Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência

Immunology and Infection

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Summary

O presente protocolo descreve as etapas para obter a trombose venosa, usando um modelo de estase. Além disso, estamos usando um método não-invasivo para medir a formação de trombos e resolução ao longo do tempo.

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Rys, R. N., Blostein, M. D., Lemarié, C. A. Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography. J. Vis. Exp. (134), e57392, doi:10.3791/57392 (2018).

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Abstract

Trombose venosa profunda é uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 500. Trombose venosa profunda pode levar à morte por embolia pulmonar ou resultados na síndrome pós-trombótica, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração, ou em hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativa crônica respiratória compromisso. Esta é a mais comum doença cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral isquêmico e é um desafio clínico para todas as disciplinas médicas, como isso pode complicar o curso de outras doenças como o câncer, doença sistêmica, cirurgia e grande trauma.

Modelos experimentais são necessários para estudar esses mecanismos. O modelo de estase induz o tamanho do trombo consistente e uma quantidade quantificável de trombo. No entanto, é necessário sistematicamente ligate ramos laterais da veia cava inferior para evitar a variabilidade em tamanhos de trombo e qualquer interpretação de dados errôneos. Nós desenvolvemos uma técnica não-invasiva para medir o tamanho do trombo usando a ultra-sonografia. Usando esta técnica, que podemos avaliar o desenvolvimento do trombo e resolução ao longo do tempo, no mesmo animal. Essa abordagem limita o número de ratos necessários para quantificação da trombose venosa consistente com o princípio da substituição, redução e refinamento de animais na investigação. Nós demonstramos que o peso do trombo e análise histológica de trombo tamanho se correlacionam com medição obtidos com ultra-sonografia. Portanto, o presente estudo descreve como induzir trombose venosa profunda em camundongos, usando o modelo de estase de veia cava inferior e como monitorá-lo usando o ultra-som de alta frequência.

Introduction

Tromboembolismo venoso (TEV), que é composto de trombose venosa profunda (TVP) e embolia pulmonar, é a terceira causa principal de morte cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. É uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 5001. VTE pode levar a: 1) morte por embolia pulmonar; 2) pós-trombótica síndrome, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração; ou 3) hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativo compromisso respiratório crônico. TeV é uma doença multi fatorial e pode resultar de estase do fluxo de sangue, danos nas paredes dos vasos, e/ou Estados de hipercoagulabilidade, devido a uma perturbação do equilíbrio entre a coagulação e os sistemas fibrinolíticos, como tem sido descrito há mais de uma centena de anos por Virchow e é conhecido como Tríade de Virchow.

Porque na maioria dos casos, é impossível obter amostras humanas de TVP, pesquisadores desenvolveram modelos animais experimentais de TVP. Vários animais, incluindo rato2rato3, coelho4, porco5, cão6e primatas não humanos7 têm sido utilizados. Os ratos podem ser geneticamente modificados e são os animais mais frequentemente usados para estudar a TVP. No entanto, como em todos os animais, DVT espontâneo não é observado em ratos. Assim, alterações físicas ou químicas da parede da veia são usadas para criar a trombose em ratos. Anteriormente nós usamos o modelo de cloreto férrico para induzir trombose na veia cava inferior (VCI) de ratos8,9,10. Este modelo tem a vantagem de produzir confiantemente trombos oclusivos em poucos minutos e pode ser usado para investigar o papel das drogas anticoagulantes e plaquetária durante TVP aguda. No entanto, é um procedimento de terminal. Assim, para estudar TVP aguda e crônica, o modelo de estase é mais adequado. Neste modelo, formação de trombos é induzida pela interrupção completa do fluxo de sangue na veia cava inferior, um dos fatores na tríade de Virchow para desenvolvimento de TVP. Este modelo pode ser usado para estudar a formação de TVP e resolução, que é uma vantagem em comparação com o FeCl3 modelo11.

Nós desenvolvemos um método não-invasivo para acompanhar a formação de trombos e resolução ao longo do tempo usando um sistema de ultra-som de alta frequência de micro imagem12. Demonstramos anteriormente que medição da trombose venosa por ultra-som correlaciona-se favoravelmente com trombos obtidos patologicamente. Confirmamos em dois estudos subsequentes que medições obtidas com ultra-som se correlacionam com o peso do trombo e área de trombo quantificada por histoquímica9,10. Mais importante, nós mostraram que o ultra-som de alta frequência pode ser usado para monitorar a formação de trombose venosa profunda em ratos12. Ele também pode ser usado para quantificar a resolução do trombo em uma forma não-invasiva.

Aqui, descrevemos o protocolo que permite a formação de trombos, usando o modelo do rato de trombose induzida em estase e como formação de trombos pode ser monitorizada de forma não-invasiva ao longo do tempo usando o ultra-som de alta frequência.

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Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo institucional Animal conta Comissão de McGill University Montreal, QC, Canadá. Todos os equipamentos necessários é listado na tabela eu.

1. murino (C57BL/6J) protocolo de estase de veia cava inferior

  1. Preparação da cirurgia
    Nota: Esta é uma cirurgia de sobrevivência e, portanto, uma técnica asséptica adequada precisa ser seguido em todos os momentos. Isso inclui certificando-se de todos os materiais estão na mão, limpeza e esterilização de instrumentos antes e entre uso e designando uma área estéril na superfície de trabalho para todo o material estéril.
    1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e materiais em autoclave. Um esterilizador de grânulo de vidro é suficiente para esterilizar dicas de instrumento entre animais, se mais de um procedimento está sendo feito de uma só vez.
    2. Anestesia os ratos masculinos C57Bl/6 8-10 semanas com uma mistura de 100% oxigênio e 2,5% de isoflurano.
      Nota: Ajuste o fluxo de oxigênio e isoflurano conforme necessário.
    3. Confirme anesthetization beliscando a pata traseira do animal entre os dedos com fórceps. Não responde a pitada indica que o animal é anestesiado.
    4. Administre analgésico de liberação lenta (buprenorfina) através da injeção subcutânea. Dê uma dose de 1 mg de analgésico por 1 kg de peso corporal (1 mg/kg)-ratos.
    5. Coloque pomada em ambos os olhos do animal para assegurar sem dessecação da córnea para a duração do procedimento.
    6. Administre 0,2 - 0,5 mL de isotônicos por 10 g de peso corporal por via subcutânea.
    7. Fixar o animal para a mesa de cirurgia, usando fita cirúrgica. Coloque o animal em posição supina para expor o abdome. Realizar a cirurgia em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia.
    8. Remova pelos do abdômen do mouse pela aplicação de um creme para 1-2 min.. Limpe a área abdominal limpar com gaze e água destilada, da remoção do cabelo se necessário.
    9. Como alternativa, remova os pelos do abdômen por fazer a barba com um barbeador elétrico pequeno.
    10. Esterilize o abdômen com Baxedin (solução de BP de gluconato de clorexidina) antes de fazer as incisões. Aplica álcool levemente com gaze para evitar a perda de calor excessivo causada pela evaporação do álcool.
  2. Exposição da veia Cava Inferior (VCI)
    1. Usando uma tesoura cirúrgica, realize uma laparotomia para abrir a cavidade abdominal.
      1. Levantar a pele com pinças na parte inferior do abdome e faça uma incisão vertical paralelo para ambos os lados da linea alba. Façam a primeira incisão à esquerda ou à direita do linea alba, dependendo da destreza do operador. A incisão é feita longe da linha média para auxiliar na ultra-sonografia mais tarde.
      2. Faça uma incisão segunda, horizontal na parte superior do abdômen.
        Nota: Sobre a penetração no abdómen, a musculatura deve ser "tendas" e penetrou com tesoura cirúrgica para evitar qualquer dano aos órgãos abdominais.
      3. Repita as incisões verticais e horizontais sobre a camada de músculo abdominal do animal. Certifique-se que tenda a musculatura durante a penetração no abdômen para não danificar os órgãos abaixo.
        Cuidado: Levante a pele e músculo longe de intestinos e outros órgãos internos ao fazer incisões para não perfurar os.
    2. Dobre a pele e o músculo longe da incisão para expor na cavidade abdominal.
    3. Aplique gaze umedecida com solução isotônica, para os lados da ferida abertura e exteriorizar os intestinos. Aplica pressão para ambos os lados do abdome para auxiliar a exteriorização do intestino. Use movimentos suaves com um aplicador de ponta de algodão para mover os intestinos. Embeba a gaze na solução isotônica e coloque sobre os intestinos exteriorizados.
      1. Gaze deve ser pre-umedecido antes da sua colocação no tecido.
    4. Mudar de lado qualquer gordura peritoneal e expor a veia cava inferior entre as veias renais e ilíacas.
    5. Fazer uma identificação inicial de ramos laterais óbvio. Um ramo lateral aparecerá como menor, mas significativa veia que Ramos longe a veia cava inferior, entre o renais e ilíacas veias. Vasculatura pode variar muito entre ratos. Os ratos podem ter ramificações laterais presentes em um ou ambos os lados a veia cava inferior.
  3. Ligadura dos ramos laterais
    Nota: Se ramos laterais estão presentes, o seguinte procedimento para cada um. Se não estiver presente, avance para o passo 4: colocação de sutura inicial sob a veia cava inferior. O site da ligadura da veia cava inferior será imediatamente distal para a veia renal esquerda, independentemente da presença de ramos laterais.
    1. Realize dissecção romba de cada lado do ramo lateral. Dissecção romba é o processo de abertura repetidamente fórceps rombudo com pressão suave, a fim de romper a fáscia sem danificar vasos circundantes.
      Atenção: Evite furar ou danificar a veia.
    2. Levante o ramo e passar uma seção de sutura de seda 6-0 debaixo da veia. Sempre cuide quando levantar ou mover os vasos. É melhor pegar a gordura ao redor dos vasos, caso contrário existe o risco de danificar a nave.
    3. Usando a pinça de sutura, fazer uma ligadura cirúrgica em torno da filial de lado usando padrão nó cirúrgico subordinação técnica. Ligadura completa é feita para garantir 100% de oclusão da veia. Use pelo menos três lances subordinante para garantir que a ligadura é segura.
    4. Repita a etapa 1.3 para qualquer restantes ramos laterais.
  4. Dissecção da aorta abdominal da veia cava inferior
    1. Realizar dissecção romba próximo a veia cava inferior imediatamente distal da veia renal esquerda. A aorta abdominal é anexada para a veia cava inferior através da fáscia, portanto, realizar a dissecção romba inicial em torno da veia cava inferior e a aorta abdominal.
      Atenção: Evite furar ou danificar a veia. Não romper nem perfure a qualquer embarcação. Esta é a parte mais crítica do processo, com o maior risco de lesões nos vasos.
    2. Continue a aplicar uma pressão suave através de dissecção romba até uma janela transparente é feita entre a aorta e a veia cava inferior.
  5. Colocação de sutura e ligadura da veia cava inferior
    1. Passe uma seção de sutura de seda 6-0 debaixo da veia cava inferior e aorta abdominal.
    2. Localize a sutura através da janela criada entre a veia cava inferior e a aorta. Use pinça para puxar a sutura e passe-o entre a aorta abdominal e a veia cava inferior. A sutura através da linha cuidadosamente, tentando não puxar/punção da veia cava inferior e a aorta abdominal.
    3. Fazer uma ligadura cirúrgica em torno da veia cava inferior com pinça de sutura, assegurando uma total oclusão da veia. Mais uma vez, fazer a ligadura imediatamente distal da veia renal esquerda.
    4. Fazer três lançamentos de sutura para fixar a ligadura.
      Nota: Também é possível passar a sutura debaixo da veia cava inferior e a aorta antes de separar os dois como uma opção alternativa. Alternativamente, as suturas de Prolene 7-0 podem ser usadas para ligadura dos ramos colaterais e a veia cava inferior.
  6. Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios
    1. Verifique se que a aorta abdominal foi deixada sem interrupções e que todos os ramos laterais têm sido ligados. A veia cava inferior aparecerá dilatação distal do site da ligadura e sem sangue fluxo será visível.
    2. Coloque toda a gordura peritoneal e os intestinos de volta na cavidade abdominal.
    3. Feche a ferida, usando pinça de sutura e sutura seda 6-0. Use uma sutura de execução (simples contínua) e certifique-se de que a sutura não será muito apertada. Uma sutura apertada se romper quando o animal acorda e se move em torno de sua gaiola.
      1. Como alternativa, use grampos PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon ou aço inoxidável para fechar ferimentos.
    4. A camada do músculo abdominal, primeiro usando sutura adequada, amarrando a técnica de sutura.
    5. Repita a técnica de sutura para a pele e verifique se o fechamento da ferida é suficiente.
      Nota: Se usar a mesma agulha de sutura e linha para vários animais, esterilize ambos em etanol a 70% antes de cada utilização.
    6. Retire o animal do gás anestésico e colocá-los numa incubadora de 34 ° C durante pelo menos 30 minutos.
    7. Novamente, administre 0,2 - 0,5 mL de isotônicos por 10 g de peso corporal por via subcutânea. Fluidos podem ser dado em dias seguintes para manter o peso corporal pré-operatório, se necessário.
    8. Monitore o animal até recuperação para garantir a cirurgia bem sucedida e avaliar a saúde geral do animal.
      Atenção: Espero uma postura encurvada ligeira para um procedimento invasivo como este, mas o animal irá se comportar normalmente logo em operação após 30 minutos.
    9. Coloque o animal em sua própria gaiola e não colocá-lo com outros animais até que se recuperou totalmente.
    10. Re-administrar analgésico diariamente para até 48 h de pós-operatório.
    11. Coloque os alimentos no chão da gaiola para o animal tempo em recuperação. Outros cuidados especiais geralmente não é necessário.
    12. Examinamos o local da ferida para vermelhidão, inchaço, ou quitação e outros sinais de infecção.
    13. Se necessário, remova suturas após 7-10 dias.
    14. Realizar eutanásia imediatamente se não for bem sucedida cirurgia (por exemplo, navio significativos danos e/ou sangue perda) ou animal não melhora com cuidados pós-operatórios. Eutanásia é geralmente realizada no pós-operatório de 48 h. Para mais experiências, use Prolene 7-0 para ligate ramos laterais e a veia cava inferior e suturas de Vicryl 5-0 para fechar a cavidade abdominal.
      1. Realizar eutanásia por anesthetization do animal em uma indução como descrito anteriormente, exceto em 5% de isoflurano. Isto é seguido por asfixia com 100% CO2 enquanto anestesiados.
      2. Após a confirmação da eutanásia por asfixia (perda de pulsação e respiração não), realize deslocamento cervical para garantir a completa eutanásia.

2. protocolo de ultra-som de alta frequência de

Nota: Este protocolo é uma adaptação da senhora Davis Instituto roedor fenotipagem núcleo SOP para ultra-sonografia de alta frequência. Este protocolo é realizado pós-operatório de 24 h, mas pode ser feito mais cedo, enquanto o animal está respondendo bem à cirurgia. O protocolo pode ser realizado a qualquer momento em ratos saudáveis e muitas vezes é feito para comparar o antes e depois da cirurgia.

  1. Preparação do Animal
    1. Coloque o animal em uma câmara de indução e anestesiar o animal com uma mistura de 100% oxigênio e 2,5% de isoflurano.
    2. Ligue o monitor de temperatura e frequência cardíaca. Lâmpada de calor posição acima da tabela para manter o animal aquecido durante o procedimento.
    3. Remover o animal da câmara de indução e aplique o lubrificante de olho para evitar a dessecação da córnea. Posição do animal na plataforma de análise e fixar o tubo anestésico para boca/nariz do animal.
    4. Ultrasom quente do gel a 37 ° C e colocar o gel no abdômen do animal. O gel de ultra-som é aquecido através de um sistema de aquecimento de água que as bombas de água através de bobinas que são enrolados em torno da garrafa de gel quente.
    5. Para a medição de frequência cardíaca (se necessário), colocar gel de eletrodo nos 4 eléctrodos da plataforma de análise e corrigir as patas do animal para os plataforma/eletrodos com esparadrapo. Coloque o animal em posição supina para a imagem latente da veia cava inferior. O sistema de imagem de ultra-som inclui uma plataforma de análise que é aquecida e contém eletrodos para monitorar o animal.
    6. Para medições de temperatura, colocar o gel de eletrodo no termômetro e introduza no recto do animal.
    7. Ajustar a lâmpada de calor e isoflurano conforme necessário para garantir que o animal é confortável, tem uma respiração entre 30-70 bpm e é mantido a 37 ° C.
    8. Se necessário, raspe o abdômen do animal ou remover cabelo com creme depilatório. Candidatar-se 1-2 minutos e limpe com gaze e água destilada.
      Nota: Muito cabelo pode afetar a qualidade das imagens.
    9. Coloque gaze debaixo ou ao lado do animal para pegar qualquer gel de ultra-som em excesso.
  2. Imagem latente do IVC e trombo
    1. Ativar o software de imagem e iniciar um novo estudo.
    2. Selecione um scanhead apropriado para a imagem latente. O scanhead usado aqui é para órgãos abdominais (frequência: 35 MHz, distância focal: 12,8 mm).
    3. Grave informações relevantes sobre o animal. Isto pode incluir o animal ID, sexo, peso, data de nascimento, tensão, etc.
    4. Baixe o scanhead até é comovente o gel de ultra-som do animal.
    5. Começa a sonda scanhead para começar a 2-D imagens do animal. Neste modo, imagens são apresentadas como duas dimensões, em vários tons de cinza.
    6. Localize a veia cava inferior e a aorta abdominal, movendo a plataforma do rato ao longo do x - ou y-avião, enquanto também se move o scanhead através de z-plano.
      Nota: Sangue vasos aparecerá com branco as paredes e o sangue dentro quase preto. A aorta abdominal será pulsam intensamente e têm paredes mais grossas, enquanto a veia cava inferior será têm paredes mais finas e comprimir/expandir facilmente a imagem da tela quando o scanhead é movido para cima e para baixo. O site da ligadura será aparente, como a veia vai ser dilatada e a parede da veia vai chegar a um ponto. Qualquer trombo formado dentro será sólido sob ecografia e não irá comprimir facilmente, como faz a parede da veia. A veia irá comprimir apenas acima da ligadura, onde não há trombo é formado.
    7. Após localizar a veia cava inferior e o local da ligadura, centralizá-las no ponto focal do ultra-som, a fim de obter a imagem mais precisa.
      1. Se a imagem for muito escura para ver claramente, ajustar o gel e remover quaisquer bolhas de ar com um aplicador de ponta de algodão.
      2. Se necessário, incline o scanhead 45° para a esquerda ou direita e reajustar a plataforma animal para ver a veia claramente. Isso é feito se houver interferência com a scanhead. Nesse cenário, a veia precisa ser fotografada em um ângulo de lado para evitar a sutura.
        Nota: Interferência de imagem geralmente é causada por manchas escuras da pele no animal, na colocação de sutura de ferida pobre ou bolhas no gel ultrasom.
    8. Usando o software, tirar fotos de todas as estruturas desejadas e fazer medições usando quaisquer ferramentas de medição. Medições comuns incluem a área de seção transversal de trombo ou largura do local da ligadura.
    9. Altere o modo de imagem de Doppler da onda de pulso para fazer medições de fluxo de sangue. Este modo permite a geração de imagens de fluxo sanguíneo vascular e a medição da velocidade de fluxo, entre outras variáveis.
    10. Incline a plataforma de análise para abaixar a extremidade posterior do animal.
    11. Altere a posição/ângulo do scanhead para que ele entrará em contato com o gel em um ângulo de 30° da extremidade posterior do animal.
    12. Reposicione o animal plataforma e scanhead. Realoca a veia cava inferior e a ligadura, se necessário.
    13. Fazer medições de fluxo de sangue ao redor do local da ligadura para confirmar a estase e levar todas as imagens desejadas. Medições comuns do fluxo de sangue incluem a velocidade média, velocidade máxima ou velocidade mediana.
    14. Salve quaisquer medições ou imagens tiradas.
  3. Recuperação de limpeza e animal
    1. Levante o scanhead para posição inicial e reposicionar a plataforma animal para sua posição inicial, também.
    2. Remova o excesso de gel fora o animal com gaze. Fazer isso com cuidado para que a sutura da ferida não vai ser rompida.
    3. Retire o termómetro do reto do animal e levar o animal fora da plataforma.
    4. Coloque o animal em sua gaiola e uma incubadora de 34 ° C.
    5. Monitore o animal até se recuperar. O procedimento é muito menor e não-invasiva. O animal vai acordar rapidamente. Continue a acompanhar o animal no dia seguinte acordo com o ponto 1.6 do presente protocolo.
    6. Limpe a plataforma animal com gaze e desinfectante.
    7. Limpe o scanhead limpo com gaze e água destilada.
      Atenção: Limpar o scanhead muito delicadamente e apenas com água destilada.
    8. Repita a etapa 2 para o próximo animal.
      1. Se feito com todas as disciplinas, verificar que todas as imagens e gravações foram salvos. Em seguida, desligue todos os equipamentos e software.

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Representative Results

Modelo de trombose venosa estase

No modelo de estase, ratos são anestesiados, e é feita uma incisão para expor a veia cava inferior (VCI). A incisão é feita no lado esquerdo ou direito do mouse em vez de uma laparotomia mediana de uma forma que não iria interferir com a sonda de ultra-som. A pele e os músculos abdominais são dobra para expor a veia cava inferior (Figura 1). Primeiro, os ramos laterais são ligados com uma sutura de seda 6-0 (Figura 2). Em seguida, a veia cava inferior é separadoda da aorta por dissecção romba e a seda é colocada ao redor da veia cava inferior (Figura 3A-C). A veia cava inferior é ligada com uma sutura de seda 6-0. Dilatação da veia cava inferior abaixo do local da ligadura é uma indicação de sucesso interrupção do fluxo sanguíneo (Figura 3D). Finalmente, a cavidade peritoneal e a pele são suturados volta de forma contínua (Figura 3E).

Monitoramento da formação de trombos usando ultrasonografia

Como mostramos anteriormente, ultra-som de alta frequência, que é comumente usado para avaliar trombose venosa em situações clínicas, pode ser usado para medir a formação de trombos e resolução ao longo do tempo em um modelo experimental murino. Usamos uma alta frequência de imagem micro sistema12. Antes da ligadura, a veia cava inferior pode ser identificada na vista longitudinal. Depois da ligadura da veia, o sucesso do procedimento pode ser visualizado. O modo de PW-Doppler pode ser usado para determinar a velocidade do fluxo de sangue antes (34,8 mm/s) e depois (5,6 mm/s) a ligadura. Porque trombos são mais densos que flui sangue, apreciamos o trombo formado no interior da veia cava inferior utilizando a ultra-sonografia, 24 horas após a ligadura (Figura 4A). Ultrasonografia permite a quantificação da velocidade do fluxo sanguíneo nos vasos usando cor Doppler. Como mostrado na Figura 4B, podemos medir o fluxo na veia antes da ligadura e apreciar a interrupção do fluxo após a ligadura, quando o trombo é formado. Dados do nosso show de laboratório um tamanho médio de trombo de 4,85 ± 0,22 mm2 em 24 horas e 5,05 ± 0,47 mm2 a 48 horas (média ± SEM).

Figure 1
Figura 1. Modelo de estase: procedimento para expor a veia cava inferior. (A) cabelo de rato do abdômen é removido usando o creme depilatório. (B) uma primeira incisão é feita no lado esquerdo do abdômen e um segundo ventral (C) da esquerda para a direita. (D) um olhar molhado e estéril é usado para exteriorize os intestinos e expor a veia cava inferior (VCI) e ramo de lado (SB). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Modelo de estase: procedimento para ligate ramo lado. (A) exposição da veia cava inferior e SB (B) posicionamento da seda sutura debaixo do SB. (C) Ligation de LRV a SB: veia renal esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Modelo de estase: procedimento para ligate a veia cava inferior. (A-B) Dissecção romba para separar a veia cava inferior da aorta. (C) colocação da seda sutura por baixo a veia cava inferior. (D) ligadura da veia cava inferior. Observa-se dilatação da veia cava inferior. (E) os músculos abdominais e pele estão fechadas separadamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Monitoramento da formação de trombos, utilizando imagens de ultra-som. (A) representante ultra-som imagens antes, imediatamente após e 24 horas após a ligadura da veia cava inferior. (B) representantes imagens de sangue velocidade representada pela cor Doppler de vazão usando processamento de cor. A escala varia de fluxo sangue codificados por cores de vermelho para amarelo para retratar alta para baixa vazão. Nos animais ligados a ausência de fluxo é representada pela ausência de cor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Existem várias etapas críticas para a formação de trombo venoso bem sucedida usando o modelo de estase. Indução da trombose venosa profunda é mais desafiador em ratos velhos, devido ao acúmulo de gordura em torno da veia cava inferior e a aorta. Idealmente, os ratos submetidos a este procedimento devem ser de 8 - 10 semanas de idade. Deve ter grande cuidado para não induzir dano endotelial na veia cava inferior durante a dissecção romba e ligadura. Além disso, é crucial para manter o animal em uma incubadora de 34 ° C durante pelo menos 30 minutos após a cirurgia e para devolvê-lo para a companhia de outro animal só após recuperação completa. Quando a cirurgia é feita corretamente, os animais se comportam muito bem durante cuidados pós-operatórios. Eles exibem sem efeitos colaterais graves, tais como claudicação, paresia ou incontinência. Eles podem apresentar movimento reduzido e uma postura ligeiramente encurvada imediatamente após a cirurgia, mas isto não é visto frequentemente como o analgésico é eficaz e a cirurgia realizada corretamente.

O modelo de estase produz um grande trombo com medições reproduzíveis do tamanho de um rato para outro. Como em humanos, a anatomia do sistema venoso varia entre os ratos e a questão da interrupção de ramo de veia cava inferior recentemente tem sido abordada na estenose e os modelos de estase de TVP13,14. Brandt et al mostrou que a formação de trombos induzida por restrição do fluxo foi impedida quando os ramos laterais foram localizados no < 1,5 mm do site da ligadura da veia cava inferior. No entanto, formação de TVP induzida pela restrição de fluxo em ratos não foi afetada pelo lado filial da ligadura13,15,16. Também foi relatado que a variabilidade do IVC ramos laterais em cepa de rato C57Bl6 tem um impacto importante na formação de trombos induzida pela ligadura completa do IVC14. Verificou-se que não ligar o lado ramos resultados em tamanho de coágulo estatisticamente menor em comparação com controles com ramos laterais ligados. Nosso estudo também sugerem que ligadura da formação de trombos consistente de ramos produzidos de lado e tamanho. No entanto, a variação anatômica mais frequente nos C57Bl/6 é que a presença de 2 volta Ramos (98% dos ratos)14. Foi demonstrado que Ramos volta a interromper tem o maior impacto no tamanho do trombo. A metodologia presente não abordou o efeito das costas ramos, que pode ser interrompido usando um cautério de baixa temperatura caneta14. No entanto, temos demonstrado essa ligadura da veia cava inferior e lateral galhos resultaram na formação de trombos consistente em C57Bl/6. Finalmente, como temos demonstrado anteriormente, o sistema de ultra-som de alta frequência e permite a medição precisa do tamanho do trombo pode ser usado para estudos a longo prazo e de translação da formação de trombos e resolução12,13 ,15.

Uma grande desvantagem do modelo de estase é a obstrução completa do fluxo de sangue, que reduz o efeito máximo de agentes administrados por via intravenosa na parede trombo e veia. Isso se torna uma questão importante quando se quer testar o efeito de um agente farmacológico. Se o efeito de uma droga específica precisa ser testado, um preferiria usando o modelo de estenose13 ou o modelo eletrolítico17. Ambos os modelos produzem trombos na presença de fluxo contínuo de sangue, permitindo que o teste de novos agentes anticoagulantes para tratamento e profilaxia de TVP.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por um subsídio do coração e derrame Foundation do Canadá e o Morris e Bella Fainman Family Foundation. Os autores gostaria de agradecer sua ajuda técnica com o sistema de imagens de ultra-som VEVO770 Veronique Michaud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 perma-hand silk suture Ethicon 706G
Surgical Scissors Fine Science Tools 20830-00
Suture tying forceps Fine Science Tools 20830-00
blunt forceps (straight and curved) Fine Science Tools 20830-00
Needle Driver Fine Science Tools 13002-10
Moria Spring Scissors Fine Science Tools 15396-00
1ml syringes BD Biosciences
26G needles Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System Visualsonics No longer sold
SR Buprenorphine ZooPharm Given to LDI by Vet
Surgery Microscope Leica Leica M651
Systan eye oinment Alcon 288/28062-0
2x2 sterile Gauze CDMV #104148
Cotton Tip Applicators from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape CDMV #7411
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References

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