Kırmızı (CD11cMerhaba ve Siglec-FMerhaba) ve deniz mavisi (CD11cMerhaba, Siglec-Fint), sırasıyla, vurgulanan AM nüfus temsil geleneksel AMs (büyük nüfus) ve pulmoner makrofajlar monosit kaynaklı ( küçük nüfus) alveoler uzayda aklına. CD45 sıralama akışı+, CD11cMerhaba, Siglec-FMerhaba hücreleri verimleri arıtılmış fare AMs. Şekil 2 hücre yüzey işaretleyicileri kesin kimlik ve insan AMs yalıtım için gerekli gösterir. İnsan AMs olumlu CD45 olduğu için tanımlanan+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+ve CD206+ BAL hücreleri ve akış aşağı akım uygulamaları için sıralanmış olabilir.

Figure 1
Resim 1 : Fare AMs temsilcisi akış sitometrik analizinde. (A) bölümünde bir fare Akciğer doku (Hematoksilen Eozin) AMs anatomik konumunu. AMs oklarla gösterilir ve ölçek çubuğu 60 mikron olduğunu. (B) temsilcisi Akış Sitometresi fare AMs BAL hücrelerdeki tanımlamak için strateji geçişi. Örneklerini bir hücre Çözümleyicisi tarafından değerlendirildi ve veri aşağı karşılaştırma için 500 olayları analiz yazılımı tarafından örnek. Kırmızı (CD11cMerhaba ve Siglec-FMerhaba) ve deniz mavisi (CD11cMerhaba, Siglec-Fint), sırasıyla, geleneksel AMs (büyük nüfus) ve pulmoner makrofajlar (küçük nüfus) monosit kaynaklı bulunmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : İnsan AMs temsilcisi akış sitometrik analizinde. (A) bir insan akciğer nakli alıcıdan gelen BAL sıvısı üzerinden insan AMs tanımlamak için strateji geçişi. İnsan AMs kültürünün yedi gün, (B) parlak alan test. Ölçek çubuğu 400 mikron olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AMs doğumda başlayan ve tüm yaşam süresi26üzerinde kalıcı ciğerleri doldurmak uzun yaşam akciğer yerleşik makrofajlar vardır. Pulmoner Fizyoloji7 ve patoloji12 ve pulmoner otoimmünite24 toplam tahmin etmek için potansiyel rolleri kabul edilmiştir. AMs akciğerler11,27 ' uzun vadeli bir durum olduğundan ve harekete geçirmek ve bağışıklık yanıtı11,24, onların rolleri diğer kronik inflamatuar ve fibrotik akciğer ilerlemesini katılan oldukları için hastalıkların değerlendirilmesi gerekir. Tarihsel olarak, AMs karışık bir kimlik vardı ve kez tanımlanmış. Yakın zamanda kabul edilen fenotipik işaretleri25,28ile şimdi insan ayırt etmek ve AMs (Örneğin, interstisyel makrofajlar, pulmoner dendritik hücreler ve monosit diğer akciğer fagositler fare için uygun «««türetilmiş) pulmoner makrofajlar. Yöntem tanımlamak burada fare ve insan AMs vitro kültür ve yalıtım için optimize edilmiştir. Bu protokoller geniş AMs için diğer türlerden kabul edilebilir olsa da, "en az gerekli" yüzey işaretleyicileri ayrıntılı karakterizasyonu için bir dizi kurmak için uygun fenotipik tayini yapılmalıdır.

Lavaj tarafından fare AMs yalıtımı için (Yani, EDTA) Aracısı şelat ve BAL tampon ön soğutma dahil mevcut çalışmada önemli olduğu bulunmuştur. AMs olduğundan alveoler duvara yapışık, PBS tek başına kullanımı hücreleri kekii etkisiz ve önemli ölçüde daha düşük verim üretti. Kateter borusu için yükleme güvenliğini sağlama başka bir kritik bir adımdır. BAL sıvı kaybı en aza indirir bir sızıntı geçirmez eki sağlamak için özen gösterilmelidir. Ekstra dikkat gereklidir lavaj genç bir fare süre (< 6 haftalık), Trakea yapısal incelik yırtılma veya sızıntı Lavaj sırasında neden olabilir. Kez üst üste iki ardışık dikiş yükleme kateterin güvenli bir ek sağlar ve kaçakları engeller. Her ne kadar enzimatik olmayan ayrılma (i.e., takıma şelatör arabelleği ile) yapıldı AM yalıtımı bu çalışmada gerçekleştirilen yalnızca, enzimatik ayrılma collagenase ile akciğer Lavaj sırasında daha iyi AM verim neden olabilir mümkündür.

BAL sıvısı üzerinden insan AM değişken verimidir. AMs insan akciğer nakli alıcılardan Norton torasik Enstitüsü'nde rutin sonrası akciğer nakli takip sırasında toplanan tüm BAL hücreleri yaklaşık yüzde 10'u teşkil ve toplam AM verim üzerinde çeşitli değişkenlere bağlıdır. Hastanın klinik durumu, lavaj içinde kullanılan tuz çözeltisi hacmi ve AM yalıtım için işlenen BAL sıvı hacmi gibi değişkenleri içerir. Microhemorrhage içinde neden öncesi lavaj yordamları (Örneğin, iğne biyopsileri) BAL hücre hücresel kompozisyon değiştirme; Yine de, fenotipik işaretleri uygulanması bir kesin tespiti ve insan AM Havuzu (Şekil 2) karakterizasyonu için sağlar.

L-929 Klima orta (M-CSF kaynak) kullanımı AMs vitro bakımı için gerekli oldu. Bizim inanç olduğunu saf M-CSF o takviyesi kültür; AMs sürdürmek için yeterli olacaktır Ancak, en iyi duruma getirilmiş bir konsantrasyon her iki insan için amele dışarı ve AMs fare gerekir. Endositoz, iltihap, antijen sunumu, olgunlaşma/harekete geçirmek durum veya bir zaman ders analiz için11,24 canlı hücre bakım gerektiren diğer tahlil karşılık çalışmaları için kullanılan kültürlü hücreleri can . Bu çalışma sırasında o sürekli kültürlü bir çizgi ve sadece kısa vadeli terminal çalışmaları AMs korumak için denendi değil (< hasat beri 30 gün) gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle, bu yöntem için bariz bir sınırlama bir uzun vadeli kültür Datası, özellikle istikrar hücrelerin olmaması (Yani, AMs bir sonlu olarak veya sürekli büyüyebilir olup olmadığını satır, cryoprotectants ve dondurma, AMs yanıt ve fenotipik ve/veya genotypic drift) devam eden kültür sonra. AMs uzun yaşam içinde vivo, hücreleri ve değişim ölçüde sağlıklı akciğerler ve bu solunum yolu enfeksiyonu veya/otoimmün inflamatuar yanıt geçiren izole hücreler arasında bekleniyor.

Genel olarak, yöntem burada belgeleri yalıtma, karakterize ve insan Bakımı ve fare AMs basitleştirilmiş bir yaklaşım bir hücre kültür sistemi içinde sunulan. Bu iletişim kuralı daha fazla bireysel deneysel gereksinimlerine göre optimize edilebilir olsa da, AMs fonksiyonel alaka solunum yolu hastalıkları ve pulmoner tıp incelemek için yeni başlayanlar protokolü olarak hizmet verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Clare Prendergast el yazması düzenleme ile yardım için teşekkür. DKN desteklenmektedir tarafından bir araştırma Flinn Vakfı'ndan (#2095) vermek ve TM Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01HL056643 ve R01HL092514) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. DKN yöntemleri geliştirilmiş, çalışma tasarlanmış ve el yazması yazdı; OM hayvan çalışmaları ve klinik örnek ihale ile destekli; SB akış sitometrik çözümlemesi ve hücre sıralama ile destekli; TM çalışmalar denetimli ve el yazması inceledim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506, (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210, (10), 1977-1992 (2013).
  3. Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13, (1), e1006140 (2017).
  4. Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191, (3), 1250-1259 (2013).
  5. MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148, (2), 657-666 (1996).
  6. Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24, (1), 38-45 (2005).
  7. Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10, (4), e1004053 (2014).
  8. Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82, (9), 4441-4448 (2008).
  9. Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7, (1), 89-100 (2014).
  10. Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145, (1), 147-154 (2006).
  11. Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16, (8), 2300-2311 (2016).
  12. Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159, (8), 4084-4093 (1997).
  13. Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20, (120), 98-107 (2011).
  14. Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136, (2), 571-577 (2009).
  15. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6, (250), 250ra113 (2014).
  16. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514, (7523), 450-454 (2014).
  17. Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38, (4), 792-804 (2013).
  18. Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, (4), 380-385 (2008).
  19. Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35, (2), 227-235 (2006).
  20. Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518, (7540), 547-551 (2015).
  21. Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74, (2), 460-469 (1984).
  22. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. (2017).
  23. Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9, (394), (2017).
  24. Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9, (398), (2017).
  25. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, (4), 503-510 (2013).
  26. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16, (1), 36-44 (2015).
  27. Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71, (11), 1006-1011 (2016).
  28. Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics