שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

Neuroscience
 

Summary

כאן אנו מציגים את שיטת מודל אנושי במבחנה של פציעה מתיחה בתבנית 96-ובכן בציר הרלוונטי לפגיעה טראומה. זה כולל שיטות בדיית לוחות מתיחה, לכימות את העלבון מכני culturing, ופצעו תאים, הדמיה, ניתוח תוכן גבוהה לכמת פגיעה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Phillips, J. K., Sherman, S. A., Oungoulian, S. R., Finan, J. D. Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format. J. Vis. Exp. (134), e57305, doi:10.3791/57305 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) הוא אתגר קליני עם גבוהה התחלואה והתמותה. למרות עשורים של מחקרים קליניים, פותחו טיפולים מוכחים אין TBI. מאמר זה מציג שיטה למחקר neurotrauma קליניים נועד להשלים קיימים מודלים קליניים. זה מציג פתופסיולוגיה האנושי באמצעות הנוירונים נגזר תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSCNs). הוא משיג טעינה דופק משך הדומה המשכים הטעינה של ניסויים קליניים סגורה פציעת ראש ההשפעה. היא מעסיקה תבנית 96-ובכן מאפשר תפוקה גבוהה ניסויים ועושה שימוש יעיל תאים יקר, ריאגנטים תרבות. ממברנות הסיליקון התייחס תחילה להסיר את העצבים פולימר משומרים, ואז בונדד לגופים מסחריים 96-ובכן צלחת ליצירת לוחות 96-ובכן מתיחה. התקן שהותקן משמש כדי להסיט פנימה או מכל תחתיות טוב מ מתחת, גרימת equibiaxial מאמץ מכני שהיא מכנית הפוגעת בתאי תרבות הבארות. הקשר בין כניסה לעומק מאמץ מכני נקבע מדעית באמצעות צילום וידאו במהירות גבוהה של ישבנים היטב במהלך הכניסה. תאים, כולל hiPSCNs, יכול להיות מחונן על אלה ממברנות הסיליקון באמצעות גרסאות אחרות של התא קונבנציונאלי תרבות פרוטוקולים פלורסנט תמונות מיקרוסקופיות של תרביות תאים רכשה, מנותח לאחר פציעה באופן אוטומטי למחצה כדי לכמת את רמת הפגיעה היטב בכל. המודל המוצג ממוטב עבור hiPSCNs אבל יכול באופן תיאורטי ניתן להחיל סוגי תאים אחרים.

Introduction

TBI הוא הגורם העיקרי לתמותה ותחלואה בארצות הברית, גרימת מקרי מוות בסביבות 52,000 לבין אשפוזים 275,000 בכל שנה1. יותר מ- 30 ניסויים קליניים של המועמד הרפוי TBI נערכו ללא הצלחה יחידה2. כשל אחיד זה מרמז כי האדם הספציפי תהליכים להפריד TBI האנושי פתופיזיולוגיה נצפתה במודלים ניסויים פרה-קליניים מכרסם נפוץ.

כניסתו של hiPSCNs יצרה הזדמנות ללמוד neurotrauma במודל אנושיים במבחנה . סמים הקרנה עם מודלים מבוססי hiPSCN עשוי לספק תוצאות שהן יותר חזוי של הצלחה קלינית מאשר מודלים העסקת תאים מכרסמים. גם, hiPSCNs יכולה להיות גנטית מניפולציות לבודד וללמוד את ההשפעה של הפרט האנושי משתנים גנטיים על פתולוגיה3.

השיטה המתוארת בכתב יד זה נועד להביא את היתרונות ייחודי של המחלה מבוסס hiPSCN כדי neurotrauma. במבחנה פציעה מתיחה מודלים של neurotrauma הם וותיקה4,5,,6 , עם ראשי מכרסם תאים, שורות תאים סרטניים אנושיים עצבית. רוב המודלים האלה יוצרות מתיחה על-ידי טעינת pneumatically קרום סיליקון. גישה זו יעילה בתבנית טוב אחת אבל הוכיח שקשה בקנה מידה עד עיצוב רב טוב7. כתוצאה מכך, לא היה מסך תפוקה גבוהה עבור סוכני לטיפול מתיחה נוירונים פצועים.

במודל זה, נמתח הקרום עקב כניסה מ מתחת עם indenter נוקשה. גישה זו הוכח שוב ושוב לייצר פתולוגיה הרלוונטית קלינית במבחנה בודדת מערכות טוב8,9,10. העבודה האחרונה שלנו הראו כי זה בקלות להרחבה מדרגית לתבנית 96-ובכן תוך שמירה על הדופק משכים הסדר עשרות אלפיות השניה11, שזה הזמן תחום סגור ההשפעה ראש אירועים12,13.

לסיכום, היתרונות העיקריים של המודל פציעה במבחנה הם הפורמט 96-ובכן, השימוש hiPSCNs, תחום הזמן הרלוונטית קלינית של העלבון.

Protocol

1. סיליקון ניקוי רעלים

  1. חותכים 254 מיקרומטר עבה, 30.48 ס"מ x 30.48 ס"מ סיליקון ממברנות למלבנים 7.5 ס"מ 11 ס"מ באמצעות סכין גילוח ותבנית אקרילי. ממברנות מלבני 10 יכולה להתבצע באמצעות כל גיליון. שמור את הנייר שמגיע עם שהסיליקון.
  2. מקם את הקרומים באמבט של מים (DI) יונים עם סבון זכוכית. אחד בכל פעם, לקרצף את הקרומים נמרצות עם קצות האצבעות בכפפה לפחות 20 s או עד lathered.
  3. יש לשטוף את הקרומים תחת די מים זורמים עד הסבון lathered יוסר בעליל. שכב על הממברנות על הנייר (מתוך האריזה שלהם) וכתב autoclave על מחזור הכבידה.
  4. משרים כל קרום סיליקון ב 250 מ של 70% אתנול לכל קרום על שאכר מסלולית-סל ד 60 עבור 24 ח' שימוש מיכל עשוי חומר אינו מגיב עם אתנול, כגון פוליפרופילן.
    1. אם אחד או יותר ממברנה ממוקם בתוך סל אחד, או אם הקרומים לדבוק בתחתית סל, להפריד את הקרומים מהסביבה שלהם עם טיפים פיפטה פלסטיק, פיפטה עצה ארונות תקשורת.
  5. להעביר את הקרומים סיליקון עם ידיים בכפפות 250 מ של מים DI לכל ממברנה ומשרים על תפקודי לב / נשימה במשך 48 שעות-60 סל ד.
  6. שכב על הממברנות בחזרה על נייר ומניחים בתנור כלי זכוכית 93 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
  7. אחסן את הקרומים על הנייר, במקום נקי ויבש, מכוסה עוד גיליון נייר כדי להגן עליהם מפני אבק.

2. צלחת פבריקציה נוספת

  1. פלזמה מתייחסים עליון 96-ובכן צלחת עם מסך פלזמה W 200 מנקה (ראה טבלה של חומרים) 60 s על מתח גבוה, והציב אותה בצד-מלמטה בתוך הפלזמה מנקה. בדוק גם מהחלון של החדר, אשר מצביע פלזמה יעיל הקימה סגול זוהר. טכניקה זו מליטה היא ממאמרו של. Sunkara et al. 14
  2. בתוך 60 s, מניחים צלחת העליון 200 מ של 1.5% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) במים DI למשך 20 דקות, התחתון לצד השני. פתרון זה אינו יציב: להכין אותו לא יותר מ- 60 s לפני החדרת את הצלחת.
    התראה: לעבוד עם APTES בשכונה fume.
  3. פלזמה לטפל של קרום סיליקון שחולצו ב הפלזמה מנקה עבור 60 s על מתח גבוה. זמן הטיפול פלזמה כך שפעולתו לא יותר מ 5 דקות לפני סוף תקופת 20 דקות בשלב 2.2.
  4. השתמש מלקחיים למיקום קרום פלזמה מטופלים מעל מלבן נייר קלף2 7.5 x 11 ס מ. ישר על 7.5 ס"מ 11 ס"מ x 0.5 ס מ לוח אלומיניום על החלק התחתון של המלחציים פבריקציה נוספת צלחת. יישר את קרום סיליקון ונייר אפייה על אלונקה אלומיניום באמצעות מלקחיים.
    הערה: תכנון בעזרת מחשב (CAD) עבור התקן זה ניתנים הקבצים את החומרים משלימה בתור קובץ קוד משלים ' העיתונות למות - 3D הגנרית. שלב '. החשבון המשויך של חומרים מסופק משלים טבלה 1: מותאם אישית בנה מכשירים - BOM.xlsx.
  5. להסיר את צמרות צלחת של האמבטיה APTES ומנערים את עודפי פתרון. לטבול בתוך אמבט מים 200 מ ל DI עבור 5 s ו- shake את עודף המים. לטבול בתוך אמבט מים שונים 200 מ ל DI עבור 5 s ו- shake את עודף המים. להחליף את המים האלה אמבטיות לפני טבילה נוספת צלחת העליון.
  6. להשתמש באוויר דחוס כדי העליון צלחת יבשה לחלוטין.
  7. מניחים צלחת העליון בחלק העליון של המלחציים פבריקציה נוספת צלחת. בעדינות לסגור את המלחציים פבריקציה נוספת צלחת להקיש את הלוח העליון, סיליקון ביחד. מהדק לפחות שעה.
  8. לאפשר את הצלחת לרפא עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר לפני השימוש, מוגן מפני אבק.

3. מתיחה צלחת

  1. לנקות את indenters.
    הערה: ראה משלים איור 1.
    1. הכן sonicator בסגנון המרחץ W 60 עם יהלו מים בטמפרטורת החדר.
    2. תמיכה הרחוב indenter מעל האמבטיה sonicator, הפוך כך רק את החלק העליון של indenters טובע עד לעומק לפחות 1 מ מ. Sonicate את indenters במשך 8 דקות ב 42 קילו-הרץ.
    3. מכה יבשה את indenters עם אוויר דחוס.
  2. יישר את הבלוק indenter.
    1. מקם מצלמה עם שידור חי מעל המכשיר מתיחה כך זה מתבונן המערך indenter. להתמקד על החלק העליון של indenters.
      הערה: ההגדרה המתוארות בסעיף 4, "אפיון ממברנה למתוח," תהיה מלכודת אחת מצלמה אפשרי עבור משימה זו.
    2. לאבטח צלחת על הבמה של המכשיר פגיעה באמצעות המלחצות הבמה (איור 1) ולמקם אור כיפת על המכשיר.
      הערה: ראה טבלה של חומרים עבור תוכנת בקרת מכשיר.
    3. להפעיל את תוכנת בקרת מכשיר על-ידי לחיצה על סמל התוכנה על שולחן העבודה של המחשב הוא שליטה על המכשיר פציעה. להפעיל את הפרוייקט "in_vitro_neurotrauma.lvproj" על ידי לחיצה על זה בחלון השיגור. מתוך חלון project, להפעיל בקרת תנועה ומקם על כלי נגינה וירטואלי גשש "(VIs),", אשר נקראים 'motion_control.vi' 'position_tracker.vi', בהתאמה, באמצעות לחיצה כפולה עליהם.
    4. לסגור את הכלוב סביב ההתקן פציעה. לחץ על הלחצן 'חץ' בפינה השמאלית העליונה של הפקד תנועה השישי כדי להפעיל את השישי ולחץ על 'ליד למטה' כדי להוריד את הבמה כדי בתוך 2 מ מ של פנייה ישירה של indenters. לחץ על הלחצן 'עצור' כדי לעצור את השישי.
      התראה: שמור את הידיים ברורה של האלונקה בשעת טיפול המצלמה בכלוב. הכלוב צריך להיות מצויד עם מתג הדלת מספק כוח להתקן מתיחה רק כאשר דלת הכלוב סגורה.
    5. בחלון project, קליק ימני על 'ציר 1'. לחץ על 'לוח הבדיקה אינטראקטיבי'. בחלון שנפתח, קבע את גודל הצעד 50 מיקרומטר על-ידי הזנת '500' יחידות בשדה 'למיקום היעד'.
    6. לחץ על הכפתור הירוק 'לעבור' בתחתית החלון 'לוח הבדיקה אינטראקטיבי' שוב ושוב עד הלוח הראשון יוצר קשר עם כל indenters. בדוק אם יש קשר על התמונה בשידור חי המוצג על-ידי המצלמה. הערה מיקום הבמה אנכי דיווחו השמאלית העליונה של חלון 'לוח הבדיקה אינטראקטיבי'; זוהי העמדה ההתקשרות הראשונה.
    7. נמוך יותר (כפי שמתואר בשלב 3.2.6) עד כל טוב יצר קשר עם indenters. במידת הצורך, להזיז את המצלמה כדי לראות את כל הצלחת לעלות על הבמה (על-ידי ציון שלילי 'היעד עמדה') ולמטה. הערה מיקום הבמה אנכי דיווחו השמאלית העליונה של החלון כאשר כל ההודעות במגע (זהו המיקום קשר מלא).
    8. הערה ההבדל בין קשר ראשון לבין עמדות קשר מלא. סגור את 'לוח הבדיקה אינטראקטיבי'. הפעל את 'בקרת תנועה השישי"(ראה שלב 3.2.4) ולחץ על 'למעלה' כדי להעלות את הבמה. לעצור את בקרת תנועה השישי עם לחצן 'עצור'.
    9. לאחר השלב בחלק העליון של הנסיעה שלו, פתח את הדלת כדי לבטל את המכשיר. התאם את הברגים קבע על הפינות של גוש indenter. לשחרר את הבורג קבע על הפינה שגרם הקשר הראשון, תנמיך והדק את הבורג השני להרים את הפינה שגרם האחרון קשר.
    10. חזור על התהליך של הנמכת הבמה עד הצלחת המגעים indenters, בוחן את התמונות קשר עבור הטיה, העלאת הבמה, ואת התאמת (שלב 3.2.9) לחסום indenter. כאשר הבמה ואת בלוק מיושרים, יגרום indenters כל קשר בעת ובעונה אחת.
    11. פתח את הדלת כדי לנטרל את המכשיר. הכנס את הברגים עניבה-מטה לתוך החורים שלהם על הבלוק indenter והדק אותם. לאשר גוש אחד עם הברגים עניבה-למטה במקום (צעדים 3.2.4-3.2.8). שימו לב מיקום הבמה שדווחו על-ידי 'אינטראקטיבית הבדיקה החלונית' כאשר הצלחת מבצע קשר. זה יהיה האפס לניסויים כניסה.
  3. לשמן את indenters.
    1. אם הבלוק indenter רק הוגדרה יש לא ובכל זאת כבר יכולתי, לנקות כרית גומי מוצק (7.5 ס"מ x 11 ס"מ x 1.5 מ מ), משטח גומי קצף רך, תאים סגורים (7.5 ס"מ x 11 ס"מ x 3 מ מ) עם מגבון ספוג אתנול המעבדה. לאפשר להם לאוויר יבש.
    2. להשרות מגבון מעבדת שמן תירס ולהפיץ אותה על משטח גומי מוצק לזרוח משעמם.
    3. במקום משטח קצף על גבי משטח גומי מוצק כדי להעביר שמן משטח קצף. המקום של 7.5 ס"מ 11 ס"מ x 0.5 ס מ לוח אלומיניום על גבי משטח קצף ולטעון אותו עם נטל משקל של 360 גר' (למשל, 6 צינורות חרוט נטען עם 45 מ של מים כל) כדי להבטיח העברת עקבית של שמן מכל משטח גומי מוצק כדי לרפד את הקצף. לאפשר 10 s עבור הנפט להעביר משטח גומי מוקצף.
    4. להזיז את הפנקס פוליאוריתנים, מוצרי פוליאוריתן אל המערך indenter. מקם את לוח אלומיניום, ומשקל נטל עליו כדי להבטיח העברה עקבית של השמן עד קצות indenters. לאפשר 10 s עבור הנפט להעביר indenters.
    5. אם יש כבר מתוח אין לוחית מאז הרחוב indenter היתה להגדיר משיכור למר בפעם הראשונה, למתוח צלחת בדיקה לפני תחילת הניסוי.
      הערה: זה ימנע כל חוסר עקביות בין התמתחות ראשונה מותח עוקבות משתנה מתערב בניסוי. לפרקי עוקבות, חזור רק צעדים 3.3.2-3.3.5 לפני כל מתיחה.
  4. למתוח צלחת.
    1. לשמן את indenters כפי שמתואר בשלב 3.3.
    2. להבטיח את הצלחת על הבמה של המכשיר פציעה עם המלחצות הבמה. אם נדרשת עקרות, להתאים את מיקום המכסה כדי לאבטח את הצלחת מבלי לחשוף את פני התרבות לאוויר החדר.
    3. הנמך את הבמה האפס-מיקום באמצעות בקרת תנועה 'השישי ' (ראה שלבים 3.2.4-3.2.6); אפס-מיקום נקבעת במהלך שלב 3.2.
    4. שנה את שם הקובץ בשדה "נתיב קובץ" 'מקם השישי מעקב' לשם קובץ ייחודי, ואז להפעיל אותו עם הלחצן 'חץ' בפינה השמאלית העליונה של החלון.
    5. הגדר את עומק ואת משך הזמן של כניסה (בדרך כלל 1-4 מ מ ו- 30 ms, בהתאמה, עומק מרבי 5 מ מ, משך מינימלי 15 ms) 'פגיעה (מ מ)', 'משך הפציעה (ms)' שדות 'התנועה בלוח הבקרה השישי' על-ידי לחיצה על השדות הקלדת הרצוי ערכים.
    6. להפעיל את התנועה ב'לוח בקרה' VI' ולחץ על 'Injure' כדי להסיט פנימה את הצלחת.
    7. להעביר את הבמה למעלה לחלק העליון של הנסיעה שלו על ידי לחיצה על 'העליון'. אז תפסיק את השישי באמצעות לחצן 'עצור', לבטל את המכשיר פגיעה על-ידי פתיחת הדלת.
    8. בדוק את ההיסטוריה הזחה של השלב הציג את 'מקם המעקב השישי' כדי לאשר כי העקירה המרבי שצוין הוחל. לחץ לחיצה ימנית על הגרף ולחץ על 'ייצוא אל Excel'. לחץ על ' קובץ | שמירה ' כדי לשמור את הנתונים.

4. אפיון מתח הממברנה

  1. צבעו את ההפסקה בחלק העליון של כל לבן indenter כדי לספק רקע חדות גבוהה עבור צילום וידאו במהירות גבוהה.
    התראה: לא מצייר שולי indenters שם הם לעשות קשר עם צלחות.
  2. 3D להדפיס עם poly(lactic acid) (PLA), או אחרת לפברק, חותמת גלילי עם אשר ליצור נקודה כל טוב. להפוך את הצילינדר 5.9 מ מ קוטר, גבוה, עם בליטה גלילית 1.5 מ מ קוטר, 1.0 מ מ גבוהה 12.2 מ"מ שבמרכזה העליון.
    הערה: דגם להדפסה תלת-ממד ' חותמת. STL' זמין בתור קובץ משלים.
  3. פלזמה מתייחסים צלחת ימין בצד-להפעלת השטח התרבות התא סיליקון בבארות 60 s, כפי שהוזכר בשלב 2.1.
  4. מניחים את הצלחת על משטח גומי או משטח. פריים של בליטה קטנה על הבול (ראה שלב 4.2) עם דיו של עט טוש. הכנס את החותמת לתוך הבאר להיבדק והקש כדי להבטיח העברת טוב דיו. פריים החותמת לפני כל טוב.
  5. יישר את הבלוק indenter ולסוך את indenters של המכשיר פציעה (ראה שלבים 3.2-3.3). תהדק את הצלחת לבמה של המכשיר פציעה. הצב אור בהיר צירית לפזר מעל המכשיר פציעה.
  6. להציב מצלמה במהירות גבוהה על דוכן בום על המכשיר פציעה, פונה ישר כלפי מטה, עם העדשה מוגדר מהקטן לגדול ממוספרות עצירת f, תפעיל את זה. הפעל את תוכנת המצלמה במחשב המחובר למצלמה. מסגרת שיעור התפריט הנפתח, בחר 2,000 מסגרות לשנייה, ובשנת הצמצם הנפתחת תפריט, בחר הזמן המהיר ביותר חשיפה אשר מניב תמונות חדות גבוהה. מרכז על הבארות מנוקד.
    1. מקם את המצלמה כך בתחום התצוגה מכיל 12 בארות ברשת 3 x 4.
      הערה: שדה ראייה זו מציעה של פשרה אופטימלי בין התפוקה ואת הרזולוציה עבור תמונת-1280 × 1,024.
  7. הורידו את הצלחת אל נקודת-האפס (ראה שלבים 3.2.4-3.2.6). בלחיצה אחת הרשומה כפתור על תוכנת המצלמה כך שייקרא 'הגורם המפעיל ב'. ליזום הגשש עמדה השישי (שלב 3.4.4).
  8. הפעל את ' מאטום לשקוף ' הבהיר צירית. הסט פנימה את הצלחת כפי שמתואר בשלב 3.4.6 הרעלה-הכרה.
  9. כבה האור מפוזר צירית.
  10. במחשב בקרת מצלמה, למצוא את החלון ms 30-40 של ההקלטה שבה מתרחשת לחריצים: גרור החיצים ההתחלה והסוף בבר שהווידאו במהירות גבוהה תוכנת המצלמה. לחץ על שמור, להגדיר את השם בשדה 'שם קובץ', בחר 'TIFF' בשדה 'תבנית', לחץ על 'שמור'.
    1. לעבור. TIF-קבצים עבור תמונות של הפחות נמתח (מתחיל) ומתח ביותר הברית (שיא כניסה).
    2. כדי למדוד את הגובה ואת הרוחב של הנקודות ברשת גם תמונות, שימוש פיג'י לפתוח את תמונות של הפחות ואת מרב למתוח side-by-side. באמצעות הכלי בחירה מלבנית ברירת המחדל, לחץ וגרור כדי לצייר תיבה סביב נקודה בתמונה מתיחה לפחות. למדוד את הגובה ואת הרוחב עם ' נתח | מדידה '.
    3. חזור על הנקודה בבאר אותו על התמונה מתיחה שיא. חזור על שאר הבארות.
  11. לחשב את המתח לגראנז'יאן בכיוונים x ו- y כדלקמן:
    Equation 1
    Equation 2
    הערה: כאן, Exx הוא המתח לגראנז'יאן בכיוון x Eyy הוא המתח לגראנז'יאן בכיוון y , X הוא הרוחב של הנקודה, Y הוא הגובה של הנקודה, f מציין את התמונה הסופית (כלומר, התמונה כניסה שיא), אני מציין את התמונה הראשונית (כלומר, התמונה טרום כניסה). ממוצע של שני ערכים כדי לקבוע את הלחץ בתוך הבאר הזו.

5. ציפוי התאים בתרבית

  1. אוטוקלב פחי ומשקולות באלאסט שישמש עבור עיקור.
  2. פלזמה להתייחס את צלחות עם תחתית סיליקון נכון-הצד-עד 60 s (ראה שלב 2.1). מיד להטביע את הצלחות בסלי סטרילי המכיל אתנול 70% למשך 15 דקות.
  3. להטביע את הצלחות בתוך תמיסת מלח סטרילית פוספט buffered (PBS) בסלי סטרילי נפרד למשך 30 דקות.
  4. האחות של PBS מן הבארות. רק יבש לוח אחד בכל פעם כדי למנוע הבארות מאבד את הטיפול פלזמה.
    התראה: סיליקון צלחות bottomed לספק משוב משושי פחות מאשר צלחות קשיח כאשר pipetting, נוטים יותר לחסום את קצה פיפטה.
  5. להוסיף 100 µL של 0.1 mg/mL פולי-L-ornithine (אש ף) לכל טוב הלוחות מעוקר. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
  6. יש לשטוף את בארות פעמיים עם 100 PBS עקר µL, עוזב לשטוף את השני על הבארות עד התליה תא יהיה מוכן.
  7. הסר את בקבוקון hiPSCNs אחסון בחנקן נוזלי באמצעות כפפות בטיחות ומניחים על קרח יבש. להעביר את הצנצנת כדי באמבט מים 37 ° C ובמהירות להפשיר בדיוק 3 דקות. לא מערבולת המבחנה.
  8. בשכונה סטרילי, בעדינות העברת תכולת הבקבוקון צינור חרוטי 50 מ ל באמצעות פיפטה סרולוגית של 1 מ"ל.
  9. יש לשטוף את המבחנה קריוגני ריק עם 1 מ"ל של מדיום תחזוקה מלאה בטמפרטורת החדר (בסיס המדיה + תוספת).
  10. העברה של 1 מ"ל של מדיה לתוך הצינור 50-mL drop-wise-עם טיפה אחת לשניה. מערבולת בעדינות את הצינור תוך הוספת. הוסף 8 מ של טמפרטורת החדר תחזוקה מלאה בינוני הצינור 50 מ ל- טיפות על 2/s.
  11. קאפ הצינור ואת היפוך 2 - 3 פעמים. לספור את התאים עם hemocytometer. לחשב את עוצמת הקול של התקשורת נוסף נדרש לדלל התליה תא 225,000 תאים/מ.
  12. Pipette בעדינות את כמות מדיה (החישוב לעיל) לתוך הצינור של השעיה התא באמצעות פיפטה סרולוגית 25 מ.
  13. להוסיף 10 µL של 1 מ"ג/מ"ל מניות laminin לכל 1 מ"ל של השעיה תא עם micropipette µL 1,000 כדי להשיג 10 µg/mL של laminin ההשעיה התא. תשאף פעם אחת למעלה ולמטה עם קצה המשמש עבור laminin, ואז קאפ הצינור, היפוך הצינור פעם אחת.
  14. האחות של PBS של הצלחות, לוח אחד בכל פעם. השתמש פיפטה רב-ערוצי להוסיף 100 µL של התליה תא hiPSCN כל טוב. הבארות יש אזור התרבות של 0.33 ס מ2, אז צפיפות תא שטח היא 67,500 תאים/ס מ2.
  15. לנוח הלוחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאחר זריעה כדי לקדם את הקובץ המצורף. למניעת ויברציות מאוורר של תרבות סטרילי הוד, מקם את הצלחות מקורה על הספסל מעבדה. דגירה התרבויות ב 37 ° C עם 5% CO2.
  16. לבצע שינוי לסיקור ב- 24 שעות, מילוי הבארות עם 200 µL של התקשורת תחזוקה מלאה. לבצע חצי מדיה שינוי של µL 100/טוב כל 2-3 ימים.

6. ופצעו תרבויות

  1. יישר את הבלוק indenter ולמצוא את האפס כפי שמתואר בשלב 3.2. לשמן את indenters כפי שמתואר בשלב 3.3.
  2. הגדר את שם הקובץ על ההיסטוריה הזחה ברכיב 'עמדה המעקב השישי' (שלב 3.4.4). להגדיר את הפרמטרים פגיעה ב- 'בקרת תנועה השישי' (שלב ' ר 3.4.5).
  3. לוקח את הצלחת להיפצע מתוך החממה ו. תהדק את זה לבמה. להתאים את המיקום של המכסה כדי לאבטח את הצלחת מבלי לחשוף את התרבויות לאוויר החדר.
  4. . תוריד את הצלחת אל נקודת האפס (צעדים 3.2.4-3.2.6) באמצעות 'בקרת תנועה השישי'. להתחיל 'עמדה המעקב השישי' (שלב 3.4.4).
  5. השתמש בפקד תנועה השישי כדי להסיט פנימה את הצלחת (כפי שמתואר בשלב 3.4.6 הרעלה-הכרה). לפרקי המזויפים, לדלג על שלב זה בלבד.
  6. לחזור השלב העליון של טווח תנועה (ראה שלב 3.4.7). להחזיר את הצלחת החממה.
  7. לבדוק ולשמור את האיתור הזחה (כמו שלב 3.4.8).

7. מיקרוסקופ

  1. הכינו 10 x מכתים פתרון עם µg/mL 2 Hoechst 33342 ו-5 µg/mL Calcein AM בתקשורת תחזוקה.
  2. כתם אחד טוב עם יתד 20 µL של 10 x מכתים פתרון.
  3. תקופת דגירה של 15 דקות עם הכתם ב 37 º C.
  4. לרכוש תמונות פלורסנט שדה רחב. שימוש FITC המקובלת, דאפי לסנן קובע כדי בתמונה של Calcein AM Hoechst 33342 אותות, בהתאמה. אם הרצף הדמיה רב טוב ייקח יותר מ- 10 דקות, הקף את הצלחת ב חממה העליונה הבמה כדי לשמור על הבריאות של התרבויות.
    הערה: 10 X, עדשה נה 0.30 מספק מפורט מספיק לקביעת תא הכדאיות, מורפולוגיה. להתאים את הרווחים כדי להבטיח טוב החזיית neurites, אפילו אם זה גורם מסוימים רוויה של סומה הרבה בהיר יותר.
  5. קטע תמונות תא בשידור חי בערוץ Calcein AM ירוק כדי לזהות סומה neurites. להשתמש בתמונות גרעיני בערוץ Hoechst 33342 כחול כדי לסייע עם זיהוי סומא.

Representative Results

ההתקן האלונקה הוא מסוגל להעביר את הבמה repeatably עם דופק משכי זמן קצר ככל 10-15 ms בהתאם משרעת של הדופק (איור 2 א). Amplitudes הדופק מאוד הדיר, אך משך הדופק משתנה לפי כ 1 ms בין חזרות. משרעת הדופק בפועל מתפתל של משרעת הדופק שנקבעו כאשר מספר רב של בארות נטענים, משרעת שנקבע הוא גבוה (ראה איור 2B). כמו משרעת של עקירה הבמה הוא גדל מעבר 3 מ מ, משרעת הזחה בפועל יותר ויותר נופל קצר משרעת הזחה שנקבעו (ראה איור 2B). יישור זהיר של בלוק פוסט מבטלת כל המגמה המתח קרום על פני שורות או עמודות (איור 2C). 3.5 מ מ שנקבעו בשלב עקירה משרעת (3.3 מ מ הזחה בפועל משרעת) עם 52 בארות מדורגים, המתח לגראנז'יאן רשע על פני כל המיקומים טוב היה 0.451 (סטיית תקן של האמצעים עבור כל המיקומים = 0.051, ממוצע של סטיות תקן עבור כל המיקומים = 0.065, n = 5 מידות לכל טוב). תוצאות אלו מוצגים כאן וחותם למרות חלקם כבר דווח על11.

תרבות האופטימלית שציווית יהיו מעטים אם בכלל גושים של תאים יותר מ-5. Neurites יהיו בודדים, דק וארוך מעוקל מעט או ללא סימן למתח או פלאיירים (איור 3 א). בתנאים אידיאליים, הכדאיות של התרבויות מקרוב תתקרב הכדאיות שצוינו בגליון הנתונים של היצרן (בדרך כלל 60-70%), תרבויות על סיליקון צריך דומים לאלה המתוחזקים על-קונבנציונאלי תרבות נוקשה מצעים ( איור 3B). Neurites עשויה או לא עשויה להיות גלוי על מיקרוסקופ שדה בהיר צריכת חשמל נמוכה. ריכוז Laminin וגם תא צפיפות להשפיע על תרבויות בסיסית, לאחר פציעה. הגדלת צפיפות תא גדל את המספר והגודל של גושים שיצרו בתרבות. הגדלת ריכוז laminin לעתים קרובות counteracted את האפקט הזה (איור 3 א). עם זאת, הגדלת laminin של ריכוז מדי קהה הרגישות של התרבויות לפגיעה (איור 4). ריכוז laminin אופטימלית עבור תרבויות שציווית 50 µg/mL של laminin (איור 3), אך ההפרדה אופטימלי בין האוכלוסיות פצוע שאם ומגיעים הושג ב 10 µg/mL של laminin (איור 4). ריכוז גבוה של laminin להפחית את הרגישות של התרבויות פגיעה בנקודות זמן קצר (איור 4), אך גם בסיסית לשיפור הכדאיות תא נקודות זמן ארוך יותר (למשל, 7 ימים). לסיכום, יש כדי למטב את הריכוז laminin עבור כל תרחיש ניסיוני.

מתח הממברנה, נקודת זמן הדמיה לאחר פציעה, laminin לריכוז תא צפיפות כל המופעל אפקט הראשי מאוד סטטיסטית על האורך neurite בכל תא (ANOVA, p < 0.001). ההשפעה של עומס קרום על אורך neurite בכל תא היה משמעותי מאוד סטטיסטית אינטראקציות עם לאחר פציעה הדמיה זמן נקודת laminin ריכוז (ANOVA, p < 0.001) ואינטראקציה סטטיסטית עם התא צפיפות (ANOVA, p < 0.05). באופן דומה, קרום המתח, לאחר פציעה הדמיה נקודת זמן, תא צפיפות ולאחר laminin ריכוז כל המופעל השפעה הראשי מאוד סטטיסטית על התא הכדאיות (ANOVA, p < 0.001). ההשפעה של מצוקת קרום התא הכדאיות היתה של אינטראקציה מאוד סטטיסטית עם נקודת זמן הדמיה לאחר פציעה (ANOVA, p < 0.001) ואינטראקציה סטטיסטית עם צפיפות התאים (ANOVA, p < 0.05). תוצאות אלה מוכיחים כי תזמון, צפיפות התאים, וריכוז laminin להפעיל השפעה חשובה על הקשר בין עלבון יישומית ותוצאות ניסיוני, אז כל אחד צריך להיות אופטימיזציה בזהירות.

הכדאיות נמוכה בתא, neurites חרוזים, יחד עם צמיחה neurite ננסיים, מצביעים על תרבות רעילים תנאי זה יכול לנבוע כראוי מוכן סיליקון. לדלג על או קיצור להשרות את המים או את התנור יבש יכול להשאיר אתנול נספג או מים ממברנה, בהתאמה, אשר ניתן לפזר לתוך כלי התקשורת ומתח את התאים. תרבויות היטב הפצועים הפחיתו הכדאיות תא, neurites מקוצר או חסרים, חרוזים neurites ו- neurites זה נראה מתוח או tensioned. פציעה עלול לגרום clumping בתרבויות תא שהיו משלפני מפוזר היטב. גושים גדולים יכולים לבלבל את ניתוח מורפולוגי. עבור ניתוח מורפולוגי, רמת פציעה אמור להיות מכוון כאלה מתרחשים שינויים מורגש, אבל התאים עדיין קיימות עם כמה neurites.

Figure 1
איור 1 : א שכותרתו סכמטי של המכשיר פציעה. מבט מלמעלה (A), מבט איזומטרי (B), מבט מלפנים (C), תצוגה בצד ימין (D). סרגל קנה מידה חל על התצוגות אורתוגרפיים (A, B ו- D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : קינמטיקה של העלבון מכני. היסטוריה (A) העקירה בשלב מעל 5 פולסים במגוון של מרשם amplitudes (מרשם amplitudes מופיעים במקרא) כאשר אין בארות נטענים. היסטוריה (B) העקירה בשלב מעל 10 פולסים במגוון של מרשם amplitudes (מרשם amplitudes מופיעים במקרא) כאשר בארות 52 נטענים. (ג) המתח הממוצע בכל היטב עם הבמה משרעת הזחה של 3.3 מ מ (n = 5 מידות לכל טוב, ממוצע תקן שגיאה לכל טוב = 0.029). שימו לב כי C4-F4 ו C9-F9 שליטה unstretched בארות. דמות זו שונתה מ. שרמן ואח 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : אופטימיזציה של תרבות תנאים על סיליקון. (א) ההשפעה של משתנה צפיפות תא ריכוז laminin על תרבויות hiPSCN על סיליקון. הצליעה גדל עם צפיפות תא ולהקטנה laminin ריכוז. צפיפות תא ריכוז laminin חייב להיות מוטבת להשגת התפזרו מונו תרבויות. תרבויות התפזרו מונו פגיעים פחות חפצים במהלך כמת. שימו לב כי הטווח הדינמי הותאם כדי למטב את החזיית neurites. כתוצאה מכך, רוויים של סומה הרבה בהיר יותר. מצגת זו היא עדיפה על החלופה של אופטימיזציה של הטווח הדינמי ביחס סומא, ההופכת את neurites דימר הרבה וכמעט בלתי נראית. התנאי מודגשת על ידי הכיכר האדומה הוערך אופטימלי עבור ניסויים במבחנה פציעה מתיחה. (B) בתנאים אופטימליים, תרבויות על ממברנות הסיליקון מופיעים דומים לתרבויות על-קונבנציונאלי סובסטרטים נוקשה. החלונית השמאלית מציגה את hiPSCNs תרבותי-תאים/cm 33,7502 עם µg/mL 3.3 של laminin על צלחת 96-ובכן קונבנציונאלי, נוקשה (המצע התרבות התא הוא פולימר שיתוף אולפין מחזורית תרביות רקמה מטופלים). החלונית ' נכון ' מתרבה לוח במסגרת אדומה (א). גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : על פנוטיפ פציעה והתלות שלו laminin ריכוז. (א) תרבות בריא, באמצעות µg/mL laminin 10 תאים 67,500/cm2. Neurites הם הרבה זמן עם אין חרוזים. ישנם כמה גרעינים מת, כמה גושים. תרבות (B) משתמש באותם תנאים תרבות, נפגע עם 57% בשיא המתח, השיקוף לאחר 4 h Neurites יקוצרו או חסרים, ובחלקם יש חרוזים (המסומנים על ידי חצים). ישנם פחות תאים Calcein AM-חיוביים ושליליים יותר Calcein AM-גרעינים (קרי, מת). פציעה גדל clumping בין התאים התקינים. (ג) 4 שעות לאחר פציעה, אורך neurite בכל תא מסרב עם הגדלת המתח באופן תלוי ריכוז laminin. (ד) 4 שעות לאחר פציעה, הכדאיות תא מסרב עם הגדלת המתח באופן תלוי ריכוז laminin. (E) 24 שעות לאחר פציעה, אורך neurite בכל תא מסרב עם הגדלת המתח באופן תלוי ריכוז laminin. (F) 24 שעות לאחר פציעה, הכדאיות תא מסרב עם הגדלת המתח באופן תלוי ריכוז laminin. (n = 4 לכל בר, קווי שגיאה הינם ± 1 סטיית תקן, סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר). זן ערכים הם להסיק הזחה הבמה באמצעות נתוני פרסום מראש על-ידי. שרמן ואח 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלים איור 1: טכני ציור indenter. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.

משלים טבלה 1: מותאם אישית שנבנה התקנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.

Pinout צלחת טוב-מטעין משלים טבלה 2:96 חיווט דיאגרמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.

קוד משלים קובץ 1: תכנון בעזרת מחשב ציורים של המכשיר פציעה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ קוד משלים 2: תכנון בעזרת מחשב ציורים של המלחציים פבריקציה נוספת צלחת- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

3 קובץ קוד משלים: ייצוג תלת-ממדי של הגיאומטריה חותמת, מתאים לשימוש עם מדפסת תלת-ממד- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

4 קובץ קוד משלים: SubVI של MuStLiMo_si_initialize.vi, אשר הוא SubVI עבור motion_control.vi. ממיר ערכים בתיבות הדו-שיח פרמטרים עבור תנועה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קוד משלים קובץ 5: SubVI עבור מספר Moves_simplified.vi קו ישר, אשר הוא SubVI עבור motion_control.vi. ממיר ערכים בתיבות הדו-שיח פרמטרים עבור תנועה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

6 קובץ קוד משלים: SubVI עבור position_tracker.vi. מונה רצועות הזחה קלט מן אנקודר לינארי. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ קוד משלים 7: ביסוס הפרוייקט LabVIEW. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

8 קובץ קוד משלים: טופ השישי רמת המעביר את המכשיר- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

9 קובץ קוד משלים: SubVI עבור motion_control.vi. ביצוע העקירה מהירה המותח את הצלחת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

10 קובץ קוד משלים: SubVI עבור motion_control.vi. ביצוע העקירה איטי שזז על הבמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

11 קובץ קוד משלים: SubVI עבור motion_control.vi. חלקות היסטוריה הזחה (בדרך כלל עם) בלוח הבקרה של motion_control.vi. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

12 קובץ קוד משלים: טופ השישי רמת שמתעדת את ההיסטוריה הזחה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

13 קובץ קוד משלים: מכיל Variable2, אשר מקיים תקשורת בין motion_control.vi position_tracker.vi. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

14 קובץ קוד משלים: סכימטי של מעגל מודפס. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

15 קובץ קוד משלים: פריסה עבור מעגל מודפס. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

המפתח להשגת עקבית, biofidelic פנוטיפ במודל זה הוא יישום של עלבון מכני biofidelic עקבית. מודל זה ניתן להפיק הדופק משכי זמן קצר ככל 10-15 ms, אשר דומים המשכים הדופק בהשפעה האנושית ראש לפי ניסויים cadaveric12,13. מרקם של העלבון הזה תלוי היישור של הצלחת עם הרחוב indenter שימון עקבית של indenters. כאשר הרחוב indenter מיושרים כראוי, יש אין מגמת המתח שהוחלו על פני שורות או עמודות (איור 2C). שכבה דקה של חומר סיכה בדרך כלל יוצר פחות חיכוך מאשר שכבה עבה, ונארזים צמיגה אינה מומלצת מאחר שהם עבירה שהסיליקון ומשנים את המעבר של אור במהלך מיקרוסקופ. משרעת הזחה הבמה בפועל יכול ליפול באופן משמעותי קצר משרעת הזחה שנקבעו בעת indenters רבים משמשים, משרעת הזחה הבמה שנקבע הוא גדול (> 3 מ מ). עם זאת, בעוד המנוע בפועל הוא פחות מ העקירה שנקבעה ב- amplitudes גדול, הוא נשאר הדיר (איור 2B). לכן, amplitudes displacements גדול, בפועל ניתן להשיג באופן אמין על-ידי הזנת ערך הקבוע מעל הערך הרצוי. משרעת הזחה חשובה רק משום proxy מוקלט בקלות לזן ממברנה של פיק, אשר מודד ישירות את העלבון מכני שגורם פתולוגיה. לכן, ההליך המתואר לקביעת קרום המתח מן הבמה העקירה הוא קריטי. תהליך זה יש לחזור אם כל רס ן שינויים למערכת משפיע על האינטראקציה בין הצלחת לבין indenters, לדוגמה אם שונה indenters קוטר, חומרים שונים indenter או ציפויים או סוגים שונים של סיליקון צלחת bottomed משמשים. התהליך של מסדר מחדש את הבלוק indenter וקביעת המיקום אפס יש לחזור בתחילתו של כל ניסוי. תיאור סכמטי של המכשיר מתיחה מוצג באיור1. דגמי תיב ם נדרש לשחזר את המכשיר ניתנים כמו תוספת חומרים: "פגיעה בהתקן - הרכבה מלאה - 3D הגנרית. שלב '; החשבון המשויך של חומרים הניתנים כמהמשלים טבלה 1: מותאם אישית בנה מכשירים - BOM.xlsx. ראה גם משלים טבלה 2 96 טוב צלחת _loader Pinout חיווט Diagram.xlsx, המתאר את חיבורי הכבלים המחברים את הרכיבים השונים של המערכות. 'Interconnector_circuit_board.dip' מתאר מעגל זה חיבורי הכבלים.

אם ההתקן מבוטלת עם הבמה ליד באמצע הנסיעה שלו, השלב מעביר לאחר החשמל מנותק כי זה קפיץ. כאשר הכוח משוחזר, יאתר לולאת המשוב הבדל גדול בין המיקום האחרון שנקבע מוכרות את המיקום בפועל. זה יגרום את הבמה לעבור לפתע המיקום שהיה כאשר ההתקן בוטלה. תנועה פתאומית זו עשויה לגרום לשגיאות בפלט של המקודד, אז צריך לקחת לנטרל את המכשיר רק כאשר הוא בתוך שלו כשהוא אינו מחובר לחשמל נח מיקומו בראש של הנסיעה שלה.

המלחציים פבריקציה נוספת מיועדת להפגיש את החלק התחתון של הגוף, סיליקון צלחת באופן המאפשר מליטה אופטימלית. לשם כך, ישנן שלוש תכונות מרכזיות בעיצוב הציג בקובץ משלימה ' העיתונות למות - 3D הגנרית. שלב '. ראשית, בעל גוף צלחת קלאמפ הוא מקביל לתחתית סיליקון. אם זה בנוי כראוי, זה ידרוש. אין התאמה לאחר ההתקנה הראשונית. שנית, השכבה של פוליאוריתנים, מוצרי פוליאוריתן ב המלחציים מספק כמות קטנה של תאימות כתשר, כמו מערכת נוקשה לגמרי תיאורטית לחוות עלייה פתאומית של אפס כח לכוח clamping אינסופית כאשר המלחציים היה סגור. המיקום של המוט ובורג set של המלחציים הם מתכווננת כך המרחק בין שני הצדדים של המלחציים יכול להיות מכויל.

כל מאמץ לספק רקע בהיר, לבן מאחורי הנקודה בתחתית טוב במהלך הניסויים אפיון זן. יותר טוב הניגוד בתמונות האלה, יהיה קל יותר יהיה כדי להפוך לאוטומטי את תהליך למדוד את הגובה ואת הרוחב של הנקודה, אשר יכול להיות מייגע עבור אופרטור אנושי לנתח ניסוי גדול. צילום וידאו מהיר בתחתית הבאר בצלחת 96-ובכן מציג אתגרים בגלל הקירות של הבאר נוטים מטילים צללים. השימוש של כיפת אור או לפזר אור צירית שיכול להעיר לאורך לקו הראייה של המצלמה ללא טשטוש התמונה מבטל צל או השתקפויות סימונים להתעורר עם מקור אור קונבנציונלי. מקור האור זמין המבריקים אמור לשמש כי תאורה מוארת מאפשר תמונות כדי לרכוש עם זמן חשיפה קצרה. פעמים חשיפה קצר למזער טשטוש תנועה. שדרוג האור דיודות (נוריות) באור צירית ' מאטום לשקוף ' מאפשר חשיפה קצר יותר, בתקופת רכישת וידאו במהירות גבוהה. הנוריות ניתן לשדרג על-ידי פתיחה צירית האור מפוזר, הסרת המניה נוריות, הרכבה 4 הספק גבוה LED מערכים לחלונית גב באמצעות נוריות מחזיקי חיבורם מתח קבוע הנוכחי, ומכנס חזרה האור מפוזר צירית (ראה טבלה של חומרים עבור מספרי קטלוג). החיסרון של שדרוג הנוריות הוא כי נוריות מקורר פסיבי לא יכול להישמר יותר מכמה שניות בשל הסיכון של התחממות יתר. לכן, באור אחר יש צורך יישור ההתאמה בלוק שלאחר ומצלמה.

השיטה הציג לכמת את מתח הממברנה על ידי מדידת התרחבות של נקודה חותמת על הקרום גסה יחסית, אבל זה יכול קנה המידה למערכת בארות מרובות בצורה איתנה. השדה זן לרוחב החלק התחתון טוב יכול להתאפיין בפירוט רב יותר באמצעות תמונה דיגיטלית המתאם. טכניקה זו כוללת ריסוס דפוס מנומר על גבי הבסיס של הבאר והדמיה על זה ואז במהירות גבוהה במהלך דפורמציה. תוכנה מסחרית ואז ניתן לכמת את המתח בכל נקודה בתמונה על ידי מעקב אחר ההתפתחות של דפוס מנומר.

פרוטוקול זה מייצר הפנוטיפ פציעה ומגובש, הרלוונטית קלינית, מתיחה ב- hiPSCNs. מוות של תאים, ניוון neurite ו- neurite ואגלי sequelae כל מתועדת היטב של TBI בבני אדם, חיה מודלים15. המפתח להצלחה במודל זה הוא ביסוס ושמירה על תרבויות בריא. באופן כללי, פרוטוקול תרבות תא פיתח עם צלחות קשיח קונבנציונלי הוא נקודת התחלה כדאי לתרבות צלחת מתיחה. עם זאת, האפשרות כי בתאים עשוי להגיב באופן שונה על סיליקון תמיד צריך לקחת בחשבון. הדבר נכון במיוחד של hiPSCNs, אשר רגישים מאוד לתנאים תרבות. כמה דוגמאות של אופטימיזציה של צפיפות תא ריכוז laminin מסופקים במקטע תוצאות נציג (איור 3, איור 4). הפעלה של שהסיליקון עם טיפול פלזמה היא חיונית. סיליקון הוא הידרופובי אינרטיים; במצבו הטבעי, זה לא תחייב laminin או מולקולות אחרות בשימוש על מנת לקדם התא מצורף. טיפול פלזמה הופך את השטח הידרופילית וחושף קבוצות תגובתי. שינויים אלה מאפשרים מולקולות אדהזיה לאגד שהסיליקון ולקדם התא מצורף. חשוב לציין כי ההשפעה של טיפול פלזמה כלתה בתוך דקות אלא אם השטח שקוע בנוזל, ולכן יש לבצע הליכים המערבות ייבוש השטח מופעל מהר ככל האפשר. דרך פשוטה לבדוק אם ההשפעה של טיפול פלזמה חדלה היא למקם droplet של מים על פני השטח. על סיליקון אינו מטופל, ה-droplet חרוז למעלה ואילו על פלזמה מטופלים סיליקון, זה עלול להתפשט. עם hiPSCNs פעם (ראה טבלה של חומרים), היצרן ממליץ על הוספת את laminin עם השעיה תא ולא ציפוי מראש. פרוטוקול זה שילבה גישה זו בהצלחה. בעוד פילוח, באופן תיאורטי, ניתן לבצע עם תוכנת קוד פתוח או שפות תכנות למטרות כלליות, רמה גבוהה של מיומנות עם כלים אלה נדרש כדי להשיג תוצאות טובות. Neurites הם לעתים קרובות קשה להבחין בין רקע אות כי הם כל כך רזה. לכן, אנו ממליצים על שימוש בכלים תוכנה מסחרית מופץ על ידי מיקרוסקופ תוכן גבוהה חברות עם מודולים ייעודיים עבור פילוח, כימות של הנוירונים, אם הם זמינים. אפילו עם תוכנה מסחרית, מומלץ לייצא תמונות של פילוח לאימות חזותי של דיוק.

ישנן כמה מגבלות הקשורים עובד ב לוחות מתיחה לעומת עבודה עם לוחות קונבנציונלי, נוקשה. לוחות מתיחה יכול לדימות כרגיל עם האוויר יעדים. עם זאת, הדמיה עם טבילה יעדים קשה מאוד. עדשה שמן עלול לגרום נזק שהסיליקון. בנוסף, המטרה מפעילה לחץ על קרום סיליקון כפי שהוא נע כלפי מעלה. הלחץ הזה מזיחה את הקרום אנכית, ולכן קשה להביא את הדגימה אל המוקד. הממברנות סיליקון כיום בשימוש בדיית הלוחות הם בעובי כ- 250 מיקרומטר. עובי זה חורג מרחק מוקד הרבה מתח גבוה, מטרות טבילה. טיפול מיוחד יש לנקוט כדי להניח את הקרומים שטוח לחלוטין מחבר חובק למעקה כדי להשיג את שטיחות הדרושות מיקרוסקופ. פוקוס אוטומטי מערכות יכול לפצות על סטיות ב השטיחות של צלחת סיים במידה מסוימת. גירסאות עתידיות של הפרוטוקול מראש ייתכן מתח הקרום לפני זה מודבקת לפסגה צלחת כדי להבטיח שטיחות. ההליך ללא דבק להדבקה קרום סיליקון צלחת העליון14 נחשב של כוח חשוב בפרוטוקול הנוכחי. זה מבטל את הסיכון neurotoxicity של הדבק, כמו גם כל הסטיות של שטיחות בשל עובי לא אחידה של שכבת דבק.

מערכים רב אלקטרודה משמשות בדרך כלל בניסויים עם hiPSCNs כדי להעריך שלהם בגרות ופונקציונליות. למרבה הצער, מערכות אלו אינם תואמים מודל זה בגלל המצע התרבות התא הוא נוקשה. זה אפשרי ליצור מערך רב אלקטרודה מתיחה, למרות זה עד כה רק כבר הוכיחה יחיד גם לעצב16,17. שימו לב כי indenters ניתן להסיר בנפרד הבלוק indenter כך מספר בארות מוסטות פנימה לא יכול לשמש שמס. הסרת את indenter מונע כניסה אך לא מונע לחלוטין את טעינת מכניים מאז יש אינרציה עדיין תנועה של נוזל הבארות נע הבמה. שווה להשוות את הבארות הללו כדי בארות הצלחות שהיו מעולם לא נתונים הבמה תנועה כדי למדוד כל השפעה פתולוגי של נוזלים. כמו כן, המערך של indenters בבלוק צריך להיות bisymmetric (סימטרי מ מלפנים לאחור, לצד). אמצעי זהירות זה מבטיח כי הצלחת אחיד נטען במהלך הכניסה, כך השלב לא הטה הצידה, לגרום המוטות לאגד ב המשאות שלהם.

אחד מהאתגרים העיקריים לחדשנות טיפולית ב neurotrauma הוא המורכבות והטרוגניות של המצב. טראומה חל על מתח רב מודאלית בכל סוג תאים במערכת העצבים המרכזית בו זמנית. נוירונים נוצרו באופן אמין מתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSCs), עכשיו זמינים באופן נרחב של ספקים מסחריים. חדשנות מתקדם במהירות בתחום זה, סוגי תאים עצביים אחרים כגון האסטרוציטים18 ו מיקרוגלייה19 הם להיות נגזרת גם hiPSCs. יתכן בהקדם האפשרי לבודד את התגובות התא האוטונומי של כל אחד מסוגי התאים ל טראומת במבחנה ולאחר מכן ל תרבות משותפת לסוגי תאים שונים כדי להבין איך הם מתקשרים אחרי טראומה. בדרך זו, בסופו של דבר ייתכן אפשרי לשחזר את האתגר קליניים מלמטה למעלה להבין אותה באופן יסודי במערכת האנושית. גישה זו היא נבדלת הגישה המקובלת להסתמך על מודלים מכרסמים ויש לו פוטנציאל ליצור תובנות הרומן להוביל לטיפולים הראשון עבור מצב זה נפוץ, הרסנית, סורר.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך בחלקו על ידי מענק של מכוני הבריאות הלאומיים (R21NS098129). נשמח לקבל סיוע טכני מעולה סוזן חן, ג'ונתן טאן, קורטני קבנו, שי קאי Ng, Bu יואן פנג, אשר תוכנן ונבנה מבנה לתמוך אורות להשתמש במהלך במהירות גבוהה הדמיה הניסויים המתוארים בכתב היד .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
.010" Silicone Sheet Specialty Manufacturing, Inc #70P001200010 Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen Fisher Scientific  #043204
Nunc 256665 Fisher Scientific  #12-565-600 Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes ULINE S-8115
Plasma Cleaner Harrick Plasma #PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich #440140 APTES
Parchment Paper Reynolds N/A
Dome Light CCS inc LFX2-100SW
Dome Light Power Supply CCS inc PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit             Siemens Nerlite DOAL-75-LED Diffuse axial light
High Power LED Array                 CREE XLamp CXA2540 High Power LED Array                
LED holder Molex 1807200001 LED Holder  
LED power supply Mean Well HLG-320H-36B Constant Current Power Supply   
FastCam Viewer software  Photron camera softeware
Fastcam Mini UX50 Photron N/A High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 Nikon #1455 High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich #P4597
iCells Cellular Dynamics International #NRC-100-010-001
iCell media Cellular Dynamics International #NRM-100-121-001 
iCell supplement Cellular Dynamics International #NRM-100-031-001
Laminin Sigma-Aldrich #L2020
Hoechst 33342 Fisher Scientific  #H3570
Calcein AM Fisher Scientific  #C3099
voice coil actuator  BEI Kimco LA43-67-000A 
optical linear encoder  Renishaw T1031-30A 
servo drive Copley Controls Xenus XTL 
Controller National Instruments cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller 
cRIO chassis National Instruments cRIO 9113
digital input module National Instruments NI 9411
data acquistion chassis National Instruments NI 9113
LabVIEW National Instruments instrument control software
hiPSCNs Cellular Dynamics International

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. (2010).
  2. Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15, (1), 1216-1236 (2014).
  3. Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14, (6), 781-795 (2014).
  4. Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19, (11), 4263-4269 (1999).
  5. Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21, (6), 1923-1930 (2001).
  6. Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21, (1), 61-72 (2004).
  7. Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28, (11), 2203-2218 (2011).
  8. Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150, (2), 192-201 (2006).
  9. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101, (2), 434-447 (2007).
  10. Kang, W. H., Morrison, B. 3rd Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14, (3), 561-575 (2015).
  11. Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
  12. Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
  13. Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
  14. Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11, (5), 962-965 (2011).
  15. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
  16. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48, (10), 945-954 (2010).
  17. Yu, Z., Morrison, B. 3rd Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103, (1), 499-510 (2010).
  18. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9, (2), 600-614 (2017).
  19. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22, (11), 1358-1367 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics