Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Neuroscience
 

Summary

Burada bir 96-iyi biçimde travma etkisi ilgili bir zaman ölçeği üzerindeki insan vitro manken streç yaralanma için bir yöntem mevcut. Bu mekanik hakaret, kültür ve hücreleri yaralanmasına, görüntü ve yaralanma ölçmek için yüksek içerik analizi miktarının gerilebilir tabak imalatı için yöntemler içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Phillips, J. K., Sherman, S. A., Oungoulian, S. R., Finan, J. D. Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format. J. Vis. Exp. (134), e57305, doi:10.3791/57305 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Travmatik beyin hasarı (TBY) Yüksek morbidite ve mortalite ile büyük bir klinik sorun olduğunu. Önceden klinik araştırmalar yılların rağmen hiçbir kanıtlanmış tedaviler Tby için geliştirilmiştir. Bu kağıt varolan önceden klinik modelleri tamamlamak amacıyla önceden klinik neurotrauma araştırma için yeni bir yöntem sunuyor. İnsan patofizyolojisi İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlar (hiPSCNs) aracılığıyla sunar. Yükleme darbe elde süre yükleme süreleri klinik için benzer kapalı kafa etkisi yaralanma. Yüksek işlem hacmi deneyler kolaylaştırır ve pahalı hücreleri ve kültür Kimyasalları verimli kullanır bir 96-şey biçimi kullanır. Silikon membran Nörotoksik iyileşmemiş polimer kaldırmak için ilk tedavi ve gerilebilir 96-şey tabak oluşturmak için ticari 96-şey plaka vücuduna bağlanmış. Özel olarak oluşturulmuş bir cihaz mekanik hücre kültür Wells yaralı equibiaxial mekanik zorlanma inducing bazılarını veya tümünü altında iyi dipleri girinti oluşturmak için kullanılır. Girinti derinlik ve mekanik zorlanma arasındaki ilişkiyi ampirik olarak yüksek hızlı videografisi iyi dipleri, girinti sırasında kullanılarak belirlenir. Hücreleri, hiPSCNs, dahil olmak üzere geleneksel hücre kültür protokolleri değiştirilmiş sürümlerini kullanarak bu silikon membran kültürlü. Hücre kültürleri floresan mikroskobik görüntülerini elde ve yaralanma yaralanma her iyi düzeyini ölçmek için yarı otomatik bir moda sonra analiz. Sunulan model hiPSCNs için en iyi duruma getirilmiş ancak teorik olarak diğer hücre tipleri için uygulanabilir.

Introduction

Tby civarında 52,000 ölümler ve 275,000 olabilecek her yıl1neden bir önemli mortalite ve morbidite Amerika Birleşik Devletleri'nde nedenidir. 30'dan fazla klinik aday therapeutics Tby için tek başarı2olmadan yapılmıştır. Bu üniforma başarısızlık insan özel işlemler sık kullanılan önceden klinik kemirgen modellerinde gözlenen patofizyolojisi insan Tby ayrı öneriyor.

HiPSCNs gelişiyle neurotrauma bir insan vitro modelde eğitim için bir fırsat yarattı. HiPSCN tabanlı modeller ile eleme uyuşturucu kemirgen hücreleri istihdam modelleri klinik başarısı daha akıllı sonuçlar. Ayrıca, hiPSCNs genetik olarak ayırmak ve bireysel insan genetik varyantların etkisi patoloji3çalışma için manipüle edilebilir.

Bu el yazması açıklanan yöntemi hiPSCN tabanlı hastalığı neurotrauma için modelleme benzersiz avantajları getirmek için tasarlanmıştır. Vitro streç yaralanma neurotrauma iyi kurulmuş4,5,6 birincil kemirgen hücreleri ve insan sinir kanser hücre hatları ile modellerdir. Bu modellerin çoğu streç pnömatik silikon membran yükleyerek oluşturmak. Bu yaklaşım tek bir iyi biçimde etkilidir ama çok iyi biçim7toplanmakta zor kanıtlamıştır. Sonuç olarak, bir yüksek üretilen iş ekran streç yaralı nöronlar tedavisi aracıları için olmamıştı.

Bu modelde, membran altında sert bir uç ile girinti nedeniyle uzanır. Bu yaklaşımı art arda klinik patoloji vitro tek iyi sistemleri8,9,10' oluşturmak gösterilmiştir. Son çalışmalarımız bu kolayca bir 96-şey formatını hangi etki alanının baş etkisi olaylar12,13kapalı zamanı darbe süreleri milisaniye11, onlarca sırasını koruyarak ölçekler olduğunu göstermiştir.

Özetle, 96-şey biçimi, hiPSCNs kullanımı ve klinik saat alan hakaret bu vitro yaralanma modeli anahtar avantajları bulunmaktadır.

Protocol

1. silikon detoksifikasyon

  1. 254 µm kalınlığında, 30.48 cm x 30.48 cm silikon membran bir tıraş bıçağı ve akrilik bir şablonu kullanarak 7.5 cm x 11 cm dikdörtgenlere kesti. 10 dikdörtgen membranlar her sayfası ile yapılabilir. Silikon ile gelir kağıt tasarrufu.
  2. Membranlar deiyonize (DI) su cam sabun ile bir fıçı yerleştirin. Teker teker, membranlar şiddetle eldivenli parmak için en az 20 ile fırçalayın s veya yayılması kadar.
  3. Membran lathered sabun gözle görülür kaldırılana kadar akan DI suyun altında yıkayın. Membranlar (onların paketinden) kağıt ve otoklav yerçekimi döngüsü üzerinde yatıyordu.
  4. Her silikon membran % 70 etanol membran üzerinde 24 h kullanım için bir orbital Çalkalayıcı-60 RPM başına 250 ml etanol, polipropilen gibi ile tepki vermez bir malzemeden yapılmış bir kapsayıcı emmek.
    1. Birden fazla membran tek bir depo yerleştirilmişse veya depo gözünün alt membranlar sadık, membranlar çevreleri plastik pipet ipuçları ile ayırmak ve ipucu raflar pipet.
  5. DI su membran başına 250 mL silikon membran eldivenli ellerle aktarmak ve 60 rpm'de 48 h için orbital Çalkalayıcı ıslatın.
  6. Membranlar geri kağıt ve 93 ° C cam fırın 4 h için bir yerde yatıyordu.
  7. Temiz ve kuru bir yerde kağıt, kağıt onları topraktan korumak için başka bir levha ile kaplı membranlar mağaza.

2. plaka imalat

  1. Plazma temizleyici bir 96-şey levhadanoluşan üst 200 W plazma ile tedavi ( Tablo malzemelerigörmek) 60 s yüksek güç, aşağıdan yan yukarıya içinde plazma temizleyici yerleştirerek. Mor kızdırma odası, hangi etkili bir plazma oluşturmuştur gösterir pencereden görünür olup olmadığını denetleyin. Bu bağ teknik Sunkara ve ark. adapte 14
  2. İçinde 60 s, 200 mL % 1,5 (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) 20 dk, DI suda levhadanoluşan üst yer alt tarafı aşağı. Bu çözüm kararsız: 60'dan daha fazla hazırlamak s plaka tanıtımı önce.
    Dikkat: İş APTES bir duman Hood ile.
  3. Plazma tedavi ayıklanan silikon membran plazma temizleyici için 60 s yüksek güç. Adım 2.2 20 dk dönemin sonundan önce en fazla 5 dk bitene öyle ki plazma tedavi zamanı.
  4. Forseps tedavi plazma zarı 7.5 x 11 cm2 parşömen kağıt dikdörtgen üstüne konumlandırmak için kullanın. Bir 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm alüminyum levha plaka imalat kelepçe alt kısmına hizalayın. Forseps kullanarak alüminyum levha silikon membran ve parşömen kağıdına hizalayın.
    Not: Bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyaları bu aygıt için ek malzemeler bir ek kod dosyası olarak sağlanır ' basın Die - Genel 3D. ADIM '. İlişkili ürün reçetesi içinde sağlanan ek tablo 1: özel cihazlar - BOM.xlsx inşa.
  5. Plaka üstleri APTES banyodan kaldırmak ve fazla çözüm sallamak. 5 s ve aşırı su kapalı sallamak için 200 mL DI su banyosu içine daldırma. 5 s ve aşırı su kapalı sallamak için farklı 200 mL DI su banyosu içine daldırma. Bu banyo suda başka bir levhadanoluşan üst daldırma önce değiştirin.
  6. Basınçlı hava levhadanoluşan üst tamamen kurumasını kullanın.
  7. Plaka plaka imalat kelepçe üst kısmında yerleştirin. Yavaşça levhadanoluşan üst ve silikon birlikte basın için plaka imalat kelepçe kapatın. Kelepçe en az 1 h için.
  8. Kullanım, toz korumalı önce oda sıcaklığında 24 h için tedavi için plaka izin.

3. bir tabak germe

  1. İndenters temiz.
    Not: Bkz. ek şekil 1.
    1. 60 W banyo tarzı sonicator DI ile oda sıcaklığında su hazırlamak.
    2. Destek böylece sadece indenters başında bir derinlik, en az 1 mm. için batık ters sonicator Hamamı yukarıda uç blok indenters 8 dk 42 kHz için solüsyon içeren temizleyicide.
    3. Darbe kuru basınçlı hava ile indenters.
  2. Uç blok hizalayın.
    1. Bu uç dizi izliyor germe aygıt üzerinde bir canlı yayın kamerayla konumlandırın. İndenters üst kısımları üzerinde odaklanın.
      Not: Bölüm 4, "Membran streç karakterize," açıklanan Kur bir mümkün kamera bu görev için düzmece.
    2. Sahne kelepçeler (şekil 1) kullanarak yaralanma aygıt sahne alanı üzerinde bir tabak güvenli ve aygıt üzerinde bir kubbe ışık yerleştirin.
      Not: araç kontrol yazılımı için Malzemeler tablo bakın.
    3. Araç kontrol yazılımı yaralanma aygıtı kontrol ediyor bilgisayarın yazılım simgesine tıklayarak başlatın. "İn_vitro_neurotrauma.lvproj" projesi başlatma penceresinde tıklatarak çalıştırın. Proje penceresinde, hareket kontrolü başlatmak ve 'motion_control.vi' ve 'position_tracker.vi', sırasıyla, üzerlerine çift tıklatarak adlandırılan izci sanal araçlar (VIS), pozisyon.
    4. Yaralanma aygıt çevreleyen kafes kapatın. Hareket kontrolü VI VI çalıştırın ve indenters bağlantı kurma 2 mm içinde Sahne Alanı'na düşürmek için ' yakın alt' ı tıklatın için sol üst köşesindeki 'OK' butonuna basın. VI durdurmak için 'Stop' düğmesini tıklatın.
      Dikkat: Tutmak ellerini kameranın içinde belgili tanımlık kafes işlenirken sedye temizleyin. Kafes kafes kapı kapalıyken germe aygıta güç sağlayan bir kapı anahtarı ile donatılmış.
    5. Proje penceresinde 'Eksen 1' sağ'ı tıklatın. 'İnteraktif Test Panel' tıklayın. Açılır penceredeki adım boyu 50 µm '500' adet 'Hedef konum' alanına girerek ayarlayın.
    6. 'İnteraktif Test paneli' penceresinin altındaki yeşil 'Git' düğmesine art arda kadar plaka ilk tıklayın herhangi bir indenters ile temas. Canlı görüntü kamera tarafından görüntülenen onay iletişim için. Not dik kademeli pozisyon bildirdi 'İnteraktif Test Panel' penceresi; sol üst Bu ilk kişi konumdur.
    7. Her şey yapana (3.2.6 adımda anlatıldığı gibi) daha fazla düşük indenters ile temas. Gerekirse, Bütün tabağı görmek ve sahne alanı yukarı taşı (belirterek bir negatif 'hedef konum') kameranın hareket ve aşağı. Dik kademeli pozisyon bildirilen Not bütün mesajları (Bu tam temas pozisyon) temas halinde olduğunuzda pencerenin üst sol.
    8. Not ilk temas ve tam temas pozisyonları arasındaki fark. 'İnteraktif Test paneli' kapatın. 'Hareket kontrolü VI' çalıştırın (bkz. Adım 3.2.4) ve tıklayın 'üst aşaması yükseltmek için'. 'Stop' tuşu ile hareket kontrolü VI durdurmak.
    9. Bir kez onun seyahat üst kısmında aşamadır, aygıtı devre dışı bırakmak için kapıyı aç. Uç blok köşelerinde set vida ayarlayın. Köşedeki kişi ilk daha düşük ve kişi son yapılan köşe yükseltmek için ters sıkıştırın, yapılan set vidayı gevşetin.
    10. Plaka sahne, yetiştirme tilt, iletişim görüntülerde teftiş indenters, rehber ve (Adım 3.2.9) ayarlama uç blok kadar sahne düşürülmesi işlemi tekrarlayın. Sahne ve blok hizalandığında, tüm indenters hale getirecek hemen başvurun.
    11. Aygıtı devre dışı bırakmak için kapıyı aç. Onların delikler uç blokta kravat aşağı vidayı yerleştirin ve onları sıkıştırın. Blok düzeyi yerde (adımları 3.2.4-3.2.8) kravat aşağı vidalarla olduğunu doğrulayın. Plaka yaptığında 'İnteraktif Test paneli' tarafından bildirilen sahne konumu dikkat iletişim. Bu girinti deneyler için sıfırıncı pozisyonda olacak.
  3. İndenters yağlama.
    1. Uç blok sadece kurulmuş olan ve değil henüz yağlanır, bir düz lastik pedi temiz (7.5 cm x 11 cm x 1.5 mm) ve yumuşak, kapalı hücreli Köpük kauçuk pad (7.5 cm x 11 cm x 3 mm) bir laboratuvar etanol batırılmış bezle. Onları hava için kuru sağlar.
    2. Laboratuvar mendil mısır yağı içinde ıslatın ve sıkıcı bir parlaklık için sağlam kauçuk ped yayıldı.
    3. Köpük yastık üzerine yağ Köpük yastık aktarmak için katı lastik pedi yerleştirin. Bir 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm alüminyum levha üstünde tepe-in belgili tanımlık Köpük yastık yerleştirin ve yaklaşık 360 g (örneğin, 45 mL su her yüklü 6 konik tüpler) balast ağırlığı ile yük tutarlı transfer petrol katı lastik pedi Köpük yastık emin olmak için. 10 izin s için köpük lastik pedi aktarmak yağ.
    4. Köpük kauçuk ped uç dizi üzerine taşıyın. Alüminyum levha ve balast kilo yağ tutarlı transfer indenters ipuçları için emin olmak için üstüne yerleştirin. 10 izin s petrol indenters için aktarmak için.
    5. Eğer plaka yok beri gergin uç blok kurulmuş ve ilk kez yağlanır, deneme başlamadan önce bir testi plaka germek.
      Not: Bu-ecek önlemek ilk streç ve sonraki uzanır arasında herhangi bir tutarsızlık deneme semptomlarıdır. Sonraki uzanır için her streç önce sadece 3.3.2-3.3.5 adımları yineleyin.
  4. Bir tabak uzat.
    1. 3.3. adımda açıklandığı gibi indenters yağlayın.
    2. Plaka yaralanma aygıt sahnede sahne kelepçeler ile güvenli. Kısırlık gerekiyorsa, Oda havası kültür yüzeye maruz kalmadan kalenin güvenliğini sağlamak için kapak konumunu ayarlamak.
    3. Sahne Alanı'na 'hareket kontrolü VI kullanarak sıfır konumunu düşürün ' (Adım 3.2.4-3.2.6 bakın); sıfır konumu 3.2 adımı sırasında belirlenir.
    4. Benzersiz bir dosya adı için 'pozisyon izleme VI' "dosyası yolu" alan içindeki dosya adını değiştirin o zaman koşmak o pencerenin sol üst köşesindeki 'OK' tuşu ile.
    5. Derinlik ve girinti süresi ayarlamak (genellikle 1-4 mm ve 30 ms, sırasıyla, 5 mm, en az süre 15 ms maksimum derinliği) 'Yaralanma (mm)' ve 'Yaralanma süre (ms)' alanları 'alanların tıklatarak ve istenen yazdırarak hareketi kontrol panelinde VI' değerleri.
    6. 'Hareketi kontrol panelinin VI' çalıştırın ve plaka girintilemek için 'Injure ''ı tıklatın.
    7. Onun seyahat üst kadar sahne 'Top' tıklatarak taşıyın. Sonra VI 'Stop' butonu ile durdurmak ve kapıyı açarak yaralanma aygıtı devre dışı bırakın.
    8. 'Pozisyon içinde izci VI' belirtilen maksimum deplasman uygulandığını doğrulamak için sunulan sahne yer değiştirme tarihi kontrol edin. Grafik üzerinde sağ tıklayın ve 'Excel'e vermek' tıklayın. Tıklayın ' dosya | Kaydet ' verileri kaydetmek için.

4. membran streç karakterize

  1. Yüksek hızlı videografisi için bir yüksek karşıtlık arka plan sağlamak için her uç beyaz üst teneffüste boya.
    Dikkat: nerede yapmak indenters jantlar boyamayýn plakalı kişi.
  2. 3D poly(lactic acid) (PLA) ile yazdırabilir veya aksi takdirde imal, silindirik bir damga ile hangi her kuyuda bir nokta yapmak. 5.9 üzerinde ortalanan mm jant çapında ve 12.2 mm silindirik çıkıntı 1.5 mm çap ve 1.0 mm-yüksek yüksek silindir olun.
    Not: Bir 3D yazdırılabilir modeli ' damgası. STL' ek dosya olarak kullanılabilir.
  3. Plazma tedavi plaka sağ yan-silikon hücre kültür yüzeyine Wells 60 için etkinleştirmek için yukarı adım 2.1 belirtildiği gibi s.
  4. Plaka bir lastik pedi veya diğer yumuşak bir yüzeye yerleştirin. Damga üzerinde küçük çıkıntı asal (bkz. Adım 4.2) kalıcı marker kalem mürekkebi ile. Damga test edilecek kuyunun içine yerleştirin ve iyi mürekkep transferini sağlamak için dokunun. Her şey önce pul Başbakan.
  5. Uç blok hizalayın ve yaralanma aygıt indenters yağlamak (bkz: adımlar 3.2-3.3). Sahne Alanı'na yaralanma cihazın plaka kelepçe. Parlak bir diffüz Aksiyel ışık yaralanma aygıt üzerinde konumlandırın.
  6. Yüksek hızlı kamera bir patlama stand yaralanma aygıt üzerinde ayarlayın, düz aşağı doğru objektif ile karşı karşıya için en küçük numaralı f-stop ayarla ve açın. Kameraya bağlı olduğu bilgisayarda kamera yazılımını başlatın. İçinde çerçeve hızı damla aşağı yemek listesi, seçme 2.000 kare / saniye ve çekim yüksek kontrastlı görüntüler veren en hızlı çekim hızı aşağı yemek listesi, seçme bırak. Merkezi noktalı wells üzerinde.
    1. Kameranın görüş alanı içinde 3 x 4 kılavuz 12 kuyu içerir şekilde konumlandırın.
      Not: Bu alan açısı arasında üretilen iş ve Çözünürlük 1280 × 1024 görüntü için en iyi bir uzlaşma sunar.
  7. Sıfır noktası plakasına alt (adımları 3.2.4-3.2.6 bakınız). Bir-tıkırtı kayıt düğmesini kamera yazılımı üzerinde böylece 'tetikleyici'okur. Pozisyon izci VI (Adım 3.4.4) başlatın.
  8. Parlak diffüz Aksiyel ışığı aç. Plaka 3.4.6. adımda açıklandığı gibi girinti.
  9. Parlak diffüz Aksiyel Işığı söndür.
  10. Kamera kontrol bilgisayarı 30-40 ms pencere girintileme oluşmasına neden olan kayıt bul: başında ve sonunda okları kamera yazılımı yüksek hızlı video oynatma çubuğuna sürükleyin. Kaydet'i tıklatın, adı 'Dosya adı' alanında ayarlanan, 'TIFF' 'Biçim' alanını seçin ve ' Kaydet '.
    1. Bakmak-den geçerek. En azından, yansımaları için TIF-dosyaları (başlangıç) gergin ve en gergin (tepe girinti) Birleşik.
    2. Yükseklik ve genişlik nokta her iki görüntülerde ölçmek için en azından görüntülerini ve tepe streç-yan yana açmak için Fiji kullanın. Varsayılan dikdörtgen seçim aracını kullanarak,'ı tıklatın ve az streç görüntü bir nokta çevresinde bir kutu çizmek için sürükleyin. Yüksekliği ve genişliği ile ölçmek ' Analyze | Ölçü '.
    3. Aynı şey tepe streç görüntü üzerinde nokta için yineleyin. Wells geri kalanı için yineleyin.
  11. X ve y yönde Lagrangian zorlanma aşağıdaki gibi hesaplar:
    Equation 1
    Equation 2
    Not: Burada, Exx x yönde Lagrangian zorlanma Eyy y yönde Lagrangian zorlanma, X nokta genişliğidir, Y nokta, f yüksekliğidir (Yani, en yüksek depoladığınız resim), son görüntüyü gösterir ve ilk görüntü (Yani, ön girinti resim) gösterir . O kadar iyi zorlanma belirlemek için iki değer ortalama.

5. kaplama kültürlü hücreleri

  1. Otoklav depo gözleri ve sterilizasyon için kullanılan balast ağırlık.
  2. Plazma tedavi silikon popolu plakaları sağ-yan-yukarı 60 s (bkz. Adım 2.1). Hemen % 70 etanol 15dk için içeren steril depo gözlerindeki plakaları daldırın.
  3. Steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 30 dk için ayrı steril depo gözlerindeki levha daldırın.
  4. PBS kuyulardan Aspire edin. Sadece kuru bir tabak kuyuları plazma tedavi kaybetme önlemek için bir zaman.
    Dikkat: silikon kaynatıp pipetting katı tabak daha az taktik geribildirim sağlamak ve bir pipet ucu engelleme olasılığı daha yüksektir.
  5. 0.1 mg/mL Poli-L-Ornitin (PLO) 100 µL sterilize tabakaları bana iyi ekleyin. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  6. Hücre süspansiyon hazır olması ne kadar ikinci yıkama wells bırakarak iki kez 100 µL steril PBS, Wells'le durulayın.
  7. HiPSCNs şişe Emanet eldiven kullanarak sıvı azot depolama biriminden çıkarın ve kuru buza yerleştirin. Hızlı bir şekilde şişeyi 37 ° C su banyosu için taşıma ve çözülme tam olarak 3 dakikadır. Şişeyi girdap değil.
  8. Steril bir başlık, yavaşça bir 50 mL konik tüp 1 mL serolojik pipet kullanarak şişe içeriğini aktarmak.
  9. Boş kriyojenik şişeyi oda sıcaklığında komple bakım orta (medya istasyonunu + Özet) 1 mL ile yıkayın.
  10. Medya 1 mL drop-wise adlı bir damla saniyede 50 mL tüp içine aktarın. Yavaşça tüp eklerken girdap. Oda sıcaklığında komple bakım Orta 8 mL 50 mL tüp yaklaşık 2 damla/s'de ekleyin.
  11. Tüp kap ve ters çevir'i 2 - 3 kez. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak. Hücre süspansiyon 225.000 hücre/ml sulandırmak için gereken ek ortam hacmi hesaplamak.
  12. Yavaşça (yukarıda hesaplanan hücre süspansiyon 25 mL serolojik pipet kullanarak tüp içine) medyanın miktarda pipette.
  13. Hücre süspansiyon laminin hücre süspansiyon 10 µg/mL ulaşmak için 1.000 µL micropipette ile 1 mL başına 1 mg/mL laminin stokunun 10 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı bir kez laminin için kullanılan ucu ile Aspire sonra tüp kap ve tüp bir kez ters çevir.
  14. Bir seferde bir tabak PBS üzerinden plakaları, Aspire edin. Her şey için hiPSCN hücre süspansiyon 100 µL eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. Alan başına hücre yoğunluğu 67,500 hücreler/cm2kuyu 0,33 cm2, bir kültür alanı var.
  15. Tabakları eki tanıtmak için tohum sonra 15 dakika oda sıcaklığında bekletin. Fan titreşimler steril kültür luk kaçmak için laboratuar bankta kapalı tabak koyun. %5 CO237 ° C'de kültürler kuluçkaya.
  16. Tam ortam değişikliği, 24 h, wells ile komple bakım medya 200 µL dolumu gerçekleştirin. 2-3 günde 100 µL/kuyu medya değiştirmek yarım gerçekleştirin.

6. ağır yaralı kültürler

  1. Uç blok hizalayın ve 3.2 adımda anlatıldığı gibi sıfır pozisyon bulmak. 3.3. adımda açıklandığı gibi indenters yağlayın.
  2. Deplasman tarihinin 'pozisyon izci VI' (Adım 3.4.4) için dosya kümesi. 'Hareket kontrolü VI' (Adım 3.4.5) yaralanma parametreleri ayarlayın.
  3. İnkübatör dışında yaralı ve sahneye kelepçe için plaka almak. Oda havası için kültürler maruz kalmadan kalenin güvenliğini sağlamak için kapak konumunu ayarlamak.
  4. 'Hareket kontrolü VI' kullanarak sıfır noktası (adımları 3.2.4-3.2.6) plaka indir. 'Pozisyon izci VI' başlatmak (Adım 3.4.4).
  5. Hareket kontrolü VI plaka (3.4.6 adımda anlatıldığı gibi) girinti oluşturmak için kullanın. Sham uzanıyor için yalnızca bu adımı atlayın.
  6. Sahne hareket yelpazesini başa dön (bkz. Adım 3.4.7). Plaka da kuluçka için dönmek.
  7. İncelemek ve deplasman izleme (aynı derecede içinde adım 3.4.8) kaydedin.

7. mikroskobu

  1. Çözüm 2 µg/mL Höchst 33342 ve 5 µg/mL Calcein AM bakım medya ile boyama x 10 hazırlayın.
  2. Her leke de çözüm boyama x 10 20 µL Spike'la.
  3. İle leke 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
  4. Geniş alan floresan görüntüleri elde etmek. Kullanım geleneksel FITC ve DAPI kümeleri Calcein AM ve Höchst 33342 sinyalleri, sırasıyla görüntüye filtre. Çok iyi görüntüleme sırası fazla 10 dakika sürer, plaka kültürlerin sağlığı korumak için bir sahne en iyi kuluçka makinesine içine.
    Not: 10 X, 0,30 NA lens hücre canlılığı ve Morfoloji belirlenmesi için yeterli ayrıntı sağlar. Bu kadar parlak soma bazı doygunluk etkilese bile kazançlar iyi görsel olarak neurites emin olmak için ayarlayın.
  5. Soma ve neurites tanımlamak için yeşil Calcein AM kanal canlı hücre Albümdeki kesiminde. Nükleer görüntülerde mavi Höchst 33342 kanalda soma tanımlaması ile yardımcı olmak için kullanılır.

Representative Results

Sedye aygıt sahne darbe süresi 10-15 ms kısa olan repeatably (şekil 2A) darbe genlik bağlı olarak hareket yeteneğine sahip. Nabız genlikleri son derece yinelenebilir ancak darbe süresi yaklaşık 1 tarafından değişir ms yinelemeleri arasındaki. Çok sayıda wells yüklenir ve öngörülen genlik yüksek olduğunda reçete darbe genlik gerçek darbe genlik ıraksar (bkz. şekil 2B). Sahne deplasman genliği 3 mm arttıkça, gerçek öteleme genlik giderek reçete deplasman genlik kısa düşüyor (bkz. şekil 2B). Dikkatli yazı blok hizalaması membran zorlanma herhangi bir eğilim satırları veya sütunları (şekil 2C) boyunca ortadan kaldırır. Girintili 52 wells ile sahne deplasman genlik (3,3 mm gerçek öteleme genlik) reçete 3.5 mm tüm iyi konumlar arasında ortalama Lagrangian zorlanma 0.451 yapıldı (Standart sapma anlamına gelir tüm konumlar için 0.051, standart sapmalar ortalaması = tüm konumlar için 0,065, n = 5 ölçümleri iyi ücret =). Bazıları zaten bildirilen11olmasına rağmen bu sonuçlar burada bütünlüğü için sunulmuştur.

Optimal, zarar görmemiş bir kültür 5'ten fazla hücre az varsa kümeleri olacaktır. Neurites tek tek, uzun, ince ve eğri ile gerginlik ya da boncuk (şekil 3A) az veya hiç iz olacak. İdeal koşullarda canlılığı kültürlerin yakından üreticinin bilgi formu (genellikle 60-%70) belirtilen canlılığı yaklaşım gerektiğini ve kültürler üzerinde silikon bu geleneksel katı kültür yüzeylerde ( tutulan benzemelidir Şekil 3B). Neurites olabilir veya bir düşük güç parlak alan mikroskobunun görünür olmayabilir. Laminin konsantrasyon ve hücre yoğunluğu kültürler temel ve yaralanma sonra etkiler. Hücre yoğunluğu artan kültürde oluşan kümeleri boyutunu ve sayısını arttı. Laminin konsantrasyon kez artan bu etkisi (şekil 3A) etkisiz. Ancak, laminin artan konsantrasyon çok fazla yaralanma (şekil 4) kültürler duyarlılığını kör. Zarar görmemiş kültürler için en uygun laminin konsantrasyonu 50 µg/mL laminin (şekil 3) yapıldı ama sahte ve streç yaralı nüfus arasında en iyi ayrılık 10 µg/mL laminin (şekil 4) elde edildi. Daha yüksek laminin konsantrasyonları yaralanma kısa sürede noktalarda (şekil 4), aynı zamanda gelişmiş temel hücre canlılığı (örneğin, 7 gün) uzun zaman noktalarda kültürlerin duyarlılık azalır. Özetle, laminin konsantrasyon deneysel her senaryo için en iyi duruma getirmek için faydalıdır.

Membran zorlanma, sonrası yaralanma görüntüleme süresi noktası, laminin konsantrasyon ve hücre yoğunluğu tüm sarf neurite uzunluğu hücre başına son derece istatistiksel olarak anlamlı bir ana etkisi (ANOVA, p < 0.001). Membran üzerinde büyük yük neurite uzunluğu hücre başına etkisi sonrası yaralanma görüntüleme saat noktası ve laminin konsantrasyon ile son derece istatistiksel olarak anlamlı etkileşimler vardı (ANOVA, p < 0.001) ve hücre istatistiksel olarak anlamlı bir etkileşim Yoğunluk (ANOVA, p < 0,05). Benzer şekilde, membran zorlanma, sonrası yaralanma süresi noktası Imaging hücre yoğunluğu ve laminin konsantrasyon tüm sarf hücre canlılığı üzerinde son derece istatistiksel olarak anlamlı bir ana etkisi (ANOVA, p < 0.001). Hücre canlılığı membran strain etkisini sonrası yaralanma görüntüleme süresi noktası son derece istatistiksel olarak anlamlı bir etkileşim vardı (ANOVA, p < 0.001) ve hücre yoğunluğu (ANOVA, p ile istatistiksel olarak anlamlı bir etkileşim < 0,05). Bu sonuçlar her dikkatli bir şekilde optimize edilmelidir böylece zamanlama, hücre yoğunluğu ve laminin konsantrasyon uygulanan hakaret ve deneysel sonuçlar arasındaki ilişki üzerinde önemli bir etkisi uygulamak kanıtlamak.

Düşük hücre canlılığı ve boncuklu neurites, bodur neurite büyüme, birlikte gelen uygun olmayan şekilde ortaya çıkabilir toksik kültür koşulları silikon hazırlanan gösterir. Atlama veya su emmek veya kuru fırın kısaltmak yapabilirsiniz absorbe etanol veya membran, sırasıyla, hangi medya içine diffüz ve hücreleri stres su. İyi yaralı kültürler hücre canlılığı, kısaltılmış veya eksik neurites, boncuklu neurites ve gergin veya gerilmiş görünüyorsun neurites indirimli. Yaralanma iyi dağınık öncesi yaralanma olan hücre kültürleri topaklanma neden olabilir. Büyük kümeleri morfolojik analiz yıkmak. Öyle ki göze çarpan değişiklikler oluşur, ancak hala bazı neurites ile mevcut hücrelerdir morfolojik analiz için yaralanma düzeyini şekilde ayarlanmış.

Figure 1
Resim 1 : A etiketli yaralanma cihazın şematik. Üstten Görünüm(a), (B) izometrik görünümü, (C) ön görünüm, (D) sağ tarafta görünümü. Ölçek çubuğu ortografik görünümler (A, B ve D) için geçerlidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Kinematik mekanik hakaret. (A) sahne deplasman geçmişleri öngörülen genlikleri (reçete genlikleri göstergede listelenen) mesafeden 5 bakliyat üzerinde hiçbir kuyu yüklendiğinde. (B) sahne deplasman geçmişleri öngörülen genlikleri (reçete genlikleri göstergede listelenen) mesafeden 10 bakliyat üzerinde 52 wells yüklendiğinde. (C) her iyi sahne deplasman genlik 3,3 mm ile ortalama zorlanma (n = 5 ölçümleri şey, standart hata iyi başına ortalama 0.029 =). C4-F4 ve C9-F9 uzatılmamış denetim kuyuları olduğunu unutmayın. Bu rakam Sherman ve ark. değiştirildi 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Optimizasyon kültür koşulları üzerinde silikon. (A) değişen hücre yoğunluğu ve laminin konsantrasyon hiPSCN kültürler silikon üzerinde etkisi. Hücre yoğunluğu artan ve azalan laminin konsantrasyonu artar clumping. Hücre yoğunluğu ve laminin konsantrasyon mono dağınık kültürler elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir. Mono-dağınık kültürler miktar sırasında eserler daha az güvenlik açığından etkilenir. Not dinamik alan neurites görselleştirme optimize etmek için ayarlandı. Sonuç olarak, çok daha parlak soma doymuş. Bu sunuyu kameranın dinamik alanı ile ilgili çok kısık neurites neredeyse görünmez render soma, en iyi duruma getirme alternatif için tercih edilir. Kızıl meydan tarafından vurgulanan koşulu vitro streç yaralanma deneyleri için uygun kabul edildi. (B) optimal koşullar altında kültürler silikon membran üzerinde benzer kültürler geleneksel sert yüzeyler üzerinde görünür. Sol panelde 33,750 hücreler/cm2 laminin (hücre kültür substrat doku kültürü tedavi döngüsel olefin kopolimer 's) bir tabakta klasik, katı 96-şey 3,3 µg/mL ile kültürlü hiPSCNs gösterir. Doğru kapı aynası (a) kırmızı özetlenen paneli üretir. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Yaralanma fenotip ve laminin konsantrasyon olan bağımlılığını. (A)sağlıklı kültür, 10 µg/mL laminin ve 67,500 hücreler/cm2kullanarak. Neurites kadar hiçbir boncuk ile vardır. Kaç ölü çekirdekleri ve kaç kümeleri vardır. (B) kültür aynı kültür koşul % 57 en yüksek gerilme ile yaralı ve 4 h Neurites kısaltılmış sonra yansıma ya da eksik, kullanma ve bazı boncuk (oklarla gösterilen) var. Daha az Calcein AM-pozitif hücreler ve daha fazla Calcein AM-negatif (Yani, ölü) çekirdeği vardır. Yaralanma arasında hayatta kalan hücreleri topaklanma artmıştır. (C) yaralanma sonra 4 h, neurite uzunluğu hücre başına zorlanma laminin konsantre bağlı bir şekilde artan ile azalır. (D) 4 h yaralanma sonra hücre canlılığı zorlanma laminin konsantre bağlı bir şekilde artan ile azalır. (E) yaralanma sonra 24 saat, neurite uzunluğu hücre başına zorlanma laminin konsantre bağlı bir şekilde artan ile azalır. (F) 24 h yaralanma sonra hücre canlılığı zorlanma laminin konsantre bağlı bir şekilde artan ile azalır. (n = 4 bar, hata çubukları ± 1 Standart sapma, ölçek çubukları olduğu gibi başına 100 µm =). Gerilim değerleri üzerinden bir önceki yayın verilerini kullanarak sahne deplasman Sherman ve ark. tarafından çıkarılabilir 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek şekil 1: teknik uç çizim. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 1: özel inşa aygıtları. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 2:96 iyi plaka-yükleyici bağlantı diyagramı kablolama. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 1: bilgisayar destekli tasarım çizimleri yaralanma cihazın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 2: bilgisayar destekli tasarım çizimleri plaka imalat kelepçe. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 3: 3D damga geometri, bir 3D printerlere harcama maddeler ile kullanıma uygun gösterimini. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 4: SubVI motion_control.vi için bir SubVI olduğunu MuStLiMo_si_initialize.vi için. İletişim kutularındaki girişleri hareket parametrelerini dönüştürür. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 5: birden çok düz çizgi Moves_simplified.vi, motion_control.vi için bir SubVI olduğu için SubVI. İletişim kutularındaki girişleri hareket parametrelerini dönüştürür. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 6: SubVI position_tracker.vi için. Sayaç parça deplasman doğrusal kodlayıcıdan girdi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 7: temel LabVIEW proje. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 8: üst düzey VI bu cihazın taşır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 9: SubVI motion_control.vi için. Plaka uzanır hızlı deplasman yürütür. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 10: SubVI motion_control.vi için. Sahne hamle yavaş deplasman yürütür. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 11: SubVI motion_control.vi için. Motion_control.vi Denetim Masası'ndaki (genellikle örneklenen) deplasman geçmiş grafiğini çizer. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 12: Top deplasman geçmişini kaydeder düzey VI. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 13: motion_control.vi ile position_tracker.vi arasındaki iletişimi sağlayan içeren Variable2,. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 14: baskılı devre kartı için şematik. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı kod dosyası 15: baskılı devre kartı için düzen. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Tutarlı bir elde etmek için anahtar, bu modelde biofidelic fenotip tutarlı biofidelic mekanik hakaret uyguluyor. Bu modeli darbe süreleri kısa 10-15 ms, kadavra deneyler12,13göre insan kafa etkileri için darbe süreleri benzer olarak oluşturabilir. Bu hakaret tutarlılığını uç blok ile plaka hizalamasını ve tutarlı yağlama indenters bağlıdır. Uç blok de hizalandığında var. hiçbir eğilim uygulanan gerilim satırlar veya sütunlar (şekil 2C) arasında İnce bir tabaka yağ genellikle daha az sürtünme daha kalın bir tabaka oluşturur ve çünkü onlar silikon faul ve ışık geçirilmesi sırasında mikroskobu engel viskoz Gresler tavsiye edilmez. Gerçek sahne deplasman genlik önemli ölçüde zaman birçok indenters kullanılır ve öngörülen sahne deplasman genlik büyük (> 3 mm) reçete deplasman genlik kısa düşebilir. Ancak, gerçek öteleme büyük genlikleri de öngörülen deplasman daha az olmakla birlikte, yinelenebilir (şekil 2B) kalır. Bu nedenle, büyük, gerçek talebiyle genlikleri güvenilir bir şekilde istediğiniz değeri aşan öngörülen bir değer girerek elde edilebilir. Sadece doğrudan patoloji indükler mekanik hakaret ölçer tepe membran zorlanma için kolayca kaydedilen bir proxy olduğu için deplasman genlik önemli değil. Bu nedenle, membran zorlanma sahne deplasman dan belirlemek için açıklanan yordamı önemlidir. Bu işlem herhangi bir önemli değişiklik plaka ve indenters farklı olması durumunda örneğin arasındaki etkileşimi etkileyen sistem için yapılır yinelenmelidir çapı indenters farklı uç malzemede veya kaplama veya silikon farklı türleri kaynatıp plaka kullanılır. Uç blok yeniden ve sıfır konumu belirleme işlemi her denemenin başlangıcında yinelenmelidir. Germe cihazın bir şematik Resim 1' de gösterilen. Aygıtı yeniden oluşturmak için gerekli CAD modellerini tamamlayıcı malzemesi olarak sağlanır: ' yaralanma aygıt - tam derleme - genel 3D. ADIM '; ilişkili ürün reçetesi sağlanan olarakek tablo 1: özel cihazlar - BOM.xlsx inşa. Ayrıca ek tablo 2 96 de plaka _loader - Bağlantı Diagram.xlsx kablolamasistemleri çeşitli bileşenleri bağlama kablo bağlantıları açıklar, bkz. 'Interconnector_circuit_board.dip' ara bağlantı kabloları bir devre kartı açıklar.

Devre dışı bırakıldı-sahnenin ortasına doğru seyahat ile yaylı olduğundan güç kesilir sonra sahne alanı taşır. Güç sağlandığında, geri besleme döngüsü son bilinen öngörülen pozisyonu ve gerçek pozisyon arasında büyük bir fark algılar. Bu aygıt devre dışı zaman oldu konumuna aniden taşımak için sahne neden olur. Ne zaman sadece bu onun beslemesiz pozisyon onun seyahat üstündeki dinleniyor aygıtı devre dışı bırakmak için dikkat edilmelidir böylece bu ani hareket kodlayıcı, çıktıda hatalara neden olabilir.

İmalat kelepçe plaka alt vücut ve silikon birlikte en iyi bağ sağlar bir şekilde getirmek için tasarlanmıştır. Bu amaçla, orada ek dosyanın içinde sunulan tasarımında üç temel özellikleri nelerdir "basın Die - Genel 3D. ADIM '. İlk olarak, kelepçe plaka vücut sahibi silikon yukarıdan aşağıya doğru paralel değildir. Bu düzgün oluşturulduysa, herhangi bir düzeltme sonra ilk kurulum gerektirir. İkincisi, kelepçe kapatıldığında tamamen katı bir sistem teorik olarak sonsuz sıkma gücü sıfır sıkma gücü bir ani artış deneyim olarak kelepçe Köpük kauçuk katman uyumluluğu altında plaka, az miktarda sağlar. Kol demiri konumunu ve kelepçe set vida ayarlanabilir böylece kelepçe iki kenarı arasındaki uzaklığı ince ayar olabilir.

Her türlü çabayı nokta arkasında parlak, beyaz bir arka plan üzerinde iyi alt soy karakterizasyonu deneyler sırasında sağlamak için yapılmalıdır. Daha iyi kontrast bu Albümdeki kolay yükseklik ve genişlik büyük bir deneme analiz insan bir operatör için sıkıcı olabilir nokta ölçme işlemini otomatikleştirmek için olur. Çünkü duvarlar iyi gölge eğilimi bir 96-şey plaka bir kuyunun yüksek hızlı videografisi sorunlar sunar. Bir kubbe ışık veya kameranın görüş hattı görüntü engel olmadan aydınlatmak diffüz Aksiyel ışık gölgeler veya geleneksel bir ışık kaynağı ile ortaya çıkacak aynasal yansımaları ortadan kaldırır. Parlak aydınlatma görüntüleri ile kısa maruz kalma süresi elde edilebilir için izin verdiği için kullanılabilir en parlak ışık kaynağı kullanılmalıdır. Kısa pozlama süreleri Hareket Bulanıklığı en aza indirmek. Diffüz Aksiyel ışık ışık yayan diyotlar (LED'ler) yükseltme yüksek hızlı video alma sırasında kısa maruz kalma süreleri sağlar. LED'ler diffüz Aksiyel ışık açarak stok LED kaldırma yükseltilebilir, 4 yüksek güç montaj LED LED sahipleri kullanarak, onlara sabit bir geçerli elektrik şebekesine bağlanması ve diffüz Aksiyel ışık (bakınız tablo ile yeniden toplama arka bölmesine diziler Malzemeler Katalog numaraları için). LED'ler yükseltme pasif soğutmalı LED'ler aşırı ısınma riski nedeniyle bir kaç saniye için tutulması cant dezavantajdır. Bu nedenle, farklı bir ışık sonrası blok ve kamera düzeltmesi hizalama için gereklidir.

Membran üzerinde damgalı bir nokta dilatasyon ölçerek membran yük miktarının sunulan yöntem nispeten ham, ama o sağlam bir şekilde birden fazla wells için büyütmek. İyi alt soy tarlada dijital görüntü korelasyon kullanarak daha ayrıntılı olarak karakterize edilebilir. Benekli bir desen üssün kuyunun üzerine püskürtme ve bunda Imaging bu tekniği içerir deformasyon sırasında yüksek hızlı. Ticari yazılım daha sonra benekli desen evrimi takip ederek zorlanma görüntüdeki her noktasında ölçmek için kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı bir çok yönlü, klinik, streç yaralanma fenotip hiPSCNs içinde üretir. Hücre ölümü, neurite dejenerasyon ve neurite boncuk Tby iyi belgelenmiş sekel insanlarda ve hayvan15modelleri. Bu modelde başarının anahtarı oluşturmaktan ve bakımını yapmaktan sağlıklı kültürler. Genel olarak, geleneksel sert plakalar ile geliştirilen bir hücre kültür gerilebilir plaka kültür için değerli bir başlangıç noktası protokoldür. Ancak, söz konusu hücre silikon üzerinde farklı şekilde yanıt verebilir olasılığı her zaman dikkate alınmalıdır. Bu özellikle kültür koşulları için çok hassas hiPSCNs doğrudur. Bazı örnekler hücre yoğunluğu ve laminin toplama en iyi duruma getirme (şekil 3, şekil 4) Temsilcisi sonuçları bölümünde sağlanır. Silikon plazma tedavisi ile aktivasyonu hayati önem taşımaktadır. Silikon hidrofobik ve tepkisizdir. doğal haliyle bu laminin veya hücre eki tanıtmak için kullanılan diğer molekülleri bağlamak değil. Plazma tedavi yüzey hidrofilik işler ve reaktif grupları gösterir. Bu değişiklikler için silikon bağlamak ve hücre eki tanıtmak adezyon molekülleri izin. Plazma tedavi etkisi yüzey sıvı içinde sular altında sürece ve aktif yüzey kurutma ilgili yordamlar kısa zamanda gerçekleştirilmesi gereken bu yüzden birkaç dakika içinde kalır unutmamak gerekir. Plazma tedavisinin etkisi yıpranmış Eğer kontrol etmek için basit bir yol yüzeyinde bir damlacık su yerleştirmektir. Bu yayar tedavi plazma silikon üzerinde ise tedavi edilmezse silikon üzerinde yukarı damlacığı boncuk. Biz kullanılan hiPSCNs ile (bkz. Tablo reçetesi) Üretici önerir laminin öncesi kaplama yerine hücre süspansiyon ile ekleme. Bu iletişim kuralı bu yaklaşım başarılı bir şekilde birleştirmiştir. Segmentasyon teorik olarak, açık kaynak yazılım veya genel amaçlı programlama dilleri ile gerçekleştirilebilir iken bu araçları yeterlilik yüksek derecede iyi sonuçlar elde etmek için gereklidir. Neurites sık sık çok ince oldukları için arka plan sinyalini ayırt etmek zordur. Bu nedenle, varsa özel ölçü birimi için segmentasyon ve nöronların, miktar ile yüksek içerik mikroskobu şirketler tarafından dağıtılmış ticari yazılım araçları kullanmanızı tavsiye ederiz. Hatta ticari yazılım ile görsel olarak doğruluğunu doğrulamak için ayrılmasını görüntüleri dışa aktarmak akıllıca olacaktır.

Gerilebilir plakaları ile geleneksel, sert plakalar çalışmaya göre çalışma ile ilgili bazı sınırlamalar vardır. Gerilebilir plakaları hava hedefleri ile normal olarak yansıması. Ancak, görüntüleme daldırma hedefleri ile çok zordur. Objektif petrol silikon zarar verebilir. Buna ek olarak, yukarı doğru hareket ederken amacı silikon membran üzerinde basınç uygular. Bu basınç membran dikey olarak, örnek odak haline getirmek üzere displaces. Şu anda plakaları imalatı kullanılan silikon membran yaklaşık 250 µm kalınlığında vardır. Bu kalınlık çok yüksek güç, daldırma hedefleri odak mesafesini aşıyor. Membranlar mükemmel düz mikroskopi için gerekli düzlemsellik ulaşmak için sıkma önce koymak için özel bakım alınması gerekir. Otofokus sistemleri için sapmaların bir dereceye kadar bitmiş plaka düzlemsellik telafi edebilirsiniz. Düzlük sağlamak için levhadanoluşan üst gümrüklü önce Protokolü'nün gelecek sürümlerinde önceden membran gerginlik. Silikon membran plaka üst14 bağlar yapıştırıcı-Alerjik yordamı geçerli Protokolü'nün önemli bir güç olarak kabul edilir. Düzlük üniform olmayan yapışkan tabaka kalınlığı nedeniyle içinde nörotoksisite yapıştırıcı yanı sıra herhangi bir sapma riskini ortadan kaldırır.

Çoklu elektrot dizilerin onların olgunluk ve işlevselliğini değerlendirmek için sık hiPSCNs ile deneyler kullanılır. Hücre kültür substrat sert olduğu için ne yazık ki, bu sistemler bu model ile uyumlu değildir. Gerilebilir çoklu elektrot dizi oluşturur, bu defa yalnızca tek bir de gösterilmiştir, ancak16,17format mümkündür. Böylece bazı kuyular değil girintilidir ve Şems hizmet verebilir indenters tek tek uç bloğundan kaldırılabilmesi için unutmayın. Uç kaldırma girinti engeller, ancak tamamen beri hala atalet hareket sıvı Wells sahne hareket ediyor ise mekanik yükleme ortadan kaldırmaz. Bu sıvı hareket herhangi bir patolojik etkisini ölçmek için asla sahne hareket tabi vardı plakalar wells için Bu kuyu karşılaştırılarak değer. Ayrıca, blok indenters dizi bisymmetric (önden arkaya simetrik ve yan yana) olmalıdır. Bu önlem, böylece sahne yana doğru eğimli değil ve kendi yatakları bağlamak çubuklar neden plaka eşit girinti sırasında yüklenir sağlar.

Neurotrauma tedavi edici yenilik için birincil zorluklardan biri karmaşıklığı ve heterojen durumu var. Travma Multi-Modal stres her hücre tipi santral sinir sistemi içinde aynı anda uygulanır. Nöronlar güvenilir İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (hiPSCs) oluşturulan ve şimdi ticari satıcıları tarafından yaygın olarak mevcuttur. Yenilik bu alanda hızlı bir şekilde ilerliyor, ve diğer sinir hücre tipleri gibi astrocytes18 ve microglia19 da hiPSCs türetilmiştir. Yakında hücre özerk yanıt travma vitro ve sonra ortak kültür farklı hücre tipleri travmadan sonra nasıl iletişim kuruyorlar anlamak için bu hücre türlerinin her biri izole etmek mümkün olabilir. Bu şekilde, sonuçta iyice bir insan sistemi anlamaya kadar alt klinik meydan yeniden oluşturmak mümkün olabilir. Bu yaklaşım kemirgen modellerde güvenerek geleneksel yaklaşım ayrıdır ve bu ortak, yıkıcı ve zorlu durum için ilk tedavi neden roman anlayışı oluşturmak için bir potansiyele sahiptir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser kısmen bir hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21NS098129) tarafından desteklenmektedir. SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng ve tasarlayan ve bu el yazması açıklanan yüksek hızlı görüntüleme deneyler sırasında kullanılan ışıklar desteklemek için bir yapı inşa Feng Yuan Bu mükemmel teknik yardım kabul etmek istiyoruz .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
.010" Silicone Sheet Specialty Manufacturing, Inc #70P001200010 Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen Fisher Scientific  #043204
Nunc 256665 Fisher Scientific  #12-565-600 Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes ULINE S-8115
Plasma Cleaner Harrick Plasma #PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich #440140 APTES
Parchment Paper Reynolds N/A
Dome Light CCS inc LFX2-100SW
Dome Light Power Supply CCS inc PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit             Siemens Nerlite DOAL-75-LED Diffuse axial light
High Power LED Array                 CREE XLamp CXA2540 High Power LED Array                
LED holder Molex 1807200001 LED Holder  
LED power supply Mean Well HLG-320H-36B Constant Current Power Supply   
FastCam Viewer software  Photron camera softeware
Fastcam Mini UX50 Photron N/A High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 Nikon #1455 High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich #P4597
iCells Cellular Dynamics International #NRC-100-010-001
iCell media Cellular Dynamics International #NRM-100-121-001 
iCell supplement Cellular Dynamics International #NRM-100-031-001
Laminin Sigma-Aldrich #L2020
Hoechst 33342 Fisher Scientific  #H3570
Calcein AM Fisher Scientific  #C3099
voice coil actuator  BEI Kimco LA43-67-000A 
optical linear encoder  Renishaw T1031-30A 
servo drive Copley Controls Xenus XTL 
Controller National Instruments cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller 
cRIO chassis National Instruments cRIO 9113
digital input module National Instruments NI 9411
data acquistion chassis National Instruments NI 9113
LabVIEW National Instruments instrument control software
hiPSCNs Cellular Dynamics International

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. (2010).
  2. Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15, (1), 1216-1236 (2014).
  3. Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14, (6), 781-795 (2014).
  4. Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19, (11), 4263-4269 (1999).
  5. Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21, (6), 1923-1930 (2001).
  6. Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21, (1), 61-72 (2004).
  7. Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28, (11), 2203-2218 (2011).
  8. Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150, (2), 192-201 (2006).
  9. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101, (2), 434-447 (2007).
  10. Kang, W. H., Morrison, B. 3rd Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14, (3), 561-575 (2015).
  11. Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
  12. Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
  13. Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
  14. Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11, (5), 962-965 (2011).
  15. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
  16. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48, (10), 945-954 (2010).
  17. Yu, Z., Morrison, B. 3rd Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103, (1), 499-510 (2010).
  18. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9, (2), 600-614 (2017).
  19. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22, (11), 1358-1367 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics