Dyp venetrombose indusert av Stasis i mus overvåket av høyfrekvente Ultrasonography

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nåværende protokollen beskriver fremgangsmåten for å få venetrombose bruker stasis modell. I tillegg bruker vi en ikke-invasiv metode for å måle dannelse og oppløsning over tid.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rys, R. N., Blostein, M. D., Lemarié, C. A. Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography. J. Vis. Exp. (134), e57392, doi:10.3791/57392 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Venetrombose er en vanlig tilstand som påvirker 1-2% av befolkningen, med en årlig forekomst av 1 i 500. Venetrombose kan føre til døden gjennom lunge embolism eller resultater etter trombotiske syndromet, preget av kroniske smerter, hevelse og sårdannelse eller kronisk pulmonal hypertensjon fører til betydelig kroniske luftveissykdommer kompromiss. Dette er den vanligste karsykdommer etter hjerteinfarkt og iskemiske hjerneslag er en klinisk utfordring for alle medisinske disipliner, som det kan komplisere løpet av andre sykdommer som kreft, systemisk sykdom, kirurgi og store traumer.

Eksperimentelle modeller er nødvendig å studere disse mekanismene. Stasis modellen induserer konsekvent blodpropp størrelse og en målbar mengde blodpropp. Det er imidlertid nødvendig å systematisk ligate sidegreiner den underlegne vena cava å unngå variasjon i blodpropp størrelser og noen feil data tolkning. Vi har utviklet en ikke-invasiv metode for å måle blodpropp størrelse ved hjelp av ultrasonography. Bruker denne teknikken, kan vi vurdere blodpropp utvikling og oppløsning over tid i samme dyret. Dette begrenser antall mus kreves for kvantifisering av venous tromboser samsvar med prinsippet om erstatning, reduksjon og raffinement av dyr i forskning. Vi har vist at blodpropp vekt og histologiske analyse av blodpropp størrelse relatere til måling oppnådd med ultrasonography. Derfor beskriver denne studien hvordan å indusere dyp venetrombose i mus med dårligere vena cava stasis modellen og overvåke den bruker høyfrekvente ultralyd.

Introduction

Venøse thromboembolism (VTE), som består av dyp venetrombose (DVT) og lunge embolism, er den tredje største dødsårsaken hjerte etter hjerteinfarkt og hjerneslag. Det er en vanlig tilstand som påvirker 1-2% av befolkningen, med en årlig forekomst av 1 i 5001. VTE kan føre til: 1) døden gjennom lunge embolism; 2) etter trombotiske syndrom, preget av kroniske smerter, hevelse og sår; eller 3) kronisk pulmonal hypertensjon fører til betydelig kroniske luftveissykdommer kompromiss. VTE er flere faktoriell sykdom og kan skyldes stasis av blodstrøm, skade på fartøyet veggene, og/eller hypercoagulable stater på grunn av en forstyrrelse av balansen mellom koagulering og fibrinolytisk systemer, som det har blitt beskrevet over hundre år siden av Virchow og er kjent som den Virchow Triad.

Fordi i de fleste tilfeller er det umulig å hente prøver fra mennesker DVT, har forskere utviklet eksperimentelle dyr modeller av DVT. Flere dyr inkludert rotten2, musen3, kanin4, gris5, hunden6og ikke-menneskelige primas7 har blitt brukt. Mus kan være genmodifisert og er den mest brukte dyr å studere DVT. Men som alle dyr, er spontane DVT ikke observert i mus. Dermed brukes fysisk eller kjemiske endringer i blodåre veggen til å opprette blodpropp i mus. Vi har brukt ferric chloride modellen for å indusere blodpropp i de underlegne vena cava (IVC) av mus8,9,10. Denne modellen har fordelen av å produsere pålitelig occlusive thrombi innen minutter og kan brukes til å undersøke rollen av anti-koagulere og anti-Platederivert narkotika under akutt DVT. Det er imidlertid en terminal prosedyre. Dermed for å studere akutte og kroniske DVT, er stasis modellen mer egnet. I denne modellen, er dannelse indusert av komplett avbrudd i blodtilførselen i IVC, en av faktorene i Virchows triaden for DVT utvikling. Denne modellen kan brukes å studere DVT dannelse og oppløsning, som er en fordel i forhold til FeCl3 modellen11.

Vi har utviklet en ikke-invasiv metode for å følge dannelse og oppløsning over tid ved hjelp av en mikro-imaging høy frekvens ultralyd systemet12. Vi har tidligere vist at måling av venous tromboser av ultralyd korrelerer positivt med thrombi oppnådd pathologically. Vi har bekreftet i to studier at mål oppnådd med ultralyd relatere blodpropp vekt og blodpropp kvantifisert ved histochemistry9,10. Enda viktigere, har vi viste at høyfrekvent ultralyd kan brukes til å overvåke dannelsen av dyp venetrombose i mus12. Det kan også brukes til å kvantifisere blodpropp oppløsning på en ikke-invasiv måte.

Her vil vi beskrive protokollen tillater dannelse stasis-indusert trombose musemodell og hvordan dannelse kan overvåkes ikke invasively over tid ved hjelp av høyfrekvente ultralyd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle dyr omsorg komiteen av McGill University Montréal, QC, Canada. Alt utstyr nødvendig er oppført i tabell jeg.

1. Trouble (C57BL/6J) IVC Stasis protokollen

  1. Kirurgi forberedelse
    Merk: Dette er en overlevelse kirurgi og derfor riktig steril teknikk må følges til enhver tid. Dette inkluderer gjør at alle materialer er for hånden, rengjøring og sterilisering instrumenter før og mellom bruk og angi et sterilt område på arbeidsgruppen overflaten for alle steril materiale.
    1. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter og materialer av autoclave. En glass bead sterilisere er tilstrekkelig å sterilisere instrument tips mellom dyr, hvis mer enn én prosedyre gjøres samtidig.
    2. Bedøve 8-10 uke gamle C57Bl/6 mannlige mus med en blanding av 100% oksygen og 2,5% isoflurane.
      Merk: Justere oksygen og isoflurane etter behov.
    3. Bekrefte anesthetization ved pinching bakre labben av dyret mellom tærne med tang. Ingen respons fra klemme angir dyret er anesthetized.
    4. Administrere langsom løslate smertestillende (buprenorfin) via injeksjon. Gi mus en dose av 1 mg av smertestillende per 1 kg kroppsvekt (1 mg/kg).
    5. Plasser øye ointment på begge øynene på dyret å sikre ingen hornhinnen uttørking for varigheten av prosedyren.
    6. Administrere 0.2 - 0,5 mL isotonic væsker per 10 g kroppsvekt subcutaneously.
    7. Fastsette dyret å tabellen kirurgi med kirurgisk tape. Plassere dyret i supine posisjon til å avdekke magen. Utføre kirurgi på en varmeputen å hindre nedkjøling.
    8. Fjerne hår fra magen av mus ved en hårfjerning krem for 1-2 min. tørke mageområdet rengjøre med gasbind og destillert vann, om nødvendig.
    9. Du kan også fjerne håret fra magen ved barbering med en liten elektrisk barberhøvel.
    10. Sterilisere magen med Baxedin (Chlorhexidine Gluconate BP løsning) før du gjør en snitt. Bruke etanol lett med gasbind å unngå overdreven varmetap forårsaket av fordampning av alkohol.
  2. Eksponering av den underlegne Vena Cava (IVC)
    1. Bruker kirurgisk saks, utføre en laparotomy for å åpne bukhulen.
      1. Løft huden med tang på nedre del av magen og gjøre en loddrett snitt parallell til hver side av linea alba. Gjør den første snittet til venstre eller høyre for linea alba, avhengig av håndbruk operatør. Snittet er gjort fra midtlinjen å hjelpe ultralyd imaging senere.
      2. Gjør en andre, horisontal snitt øverst i magen.
        Merk: Ved gjennomtrengning i magen, muskulatur bør være "tented" og deretter gjennomsyret med kirurgisk saks å forhindre skade abdominal organer.
      3. Gjenta de vertikale og horisontale incisions på bukmuskel laget av dyret. Husk å telt muskulatur under penetrasjon i magen for ikke å skade organer under.
        Forsiktig: Løft hud og muskel fra tarmen og andre indre organer når snitt for ikke å punktere dem.
    2. Kast hud og muskel fra snittet til å utsette bukhulen.
    3. Bruk gasbind, fuktet isotonic løsning, ved siden av såret åpningen og externalize tarmen. Bruk press på begge sider av magen til hjelpe eksternalisering av tarmen. Bruke skånsom bevegelser med en bomull tips applikator flytte tarmen. Nyt gasbind i isotonic løsning og sovrapponetelo externalized tarmen.
      1. Gasbind bør være pre-fuktet før plassering på vev.
    4. Gå til side noen peritoneal fett, og utsette IVC mellom nyre og iliaca venene.
    5. Gjøre en innledende identifisering av åpenbare sidegreiner. En side gren vises som mindre, men betydelig venen som grener fra IVC, mellom nyre og iliaca vener. Blodkar kan variere mellom mus. Mus kan ha sidegreiner tilstede på en eller begge sider av IVC.
  3. Ligation av sidegreiner
    Merk: Hvis sidegreiner, etterfølges følgende prosedyre for hver. Hvis ikke finnes, går du til trinn 4: første Sutur plassering under IVC. Det ligation av IVCEN blir umiddelbart distale til venstre nyre blodåre, uavhengig av tilstedeværelse av sidegreiner.
    1. Utføre sløv disseksjon på hver side av siden grenen. Sløv disseksjon er prosessen med å åpne gjentatte ganger sløv tang med lett press, for å bryte gjennom fascia uten å skade omkringliggende fartøy.
      Forsiktig: Unngå punktering eller skade venen.
    2. Løft grenen og passere en del av 6-0 silke Sutur under venen. Alltid ta vare når løfte eller flytte skip. Det er best å ta fettet rundt fartøyene, ellers er det en risiko for skade fartøyet.
    3. Bruke Sutur tang, lage en surgical ligation rundt siden grenen bruker standard kirurgisk knot knytte teknikk. Full ligation gjøres for å sikre 100% okklusjon av venen. Bruk minst tre knytte kaster for å sikre ligation er sikkert.
    4. Gjenta trinn 1.3 for eventuelle gjenværende sidegreiner.
  4. Disseksjon av abdominal aorta fra IVCEN
    1. Utføre sløv disseksjon rundt IVC umiddelbart distale fra venstre nyre venen. Abdominal aorta er knyttet til IVC via fascia, derfor utføre innledende sløv disseksjon rundt både IVC og abdominal aorta.
      Forsiktig: Unngå punktering eller skade venen. Ikke brudd eller punktere enten fartøy. Dette er den mest kritiske delen av prosedyren, med den høyeste risikoen for fartøyet skade.
    2. Fortsette å bruke lett trykk via sløv disseksjon til et klart vindu er gjort mellom aorta og IVC.
  5. Sutur plassering og IVC ligatur
    1. Sende en del av 6-0 silke Sutur under IVC og abdominal aorta.
    2. Finn suture gjennom vinduet opprettet mellom IVC og aorta. Bruk tang til å trekke suture og tråd det mellom abdominal aorta og IVC. Tråd suture gjennom nøye, prøver ikke å trekke/punktering IVC og abdominal aorta.
    3. Gjøre en surgical ligation rundt IVCEN med Sutur tang, sikrer en total okklusjon i venen. Igjen, gjør ligation umiddelbart distale fra venstre nyre venen.
    4. Gjøre tre Sutur kaster å sikre ligation.
      Merk: Det er også mulig å admission card suture under IVC og aorta før skiller to som et alternativ. 7-0 Prolene suturer kan også brukes for ligation av sidegreiner og IVC.
  6. Såret nedleggelse og postoperativ omsorg
    1. Kontroller at abdominal aorta har stått uavbrutt og at alle sidegreiner har vært samskrevet. IVCEN vises strekte distale fra området hemorroider og ingen blod flyte vises.
    2. Sett alle peritoneal fett og tarmen tilbake i bukhulen.
    3. Lukke såret Sutur tang og 6-0 silke Sutur. Bruk en kjører Sutur (enkel kontinuerlig) og sikre at suture ikke vil være for stram. En stram Sutur vil Ruptur Når Dyret våkner og går rundt buret sitt.
      1. Alternativt bruke PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon eller rustfrie klipp for såret nedleggelse.
    4. Sutur laget av bukmuskel først bruker riktig Sutur knytte teknikk.
    5. Gjenta Sutur teknikk for huden og kontroller såret nedleggelse er tilstrekkelig.
      Merk: Hvis bruker samme Sutur nål og tråd for flere dyr, sterilisere både i 70% etanol før bruk.
    6. Fjerne dyret fra bedøvende gass og plassere dem i en 34 ° C inkubator i minst 30 minutter.
    7. Igjen, administrere 0.2 - 0,5 mL isotonic væsker per 10 g kroppsvekt subcutaneously. Væsker kan gis i følgende dager å opprettholde pre-operative kroppsvekt, om nødvendig.
    8. Overvåke dyret til frisk å sikre vellykket operasjon og vurdere den generelle helsen av dyret.
      Forsiktig: Forventer en liten sammenkrøket holdning for en invasiv prosedyre som dette, men dyret vil fungere normalt så tidlig som 30 minutter etter operasjon.
    9. Plasser dyret i sin egen bur og plasser det ikke med andre dyr til helt frisk.
    10. Å administrere smertestillende daglig for opptil 48 h postop.
    11. Plasser mat på gulvet i buret for dyr stund i utvinningen. Annen spesiell behandling er vanligvis ikke nødvendig.
    12. Undersøke såret området for rødhet, hevelse eller utslipp og andre symptomer av infeksjon.
    13. Eventuelt fjerne suturer etter 7-10 dager.
    14. Utføre euthanasia umiddelbart hvis operasjonen mislykkes (f.eks betydelig fartøyet skade og/eller blod tap) eller dyr ikke blir bedre med postoperativ pleie. Euthanasia er vanligvis utført på 48 timer postop. For lengre eksperimenter, bruk 7-0 Prolene for å ligate sidegreiner og IVCEN og 5-0 Vicryl suturer for å lukke bukhulen.
      1. Utføre euthanasia ved anesthetization av dyr i en induksjon som tidligere beskrevet, unntatt på 5% isoflurane. Dette etterfølges av kvelning med 100% CO2 mens anesthetized.
      2. Etter bekreftelse av euthanasia ved kvelning (tap av hjerteslag og ikke puste), utføre cervical forvridning for å sikre fullstendig euthanasia.

2. High Frequency ultralyd protokollen

Merk: Denne protokollen er tilpasset fra Lady Davis Institute gnager Phenotyping Core SOP for høyfrekvent ultralyd imaging. Denne protokollen er utført 24 h post-operativ, men kan gjøres før så lenge dyret svarer godt til operasjonen. Protokollen kan utføres når som helst på sunne mus og er ofte gjort så sammenligne før og etter operasjonen.

  1. Utarbeidelse av dyr
    1. Plasser dyret i en induksjon kammer og bedøve dyret med en blanding av 100% oksygen og 2,5% isoflurane.
    2. Slå på hjertefrekvens og temperatur monitor. Posisjon varmelampe over bordet for å holde dyr varme under prosedyren.
    3. Fjern dyret fra induksjon kammeret og bruke øye smøremiddel for å hindre hornhinnen uttørking. Plasser dyret på analyse plattform og påføre bedøvende røret til dyrets munn/nese.
    4. Varm ultralyd gel 37 ° c og plasser gel på magen på dyret. Ultralyd gel er oppvarmet med en oppvarming av vann system som pumper varmt vann gjennom spoler som er pakket rundt flaske gel.
    5. For hjertefrekvens målinger (om nødvendig), sette elektrodegel på 4 elektrodene på analyse plattformen og fikse paws av dyr å plattform/elektrodene med kirurgisk tape. Plassere dyret i supine posisjon for bildebehandling til IVCEN. Ultralyd imaging system inkluderer en analyse plattform som er varmet og inneholder elektroder for overvåking dyret.
    6. For temperaturmålinger, sette elektrodegel på termometer og inn i endetarmen av dyret.
    7. Justere varmelampe og isoflurane som nødvendig for å sikre at dyr er komfortable, har en åndedrett mellom 30-70 bpm og holdes på 37 ° C.
    8. Hvis nødvendig, barbere magen av dyr eller fjerne hår med hår fjerning krem. Søke for 1-2 minutter, og gni den ren med gasbind og destillert vann.
      Merk: For mye hår kan påvirke kvaliteten på bildene.
    9. Plasserer gasbind under eller ved siden av det dyr å fange noen overflødig ultralyd gel.
  2. Tenkelig IVC og blodpropp
    1. Slå på bildebehandlingsprogramvare og begynne en ny studie.
    2. Velg en passende scanhead for bildebehandling. Scanhead her er for abdominal organer (frekvens: 35 MHz, brennvidde: 12,8 mm).
    3. Registrer all relevant informasjon om dyret. Dette kan omfatte dyr ID, kjønn, vekt, fødselsdato, belastning, osv.
    4. Senk scanhead ned til den berører ultralyd gel på dyret.
    5. Starte scanhead proben for å starte 2D-bilder av dyr. I denne modusen presenteres bildene som to tredimensjonale, i forskjellige nyanser av grått.
    6. Finne IVC og abdominal aorta ved å flytte musen plattformen i x - og/eller y-flyet, mens også flytter scanhead gjennom z-flyet.
      Merk: Blod fartøy vises med deres veggene hvite og blod i nesten svart. Abdominal aorta vil pulsere intenst og har tykke vegger, mens IVCEN vil har tynnere vegger og komprimere/utvide lett på bildet skjermen når scanhead flyttes og ned. Hemorroider området blir tydelig, mens venen vil bli utvidet og vene veggen vil komme til et punkt. Noen blodpropp dannet inne heltrukket under ultralyd imaging og komprimerer ikke lett som blodåre veggen gjør. Venen vil komprimere bare over ligation, der ingen blodpropp dannes.
    7. Ved å finne midtstille IVCEN og området hemorroider, dem på det sentrale punktet i ultralyd, for å oppnå mest nøyaktige bildet.
      1. Hvis bildet er for mørkt til å se klart, justere gel og fjern eventuelle luftbobler med en bomull tips applikator.
      2. Eventuelt tilt scanhead 45 grader til venstre eller høyre og justere en dyr plattform se venen klart. Dette gjøres hvis det innblanding i scanhead. I dette scenariet må venen avbildes i side-vinkel å unngå suture.
        Merk: Image forstyrrelser er oftest forårsaket av mørke flekker av huden på dyr, dårlig sår Sutur plassering eller bobler i ultralyd gel.
    8. Bruker programvaren, ta bilder av noen ønsket strukturer og foreta målinger måling verktøy. Felles mål inkluderer tverrsnitt av blodpropp eller bredden på området hemorroider.
    9. Endre tenkelig modus til puls-bølge Doppler gjøre blodet flyt mål. Denne modusen lar avbilding av vaskulær blodstrøm og måling av flyten hastighet, blant andre variabler.
    10. Vipp analyse plattformen for å senke den bakre enden av dyret.
    11. Endre visningsvinkelen/av scanhead slik at det vil kontakte gel i en vinkel på ca 30° fra den bakre enden av dyret.
    12. Flytte dyr plattformen og scanhead. Flytte IVC og ligatur om nødvendig.
    13. Gjøre blodet flyt mål rundt området hemorroider å bekrefte stasis og ta bilder ønsket. Felles mål av blodstrøm være gjennomsnittlig hastighet, topp hastighet eller median hastighet.
    14. Lagre noen målinger eller bilder tatt.
  3. Opprydding og dyr
    1. Øke scanhead første posisjon og flytte dyr plattform til sin opprinnelige posisjon, også.
    2. Fjern overflødig gel av dyret med gasbind. Gjør dette forsiktig slik at såret Sutur ikke vil være sprukket.
    3. Termometeret fra dyrets endetarmen og ta dyret av plattformen.
    4. Plassere dyret i buret sitt og en 34 ° C inkubator.
    5. Overvåke dyret til gjenoppretting. Fremgangsmåten er svært små og ikke-invasiv. Dyret vil våkne opp raskt. Fortsette overvåking dyr i de følgende dagene i samsvar med § 1.6 av denne protokollen.
    6. Rengjør dyr plattformen med gasbind og desinfeksjonsmidler.
    7. Tørk scanhead rent med gasbind og destillert vann.
      Forsiktig: Rengjør scanhead svært forsiktig og bare med destillert vann.
    8. Gjenta trinn 2 for det neste dyr.
      1. Hvis ferdig med alle fag, må du kontrollere at alle bilder og opptak er lagret. Deretter slå av alt utstyr og programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stasis venetrombose modell

I stasis modellen, mus er anesthetized, og et snitt er gjort for å avsløre den underlegne vena cava (IVC). Snittet er gjort på venstre eller høyre side av musen i stedet for en midtlinjen laparotomy på en måte som ikke ville forstyrre den ultralyd proben. Magemusklene og huden er fold tilbake å avsløre IVC (figur 1). Først er sidegreiner samskrevet med en 6-0 silke Sutur (figur 2). Deretter IVC er separert fra aortabuen sløv disseksjon og silke plasseres rundt IVC (figur 3A-C). IVC er samskrevet med en 6-0 silke Sutur. Dilatasjon av IVC under området hemorroider er en indikasjon på vellykket avbrudd i blodtilførselen (figur 3D). Til slutt, bukhulen og huden er sutured i en kontinuerlig måte (figur 3E).

Overvåking av dannelse bruker ultrasonography

Som vi tidligere har vist, kan høyfrekvent ultralyd, som er vanlig å vurdere venetrombose i klinisk innstillinger, brukes til å måle dannelse og oppløsning over tid i en eksperimentell murine modell. Vi brukte en høyfrekvent mikro-imaging system12. Før hemorroider, kan IVCEN identifiseres i visningen langsgående. Etter ligation av venen, kan suksessen til prosedyren visualiseres. PW-Doppler modus kan brukes til å bestemme blod flyten hastighet før (34.8 mm/s) og etter (5.6 mm/s) til hemorroider. Fordi thrombi er tettere enn strømmer blod, kunne vi verdsette det dannet blodpropp i IVC bruker ultrasonography, 24 timer etter ligatur (figur 4A). Ultrasonography tillater kvantifisering av hastigheten av blodstrøm i fartøy bruker farge Doppler. Som vist i figur 4B, kan vi måle flyt i venen før ligatur og takker avbrudd i flyten etter hemorroider, når blodpropp er dannet. Data fra vårt laboratorium show en gjennomsnittlig blodpropp størrelse av 4,85 ± 0.22 mm2 på 24 timer og 5.05 ± 0.47 mm2 på 48 timer (mener ± SEM).

Figure 1
Figur 1. Stasis modell: prosedyre å avsløre den underlegne vena cava. (A) musen hår fra magen fjernes ved hjelp av hår fjerning krem. (B) en første snitt er gjort på venstre side av magen og en andre ventrale ett (C) fra venstre til høyre. (D) en våt sterilt blikk brukes exteriorize tarmen og avsløre dårligere vena cava (IVC) og siden gren (SB). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Stasis modell: prosedyre å ligate siden grenen. (A) utstilling av IVC og SB. (B) plassering av Sutur silke under SB. (C) Ligation av den SB. LRV: venstre nyre blodåre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Stasis modell: prosedyre å ligate den underlegne vena cava. (AB) Sløv disseksjon skille IVCEN fra aortabuen. (C) plassering av Sutur silke under IVC. (D) ligation av IVC. Dilatasjon til IVCEN er observert. (E) magemuskler- og hud er stengt separat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Overvåking av dannelse med ultralyd imaging. (A) representant ultralyd bilder før, umiddelbart etter og 24 timer etter ligation av IVC. (B) representanter bilder av blod flyte hastighet avbildet av farge Doppler med fargebehandling. Omfanget av fargekodede blodet flyt varierer fra rød til gul å skildre høy til lav strømning. I ligated dyr er fravær av flyt avbildet av fraværet av fargen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere viktige skritt for vellykket venøs dannelse ved hjelp av stasis modellen. Induksjon av venetrombose er mer utfordrende i gamle mus på grunn av opphopning av fett rundt de underlegne vena cava og aorta. Ideelt sett skal mus under denne prosedyren 8 - 10 uker gammel. Stor forsiktighet bør tas ikke å indusere endothelial skader i IVCEN i sløv disseksjon og ligatur. I tillegg er det avgjørende å holde dyr i en 34 ° C inkubator i minst 30 minutter etter operasjonen og returnere den til selskapet av andre dyr etter full gjenoppretting. Når operasjonen er gjort riktig, fungerer dyrene bemerkelsesverdig godt under postoperativ pleie. De viser ingen alvorlige bivirkninger som klagesang, vc6 eller inkontinens. De kan ha redusert bevegelse og en litt sammenkrøket holdning umiddelbart etter kirurgi, men dette er ikke sett ofte så lenge smertestillende er effektiv og operasjonen utføres riktig.

Stasis modellen produserer en stor blodpropp med reproduserbar størrelse mål fra en mus til en annen. Som mennesker, anatomien i det venøse systemet varierer mellom mus og spørsmålet om IVC gren avbrudd nylig er behandlet i stenose og stasis modellene DVT13,14. Brandt et al. viste at dannelse av flyt begrensning ble forhindret når sidegreiner lå i < 1,5 mm IVC ligation området. Imidlertid var DVT dannelsen av flyt begrensning i mus ikke påvirket av siden gren ligation13,15,16. Det ble også rapportert at variasjon av IVC sidegreiner i C57Bl6 musen belastning har en viktig innvirkning på dannelse av komplett ligation IVC14. Det ble funnet at ikke ligating siden grener resultater i statistisk mindre blodpropp størrelse sammenlignet med kontroller med samskrevet sidegreiner. Vår studie tyder også på at ligation siden grener produsert konsekvent dannelse og størrelse. Men er de hyppigste anatomiske variasjon i C57Bl/6 tilstedeværelsen av 2 tilbake grener (98% av mus)14. Det ble demonstrert at avbryte tilbake grenene har den største effekten på blodpropp størrelse. Nåværende metodene opp ikke effekten av tilbake grener, som kan bli avbrutt bruk en lav temperatur cautery penn14. Vi viste imidlertid at ligation IVC og siden grener resulterte i konsekvent dannelse i C57Bl/6. Til slutt, som vi tidligere har vist, høyfrekvent ultralyd systemet tillater presis måling av blodpropp størrelse og kan brukes til langsiktig og translasjonsforskning studier av dannelse og oppløsning12,13 ,15.

En stor ulempe av stasis modellen er fullstendig hindringen av blodstrøm, noe som reduserer maksimal effekten av intravenøst administrert agenter på blodpropp og venen veggen. Dette blir et viktig problem når man ønsker å teste effekten av en farmakologisk agent. Hvis effekten av en bestemt stoffet må testes, foretrekker en stenose modell13 eller elektrolytisk modell17. Begge modellene produsere thrombi i nærvær av kontinuerlig blodstrøm, som tillater testing av nye anti-koagulere agenter for DVT profylakse og behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra hjertet og Stroke Foundation of Canada og The Morris og Bella Fainman Family Foundation. Forfatterne vil gjerne takke Veronique Michaud for hennes teknisk hjelp med VEVO770 ultralyd imaging system.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 perma-hand silk suture Ethicon 706G
Surgical Scissors Fine Science Tools 20830-00
Suture tying forceps Fine Science Tools 20830-00
blunt forceps (straight and curved) Fine Science Tools 20830-00
Needle Driver Fine Science Tools 13002-10
Moria Spring Scissors Fine Science Tools 15396-00
1ml syringes BD Biosciences
26G needles Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System Visualsonics No longer sold
SR Buprenorphine ZooPharm Given to LDI by Vet
Surgery Microscope Leica Leica M651
Systan eye oinment Alcon 288/28062-0
2x2 sterile Gauze CDMV #104148
Cotton Tip Applicators from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape CDMV #7411
Ultrasound gel (Aquasonic-100) Dufort & Lavigne #AKEN4061
Incubator From JGH
Isoflurane Dispomed
Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment Dispomed
Hair remover Nair
Water heated hard pad Braintree Scientific, Inc. #HHP-2
Gaymar heater water pump TP500 MATVET Inc. #R-500305
Infra-red heating lamp electrimat inc. #1R175R-PAR
Mouse rectal temperature prope emkaTECHNOLOGIES
Sterile water From JGH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25, (1), 1-5 (2003).
  2. McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi. Thromb Haemost. 85, (6), 1018-1024 (2001).
  3. Singh, I., et al. Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells. Circulation. 107, (6), 869-875 (2003).
  4. Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Ann Nucl Med. 8, (3), 193-199 (1994).
  5. Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, (2), 256-263 (2003).
  6. Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom. J Nucl Med. 41, (6), 1056-1064 (2000).
  7. Wakefield, T. W., et al. Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy. J Vasc Surg. 31, (2), 309-324 (2000).
  8. Robins, R. S., et al. Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice. Blood. 121, (4), 692-699 (2013).
  9. Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis. Blood. 127, (6), 769-777 (2016).
  10. Laurance, S., et al. Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2017).
  11. Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 556-562 (2012).
  12. Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. In vivo monitoring of venous thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10, (3), 447-452 (2012).
  13. Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56, (2), 145-152 (2014).
  14. Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13, (4), 660-664 (2015).
  15. Luther, N., et al. Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution. Circ Res. (2016).
  16. Subramaniam, S., et al. Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development. Blood. 129, (16), 2291-2302 (2017).
  17. Diaz, J. A., et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, (2), 366-375 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics