Thrombose veineuse profonde induite par stase chez les souris surveillé par échographie de haute fréquence

Immunology and Infection

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Summary

Le présent protocole décrit les étapes pour obtenir une thrombose veineuse à l’aide d’un modèle de stase. En outre, nous utilisons une méthode non invasive pour mesurer la formation du thrombus et la résolution au fil du temps.

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Rys, R. N., Blostein, M. D., Lemarié, C. A. Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography. J. Vis. Exp. (134), e57392, doi:10.3791/57392 (2018).

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Abstract

La thrombose veineuse est une affection fréquente qui touche 1 à 2 % de la population, avec une incidence annuelle de 1 à 500. Thrombose veineuse peut mener à la mort par embolie pulmonaire ou de résultats dans le syndrome post-thrombotique, caractérisée par la douleur chronique de jambe, gonflement et ulcérations, ou dans l’hypertension pulmonaire chronique entraînant des chroniques respiratoires compromis. C’est la maladie cardiovasculaire plus répandue après infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral ischémique et constitue un défi clinique pour toutes les disciplines médicales, comme il peut compliquer le cours d’autres maladies comme le cancer, maladie systémique, chirurgie et traumatismes majeurs.

Modèles expérimentaux sont nécessaires pour étudier ces mécanismes. Le modèle de stase induit taille thrombus cohérente et un montant quantifiable de thrombus. Cependant, il faut systématiquement ligaturer les branches latérales de la veine cave inférieure afin d’éviter la variabilité de la taille du thrombus et de toute interprétation des données erronées. Nous avons développé une technique non-invasive pour mesurer la taille du thrombus à l’aide de l’échographie. En utilisant cette technique, nous pouvons imposer des thrombus développement et la résolution au fil du temps chez le même animal. Cette approche limite le nombre de souris nécessaire pour la quantification de la thrombose veineuse conforme au principe de remplacement, réduction et raffinement des animaux en recherche. Nous avons démontré que poids de thrombus et l’analyse histologique des thrombus taille en corrélation avec les mesures obtient avec l’échographie. Par conséquent, la présente étude décrit comment induire une thrombose veineuse profonde chez les souris en utilisant le modèle de stase de veine cave inférieure et sa surveillance en utilisant des ultrasons de haute fréquence.

Introduction

Thromboembolie veineuse (TEV), qui est composé de thrombose veineuse profonde (TVP) et l’embolie pulmonaire, est la troisième cause de décès d’origine cardiovasculaire après infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. C’est une affection fréquente qui touche 1 à 2 % de la population, avec une incidence annuelle de 1 5001. VTE peut conduire à : 1) décès par embolie pulmonaire ; 2) syndrome post-thrombotique, caractérisé par une douleur chronique de jambe, gonflement et ulcérations ; ou 3) hypertension pulmonaire chronique entraînant importants compromis respiratoire chronique. VTE est une maladie multifactorielle et peut résulter de la stase de la circulation sanguine, dommages aux parois des vaisseaux, et/ou hypercoagulation États en raison d’une rupture de l’équilibre entre la coagulation et les systèmes fibrinolytiques, telle qu’elle a été décrite il y a plus de cent ans par Virchow et est connu comme la triade de la Rudolf Virchow.

Parce que dans la plupart des cas, il est impossible d’obtenir des échantillons humains de thrombose veineuse profonde, les chercheurs ont développé des modèles animaux expérimentaux de thrombose veineuse profonde. Plusieurs animaux dont rat2souris3, lapin4, porc5, chien6et primate non humain,7 ont été utilisés. Les souris peuvent être génétiquement modifiés et sont l’animal le plus souvent utilisé pour étudier la thrombose veineuse profonde. Toutefois, comme chez tous les animaux, DVT spontanée n'est pas observé chez les souris. Ainsi, des modifications physiques ou chimiques de la paroi veineuse sont utilisées pour créer la thrombose chez la souris. Nous avons déjà utilisé le modèle de chlorure ferrique pour thrombose de la veine cave inférieure (VCI) de souris8,9,10. Ce modèle a l’avantage de produire efficacement des thrombi occlusifs quelques minutes et peut être utilisé pour étudier le rôle des médicaments anticoagulants et antiplaquettaires au cours de la thrombose veineuse profonde aiguë. Cependant, c’est une procédure terminale. Ainsi, pour étudier la thrombose veineuse profonde aiguë et chronique, la stase est plus adapté. Dans ce modèle, la formation du thrombus est induite par l’interruption complète de la circulation sanguine dans la VCI, l’un des facteurs dans la triade de Virchow pour le développement de la thrombose veineuse profonde. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la formation de la thrombose veineuse profonde et de la résolution, qui est un avantage par rapport à la FeCl3 modèle11.

Nous avons développé une méthode non invasive pour suivre la formation du thrombus et la résolution au fil du temps en utilisant un système de micro-imagerie haute fréquence ultrason12. Nous avons démontré précédemment que mesure de la thrombose veineuse par échographie est favorablement en corrélation avec thrombus obtenus à l’examen anatomo-pathologique. Dans deux études ultérieures, nous avons confirmé que les mesures obtenues par échographie en corrélation avec le poids du thrombus et zone de thrombus quantifié en histochimie9,10. Plus important encore, nous avons montré que les ultrasons haute fréquence peuvent être utilisé pour surveiller la formation d’une thrombose veineuse profonde en souris12. Il peut également servir à quantifier la résolution thrombus de façon non invasive.

Ici, nous allons décrire le protocole permettant la formation de thrombus en utilisant le modèle de souris de thrombose induite par la stase et comment la formation de thrombus peut être surveillée de façon non invasive au fil du temps en utilisant des ultrasons de haute fréquence.

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Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le Canada Animal Care Comité d’Université McGill Montréal, QC, institutionnel. Tout l’équipement nécessaire est répertorié dans le tableau j’ai.

1. murin (C57BL/6J) Protocole de stase IVC

  1. Préparation de la chirurgie
    Remarque : Il s’agit d’une chirurgie de survie et par conséquent, une technique aseptique appropriée doit être suivie à tout moment. Cela inclut en s’assurant que tous les matériaux sont à portée de main, nettoyage et stérilisation des instruments avant et entre utilisation et désignant une zone stérile sur la surface de travail pour tout le matériel stérile.
    1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux et matériel par autoclave. Un stérilisateur de perle de verre suffit stériliser les conseils d’instrument entre les animaux, si plus d’une procédure se faite en une seule fois.
    2. Anesthésier les souris mâles de 8 à 10 semaine vieux C57Bl/6 avec un mélange de 100 % d’oxygène et de 2,5 % isoflurane.
      Remarque : Régler le débit d’oxygène et isoflurane comme nécessaire.
    3. Confirmer anesthetization en pinçant la patte arrière de l’animal entre les orteils avec une pince. Aucune réponse de la pincée n’indique que l’animal est anesthésié.
    4. Administrer un analgésique de libération lente (buprénorphine) par injection sous-cutanée. Donne souris une dose de 1 mg d’analgésique par 1 kg de poids corporel (1 mg/kg).
    5. Placez onguent sur les deux yeux de l’animal à n’assurer aucune cornée dessiccation pendant la durée de la procédure.
    6. Administrer par voie sous-cutanée 0,2 - 0,5 mL de liquide isotonique par 10 g de poids corporel.
    7. Fixer l’animal en place à la table de chirurgie à l’aide de ruban chirurgical. Placer l’animal dans une position en décubitus dorsal pour exposer l’abdomen. Opérer sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie.
    8. Enlever les poils de l’abdomen de la souris en application d’une épilation crème pendant 1-2 min. essuyer la zone abdominale, nettoyer avec de la gaze et l’eau distillée, si nécessaire.
    9. Vous pouvez également enlever les poils de l’abdomen par le rasage avec un rasoir électrique petit.
    10. Stériliser l’abdomen avec Baxedin (Solution de Chlorhexidine Gluconate BP) avant de faire des incisions. Appliquer l’éthanol légèrement avec de la gaze pour éviter la perte de chaleur excessive causée par l’évaporation de l’alcool.
  2. Exposition de la veine cave inférieure (VCI)
    1. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, effectuer une laparotomie pour ouvrir la cavité abdominale.
      1. Soulever la peau avec une pince au bas du ventre et de pratiquer une incision verticale parallèle de part et d’autre de la linea alba. Faire l’incision première à gauche ou à droite de la linea alba, selon le caractère gaucher ou droitier de l’opérateur. L’incision est faite loin de la ligne médiane pour aider à l’imagerie par ultrasons, par la suite.
      2. Faire une incision Deuxièmement, horizontale en haut de l’abdomen.
        Remarque : Dès la pénétration dans l’abdomen, la musculature doit être « tentes » et ensuite pénétrée avec des ciseaux chirurgicaux pour éviter tout dommage aux organes abdominaux.
      3. Répétez les incisions verticales et horizontales sur la couche de muscle de l’abdomen de l’animal. N’oubliez pas de la musculature de tente lors de la pénétration dans l’abdomen de manière à ne pas endommager les organes sous.
        ATTENTION : Soulever la peau et des muscles des intestins et autres organes internes en faisant des incisions de manière à ne pas perforer les.
    2. Pliez la peau et le muscle de l’incision pour exposer la cavité abdominale.
    3. Appliquez la gaze, imbibé d’une solution isotonique, aux côtés de l’ouverture de la plaie et externaliser les intestins. Appuyez sur les deux côtés de l’abdomen pour aider l’externalisation de l’intestin. Utilisez des mouvements douces avec un coton-tige pour déplacer les intestins. Tremper la gaze dans une solution isotonique et placez-le sur les intestins externalisés.
      1. Gaze doit être de démaquillage avant le placement sur le tissu.
    4. Écarter toute graisse péritonéale et exposer la VCI entre les veines rénales et iliaques.
    5. Faire une identification initiale des branches latérales évidentes. Une branche latérale apparaît comme plus petite, mais les veines veine importante qui bifurque de la VCI, entre le rein et iliaque. Système vasculaire peut varier considérablement entre les souris. Souris peuvent avoir des branches latérales présentes sur une ou deux faces de la VCI.
  3. Ligature des branches latérales
    Remarque : Si les branches secondaires sont présents, la procédure suivante est suivie pour chacun d’eux. Si non présent, passez à l’étape 4 : mise en place de suture Initial en vertu de la VCI. Le site de la ligature de l’IVC sera immédiatement distal par rapport à la veine rénale gauche, indépendamment de la présence de branches latérales.
    1. Effectuer une dissection émoussée sur chaque côté de la branche de côté. Par dissection par clivage est le processus d’ouverture à plusieurs reprises pince émoussée par légère pression, afin de percer le carénage sans endommager les vaisseaux avoisinants.
      Mise en garde : Éviter toute perforation ou d’endommager la veine.
    2. Soulever la branche et passer d’une section de 6-0 de suture en soie sous la veine. Toujours prendre soin quand soulever ou déplacer des bateaux. Il est préférable de saisir la graisse autour des vaisseaux, dans le cas contraire, il y a un risque d’endommager le bateau.
    3. À l’aide de pinces à suture, faire une ligature chirurgicale autour de la branche de côté aide standard noeud chirurgicale liant technique. La ligature complet est faite pour assurer 100 % occlusion de la veine. Utilisez au moins trois lancers liant la ligature est bien fixée.
    4. Répétez l’étape 1.3 pour toutes les branches latérales restantes.
  4. Dissection de l’aorte abdominale de la VCI
    1. Effectuer une dissection émoussée autour de la VCI immédiatement distale de la veine rénale gauche. L’aorte abdominale est attaché à l’IVC via le fascia, donc effectuer une dissection émoussée initiale autour de l’IVC et de l’aorte abdominale.
      ATTENTION : Évitez de percer ou d’endommager la veine. Ne pas se rompre ou perforer deux navires. C’est la partie la plus critique de la procédure, avec le plus haut risque de lésion vasculaire.
    2. Continuer à appliquer une légère pression par dissection par clivage jusqu'à ce qu’une fenêtre transparente est prise entre l’aorte et la VCI.
  5. Suture et ligature IVC
    1. Passer d’une section de 6-0 la suture soie sous l’IVC et l’aorte abdominale.
    2. Localiser la suture à travers la fenêtre créée entre l’IVC et l’aorte. Forceps permet de tirer la suture et le passer entre l’aorte abdominale et IVC. La suture par fil avec soin, essayant de ne pas tirer/ponction l’IVC et l’aorte abdominale.
    3. Faire une ligature chirurgicale autour de la VCI avec pinces à suture, assurant une occlusion totale de la veine. Encore une fois, faire la ligature immédiatement distale de la veine rénale gauche.
    4. Faire trois lancers de suture pour garantir la ligature.
      Remarque : Il est également possible de passer la suture sous l’IVC et l’aorte avant de séparer les deux comme solution de rechange. Par ailleurs, les sutures de prolène 7-0 peuvent être utilisés pour la ligature des branches secondaires et la VCI.
  6. Fermeture de la plaie et soins post-opératoires
    1. Vérifiez que l’aorte abdominale a été laissée sans interruption et que toutes les branches latérales ont été ligaturés. La VCI apparaîtra dilatée distale sur le site de ligature et pas de sang écoulement sera visible.
    2. Replacez toute la graisse péritonéale ainsi que les intestins dans la cavité abdominale.
    3. Refermer la plaie à l’aide de pinces à suture et suture de soie de 6-0. Utiliser une suture en cours d’exécution (simple continue) et veiller à ce que la suture ne sera pas trop serrée. Une suture serrée va se rompre lorsque l’animal se réveille et se déplace autour de sa cage.
      1. Vous pouvez également utiliser les clips PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon ou inox pour refermer les plaies.
    4. Suture de la couche de muscles abdominaux tout d’abord à l’aide de sutures appropriées liant technique.
    5. Répétez la technique de suture pour la peau et vérifier la fermeture de la plaie est suffisante.
      Remarque : Si vous utilisez la même aiguille à suture fil pour plusieurs animaux, stériliser tous les deux dans l’éthanol à 70 % avant chaque utilisation.
    6. Retirer l’animal de gaz anesthésique et les placer dans un incubateur à 34 ° C pendant au moins 30 minutes.
    7. Encore une fois, administrer 0,2 - 0,5 mL de liquide isotonique par 10 g de poids corporel par voie sous-cutanée. Fluides peuvent être donnés dans les jours suivants pour maintenir le poids corporel au stade préopératoire, si nécessaire.
    8. Surveiller l’animal jusqu'à la guérison d’assurer avec succès une intervention et d’évaluer la santé globale de l’animal.
      Mise en garde : S’attendre à une posture voûtée légère pour une procédure invasive comme celui-ci, mais l’animal se comportera normalement dès post-opération de 30 minutes.
    9. Placer l’animal dans sa propre cage et ne le jetez pas avec les autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri.
    10. Re-administrer des analgésiques par jour pour jusqu'à 48 h postop.
    11. Placer les aliments sur le plancher de la cage de l’animal tout en récupération. Autres soins spéciaux n’est généralement pas nécessaire.
    12. Examiner la plaie pour la rougeur, l’enflure, ou décharge et tout autre signe d’infection.
    13. Si nécessaire, enlever les sutures après 7-10 jours.
    14. Effectuer l’euthanasie immédiatement si la chirurgie est infructueuse (p. ex. perte dommages et/ou de sang d’important navire) ou animal ne s’améliore pas avec les soins post-opératoires. L’euthanasie est généralement effectuée à postop 48 h. Pour des plus longues expériences, utilisez prolène 7-0 pour ligaturer les branches secondaires et la VCI et sutures Vicryl 5-0 pour fermer la cavité abdominale.
      1. Effectuer l’euthanasie par anesthetization de l’animal dans une induction comme décrit précédemment, sauf à l’isoflurane 5 %. Elle est suivie d’asphyxie avec 100 % de CO2 tandis qu’anesthésiés.
      2. Après confirmation de l’euthanasie par asphyxie (perte de rythme cardiaque et ne respire pas), effectuer la dislocation cervicale afin d’assurer l’euthanasie complet.

2. protocole d’ultrasons haute fréquence

Remarque : Ce protocole est adapté de la Lady Davis Institute rongeur phénotypage Core SOP pour imagerie par ultrasons haute fréquence. Ce protocole est effectué post-opératoire de 24 h, mais peut être fait plus tôt tant que l’animal répond bien à la chirurgie. Le protocole peut être effectué à tout moment sur des souris saine et est souvent fait de comparer avant et après la chirurgie.

  1. Préparation de l’Animal
    1. Placer l’animal dans une chambre à induction et anesthésier l’animal avec un mélange de 100 % d’oxygène et de 2,5 % isoflurane.
    2. Tourner sur la fréquence cardiaque et de surveiller la température. Feu de position chaleur tableau pour réchauffer l’animal au cours de la procédure ci-dessus.
    3. Retirer l’animal de la chambre de l’induction et appliquer du lubrifiant oculaire pour empêcher la dessiccation cornéenne. Placez l’animal sur la plate-forme d’analyse et d’apposer le tube anesthésique à la bouche/nez de l’animal.
    4. Chaud ultrasons gel à 37 ° C et placer le gel sur le ventre de l’animal. Le gel d’échographie est chauffé à l’aide d’un système de chauffage de l’eau que les pompes réchauffent l’eau à travers des bobines qui sont enroulées autour de la bouteille de gel.
    5. Pour les mesures de la fréquence cardiaque (au besoin), mettre le gel de l’électrode sur les 4 électrodes de la plateforme d’analyse et de fixer les pattes de l’animal aux plate-forme/électrodes avec ruban chirurgical. Placer l’animal dans une position en décubitus dorsal pour l’imagerie de la VCI. L’échographie, système d’imagerie comprend une plate-forme d’analyse qui est réchauffée et contient des électrodes pour la surveillance de l’animal.
    6. Pour les mesures de température, mettre le gel de l’électrode sur le thermomètre et insérer dans le rectum de l’animal.
    7. Ajuster la lampe chauffante et isoflurane nécessaires assurer cet animal est confortable, a une respiration entre 30-70 bpm et est maintenu à 37 ° C.
    8. Si nécessaire, raser le ventre de l’animal ou enlever les poils avec la crème dépilatoire. Appliquez pendant 1-2 minutes et essuyez avec une gaze et de l’eau distillée.
      NOTE : Trop de cheveux peut affecter la qualité des images.
    9. Placez la gaze sous ou à côté de l’animal à attraper tout gel échographie excès.
  2. Imagerie de l’IVC et Thrombus
    1. Ouvrez le logiciel d’imagerie et commencer une nouvelle étude.
    2. Sélectionnez un transmissent approprié pour l’imagerie. Le transmissent utilisé ici est pour les organes abdominaux (fréquence : 35 MHz, la longueur focale : 12,8 mm).
    3. Consigner toute information pertinente concernant l’animal. Ceci peut inclure l’animal ID, sexe, poids, date de naissance, souche, etc..
    4. Abaisser le transmissent jusqu'à ce qu’il est en contact avec le gel d’échographie sur l’animal.
    5. Commencer la sonde transmissent pour commencer l’imagerie 2D de l’animal. Dans ce mode, les images sont présentées en deux dimensions, dans différentes nuances de gris.
    6. Localiser l’IVC et l’aorte abdominale en déplaçant la plate-forme souris tout au long de le x - et/ou plan-y, tout en déplaçant également le transmissent à travers le plan z.
      NOTE : Sang navires apparaîtra avec leur blanc des murs et du sang à l’intérieur presque noire. L’aorte abdominale va vibrer intensément et ont des parois plus épaisses, tandis que l’IVC aura des murs plus minces et compression/expansion facilement sur l’image de l’écran lorsque le transmissent est déplacé vers le haut et vers le bas. Le site de ligature sera apparent, car la veine va se dilater et de la paroi veineuse viendra à un point. Aucun thrombus formé à l’intérieur sera solide sous échographie et ne compressera pas facilement comme le fait de la paroi veineuse. La veine va compresser seulement au-dessus de la ligature, où aucun thrombus ne se forme.
    7. À localiser l’IVC et le site de la ligature, centrer sur le point focal de l’échographie, afin de réaliser l’image plus précise.
      1. Si l’image est trop sombre pour voir clairement, ajuster le gel et éliminez les bulles d’air avec un coton-tige.
      2. Si nécessaire, inclinez le transmissent 45° à gauche ou à droite et réajuster la plate-forme animale pour discerner la veine. Cela, s’il y a interférence avec le transmissent. Dans ce scénario, la veine doit être photographié à un angle de côté pour éviter la suture.
        NOTE : Brouillage de l’Image est plus souvent causée par des taches sombres de la peau animale, placement de suture plaie pauvres, ou de bulles dans le gel d’échographie.
    8. En utilisant le logiciel, prendre des photos de toutes les structures désirés et effectuer des mesures à l’aide d’outils de mesure. Mesures courantes incluent le thrombus section transversale ou la largeur de l’emplacement de la ligature.
    9. Changer le mode d’imagerie à la vague d’impulsion Doppler pour faire des mesures du débit sanguin. Ce mode permet l’imagerie du flux sanguin vasculaire et la mesure de la vitesse d’écoulement, entre autres variables.
    10. Penchez la plateforme d’analyse pour abaisser l’extrémité postérieure de l’animal.
    11. Changer l’angle et la position du transmissent afin qu’il communiquera avec le gel à un angle de 30° environ de l’extrémité postérieure de l’animal.
    12. Repositionner la plate-forme animale et transmissent. Relocaliser l’IVC et ligature si nécessaire.
    13. Faire des mesures du débit sanguin autour du site de ligature pour confirmer la stase et de prendre toutes les images désirés. Les mesures courantes de la circulation sanguine incluent la vitesse moyenne, vitesse maximale ou la vitesse médiane.
    14. Enregistrez toute les mesures ou les images prises.
  3. Récupération de nettoyage et des animale
    1. Soulever le transmissent à position initiale et repositionner la plate-forme animal dans sa position initiale, aussi bien.
    2. Retirer l’excès gel hors l’animal avec de la gaze. Pour ce faire doucement pour que la suture de la plaie ne va pas se rompre.
    3. Retirer le thermomètre du rectum de l’animal et de prendre l’animal hors de la plate-forme.
    4. Placer l’animal dans sa cage et un incubateur de 34 ° C.
    5. Surveiller l’animal jusqu'à la guérison. La procédure est très mineure et non invasif. L’animal va réveiller rapidement. Continuer de surveiller l’animal dans les jours suivants, conformément à l’article 1.6 du présent protocole.
    6. Nettoyer la plate-forme animale avec gaze et désinfectant.
    7. Essuyez le transmissent avec gaze et de l’eau distillée.
      Mise en garde : Nettoyer le transmissent très doucement et uniquement avec l’eau distillée.
    8. Pour le prochain animal, répétez l’étape 2.
      1. Si fait avec tous les sujets, vérifier que toutes les images et les enregistrements ont été enregistrées. Avant de s’éteindre tous les équipements et logiciels.

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Representative Results

Modèle de stase veineuse thrombose

Dans le modèle de stase, les souris sont anesthésiés, et une incision est faite pour exposer la veine cave inférieure (VCI). L’incision est faite sur le côté gauche ou droit de la souris au lieu d’une laparotomie médiane d’une manière qui ne porterait pas atteinte avec la sonde d’échographie. Les muscles abdominaux et la peau sont pli arrière pour exposer l’IVC (Figure 1). Tout d’abord, les branches latérales sont ligaturés avec une suture de soie de 6-0 (Figure 2). Ensuite, la VCI est séparée de l’aorte par dissection par clivage et la soie est placée autour de la VCI (Figure 3 a-C). La VCI est ligaturée avec une suture de soie de 6-0. Dilatation de la VCI sous le site de la ligature est une indication de succès interruption du débit sanguin (Figure 3D). Enfin, la cavité péritonéale et la peau sont suturées retour de façon continue (Figure 3E).

Suivi de la formation du thrombus à l’aide de l’échographie

Comme nous l’avons déjà montré, échographie de haute fréquence, qui est couramment utilisée pour évaluer la thrombose veineuse en milieu clinique, peut servir à mesurer la formation du thrombus et la résolution au fil du temps dans un modèle expérimental murin. Nous avons utilisé un système de micro-imagerie haute fréquence12. Avant la ligature, la VCI peut être identifiée dans la vue longitudinale. Après la ligature de la veine, le succès de la procédure peuvent être visualisé. Le mode PW-Doppler peut être utilisé pour déterminer la vitesse d’écoulement de sang avant (34,8 mm/s) et après (5,6 mm/s) la ligature. Thrombus étant plus denses que l’écoulement sanguin, nous avons pu apprécier le thrombus formé à l’intérieur de la VCI à l’aide de l’échographie, 24 heures après la ligature (Figure 4 a). L’échographie permet à la quantification de la vélocité du flux sanguin dans les vaisseaux à l’aide de color Doppler. Comme le montre la Figure 4 b, nous pouvons mesurer le débit dans la veine avant la ligature et apprécier l’interruption de la circulation après la ligature, lorsque le thrombus se forme. Données de notre laboratoire montrent une taille moyenne de thrombus 4,85 ± 0,22 mm2 à 24 heures et 5.05 ± 0,47 mm2 à 48 heures (moyenne ± SEM).

Figure 1
Figure 1. Modèle de stase : procédure pour exposer la veine cave inférieure. (A) cheveux de souris de l’abdomen est supprimée à l’aide de crème dépilatoire. (B) une première incision est faite sur le côté gauche de l’abdomen et une deuxième ventrale (C) de gauche à droite. (D) un regard stérile humide sert à extérioriser les intestins et exposer la veine cave inférieure (VCI) et la branche latérale (SB). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Modèle de stase : procédure pour ligaturer la branche côté. (A) l’exposition de l’IVC et Placement SB. (B) de la soie de suture sous le SB. (C) Ligation de la LRV SB. : veine rénale gauche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Modèle de stase : procédure pour ligaturer la veine cave inférieure. (A-B) Par dissection par clivage pour séparer la VCI de l’aorte. (C) mise en place de la soie de suture sous la VCI. (D) la ligature de la VCI. Dilatation de la VCI est observée. (E) les muscles abdominaux et la peau sont fermées séparément. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Suivi de la formation du thrombus à l’aide de l’échographie. (A) échographie représentante les images avant, immédiatement après et 24 heures après la ligature de la VCI. (B) les représentants des images de sang coulent représentée par color Doppler de la vitesse à l’aide de traitement des couleurs. Le barème des plages de débit de sang couleur du rouge au jaune pour dépeindre élevé à faible débit. Chez les animaux ligaturés, l’absence de flux est représenté par l’absence de couleur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Il y a plusieurs étapes cruciales pour la formation du thrombus veineux avec succès en utilisant le modèle de stase. Induction de la thrombose veineuse profonde est plus difficile à des souris âgées en raison de l’accumulation de graisse autour de la veine cave inférieure et l’aorte. Idéalement, les souris subissant cette procédure devraient être 8 - âgés de 10 semaines. Il faut en grand ne pas d’induire des lésions endothéliales dans la VCI au cours de la dissection non tranchante et ligature. En outre, il est crucial de garder l’animal dans un incubateur à 34 ° C pendant au moins 30 minutes après la chirurgie et de le renvoyer à la société de l’autre animal qu’après rétablissement complet. Lorsque la chirurgie est faite correctement, les animaux se comportent remarquablement bien lors des soins post-opératoires. Ils ne montrent aucun effets secondaires graves comme une boiterie, parésie ou incontinence. Ils peuvent montrer mouvement réduit et une posture légèrement voûtée immédiatement après la chirurgie, mais cela n’est pas vu souvent aussi longtemps que l’analgésique est efficace et la chirurgie ont été exécutés correctement.

Le modèle de stase produit un gros thrombus avec des mesures reproductibles taille d’une souris à l’autre. Comme chez les humains, l’anatomie du système veineux varie entre la souris et la question de l’interruption de branche IVC a récemment été abordée dans la sténose et les modèles de stase DVT13,14. Brandt et coll. ont montré que la formation du thrombus induite par la restriction de débit a été empêchée lorsque les branches secondaires sont situées à < 1,5 mm du site ligature IVC. Cependant, formation de thrombose veineuse profonde induite par la restriction de la circulation chez la souris n’est pas affectée par côté branche ligature13,15,16. Il a été également signalé que la variabilité des branches latérales IVC dans la souche de souris C57Bl6 a un impact important sur la formation du thrombus induite par ligature complète de l' IVC14. Il a été constaté que la ligature ne pas côté branches résultats statistiquement plus petit caillot taille comparée aux témoins avec des branches latérales ligaturé. Notre étude suggère également que la ligature du côté branches produites la formation du thrombus cohérente et taille. Cependant, la variation anatomique plus fréquente C57Bl/6 est que la présence de retour 2 branches (98 % des souris)14. Il a été démontré qu’interruption dos branches a le plus grand impact sur la taille du thrombus. La méthodologie actuelle n’a pas abordé l’effet des branches arrière, qui peut être interrompue à l’aide d’une basse température cautère stylo14. Cependant, nous avons démontré que la ligature de l’IVC et côté branches a abouti à la formation du thrombus cohérente C57Bl/6. Enfin, comme nous l’avons démontré précédemment, le système à ultrasons haute fréquence permet la mesure précise de la taille du thrombus et peut être utilisé pour des études à long terme et translationnelles de la formation du thrombus et résolution12,13 ,,15.

Un inconvénient majeur du modèle stase est l’obstruction complète de la circulation sanguine, ce qui réduit l’effet maximal d’agents administrées par voie intraveineuse sur le mur du thrombus et de la veine. Cela devient un enjeu important quand on veut tester l’effet d’un agent pharmacologique. Si l’effet d’une drogue spécifique doit être mis à l’essai, on préfère en utilisant le modèle de sténose13 ou le modèle électrolytique17. Les deux modèles produisent des thrombus en présence de débit sanguin continu, qui permettent de tester de nouveaux agents d’anticoagulant pour la prophylaxie de la thrombose veineuse profonde et le traitement.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation canadienne des maladies du coeur et la Morris et Bella Fainman Family Foundation. Les auteurs tiennent à remercier Véronique Michaud pour son aide technique avec le système d’imagerie à ultrasons VEVO770.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 perma-hand silk suture Ethicon 706G
Surgical Scissors Fine Science Tools 20830-00
Suture tying forceps Fine Science Tools 20830-00
blunt forceps (straight and curved) Fine Science Tools 20830-00
Needle Driver Fine Science Tools 13002-10
Moria Spring Scissors Fine Science Tools 15396-00
1ml syringes BD Biosciences
26G needles Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System Visualsonics No longer sold
SR Buprenorphine ZooPharm Given to LDI by Vet
Surgery Microscope Leica Leica M651
Systan eye oinment Alcon 288/28062-0
2x2 sterile Gauze CDMV #104148
Cotton Tip Applicators from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape CDMV #7411
Ultrasound gel (Aquasonic-100) Dufort & Lavigne #AKEN4061
Incubator From JGH
Isoflurane Dispomed
Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment Dispomed
Hair remover Nair
Water heated hard pad Braintree Scientific, Inc. #HHP-2
Gaymar heater water pump TP500 MATVET Inc. #R-500305
Infra-red heating lamp electrimat inc. #1R175R-PAR
Mouse rectal temperature prope emkaTECHNOLOGIES
Sterile water From JGH

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References

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