인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

Neuroscience
 

Summary

여기 선물이 외상 영향 관련 날짜 표시줄에 96-잘 형식에서 스트레치 상해의 모델 인간 생체 외에서 하는 방법. 이 기계적 모욕, 경작 및 셀 부상, 이미징, 및 상해 계량 높은 콘텐츠 분석 측정 stretchable 번호판 조작에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Phillips, J. K., Sherman, S. A., Oungoulian, S. R., Finan, J. D. Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format. J. Vis. Exp. (134), e57305, doi:10.3791/57305 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

외상 성 뇌 손상 (TBI)은 높은 사망률과 사망 주요 임상 도전 이다. 전 임상 연구의 십 년간에 불구 하 고 아니 입증 된 치료 TBI에 대 한 개발 되었습니다. 이 문서는 기존 전 임상 모델을 보완 하기 위한 전 임상 neurotrauma 연구에 대 한 새로운 메서드를 제공 합니다. 그것은 인간의 이상 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 (hiPSCNs)를 통해 소개합니다. 그것은 로드 펄스 달성 기간 임상의 로딩 기간 유사한 폐쇄 머리 영향 부상. 그것은 높은 처리량 실험을 용이 하 게 하 고 비싼 셀 및 문화 시 약의 효율적 사용 96-잘 형식을 사용 합니다. 실리콘 막 신경 uncured 폴리머를 제거 하려면 먼저 처리 되며 다음 stretchable 96 잘 접시를 만드는 상업적인 96 잘 접시에 보 세. 사용자 장치는 기계적으로 우물에 문화에 있는 세포를 손상 equibiaxial 기계적인 긴장을 유도 아래에서 잘 바닥의 일부 또는 전부를 사용 됩니다. 들여쓰기 깊이 기계적 스트레인의 관계 경험 잘 바닥의 고속 videography를 사용 하 여 들여쓰기 중 결정 됩니다. HiPSCNs를 포함 하 여 셀, 기존의 세포 배양 프로토콜의 수정된 버전을 사용 하 여 이러한 실리콘 막에 배양 수 있습니다. 세포 배양의 형광 현미경 이미지는 취득 하 고 반자동 방식에 각 잘 상해의 수준을 계량으로 부상 후 분석. 제시 하는 모델은 hiPSCNs에 최적화 되어 있지만 수 이론에서에 적용할 다른 세포 유형.

Introduction

TBI 일으키는 약 52000 죽음과 275000 입원 마다 년1사망률과 질병 률, 미국에서의 주요 원인입니다. TBI에 대 한 후보 치료제의 임상 시험을 30 개 이상의 단일 성공2없이 실시 되었습니다. 이 유니폼 실패 인간-특정 프로세스에서 일반적으로 사용 되 전 임상 설치류 모델에서 관찰 하는 이상 인간의 TBI를 별도 나왔다.

HiPSCNs의 출현 neurotrauma 인간의 생체 외에서 모델을 공부 하는 기회를 창조 했다. 약 hiPSCN 기반 모델 심사는 설치류 셀을 채용 하는 모델 보다 더 많은 임상 성공의 예측 결과 제공할 수 있습니다. 또한, hiPSCNs는 격리 하 고 병 리3개별 인간의 유전 이체의 효과 연구 유전으로 조작할 수 있습니다.

이 원고에 설명 된 메서드는 neurotrauma을 모델링 하는 hiPSCN 기반 질병의 독특한 장점을 설계 되었습니다. Neurotrauma의 스트레치 부상 모델에 생체 외에서 잘 설립된4,5,6 주 쥐 세포와 인간의 신경 암 세포 라인은. 이러한 모델의 대부분은 공기 실리콘 막 로드 하 여 스트레치를 생성 합니다. 이 방법은 단일 잘 형식에 효과적입니다 하지만 다 잘 형식7최대 규모 어려운 입증 되었습니다. 결과적으로, 결코 스트레치 부상된 신경 치료 하는 에이전트에 대 한 높은 처리량 화면 계속 있다.

이 모델에서 막 때문에 엄밀한 indenter와 밑에서 들여쓰기 펼쳐져 있습니다. 이 방법은 단일 잘 시스템8,,910관련 임상 병리학에 생체 외에서 생성 하 반복적으로 표시 되었습니다. 우리의 최근 작품으로는 쉽게 확장 96 잘 서식 하는 도메인의 닫히는 머리 영향 이벤트12,13시간 펄스 기간 수십 밀리초11, 순서를 유지 하면서 나타났습니다.

요약 하자면,이 생체 외에서 부상 모델의 주요 장점에 96 잘 형식, hiPSCNs의 사용 및 모욕의 임상 관련 시간 도메인.

Protocol

1. 실리콘 해독

  1. 254 µ m 두께, 30.48 cm x 30.48 cm 실리콘 막 면도날과 아크릴 서식 파일을 사용 하 여 7.5 c m x 11 c m 사각형으로 잘라. 10 사각형 막 각 시트와 함께 할 수 있다. 실리콘에와 함께 제공 되는 종이 저장 합니다.
  2. 세포 막 이온된 (DI) 수 유리 비누로 욕조에 놓습니다. 한 번에 하나씩 적어도 20 gloved 손끝으로 적극적으로 막 문질러 s까지 오면서.
  3. Lathered 비누 가시 제거 될 때까지 실행 디 물 아래 막을 헹 구 십시오. 세포 막 (포장)에서 종이 중력 사이클에 압력솥에 누워.
  4. 각 실리콘 막 24 h. 사용에 대 한 60 rpm에서 궤도 통에 막 당 70% 에탄올의 250 mL에 에탄올, 폴 리 프로필 렌 등으로 반응 하지 않는 소재로 만든 컨테이너를 담근 다.
    1. 하나 이상의 막 단일 저장소에 배치 됩니다 또는 세포 막 궤의 바닥에 붙어 있으면 세포 막 플라스틱 피 펫 팁 그들의 환경에서 고 팁 랙 플라스틱 합니다.
  5. Gloved 손 가진 실리콘 막 막 당 디 물 250 mL에 전송 하 고 60 rpm에서 48 h에 대 한 궤도 통에 담가.
  6. 다시 종이 4 h 93 ° C 유리 오븐에 장소에는 막 하다.
  7. 종이에, 깨끗 하 고 건조 장소에 덮여 먼지에서 그들을 보호 하기 위해 종이의 또 다른 시트 멤브레인을 저장 합니다.

2. 플레이트 제작

  1. 플라즈마 치료 200 W 플라즈마와 96 잘 접시 탑 클리너 ( 재료의 표참조) 60에 대 한 높은 전력, 청소기 하단 사이드-업 플라즈마 내부 배치에 s. 형광 보라색 효과적인 플라즈마 형성 했다 나타내는 챔버의 창문을 통해 볼 수 있는지 확인 합니다. 이 본딩 기술은 Sunkara 외. 에서 적응 됩니다. 14
  2. 60 내 s, 1.5% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (항) 20 분 디 물 200 mL에 접시 탑을 배치 하단 사이드 다운. 이 솔루션은 안정적인: 60 보다 더 준비 접시를 소개 하기 전에 s.
    주의: 항 증기 두건에서 작동 합니다.
  3. 플라즈마 치료 60 플라스마에서 추출 된 실리콘 막으로 청소기 높은 전력에 대 한 s. 5 분 더 이상 단계 2.2에서에서 20 분 기간 종료 전에 완료 되도록 플라즈마 처리 시간.
  4. 집게를 사용 하 여 플라즈마 처리 막 7.5 x 11 cm2 양피지 종이 사각형 위에 위치. 7.5 cm x 11 cm x 플레이트 제작 클램프의 아래 부분에 0.5 cm 알루미늄 석판을 맞춥니다. 집게를 사용 하 여 알루미늄 슬 래 브에 실리콘 막 및 양피지 종이 맞춥니다.
    참고:이 장치에 대 한 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 파일 보충 코드 파일로 보충 자료에 제공 된 ' 프레스 다이-일반 3D. 단계 '. 재료의 관련된 법안에 제공 된 보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치-BOM.xlsx.
  5. 플레이트 상판 항 목욕에서 제거 하 고 초과 솔루션을 떨쳐. 5 s 및 과잉의 물 떨어져 동요 200 mL 디 물 목욕으로 찍어. 5 s 및 과잉의 물 떨어져 동요에 대 한 다른 200 mL 디 물 목욕으로 찍어. 또 다른 접시 탑을 찍기 전에이 욕조에 물을 교체 합니다.
  6. 압축 공기를 사용 하 여 접시 탑을 완전히 건조.
  7. 플레이트 제작 클램프의 상단 부분에서 접시 탑을 놓습니다. 부드럽게 플레이트 제작 클램프를 플레이트 상단 및 실리콘을 함께 눌러 닫습니다. 적어도 1 h의 클램프
  8. 접시 사용, 먼지 로부터 보호 하기 전에 실 온에서 24 h에 대 한 치료를 하실 수 있습니다.

3. 스트레칭 접시

  1. 청소는 indenters.
    참고: 보조 그림 1을 참조 하십시오.
    1. Di 60 W 목욕 스타일 sonicator 실 온에서 물을 준비 합니다.
    2. 지원 하는 indenters의 꼭대기만 깊이의 적어도 1 m m.에 잠긴 거꾸로 sonicator 목욕 위에 indenter 블록 Sonicate 42 kHz에서 8 분 indenters.
    3. 타격 건조 압축 공기와 함께 indenters.
  2. Indenter 블록을 맞춥니다.
    1. 있도록 indenter 배열에 보고 스트레칭 장치 위에 생중계와 함께 카메라를 배치 합니다. indenters의 꼭대기에 초점.
      참고: 섹션 4, "막 스트레치 특성화"에 설명 된 설치는이 작업에 대 한 하나의 가능한 카메라 설치.
    2. 무대 클램프 (그림 1)를 사용 하 여 부상 장치의 무대에 접시를 장악 하 고 돔 빛에 배치 하는 장치.
      주: 악기 제어 소프트웨어에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    3. 부상 장치를 제어 하는 컴퓨터의 바탕 화면에 있는 소프트웨어 아이콘을 클릭 하 여 인스트루먼트 컨트롤 소프트웨어를 시작 합니다. 실행 창에서 클릭 하 여 "in_vitro_neurotrauma.lvproj" 프로젝트를 실행 합니다. 프로젝트 창에서 모션 컨트롤을 시작 하 고 위치 추적기 가상 악기 (Vi)는 이름은 'motion_control.vi' 및 'position_tracker.vi', 각각, 그들을 두 번 클릭 하 여.
    4. 부상 장치를 둘러싼 케이지를 닫습니다. 모션 컨트롤 VI VI를 실행 하 고 아래쪽을 클릭 ' 근처 ' 낮은 문의 indenters의 2 mm 이내에 무대의 왼쪽된 위 모퉁이 있는 '화살표' 버튼을 누릅니다. VI를 중지 하려면 '중지' 버튼을 클릭 합니다.
      주의: 계속 손을 들 것의 장에 카메라를 조작 하는 경우 취소 합니다. 감 금 소는 감 금 소 문의 닫을 때에 스트레칭 장치에 파워를 제공 하는 도어 스위치와 적합 해야 한다.
    5. 프로젝트 창에서 마우스 오른쪽 ' 축 1' 클릭. '대화형 테스트 패널'을 클릭 하십시오. 열리는 창에서 ' 대상 위치 ' 필드에 '500' 단위를 입력 하 여 단계 크기 50 µ m를 설정.
    6. 녹색 단추를 클릭 '이동' ' 대화형 테스트 패널 ' 창의 맨 아래에 반복 해 서 접시까지 먼저 어떤 indenters와 접촉 하는 게. 카메라에 의해 표시 되는 라이브 이미지에 연락처를 확인 합니다. 참고 세로 무대 위치에 보고 된 ' 대화형 테스트 패널 ' 창; 왼쪽 상단 이것은 연락처의 첫 번째 위치입니다.
    7. 모든 잘 했다 때까지 낮은 (3.2.6 단계에서 설명) 하는 대로 추가 indenters와 접촉. 필요한 경우 전체 접시를 보고 (부정적인 ' 대상 위치 '를 지정) 하 여 스테이지를 이동 하는 카메라를 이동 하 고 아래로. 참고 세로 무대 위치에 보고 된 모든 게시물 접촉 (이것은 전체 연락처 위치)에 있을 때 윈도우의 왼쪽 상단.
    8. 참고 첫 번째 연락처와 전체 연락처 위치 간의 차이. '대화형 테스트 패널'을 닫습니다. '모션 컨트롤 VI' 실행 (단계 3.2.4 참조) 무대를 '위에' 클릭 합니다. '중지' 버튼으로 모션 컨트롤 VI를 중지 합니다.
    9. 무대는 그것의 여행의 상단에, 일단 장치를 비활성화 하려면 문을 엽니다. Indenter 블록의 모서리에 있는 설정된 나사를 조정 합니다. 연락처 처음, 그것을 낮은 만든 연락처 마지막 코너를 인상 반대 나사를 만든 코너에는 나사를 풉니다.
    10. 접시 무대, 높이, 기울기에 대 한 연락처 이미지 검사 indenters, 연결 하 고 indenter는 차단 (단계 3.2.9) 조정 될 때까지 무대를 낮추기의 과정을 반복 합니다. 무대와 블록 정렬 됩니다 때 모든 indenters 만들 것입니다 한 번에 문의.
    11. 장치를 비활성화 하려면 문을 엽니다. 타이 다운 나사 indenter 블록에 그들의 구멍에 삽입 하 고 그들을 강화. 블록 장소 (단계 3.2.4-3.2.8) 타이 다운 나사와 레벨 되는지 확인 합니다. 접시가 ' 대화형 테스트 패널 '에서 보고 무대 위치의 접촉. 이 들여쓰기 실험에 대 한 제로 위치 될 것입니다.
  3. indenters 기름칠
    1. Indenter 블록 그냥 설정 되었습니다 아직 윤 활 되지는 경우 단단한 고무 패드를 청소 (7.5 c m x 11cm x 1.5 m m)와 부드러운, 닫 히 세포 거품 고무 패드 (7.5 c m x 11cm x 3 m m) 에탄올 배어 연구소 삭제 기능으로. 그들을 허용 공기 건조.
    2. 실험실 지우기 옥수수 기름에 담가 고 둔 한 광택에 단단한 고무 패드에 그것을 확산.
    3. 거품 패드에 기름을 전송할 단단한 고무 패드에 거품 패드를 두십시오. 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm 알루미늄 슬라브 폼 패드 위에 놓고 약 360 g (예를 들어, 각 물 45 mL 로드의 원뿔 관 6 개)의 밸러스트 무게와 로드 거품 패드에 단단한 고무 패드에서 오일의 일관 된 전송 되도록. 10 허용 거품 고무 패드를 전송 하는 석유에 대 한 s.
    4. Indenter 배열에 거품 고무 패드를 이동 합니다. 알루미늄 슬 래 브와 밸러스트 무게는 indenters의 끝에는 오일의 일관 된 전송 되도록 그것의 위에 배치 합니다. 10 수는 indenters을 석유에 대 한 s.
    5. 없는 접시부터 뻗어 되었습니다 경우 indenter 블록 설정 하 고 실험을 시작 하기 전에 테스트 플레이트 스트레칭, 처음으로 윤 활.
      참고:이 실험을 혼동에서 첫 번째 스트레칭 및 후속 뻗어 사이의 어떤 불일치를 방지 합니다. 이후 복 역, 각 스트레칭 하기 전에 단계 3.3.2-3.3.5만 반복 합니다.
  4. 접시를 스트레치.
    1. 3.3 단계에서 설명한 대로 indenters에 기름칠.
    2. 무대 클램프와 부상 장치의 무대에 접시를 보안 합니다. 불 임이 필요한 경우 문화 표면 방 공기에 노출 하지 않고 접시를 확보 하 여 뚜껑의 위치를 조정 합니다.
    3. '모션 컨트롤 VI를 사용 하 여 0 위치에 단계 낮은 ' (단계 3.2.4-3.2.6 참조). 0 위치는 3.2 단계 결정 됩니다.
    4. 그 창의 왼쪽된 위 모퉁이 있는 '화살표' 버튼으로 실행 다음 고유한 파일 이름에 '위치 추적 6'에서 "파일 경로" 입력란에 파일 이름을 변경 합니다.
    5. 깊이 들여쓰기의 기간 설정 (일반적으로 1 ~ 4 밀리미터 및 30 ms, 각각, 최대 깊이 5 m m, 최소 15 ms) '부상 (mm)' 및 '이동 제어판에서 VI' 필드를 클릭 하 고 원하는 입력 함으로써 ' 부상 기간 (ms)' 분야 값입니다.
    6. '운동 제어 패널 6'를 실행 하 고 'Injure' 접시를 클릭 하십시오.
    7. 여행 가기 무대 '위에'를 클릭 하 여 이동 합니다. 다음 '중지' 버튼으로 VI를 중지 하 고 문을 열어 부상 장치를 비활성화.
    8. 지정 된 최대 변위 적용 된 것인지 '위치 추적기 VI'에서 제시 하는 무대의 변위 역사를 검사 합니다. 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 Excel로 내보내기'를 클릭 합니다. 클릭 하십시오 ' 파일 | 저장 '으로 데이터를 저장.

4. 막 스트레치 특성화

  1. 각 indenter 흰색 고속 videography 고대비 배경을 제공의 상단에 쉬는 시간을 페인트.
    주의: 어디 그들은 확인 하는 indenters의 테두리를 페인트 하지 마십시오 격판덮개와 접촉.
  2. 3D는 poly(lactic acid) (PLA), 인쇄 또는 그렇지 않으면 조작, 각 잘에서 점 하 게 하는 원통형 스탬프. 실린더 5.9 m m 직경에서 및 높이, 높이 1.0 m m와 원통형 돌출 1.5 m m 직경 12.2 m m 위에 중심을 확인 합니다.
    참고: 3D 인쇄 모델 ' 스탬프. STL' 보조 파일로 사용할 수 있습니다.
  3. 플라즈마 치료 접시 오른쪽-사이드-최대 60 스에서 실리콘 셀 문화 표면 활성화 s, 단계 2.1에서에서 설명 했 듯이.
  4. 고무 패드 또는 다른 부드러운 표면에 접시를 놓습니다. 프라임 스탬프에 작은 돌출 (단계 4.2 참조) 영구 마커 펜에서 잉크. 테스트를 잘으로 스탬프를 삽입 하 고 잉크의 좋은 전송 되도록 누릅니다. 모든 잘 전에 스탬프 프라임.
  5. Indenter 블록을 정렬 하 고 기름칠을 부상 장치 indenters (참조 단계 3.2 3.3). 부상 장치의 무대에 판 클램프. 부상 장치 위에 밝은 확산 축 빛 위치.
  6. 부상 장치 붐 스탠드에 고속 카메라 설정, 렌즈 바로 아래쪽으로 직면 하 고는 작은 번호 f-로 설정 하 고 그것을 설정. 카메라에 연결 된 컴퓨터에 카메라 소프트웨어를 시작 합니다. 프레임 속도 드롭 다운 메뉴에서에서 선택 2000 프레임 초당 셔터에 드롭 다운 메뉴, 선택 높은 콘트라스트 이미지를 생성 하는 빠른 노출 시간. 점선된 우물에 센터입니다.
    1. 보기의 필드는 3 x 4 격자에서 12 우물이 포함 되도록 카메라를 배치 합니다.
      참고:이 필드의 보기 처리량 및 해상도 1280 × 1024 이미지 간의 최적의 타협을 제공합니다.
  7. 0 포인트 접시 낮은 (단계 3.2.4-3.2.6 참조). 1-클릭 기록 '에 트리거'를 읽을 수 있도록 카메라 소프트웨어에 단추. 위치 추적기 VI (3.4.4 단계)을 시작 합니다.
  8. 밝은 확산 축 빛을 켜십시오. 3.4.6 단계에서 설명한 대로 접시를 들여쓰기.
  9. 밝은 확산 축 빛을 끄십시오.
  10. 카메라 제어 컴퓨터에서 찾을 들여쓰기 발생 하는 기록의 30 ~ 40 ms 윈도우: 카메라 소프트웨어에서 고속 비디오 재생 막대에 시작과 끝 화살표를 끌어. 저장을 클릭 합니다, 그리고 ' 파일 이름 ' 필드에 이름을 설정 '형식' 필드에 '티파니'를 선택 하 고 '저장'을 클릭 합니다.
    1. 통해 보고 합니다. 최소한의 이미지에 대 한 TIF 파일 (시작) 기지개 하 고 가장 (피크 들여쓰기) 상태를 뻗어.
    2. 높이 너비의 두 이미지는 점의 측정, 피지 사용 하 여 최소한의 이미지를 열고 피크 스트레치 측면-의해-측면. 기본 사각형 선택 도구를 사용 하 여 클릭 하 고 끌어 이상 스트레칭 이미지에서 점 주위에 상자를 그립니다. 높이 너비를 측정 ' 분석 | 측정 '.
    3. 피크 스트레치 이미지에 같은 음에 도트에 대해 반복 합니다. 우물의 나머지에 대해 반복 합니다.
  11. 다음과 같이 xy 방향에 있는 Lagrangian 스트레인을 계산.
    Equation 1
    Equation 2
    참고: 여기, Exx x 방향에 라그랑주 스트레인, Eyy y 방향에 있는 Lagrangian 스트레인, X 는 도트의 폭, Y 는 점, f의 높이 는 최종 이미지 (, 피크 들여쓰기 이미지), 그리고 초기 이미지 (, 사전 들여쓰기 이미지)를 나타냅니다 . 잘에 긴장을 확인 하는 두 값을 평균입니다.

5. 도금 배양된 세포

  1. 압력솥 궤 및 밸러스트 무게를 살 균을 위해 사용 됩니다.
  2. 플라즈마 치료는 실리콘 바닥 플레이트 오른쪽-사이드-최대 60 s (단계 2.1 참조). 즉시 15 분 동안 70%의 에탄올을 포함 하는 멸 균 쓰레기통에 접시 잠수함.
  3. 30 분에 대 한 별도 멸 균 쓰레기통에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 (PBS)에 번호판 잠수함
  4. 우물에서 PBS 발음 플라즈마 처리를 잃는에서 우물을 방지 하기 위해 한 번에 한 접시를 건조만.
    주의: 실리콘 바닥된 접시 pipetting 때 경직 된 플레이트 보다 덜 촉각 피드백을 제공 하 고 더는 피 펫의 끝을 차단 하는 것
  5. 소독된 판에 잘 당 0.1 mg/mL 폴 리-L-ornithine (PLO)의 100 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
  6. 100 µ L 살 균 PBS, 세포 현 탁 액 준비 될 때까지 두 번째 워시 우물에 떠나와 두 번 웰 스 린스.
  7. 안전 장갑을 사용 하 여 액체 질소 저장에서 hiPSCNs의 유리병을 제거 하 고 드라이 아이스에. 빨리 37 ° C 물 목욕에 유리병을 수송 하 고 정확 하 게 3 분에 대 한 해 동. 유리병을 소용돌이 친다 하지 마십시오.
  8. 살 균 후드, 부드럽게 유리병의 내용을 50 mL 원뿔 튜브 1 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 전송.
  9. 실내 온도 완벽 한 유지 보수 매체 (미디어 베이스 + 보충)의 1 mL와 함께 빈 극저온 유리병을 씻어.
  10. 초 당 약 한 방울에 drop-wise 50 mL 튜브에 미디어의 1 mL를 전송 합니다. 추가 하는 동안 부드럽게 튜브를 소용돌이 친다. 약 2 방울/s에서 50 mL 튜브에 실내 온도 완벽 한 유지 보수 매체의 8 mL를 추가 합니다.
  11. 튜브 캡 및 반전 2-3 번. hemocytometer 셀을 계산 합니다. 225000 셀/mL로 세포 현 탁 액을 희석 하는 데 필요한 추가 미디어의 볼륨을 계산 합니다.
  12. 부드럽게 플라스틱 (위의 계산) 세포 현 탁 액 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여의 관으로 미디어의 양을.
  13. 세포 현 탁 액에서 laminin의 10 µ g/mL를 달성 하기 위해 1000 µ L micropipette와 셀 서 스 펜 션의 1 mL 당 1 mg/mL laminin 주식의 10 µ L를 추가 합니다. 아래로 한 번 laminin, 사용 팁과 발음 다음 튜브 캡 하 고 튜브를 한 번 반전.
  14. 한 번에 한 접시는 접시에서 PBS 발음 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 우물에 hiPSCN 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가. 그래서 지역 당 세포 밀도 67,500 셀/cm2우물 0.33 c m2의 문화 영역이 있다.
  15. 첨부 파일 홍보 뿌리기 후 15 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 휴식. 메 마른 문화 후드의 팬 진동 방지, 실험실 벤치에 덮여 접시를 놓습니다. 5% CO2와 37 ° C에서 문화를 품 어.
  16. 24 h, 완벽 한 유지 보수 미디어의 200 µ L로 우물을 채우는 전체 미디어 변화를 수행 합니다. 미디어의 100 µ L/2-3 일 마다 변경 반 수행 합니다.

6. 문화 부상

  1. Indenter 블록을 정렬 하 고 단계 3.2에에서 설명 된 대로 제로 위치를 찾습니다. 3.3 단계에서 설명한 대로 indenters에 기름칠.
  2. (3.4.4 단계)에 '위치 추적기 VI'에 변위의 역사에 대 한 파일 이름을 설정 합니다. 상해의에서 매개 변수는 '모션 컨트롤 VI' (3.4.5 단계)를 설정 합니다.
  3. 인큐베이터에서 부상 하 여 무대에 클램프 플레이트를 가져가 라. 방 공기에 문화를 노출 하지 않고 접시를 확보 하 여 뚜껑의 위치를 조정 합니다.
  4. '모션 컨트롤 6'를 사용 하 여 0 점 (단계 3.2.4-3.2.6)에 접시를 낮춥니다. '위치 추적기 VI' 시작 (3.4.4 단계).
  5. 운동 제어 VI를 사용 하 여 (단계 3.4.6에서에서와 같이) 접시를. 가짜 뻗 기에만이 단계를 건너뜁니다.
  6. 무대는 맨 위로 돌아가기 모션의 범위 (단계 3.4.7 참조). 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
  7. 검사 하 고 변위 추적 (3.4.8 단계)로 저장 합니다.

7입니다. 현미경

  1. 2 µ g/mL Hoechst 33342 및 5 µ g/mL Calcein 오전 유지 보수 미디어에서 솔루션 얼룩 x 10을 준비 합니다.
  2. 각 얼룩 얼룩 솔루션 x 10의 20 µ L 스파이크와 함께 잘.
  3. 37 ° c.에 얼룩과 15 분 동안 품 어
  4. 넓은 필드 형광 이미지를 취득 합니다. 사용 하 여 기존의 FITC와 DAPI 세트 Calcein 오전 및 Hoechst 33342 신호를 각각 이미지를 필터링 합니다. 다 잘 이미징 시퀀스에는 10 분 이상 걸릴 것입니다, 문화의 건강을 유지 하기 위해 무대 최고 인큐베이터에서 접시를 묶습니다.
    참고: 10 배, 0.30 NA 렌즈 제공 합니다 충분 한 세부를 세포 생존 능력 및 형태에 대 한. 이 많은 밝은 소마의 일부 채도 발생 neurites의 좋은 시각화를 위해 이익 조정 합니다.
  5. 소마와 neurites 식별 하 녹색 Calcein 오전 채널에서 라이브 셀 이미지를 세그먼트. Soma의 식별을 지원 하기 위해 블루 Hoechst 33342 채널에서 핵 이미지를 사용 합니다.

Representative Results

들 것 장치는 (그림 2A) 펄스의 진폭에 따라 펄스 기간이 짧은 10-15 ms와 오래전 무대를 이동 수 있습니다. 펄스 진폭 높게 반복 가능 하지만 펄스 기간 약 1 다릅니다 반복 사이 ms. 우물의 많은 수는 로드 하 고 소정의 진폭은 실제 펄스 진폭 된 펄스 진폭에서 다른 ( 그림 2B참조). 3mm 넘어 무대 변위의 진폭 증가로 실제 변위 진폭 점점 미치지 된 변위 진폭 ( 그림 2B참조). 조심 게시물 블록의 맞춤 행 또는 열 (그림 2C) 막 스트레인에 어떤 추세 든 지 제거. 3.5 m m 52 우물 들여쓰기 단계 변위 진폭 (3.3 m m 실제 변위 진폭) 처방, 모든 잘 지역에 걸쳐 평균 Lagrangian 긴장 했다 0.451 (모든 위치에 대 한 의미의 표준 편차 = 0.051, 평균 표준 편차 모든 위치에 대 한 = 0.065, n = 잘 당 5 측정). 이러한 결과 비록 그들 중 일부는 이미 보고 된11완전성에 대 한 여기 표시 됩니다.

최적, 손상 되지 않은 문화는 5 개 이상의 세포의 경우 몇 덩어리로 있을 것 이다. 개별, 슬림, 길고 긴장 또는 구슬 (그림 3A)의 거의 없거나 전혀 없는 기호로 곡선 Neurites 있을 것입니다. 이상적인 조건 하에서 문화의 생존 제조업체의 데이터 시트 (일반적으로 60-70%)에 지정 된 생존 접근 밀접 하 게 해야 하 고 실리콘에 문화는 기존의 경직 된 문화 기판 ( 유지 그 유사 합니다. 그림 3B). Neurites 되거나 저전력 밝은 분야 현미경에 표시 되지 않을 수 있습니다. Laminin 농도 세포 밀도 및 부상 후 기준선에 영향. 셀 밀도 증가 수 및 문화에서 형성 하는 덩어리의 크기를 증가 했다. 종종 laminin 농도 증가 counteracted이 효과 (그림 3A). 그러나, 부상 (그림 4) 문화의 감도 무디게 하 너무 많이 집중 된 laminin 증가. 손상 되지 않은 문화에 대 한 최적의 laminin 농도 50 µ g/mL laminin (그림 3), 하지만 가짜 고 스트레치 부상된 인구 사이 최적의 분리 laminin (그림 4)의 10 µ g/mL에서 얻은 했다. 높은 laminin 농도 점에서 긴 시간 (예를 들어, 7 일) 향상 된 초기 세포 생존 능력 뿐만 아니라 짧은 시간 포인트 (그림 4), 부상 문화의 감도 감소. 요약 하자면, 그것은 각 실험 시나리오에 대 한 laminin 농도 최적화 가치가입니다.

막 긴장, 후 부상 영상 시간, laminin 농도, 및 세포 밀도 모든 셀 당 neurite 길이에 고도의 통계적으로 중요 한 주요 효과 발휘 (ANOVA, p < 0.001). 셀 당 neurite 길이에 막 긴장의 효과 했다 후 부상 이미징 시간 지점과 laminin 농도와 높은 통계적으로 중요 한 상호 작용 (ANOVA, p < 0.001)와 셀와 통계적으로 중요 한 상호 작용을 밀도 (ANOVA, p < 0.05). 마찬가지로, 막 긴장, 후 부상 밀도, 셀 시간 포인트, 이미징 및 모든 laminin 농도 세포 생존 능력에 높은 통계적으로 중요 한 주요 효과 발휘 (ANOVA, p < 0.001). 세포 생존 능력에 막 긴장의 효과 했다 후 부상 이미징 시간 포인트와 높게 통계적으로 중요 한 상호 작용을 (ANOVA, p < 0.001) 및 셀 밀도 (ANOVA, p 와 통계적으로 중요 한 상호 작용을 < 0.05). 이러한 결과 타이밍, 세포 밀도, 그리고 laminin 농도 발휘 적용된 모욕 및 실험 결과 관계에 중요 한 영향을 미치는 그래서 각 신중 하 게 최적화 되어야 합니다 증명.

낮은 세포 생존 능력 및 저하 neurite 성장, 함께 파란색된 neurites 독성 문화 조건에서 부적절 하 게 발생할 수 있는 실리콘 준비를 나타냅니다. 건너뛰기 또는 물 담가 또는 건조 오븐 단축 수 흡수 에탄올 떠나거나 미디어로 확산 하 고 셀 강조 수 있는 멤브레인, 각각, 물. 세포 생존 능력, 단축 또는 누락 neurites, 파란색된 neurites, 및 긴장 된 또는 데크에 neurites 잘 부상된 문화 감소 됩니다. 부상 수 있습니다 잘 분산 된 사전 부상 했다 세포 배양에 응집을 유도 하 고 있다. 큰 덩어리는 형태소 분석을 혼동 수 있습니다. 형태소 분석에 대 한 눈에 띄는 변화가 발생 하지만 셀은 여전히 일부 neurites 함께 존재 하는 상해 수준을 조정 한다.

Figure 1
그림 1 : A 라는 부상 장치 회로도. (A) 평면도, 아이소메트릭 뷰 (B), (C) 전면 보기, (D) 오른쪽 보기. 눈금 막대는 직교 뷰 (A, B, D)에 적용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 기계적 모욕의 운동학. (A) 단계 변위 기록 된 진폭 (범례에 나열 된 진폭)의 범위에서 5 펄스 동안 아무 웰 스는 로드 되었을 때. (B) 단계 변위 기록 된 진폭 (범례에 나열 된 진폭)의 범위에서 10 펄스 동안 52 웰 스는 로드 되었을 때. (C) 각 잘 3.3 m m의 무대 변위 진폭의 평균 변형 (n = 5 측정 음, 당 평균 표준 오차 잘 당 0.029 =). C4-f 4와 c 9 f 9는 스트레치 제어 우물 note. 이 그림에서 셔먼 수정 되었습니다. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 문화의 최적화 실리콘에 조건. (A) 다양 한 실리콘에 hiPSCN 문화에 셀 밀도 laminin 농도의 효과. 셀 밀도 증가 laminin 농도 감소와 응집 증가 합니다. 셀 밀도 laminin 농도 문화 모노 분산을 달성 하기 위하여 낙관 되어야 한다. 모노 분산 문화는 덜 취약 아티팩트를 정량화 하는 동안. 참고 동적 범위는 neurites의 시각화를 최적화 하기 위해 조정 되었습니다. 결과적으로, 많은 밝은 소마 포화 됩니다. 이 프레 젠 테이이 션은 많은 주차 neurites 거의 보이지 않는 렌더링 소마에 대해 동적 범위를 최적화의 대안을 선호. 빨간색 사각형으로 강조 표시 조건 스트레치 부상 실험 체 외에 대 한 최적의 간주 했다. (B) 최적의 조건에서 실리콘 막에 문화 유사 하 게 나타납니다 기존의 딱딱한 기판에 문화. 왼쪽된 패널 hiPSCNs 33,750 셀/cm2 (셀 문화 기판은 취급 하는 조직 문화 주기적 올레 공동 중합체) 기존의 엄밀한 96 잘 접시에 laminin의 3.3 µ g/mL에서 교양 보여줍니다. 오른쪽 패널 (A)에서 빨간색으로 설명 패널을 재현 합니다. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 부상 표현 형 및 그것의 의존 laminin 농도. (A) 건강 한 문화, 10 µ g/mL laminin 및 67,500 셀/c m2를 사용 하 여. Neurites 아무 구슬과 오래 있습니다. 몇 가지 죽은 핵, 그리고 몇 덩어리 있다. (B) 문화 같은 문화 조건, 57% 피크 스트레인 부상 4 h. Neurites 단축 후 몇 군데 또는 누락 된, 그리고 일부는 구슬 (화살표로 표시). 적은 Calcein 오전-긍정적인 세포 그리고 있다 더 많은 Calcein 오전 음수가 핵 (, 죽은). 부상 가운데 살아남은 세포 응집을 증가 했다. (C) 부상 후 4 h, 셀 당 neurite 길이 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (D) 부상 후 4 h, 세포 생존 능력 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (E) 부상 후 24 h, 셀 당 neurite 길이 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (F) 부상 후 24 h, 세포 생존 능력 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (n = 4 당 바, 오차 막대는 ± 1 표준 편차, 스케일 바 = 100 µ m). 스트레인 값은 셔먼 외. 여 이전 게시에서 데이터를 사용 하 여 단계 변위에서 추론 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1:는 indenter의 드로잉 기술. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 테이블 2: 96 잘 접시-로더 핀아웃 배선도. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 1: 부상 장치의 컴퓨터 지원 설계 도면. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 2: 플레이트 제작 클램프의 컴퓨터 지원 설계 도면. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 3: 스탬프 형상, 3D 프린터와 함께 사용 하기 위해 적합 한 3D 표현. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 4: SubVI MuStLiMo_si_initialize.vi, 인 motion_control.vi 위한 SubVI에 대 한. 모션에 대 한 매개 변수를 대화 상자에 항목을 변환합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 5: SubVI 여러 직선 라인 Moves_simplified.vi, 인 motion_control.vi 위한 SubVI에 대 한. 모션에 대 한 매개 변수를 대화 상자에 항목을 변환합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 6: SubVI position_tracker.vi에 대 한. 카운터 트랙 치환 선형 인코더에서 입력입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 7: 기반 LabVIEW 프로젝트. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 8: 탑 이동 장치 레벨 VI. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 9: SubVI motion_control.vi에 대 한. 접시를 뻗어 급속 한 변위를 실행 합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 10: SubVI motion_control.vi에 대 한. 스테이지를 이동 하는 느린 변위를 실행 합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 11: SubVI motion_control.vi에 대 한. Motion_control.vi 컨트롤 패널에서 (보통 언더샘플링된) 변위 역사를 플롯합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 12: 변위 역사를 기록 하는 레벨 6 톱. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 13: 포함 Variable2, motion_control.vi와 position_tracker.vi 사이 통신. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 14: 인쇄 회로 기판에 대 한 도식. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 코드 파일 15: 인쇄 회로 보드 레이아웃. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

일관 된 취득의 열쇠, biofidelic 표현 형이이 모델에 일관 된 biofidelic 기계 모욕을 적용 합니다. 이 모델 기간이 10-15 ms와 유사한 시체 실험12,13에 따라 인간의 머리 영향에 대 한 펄스 기간 짧은 펄스를 생성할 수 있습니다. 이 모욕의 일관성 indenter 블록 플레이트의 맞춤은 indenters의 일관 된 윤 활에 따라 다릅니다. 때 indenter 블록 정렬 잘 있다 아무 추세 적용 된 스트레인에 행 또는 열 (그림 2C). 윤활제의 얇은 레이어는 일반적으로 두꺼운 층 마찰 만들고 점성 윤활제는 실리콘 파울 현미경 중 빛의 통로 방해 때문에 권장 하지 않습니다. 실제 무대 변위 진폭 수 짧은을 실질적으로 된 변위 진폭 때 많은 indenters을 사용 하 고 소정의 단계 변위 진폭 큰 (> 3 m m) 이다. 그러나, 실제 변위는 큰 진폭에 소정의 변위 보다, 하는 동안 반복 (그림 2B) 남아 있다. 따라서, 큰, 실제 변위 진폭 원하는 값 초과 된 값을 입력 하 여 안정적으로 얻을 수 있습니다. 변위 진폭 피크 막 스트레인, 병 리를 유도 기계 모욕을 직접 측정에 대 한 쉽게 기록 된 프록시 때문에 중요 합니다. 따라서, 단계 진지 변환에서 막 부담을 결정에 대 한 설명 하는 절차가 중요 합니다. 접시와 indenters, 예를 들어 다른 간의 상호 작용에 영향을 주는 시스템에 변경 내용이 있는 주요 경우이 프로세스를 반복 해야 직경 indenters, 다른 indenter 자료 또는 코팅, 실리콘의 종류 바닥된 플레이트 사용 됩니다. 각 실험의 시작에 indenter 블록을 재조정 하 고 제로 위치를 결정 하는 과정을 반복 한다. 스트레칭 장치의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. CAD 모델 장치를 재현 하는 데 필요한 보충 자료로 제공 됩니다: ' 부상 장치-전체 어셈블리-일반 3D. 단계 '; 제공 되는 자료의 관련된 법안으로보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치-BOM.xlsx. 또한 보충 테이블 2 96 잘 접시 _loader - 핀 배선 Diagram.xlsx, 시스템의 다양 한 구성 요소를 연결 하는 케이블 연결 설명 참조. 'Interconnector_circuit_board.dip'는 케이블을 상호 연결 하는 회로 보드에 설명 합니다.

여행 중간 근처 무대 장치를 비활성화 하는 경우 그것은 스프링 때문에 전원 차단 후 무대 이동 합니다. 전원이 복원 되 면 피드백 루프 마지막 알려진된 된 위치와 실제 위치 사이의 큰 차이 감지 합니다. 이 위치로 갑자기 이동 무대 장치가 비활성화 되었습니다 때 발생 합니다. 않으므로 주의 한다 그것은 그것의 전원이 꺼져 있는 휴식 여행 상단에 위치 하는 경우에 장치를 비활성화 하려면이 갑자기 모션 인코더의 출력에서 오류를 발생할 수 있습니다.

제조 클램프는 최적의 결합을 허용 하는 방식으로 함께 접시 신체와 실리콘 바닥을가지고 설계 되었습니다. 이 위해, 있는 세 가지 핵심 기능 추가 파일에서 제공 하는 디자인 ' 프레스 다이-일반 3D. 단계 '. 첫째, 클램프 플레이트 몸 홀더 실리콘 바닥에 평행 하다. 이 제대로 빌드된 경우 초기 설치 후 아무 조정이 필요 합니다. 둘째, 클램프에 거품 고무의 레이어 클램프 폐쇄 때 완전히 딱딱한 시스템 이론적으로 무한 한 클램핑 힘을 제로 클램핑 힘에서 급격 한 증가 경험으로 접시, 아래 준수의 작은 금액을 제공 합니다. 크로스바의 위치와 클램프의 나사는 클램프의 두 측면 사이의 거리는 괜찮을 수 있다 그래야 조정 가능 하다.

모든 노력 스트레인 특성 실험 중 점 뒤에 밝은, 흰색 배경 잘 하단에 제공 하 여야 한다. 더 나은 대비 이러한 이미지에 쉽게 될 것입니다 높이 교환원 큰 실험 분석에 대 한 지루한 될 수 있는 도트의 너비를 측정 하는 과정을 자동화. 96 잘 접시에 우물의 바닥의 고속 videography 우물의 벽 그림자 경향이 있기 때문에 도전을 선물 한다. 돔 빛 또는 카메라의 시선에 따라 이미지를 왜곡 없이 밝히는 수 확산 축 빛의 사용은 그림자 또는 반사 반사 기존의 광원으로 발생 하는 것을 제거 합니다. 밝은 빛 소스 밝은 조명 이미지 짧은 노출 시간으로 획득 될 수 있기 때문에 사용 되어야 한다. 짧은 노출 시간 동작 흐림 효과 최소화합니다. 확산 축 빛의 발광 다이오드 (Led)를 업그레이드 중 고속 비디오 짧은 노출 시간을 허용 한다. Led Led 주식 제거 확산 축 빛을 개방 하 여 업그레이드할 수 있습니다, 그리고 장착 4 높은 전원 LED Led 홀더를 사용 하 여, 일정 한 현재 전력 공급에 연결 하 고 확산 축 빛 (참조 테이블의 재조합 백 창 배열 재료 카탈로그 번호). 업그레이드 하는 Led의 단점은 과열 될 위험이 몇 초에 대 한 수 동적으로 냉각된 Led 유지할 수 없는. 따라서, 다른 빛 후 블록 및 카메라 조정의 필요 합니다.

점 막에 스탬프의 팽창 측정 하 여 막 스트레인 측정의 표시 방법은 상대적으로 원유, 하지만 그것은 강력한 방식으로 여러 우물 확장할 수 있습니다. 잘 아래쪽 스트레인 필드 디지털 이미지 상관 관계를 사용 하 여 좀 더 자세하게에서 특징 수 있습니다. 이 기술은 포함 한다 우물의 기지에 얼룩 덜 룩 한 패턴을 분사 하 고 다음에 그것을 이미징 변형 중 고속. 상용 소프트웨어는 다음 얼룩 덜 룩 한 패턴의 진화를 추적 하 여 이미지의 모든 지점에서 스트레인 척도를 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 hiPSCNs에 다 면, 임상 관련, 스트레칭 상해 형을 생성합니다. 세포 죽음, neurite 변성 및 neurite 구슬 인간에서 TBI의 모든 문서화 sequelae 이며 동물 모델15. 이 모델에서 성공의 열쇠는 설정 이며 건강 한 문화를 유지 하. 일반적으로 말하자면, 기존의 경직 된 플레이트와 개발 세포 문화 프로토콜 stretchable 격판덮개 문화에 대 한 가치 있는 출발점입니다. 그러나, 문제의 세포 실리콘에 다르게 응답할 수 있습니다 가능성 항상 고려 되어야 한다. 이 문화 상황에 매우 민감한 hiPSCNs의 특히 사실 이다. 셀 밀도 laminin 농도 최적화의 몇 가지 예는 (그림 3, 그림 4) 대표적인 결과 섹션에서 제공 됩니다. 플라즈마 처리 된 실리콘의 활성화는 생명 이다. 실리콘은 소수 성 그리고 unreactive; 자연 상태에서 그것은 하지 laminin 또는 셀 첨부를 홍보 하는 데 사용 하는 다른 분자에 바인딩합니다. 플라즈마 처리는 친수성 표면을 렌더링 하 고 반응 그룹 노출. 이러한 변화 접착 분자 실리콘 바인딩할 홍보 셀 첨부 파일을 허용 합니다. 그것은 중요 한 플라즈마 처리 효과 표면, 액체에 빠져들 고 그래서 최대한 빨리 활성화 된 표면 건조를 포함 하는 절차를 수행 해야 분 이내 사라지는 것. 플라즈마 처리의 효과 없어진 경우 확인 하는 간단한 방법은 표면에 물 한 방울을 배치 하는 것입니다. 플라즈마 처리 실리콘에 밖으로 전파 하는 반면 치료 실리콘에는 물방울을 구슬 것입니다. 우리가 사용 하는 hiPSCNs와 ( 재료의 표참조), 제조업체 셀 서 스 펜 션 보다는 사전 코팅 laminin 추가 것이 좋습니다. 이 프로토콜은이 접근을 성공적으로 통합 했다. 세분화, 이론적으로, 달성 될 수 있다 오픈 소스 소프트웨어 또는 범용 프로그래밍 언어, 하는 동안 이러한 도구와 능력의 높은 학위 좋은 결과 얻기 위해 필요 합니다. Neurites는 자주 그들은 너무 슬림 하기 때문에 배경 신호 로부터 구별 하기 어렵다입니다. 따라서, 우리는 그들이 사용할 수 있는 경우 전용 모듈 세분화와 뉴런의 정량화에 대 한 높은 콘텐츠 현미경 회사에서 배포 하는 상용 소프트웨어 도구를 사용 하 여를 권장 합니다. 상용 소프트웨어와도 시각적으로 정확도 확인 하기 위해 세분화의 이미지를 내보낼 현명 하다.

기존의 경직 된 플레이트 작업에 비해 stretchable 접시에서 일하고와 관련 된 몇 가지 제한이 있습니다. Stretchable 접시 공기 목표와 정상적으로 몇 군데 될 수 있습니다. 그러나, 집중 목표와 이미징 매우 어렵습니다. 렌즈 오일 실리콘을 손상 될 수 있습니다. 또한, 목표 위쪽으로 이동할 때 실리콘 막에 압력을 미치는. 이 압력 배 수량 막 수직, 어렵게 초점으로 샘플을가지고. 현재 판 제조에 사용 되는 실리콘 막 약 250 µ m 두께입니다. 이 두께 많은 높은 전력, 침수 목표의 초점 거리를 초과합니다. 특별 한 배려는 현미경에 필요한 평탄도 달성 하기 위해 클램핑 하기 전에 완벽 하 게 평면 멤브레인을가지고 한다. 자동 초점 시스템 어느 정도 완성 된 플레이트의 평탄도에 편차를 보정할 수 있습니다. 이후 버전의 프로토콜 평탄도 보장 하기 위해 접시 위쪽에 접착은 전에 막을 긴장 미리 수 있습니다. 플레이트 최고14 에 실리콘 막 본딩 접착제 없는 절차에는 현재 프로토콜의 중요 한 힘으로 간주 됩니다. 그것은 평탄도 접착제 층의 비균일 두께 때문에 neurotoxicity 어떤 편차 및 접착제에서의 위험을 제거합니다.

다중 전극 배열 일반적으로 그들의 성숙과 기능을 평가 하기 위해 hiPSCNs와 함께 실험에 사용 됩니다. 셀 문화 기판은 엄밀한 때문에 불행 하 게도, 이러한 시스템이 모델과 호환 되지 않습니다. Stretchable 다중 전극 어레이 만들, 비록이 지금까지 입증 되었습니다 하나의 잘 포맷16,17가능 하다. Note는 indenters에서에서 제거할 수 있습니다 개별적으로 indenter 블록을 일부 우물 들여쓰기 되지 shams로 사용할 수 있습니다. 제거 하 고 indenter 들여쓰기를 방지 하지만 기계적 로드 이므로 우물에 있는 액체의 여전히 관성 모션 스테이지를 이동 하는 동안 완전히 제거 하지 않습니다. 그것은 결코 단계 모션 움직임의 어떤 병 적인 영향을 측정에 적용 했다 플레이트에 웰 스 우물 비교 가치가 있다. 또한, 블록에 indenters의 배열 bisymmetric (앞 뒤쪽으로 대칭과 좌우로) 이어야 한다. 이 경고는 무대 옆으로 기울기 하지 않으며 그들의 베어링에 바인딩할 막대를 원인이 되도록 들여쓰기, 중 접시 로드 균등 하 게 보장 합니다.

Neurotrauma 치료 혁신을 주요 과제 중 하나입니다 복잡 하 고이 조건. 외상에 적용 됩니다 멀티 모달 스트레스 중앙 신경 시스템에 모든 셀 형식을 동시에. 신경 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 안정적으로 생성 된 고 널리 상용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. 혁신은이 분야에서 신속 하 게 진행 되 고 이다18 microglia19 같은 다른 신경 세포 유형 또한 hiPSCs에서 파생 되 고. 곧 체 외에 외상 그리고 공동 문화 다른 세포 유형 그들은 외상 후 통신 하는 방법을 이해 하는 것이 세포 유형의 각각의 셀 자치 응답 분리 수 수 있습니다. 이 방법에서는, 궁극적으로 철저 하 게 인간의 시스템에 그것을 이해 하는 바닥에서 임상 도전 최대 다시 수 수 있습니다. 이 방법은 다른 설치류 모델에 의존 하는 기존의 접근 이며이 일반적인, 엄청난, 그리고 다루기 힘든 조건에 대 한 첫 번째 치료를 이끌어 내는 새로운 통찰력을 생성 하는.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 건강의 국가 학회 (R21NS098129)에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 됩니다. SueSan 첸, 조나단 탄, 코 티 카 나, 시 카이 니 Feng 위안 부, 누가 설계 및 구조 지원 고속 이미징 실험이이 원고에서 설명 하는 동안 사용 되는 조명 내장에서 우수한 기술 지원을 인정 하 고 싶습니다. .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
.010" Silicone Sheet Specialty Manufacturing, Inc #70P001200010 Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen Fisher Scientific  #043204
Nunc 256665 Fisher Scientific  #12-565-600 Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes ULINE S-8115
Plasma Cleaner Harrick Plasma #PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich #440140 APTES
Parchment Paper Reynolds N/A
Dome Light CCS inc LFX2-100SW
Dome Light Power Supply CCS inc PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit             Siemens Nerlite DOAL-75-LED Diffuse axial light
High Power LED Array                 CREE XLamp CXA2540 High Power LED Array                
LED holder Molex 1807200001 LED Holder  
LED power supply Mean Well HLG-320H-36B Constant Current Power Supply   
FastCam Viewer software  Photron camera softeware
Fastcam Mini UX50 Photron N/A High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 Nikon #1455 High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich #P4597
iCells Cellular Dynamics International #NRC-100-010-001
iCell media Cellular Dynamics International #NRM-100-121-001 
iCell supplement Cellular Dynamics International #NRM-100-031-001
Laminin Sigma-Aldrich #L2020
Hoechst 33342 Fisher Scientific  #H3570
Calcein AM Fisher Scientific  #C3099
voice coil actuator  BEI Kimco LA43-67-000A 
optical linear encoder  Renishaw T1031-30A 
servo drive Copley Controls Xenus XTL 
Controller National Instruments cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller 
cRIO chassis National Instruments cRIO 9113
digital input module National Instruments NI 9411
data acquistion chassis National Instruments NI 9113
LabVIEW National Instruments instrument control software
hiPSCNs Cellular Dynamics International

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. (2010).
  2. Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15, (1), 1216-1236 (2014).
  3. Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14, (6), 781-795 (2014).
  4. Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19, (11), 4263-4269 (1999).
  5. Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21, (6), 1923-1930 (2001).
  6. Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21, (1), 61-72 (2004).
  7. Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28, (11), 2203-2218 (2011).
  8. Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150, (2), 192-201 (2006).
  9. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101, (2), 434-447 (2007).
  10. Kang, W. H., Morrison, B. 3rd Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14, (3), 561-575 (2015).
  11. Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
  12. Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
  13. Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
  14. Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11, (5), 962-965 (2011).
  15. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
  16. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48, (10), 945-954 (2010).
  17. Yu, Z., Morrison, B. 3rd Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103, (1), 499-510 (2010).
  18. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9, (2), 600-614 (2017).
  19. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22, (11), 1358-1367 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics